ES2225132T3 - Anticuerpos especificos y fragmentos de anticuerpos para tgfbeta1. - Google Patents
Anticuerpos especificos y fragmentos de anticuerpos para tgfbeta1.Info
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Abstract
Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGFbeta1, en donde dicho miembro de unión específica comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un CDR3 de VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en el CDR3 del VH del SL15, identificado por la SEC. Nº ID.: 13, o el CDR3 del VH del JT182, identificado por la SEC. Nº ID.: 15.
Description
Anticuerpos específicos y fragmentos de
anticuerpo para TGF\beta_{1}.
La presente invención se refiere a miembros de
unión específica, particularmente a anticuerpos y fragmentos de los
mismos, los cuales se unen al factor de crecimiento transformante 1
(TGF\beta_{1}). Más particularmente, la invención se refiere a
miembros de unión específica que incluyen el CDR3 de la VH del
anticuerpo SL15 (el anticuerpo anteriormente conocido como Kylie),
especialmente el dominio VH del SL15, el cual podría estar en
combinación con los dominios SL15A o SL15S. Más aún, la invención
se refiere al uso de tales miembros de unión específica en
preparaciones farmacéuticas, particularmente para el tratamiento de
la enfermedad fibrótica, la modulación de la curación de las
heridas, y el tratamiento del cáncer.
La PCT/GB89/02.450 publicada como WO97/13.844
descubre el aislamiento de anticuerpos humanos específicos para el
TGF\beta_{1}, y anticuerpos humanos específicos para el
TGF\beta_{2}. Describe anticuerpos con el dominio VH de 31G9 y
variantes del dominio. Más específicamente, la solicitud describía
el anticuerpo CS37 que comprende el dominio VH del 31G9 junto con
el dominio VL del CS37 y variantes de este dominio, incluyendo
anticuerpos que:
- (i)
- compiten en ELISA con el CS37 por la unión al TGF\beta_{1},
- (ii)
- unen el TGF\beta_{1} preferentemente con relación al TGF\beta_{3}, y
- (iii)
- neutralizan el TGF\beta_{1}.
La presente invención se basa en la
identificación de anticuerpos que están relacionados con el CS73,
pero que tienen propiedades ventajosas inesperadas en relación a la
unión y neutralización del TGF\beta_{1}. Éstos no se unen a, o
neutralizan, el TGF\beta_{2} o el TGF\beta_{3}.
Los anticuerpos de la presente invención
neutralizan intensamente el TGF\beta_{1} activo. El epítopo
para estos anticuerpos se halla en la región
C-terminal del TGF\beta_{1} (residuos
83-112) e incluye el bucle formado por los residuos
92-98 del TGF\beta_{1}, también conocido como
dedo 2, una región que se ha identificado que interacciona con el
receptor del TGF\beta_{1}. Los anticuerpos unen preferentemente
el TGF\beta_{1} activo con respecto al TGF\beta_{1}
latente.
También se descubren en ésta variantes del SL15S
que neutralizan intensamente el TGF\beta_{1}. Estas varían
principalmente por sustituciones de aminoácidos en el CDR3 de los
dominios VH o VL. Sin embargo, hay otros sitios en los que podrían
hacerse sustituciones, por ejemplo, en el residuo 25 en la cadena
ligera podría sustituirse una alanina, generándose el anticuerpo de
IgG4, IgG4 SL15A, CAT-192. Podrían hacerse varias
sustituciones que son compatibles con la retención de la intensa
actividad neutralizante. Los anticuerpos de esta invención serán
particularmente útiles para el tratamiento de las enfermedades
fibróticas, por ejemplo, la fibrosis pulmonar, la modulación de la
respuesta de cicatrización, por ejemplo, en la curación de heridas y
en la cicatrización corneal, y en otros contextos discutidos con
más detalle más abajo, tales como el tratamiento de tumores.
Las proteínas unidoras específicas, tales como
los anticuerpos, que se basan en las regiones determinantes de
complementariedad (CDR) de los ventajosos dominios VH y VL de
anticuerpo identificados en ésta, particularmente las regiones CDR3,
serán útiles para los propósitos discutidos, y representan aspectos
de la presente invención.
Las realizaciones más preferidas de la presente
invención, en sus diversos aspectos, se basan en el CDR3 de VH del
dominio VH del SL15 identificado en ésta, dominios VH que incluyen
el CDR3 del VH del SL15, especialmente el mismo dominio VH del SL15,
y emparejamientos de tales dominios VH con dominios VL,
especialmente los dominios VL del SL15A y SL15S, u otros dominios VL
que comprenden el CDR3 del VL del SL15. El dominio unidor de
antígeno del SL15 (en cualquier formato, por ejemplo, scFv o IgG4)
consiste en el VH del SL15 y, en dos variantes, bien el VL del
SL15A (CS37) o el VL del SL15S (CS37 con A25S). En cualquiera de
las dos variantes, el SL15 es el anticuerpo anteriormente conocido
como Kylie. El scFv del SL15S es conocido también como
CAT-191; la IgG4 de SL15A es también conocida como
CAT-192; y la IgG54 de SL15S es también conocida
como CAT-193.
Otras realizaciones de la invención en sus varios
aspectos se basan en el CDR3 del VH del JT182, dominios VH que
incluyen el CDR3 del JT182, especialmente el dominio VH del JT182,
y emparejamientos de tales dominios VH con dominios VL,
especialmente el dominio VL del CS37. El JT182 no es tan efectivo
como el SL15, pero todavía tiene inesperadas propiedades mejoradas
respecto el CS37.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un miembro de unión específica aislado capaz de unir el
TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica
comprende un dominio unidor de antígeno que comprende un CDR3 de VH
con una secuencia de aminoácido sustancialmente tal como se dispone
para el CDR3 del VH del SL15 o JT182 en la Tabla 1 o Tabla 2.
Los residuos que difieren entre los fragmentos de
scFv están subrayados.
La invención proporciona además dicho miembro de
unión específica aislado, el cual comprende además un CDR1 de VH o
CDR2 de VH con secuencias de aminoácidos sustancialmente tal como
se dispone en uno o ambos del CDR1 del VH y CDR2 del VH del VH del
CS37, preferiblemente ambos (Tabla 2).
En una realización preferida, los dominios de
unión están portados por una estructura de anticuerpo humano. Un
ejemplo preferido de una realización tal es un dominio VH con una
secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta en el
dominio VH del JT182, la secuencia del cual se detalla en la SEC.
Nº ID.: 10. Un realización aún más preferida es un dominio VH con
una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta
en el dominio VH del SL15, la secuencia del cual se detalla en la
SEC. Nº ID.: 4.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un miembro de unión específica aislado capaz de unir el
TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica
comprende un dominio unidor de antígeno que comprende un dominio VL
con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la
dispuesta en el dominio VL del SL15S, la secuencias del cual se
detalla en la SEC. Nº ID.: 8.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
un miembro de unión específica capaz de unir el TGF\beta_{1},
que comprende un dominio VH tal como se dispuso más arriba en
relación al primer aspecto, y un dominio VL, en donde,
preferiblemente, el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos
sustancialmente tal como la dispuesta en el dominio VL del CS37
(SL15A), la secuencias del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 6, o
el VL del SL15S, la secuencias del cual se detalla en la SEC. Nº
ID.: 8.
En una realización particularmente preferida, la
invención proporciona un miembro de unión específica que comprende
el dominio VL del CS37 y un dominio VH seleccionado de entre el VH
del JT182 y el VH del SL15, más preferiblemente el VH del SL15. En
una realización aún más particularmente preferida, la invención
proporciona un miembro de unión específica que comprende el VH del
SL15 y el VL del SL15A (VL del CS37) o el VL del SL15S.
Las realizaciones preferidas de la invención
proporcionan miembros de unión específica que comprenden el dominio
VH de JT182 o VH de SL15, en los cuales se han realizado 1, 2, 3, 4
ó 5 sustituciones de aminoácidos en un CDR, por ejemplo, el CDR3,
y/o el FR, cuyos miembros de unión específica retienen la capacidad
de unir el TGF\beta_{1}. Otras realizaciones preferidas
adicionales proporcionan miembros de unión específica que comprenden
el VL del SL15A (CS37) o el VL del SL15S, o el dominio VL del SL15S
(CS37) o el VL del SL15A en los cuales se han realizado 1, 2, 3, 4 ó
5 sustituciones de aminoácidos en un CDR, por ejemplo, el CDR3, y/o
FR, cuyos miembros de unión específica retienen la capacidad de
unir el TGF\beta_{1}. Tales sustituciones de aminoácidos son
generalmente "conservadoras", por ejemplo, sustituciones de un
residuo hidrofóbico tal como la isoleucina, valina, leucina o
metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro,
tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o
glutamina por asparagina. En ciertas posiciones también son
permisibles las sustituciones no conservadoras.
Tales miembros de unión específica son también
capaces de unir el TGF\beta_{1}. Las realizaciones preferidas
carecen de reactividad cruzada significativa con el
TGF\beta_{2} y/o TGF\beta_{3}, preferiblemente con el
TGF\beta_{1} y TGF\beta_{3}.
Las realizaciones preferidas neutralizan
fuertemente el TGF\beta_{1}, y tienen una potencia de al menos
5 veces mejor que la del CS37, más preferiblemente aproximadamente
10 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces o 150
veces mejor, en un ensayo con radioreceptor (Lucas, C. et al.,
Meth. Enzymology 198:303-316 (1991)). La
potencia se mide con el anticuerpo bajo estudio y con el CS37 en
formatos moleculares equivalentes, por ejemplo, como anticuerpos
monovalentes (scFv o Fab) o como anticuerpos bivalentes (IgG1 o
IgG4).
Las realizaciones preferidas unen el
TGF\beta_{1} activo con preferencia respecto al
TGF\beta_{1} latente.
Las variantes de los dominios VH y VL y de los
CDR de los que están formados estas secuencias en ésta, y las
cuales pueden emplearse en miembros de unión específica para el
TGF\beta_{1}, pueden obtenerse por medio de procedimientos de
alteración de la secuencia o mutación y búsqueda. Tales
procedimientos también se proporcionan en la presente invención.
Además de las secuencias de anticuerpos, el
miembro de unión específica también podría comprender otros
aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido, tales
como un dominio plegado, o para conferir a la molécula otra
característica funcional aparte de su capacidad de unir el antígeno.
Los miembros de unión específica de la invención podrían ser
portadores de una marca detectable, o podrían estar conjugados a
una toxina o enzima (por ejemplo, a través de un enlace peptidilio
o de un engarce).
En aspectos adicionales, la invención proporciona
un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica
un miembro de unión específica tal como se ha definido más arriba,
y procedimientos para preparar miembros de unión específica de la
invención, los cuales comprenden la expresión de dichos ácidos
nucleicos en condiciones que permiten la expresión de dicho miembro
de unión y la recuperación del miembro de unión.
Los miembros de unión específica acordes con la
invención podrían usarse en un procedimiento de tratamiento o
diagnosis del cuerpo humano o animal, tal como un procedimiento de
tratamiento (el cual podría incluir el tratamiento profiláctico) de
una enfermedad o alteración en un paciente humano, el cual
comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un
miembro de unión específica de la invención. Las condiciones
tratables de acuerdo con la presente invención se describen más
abajo.
Estos y otros aspectos de la invención se
describen más abajo con mayor detalle.
Todos los documentos mencionados en ésta se
incorporan por referencia. Las secuencias descritas en ésta se
muestran y se denominan en la notación convencional de 5' a 3' y N
a C respectivamente para las secuencias de ácidos nucleicos y
aminoácidos, a menos que se indique específicamente lo
contrario.
Figura 1: Neutralización del TGF\beta_{1}
pero no del TGF\beta_{2} o \beta_{3} por parte del scFv del
SL15S en un ensayo de proliferación usando células TF1. Se muestra
que la neutralización por parte del mAb de Genzyme (Mab 1D.11.16,
cuadrados) o del scFv del SL15S (rombos) del TGF\beta_{1},
\beta_{2} o \beta_{3} indujo la inhibición de la
proliferación de TF1.
Figura 2: Inhibición de la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 mediante scFv
anti-TGF\beta_{1}. Las preparaciones de scFv de
SL15S, JT183 y CS37 se valoraron 2 veces y se ensayaron por su
capacidad para inhibir la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. El SL15S y el JT183 se usaron como his-preps, el CS37 se purificó mediante FPLC.
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. El SL15S y el JT183 se usaron como his-preps, el CS37 se purificó mediante FPLC.
Figura 3: Inhibición de la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 mediante
anticuerpos anti-TGF\beta_{1}. El scFv de SL15S,
la IgG4 de SL15S y la IgG4 de SL15A se compararon con el mAb de
Genzyme por su capacidad para inhibir la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. Los datos son el
promedio de 3 experimentos, usando una serie de dilución de tres
veces.
Figura 4: Inhibición de la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 por parte del
scFv en presencia de TGF\beta_{1} latente. Se ensayaron el scFv
del SL15S y la IgG4 del SL15A por su capacidad para inhibir la unión
del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. Para
investigar si el SL15S reconocía el TGF\beta_{1} latente, el
experimento estándar se realizó en presencia 0,1 nM de
TGF\beta_{1} latente, TGF\beta_{1} activo, o
TGF\beta_{1} latente activado con ácido. Los datos se expresan
como % del máximo para cada conjunto de condiciones.
Figura 5: Neutralización de la inhibición de la
proliferación de células TF1 inducida por el TGF\beta_{1}
mediante scFv e IgG en presencia de TGF\beta_{1} latente. La
capacidad del scFv del SL15S o de la IgG4 del SL15A apra neutralizar
la inhibición del crecimiento inducida por el TGF\beta_{1}
latente, el TGF\beta_{1} activo, o el TGF\beta_{1} latente
activado con ácido, se comparó en el ensayo con TF1. En (a) se
compararon diversas concentraciones de formatos de TGF\beta_{1},
mientras que en (b) se compararon el scFv y la IgG4 frente a 20 mM
de formatos del TGF\beta_{1}. Los datos se expresan como % del
control (crecimiento en ausencia de TGF\beta_{1}). La
inhibición inducida por el TGF\beta_{1} se debe a la pequeña
cantidad de TGF\beta_{1} activo presente en la preparación
latente.
Figura 6: Inhibición de la unión del scFv del
CS37 exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} usando TFG\beta
quiméricos. La unión del scFv del CS37 exhibido sobre fagos al
TGF\beta_{1} se ensayó mediante ELISA en presencia de: la
isoforma TGF\beta_{1} (TGF\beta_{1}); la isoforma
TGF\beta_{2} (TGF\beta_{2}); TGF\beta_{1}/\beta_{2}
(83-112) (1-1-2);
TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112
(2-2-1);
TGF\beta_{1}-\beta_{2}
(40-112) (1-2-2); o
TGF\beta_{2}-\beta_{1}
(92-98).
Figura 7: Inhibición de la unión del SL15S (scFv
del Kylie) exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} usando
TFG\beta quiméricos. La unión del scFv del SL15S (Kylie) exhibido
sobre fagos al TGF\beta_{1} se ensayó mediante ELISA en
presencia de: la isoforma TGF\beta_{1} (TGF\beta_{1}); la
isoforma TGF\beta_{2} (TGF\beta_{2});
TGF\beta_{1}/\beta_{2} (83-112)
(1-1-2);
TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112
(2-2-1);
TGF\beta_{1}-\beta_{2}
(40-112) (1-2-2); o
TGF\beta_{2}-\beta_{1}
(92-98) (92-98).
Figura 8: El efecto del CAT192 sobre la
re-epitelización corneal se investigó a
continuación de una herida excisional con trépano de la córnea
bovina aislada en el modelo de cultivo de órganos con interfaz
aérea. Las córneas bovinas se trataron, bien con 100 \mul de
Medio 199 libre de suero (control), o con medio que contenía el
vehículo (para el anticuerpo y TGF\beta_{1}). Inmediatamente
después de la herida se administraron anticuerpos nulos del mismo
isotipo (10 \mug), TGF\beta_{1} (1 ng), o CAT192 (10 \mug),
y a intervalos de 12 horas a partir de entonces. El CAT192 causó un
incremento significativo en la velocidad de
re-epitelización de la córnea bovina herida,
mientras que el TGF\beta_{1} causó una disminución significativa
en esta variable. Los datos se expresan como porcentaje de
re-epitelización de la herida corneal. Cada punto
representa el valor medio y las barras verticales muestran el error
estándar de la media de 8 córneas por punto. El efecto de los
diferentes tratamientos se comparó en cada instante usando el ANOVA
de medidas repetidas con el test de Bonferroni. * P <
0,01 en comparación con el grupo de tratamiento con anticuerpo
nulo; t P < 0,01 en comparación con el grupo tratado con
el vehículo.
Figura 9: El efecto del CAT192 sobre la
re-epitelización corneal se investigó a
continuación de una herida por excisión con trépano de la córnea
bovina aislada en el modelo de cultivo de órganos con interfaz
aérea. El CAT192 (0,001-10 \mug) se administró
inmediatamente después de la herida, y a intervalos de 12 horas a
partir de entonces. El CAT192 causó un incremento relacionado con
la dosis significativo en re-epitelización de la
córnea bovina herida. El EC50 para el CAT192 estuvo entre 0,01 y 0,1
\mug. Los datos se expresan como porcentaje de cambio en la
re-epitelización del grupo control tratado con
vehículo. Las líneas de puntos muestran el error estándar de la
media del grupo control con vehículo. Cada punto representa el valor
medio, y las barras verticales muestra el error estándar de la
media de 6 córneas por punto. El efecto de las diferentes dosis de
CAT192 se comparó con el tratamiento control usando el ANOVA de una
vía, y el test de Dunnet; * P \leftarrow 0,01.
Describe un miembro de un par de moléculas que
tienen especificidad de unión la una por la otra. Los miembros de
un par de unión específica podrían derivarse naturalmente o
producirse total o parcialmente de forma sintética. Un miembro del
par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad,
que se une específicamente a, y es por tanto complementaria de una
determinada organización espacial y polar del otro miembro del par
de moléculas. Por tanto, los miembros del par tienen la propiedad
de unirse específicamente entre ellos. Son ejemplos de tipos de
pares de unión específica: el antígeno-anticuerpo,
la biotina-avidina, la
hormona-receptor de la hormona, el
receptor-ligando, el
enzima-sustrato. Esta aplicación se refiere a
reacciones del tipo antígeno-anticuerpo.
Describe una inmunoglobulina, sea natural o
producida parcial o totalmente de forma sintética. El término
también incluye cualquier polipéptido o proteína que tenga un
dominio unidor que es, o es sustancialmente homólogo de, un dominio
unidor de anticuerpo. Estos pueden derivarse a partir de fuentes
naturales, o podrían producirse parcial o completamente de forma
sintética. Son ejemplos de anticuerpos los isotipos de
inmunoglobulinas y sus subclases isotípicas; los fragmentos que
comprenden un dominio de unión de antígeno, tales como Fab, scFv,
Fv, dAb, Fd; y los diacuerpos.
Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros
anticuerpos y usar técnicas de la tecnología del ADN recombinante
para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen
la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas podrían
implicar introducir el ADN que codifica la región variable de
inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad
(CDR) de un anticuerpo, en las regiones constantes, o regiones
constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina
diferente. Ver, por ejemplo, la EP-A- 184.187, la
GB-2.188.638-A, o la
EP-A-239.400. Podría someterse un
hibridoma u otra célula que produjera un anticuerpo a mutación
genética u otros cambios, los cuales podrían o no alterar la
especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Puesto que los anticuerpos pueden modificarse de
un cierto número de formas, el término "anticuerpo" debería
considerarse que abarca cualquier miembro de unión específica o
sustancia que tenga un dominio unidor con la especificidad
requerida. Por tanto, este término abarca los fragmentos de
anticuerpo, los derivados, equivalentes funcionales, y homólogos de
anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un
dominio unidor de inmunoglobulina, tanto si es natural o completa o
parcialmente sintético. Por tanto, las moléculas quiméricas que
comprenden un dominio unidor de inmunoglobulina, o equivalente,
fusionado a otro polipéptido están incluidas. La clonación y
expresión de anticuerpos quiméricos se describe en
EP-A-0.120.694 y
EP-A-0.125.023.
Se ha mostrado que los fragmentos de un
anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos.
Los ejemplos de fragmentos unidores son (i) el fragmento Fab
consistente en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd
consistente en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv
consistente en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el
fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature
341:544-546 (1989)), el cual consiste en un dominio
VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un
fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, (vii)
moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un
dominio VL están unidos mediante un engarce peptídico que permite
que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de
antígeno (Bird, et al., Science
242:423-426 (1988); Huston et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988));
(viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos
(PCT/US92/09.965); y (ix) "diacuerpos", fragmentos
multivalentes o multiespecíficos construidos mediante la fusión de
genes (WO94/13.804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:6444-6448 (1993)). Las moléculas de
Fv, scFv o diacuerpo podrían estabilizarse mediante la
incorporación de puentes disulfuro uniendo los dominios VH y VL (Y.
Reiter et al., Nature Biotech
14:1239-1245 (1996)). Los minicuerpos que
comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también podrían
construirse (S. Hu et al., Cancer Res.
56:3055-3061 (1996)).
Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, en
los que cada polipéptido comprende un primer dominio que comprende
una región unidora de una cadena ligera de inmunoglobulina, y un
segundo dominio que comprende una región unidora de una cadena
pesada de inmunoglobulina, estando unidas las dos regiones (por
ejemplo, mediante un engarce peptídico) pero siendo incapaces de
asociarse entre ellas para formar un sitio de unión de antígeno: los
sitios de unión de antígeno se forman mediante la asociación del
primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el
segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero
(WO94/13.804).
Cuando deban usarse anticuerpos biespecíficos,
estos podrían ser anticuerpos biespecíficos convencionales, los
cuales pueden construirse de diferentes formas (Holliger, P. y
Winter, G., Current Opinion Biotechnol.
4:446-449 (1993)), por ejemplo, pueden prepararse
químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o podrían se
cualquiera de los fragmentos biespecíficos de anticuerpo mencionados
más arriba. Podría ser preferible usar dímeros de scFv o diacuerpos
en vez de anticuerpos completos. Los diacuerpos y scFv pueden
construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variables,
reduciendo potencialmente los efectos de la reacción
anti-idiotípica.
Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los
anticuerpos completos biespecíficos, también podrían ser
particularmente útiles puesto que pueden construirse y expresarse
fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros
polipéptidos tales como los fragmentos de anticuerpo) con las
especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente
usando la exhibición sobre fagos (WO94/13.804) a partir de
bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante,
por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X,
entonces puede construirse una biblioteca en donde el otro brazo se
varía y se selecciona un anticuerpo con la especificidad apropiada.
Los anticuerpos enteros biespecíficos pueden construirse mediante
manipulación
"knobs-into-holes" (J.B.B.
Ridgeway et al., Protein Eng.
9:616-621 (1996)).
Los diacuerpos podrían construirse con un sitio
unidor para el TGF\beta_{1} formado por los dominios VH y VL,
tal como se descubre en esta solicitud, siendo el otro sitio de
unión para el TGF\beta_{1}. El sitio de unión de
TGF\beta_{2} podría formarse, por ejemplo, a partir de los
dominios VH y VL del anticuerpo 6B1 (WO97/13.844).
Describe la parte de un anticuerpo que comprende
el área que se une específicamente a, y es complementaria de parte
o de la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un
anticuerpo podría unirse sólo a una parte concreta del anticuerpo,
la cual se denomina epítopo. Un dominio unidor de antígeno podría
ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpo
(por ejemplo, un fragmento de anticuerpo denominado Fd consistente
en un dominio VH). Preferiblemente, un dominio de unión de antígeno
comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y
una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).
Podría usarse para referirse a la situación en la
cual un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna
unión significativa con moléculas distintas de su(s)
pareja(s) de unión específica. El término es también
aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión de antígeno es
específico para un epítopo determinado, el cual es portado por un
cierto número de antígenos, en cuyo caso el miembro de unión
específica portador del dominio de unión de antígeno será capaz de
unirse a los diversos antígenos portadores del epítopo.
Se usa generalmente en el sentido de incluir, es
decir, que permite la presencia de una o más características o
componentes.
Se refiere al estado en el cual los miembros de
unión específica de la invención, o el ácido nucleico que codifica
tales miembros de unión, estará de acuerdo con la presente
invención. Los miembros y ácido nucleico estarán libres o
sustancialmente libres de materiales con los que están naturalmente
asociados, tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los
cuales se hallan en su entorno natural, o el entorno en el que se
preparan (por ejemplo, un cultivo celular) cuando tal preparación
es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in
vitro o in vivo. Los miembros y ácido nucleico podrían
formularse con diluyentes o adyuvantes, y todavía aislarse por
motivos prácticos -por ejemplo, los miembros estarán normalmente
mezclados con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir
placas de microvaloración para su uso en inmunoensayos, o estarán
mezclados con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables
cuando se usen en diagnosis o terapia. Los miembros de unión
específica también podrían estar glicosilados, bien naturalmente o
mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo,
células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o podrían no estar glicosilados
(por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula
procariota).
Por "sustancialmente tal como se dispone en"
se pretende indicar que el CDR o dominio VH o VL de la invención
será idéntico o altamente similar con las regiones especificadas a
partir de las cuales se dispone la secuencia en ésta. Por
"altamente similar" se contempla que podrían hacerse desde 1
hasta 5, preferiblemente desde 1 hasta 4, tales como de 1 a 3 ó 1 ó
2, ó 3 ó 4 sustituciones en el CDR y/o dominio VH o VL.
La estructura para realizar un CDR de la
invención será generalmente de una secuencia de cadena pesada o
ligera de un anticuerpo, o una porción sustancial de la misma en la
cual el CDR está situado en una ubicación correspondiente a la del
CDR de los dominios variables VH y VL de anticuerpo codificados por
los genes reordenados de inmunoglobulina. Las estructuras y
ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina podrían
determinarse por referencia a (Kabat, E.A. et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición,
U.S. Department of Health and Human Services, 1987, y
actualizaciones del mismo, ahora disponibles en Internet
(http://immuno.bme.nwu.edu)). Los CDR son generalmente tal
como los define Kabat. Adicionalmente, en el CDR podrían injertarse
residuos de injerto del bucle definido por Chothia adyacente al
CDR1 del VH de Kabat. Para el SL15S esto incluiría los residuos 26 a
30 de la cadena pesada (GFTGS).
Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos,
sustancialmente tal como se dispone en la Tabla 1, se lleva como el
CDR3 en un dominio variable de cadena pesada humana o en una
porción sustancial del mismo.
Los dominios variables empleados en la invención
podrían derivarse de cualquier dominio de línea germinal o dominio
variable humano reordenado, o podrían ser un dominio variable
sintético basado en secuencias consenso de dominios variables
humanos conocidos. Las secuencias derivadas de CDR de la invención
podrían introducirse en un repertorio de dominios variables que
carezcan de regiones CDR3, usando la tecnología del ADN
recombinante.
Por ejemplo, Marks et al.
(Bio/Technology 10:779-783 (1992)) describen
procedimientos para producir repertorios de dominios variables de
anticuerpo, en los cuales los cebadores consenso dirigidos contra o
adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable se usan
conjuntamente con cebadores consenso contra la tercera región
estructural humana de genes del VH humano para proporcionar un
repertorio de dominios variables VH que carecen de CDR3. Marks
et al., describen además cómo este repertorio podría
combinarse con un CDR3 de un anticuerpo concreto. Usando técnicas
análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención
barajarse con repertorios de dominios VH o VL que carecieran de un
CDR3, y los dominios VH o VL completos barajados podrían combinarse
con un dominio VH o VL afín para proporcionar miembros de unión
específica de la invención. El repertorio podría a continuación
exhibirse sobre un sistema huésped apropiado, tal como el sistema
de exhibición sobre fagos de WO92/01.047 de forma que pudieran
seleccionarse miembros de unión específica apropiados. Un
repertorio podría consistir en, desde algo como 10^{4} miembros
hacia arriba, por ejemplo, desde 10^{6} hasta 10^{8} o 10^{10}
miembros.
También se descubren técnicas de mezcla o
combinatorias análogas en Stemmer (Nature
370:389-391 (1994)), el cual describe la técnica en
relación a un gen de la \beta-lactamasa, pero
observa que la estrategia podría usarse para la generación de
anticuerpos.
Una alternativa adicional es general regiones VH
o VL nuevas portadoras de secuencias derivadas del CDR de la
invención usando mutagénesis aleatoria de, por ejemplo, el gen del
SL15 o del JT182, o los genes del SL15A o SL15S, para generar
mutaciones dentro del dominio variable entero. Tal técnica es
descrita por Gram et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:3576-3580 (1992)), los cuales usaron PCR
propensa al error.
Otro procedimiento que podría usarse es la
mutagénesis dirigida contra regiones CDR de los genes VH o VL.
Tales técnicas son descritas por Barbas et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)) y
Schier et al. (J. Mol. Biol.
263:551-567 (1996)).
Todas las técnicas descritas más arriba son
conocidas como tales en la técnica y no forman parte por sí mismas
de la presente invención. La persona capacitada será capaz de usar
tales técnicas parar proporcionar miembros de unión específica de
la invención usando metodología rutinaria en la técnica.
Un aspecto ulterior de la invención proporciona
un procedimiento para obtener un dominio de anticuerpo unidor de
antígeno específico para el TGF\beta_{1}, y preferiblemente uno
o más de las propiedades adicionales descubiertas en ésta para los
miembros de unión específica acordes con realizaciones de la
invención, comprendiendo el procedimiento proporcionar, por medio
de la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH
detallado en ésta (SL15 o JT182), un dominio VH que es una
secuencia de aminoácidos variante de la del dominio VH, combinando
el dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL, y
ensayando la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un
dominio de anticuerpo unidor de antígeno específico para el
TGF\beta_{1}, y opcionalmente con una o más de dichas
propiedades preferidas. Dicho dominio VL podría tener una secuencia
de aminoácidos que es sustancialmente tal como se dispone para el
SL15A (CS37) o podría tener una secuencia de aminoácidos que es
sustancialmente tal como se dispone para el VL.
Podría emplearse un procedimiento análogo en el
cual una o más variantes de secuencias de un dominio VL descubierto
en ésta se combinan con uno o más dominios VH.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
un procedimiento para preparar un miembro de unión específica para
el TGF\beta_{1}, procedimiento que comprende:
- a)
- proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH, los cuales o bien incluyen un CDR3 a ser remplazado o carecen de una región codificante del CDR3;
- b)
- combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en ésta para el CDR3 del VH del SL15 o JT182, de tal forma que el ácido nucleico donante se inserta en una región CDR3 en el repertorio, con objeto de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH;
- c)
- expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio de producto; y
- d)
- seleccionar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}; y
- e)
- recuperar dicho miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica.
De nuevo, podría emplearse un procedimiento
análogo en el cual un CDR3 de VL de la invención se combinan con un
repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL, el cual
o bien incluye un CDR3 a remplazar o carece de una región que
codifique el CDR3.
Similarmente, uno o más, o los tres CDR podrían
injertarse en un repertorio de dominios VH o VL, los cuales se
examinan a continuación en busca de un miembro de unión específica
o miembros de unión específica para el TGF\beta_{1}.
Una porción sustancial de un dominio variable de
inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR, junto
con sus regiones estructurales intermedias. Preferiblemente, la
porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de una de
las dos o de ambas la primera y cuarta regiones estructurales,
siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera
región estructural y el 50% N-terminal de la cuarta
región estructural. Los residuos adicionales en el extremo
N-terminal o C-terminal de la parte
sustancial del dominio variable podría ser aquélla que no está
normalmente asociada con las regiones del dominio variable que
ocurren de forma natural. Por ejemplo, la construcción de miembros
de unión específica de la presente invención realizada mediante
técnicas de ADN recombinante podría resultar en la introducción de
residuos N- o C-terminales codificados por engarces
introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de
manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción
de engarces para unir dominios variables de la invención a
secuencias proteicas adicionales, incluyendo las cadenas pesadas de
inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo, en la
producción de diacuerpos) o marcas de proteínas, tal como se discute
con mayor detalle más abajo.
Aunque en un aspecto preferido de la invención se
prefieren los miembros de unión específica que comprenden un par de
dominios VH y VL, los dominios de unión sencillos badasdos en
secuencias de dominios VH o VL forman aspectos adicionales de la
invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina sencillos,
especialmente los dominios VH, son capaces de unir antígenos diana
de manera específica.
En el caso de cualquiera de los dominios de unión
específica de cadena sencilla, estos dominios podrían usarse para
examinar en busca de dominios complementarios capaces de formar un
miembro de unión específica de dos dominios capaz de unir el
TGF\beta_{1}.
Esto podría conseguirse mediante procedimientos
de exhibición sobre fagos usando la denominada estrategia
combinatoria dual jerárquica, tal como se descubre en WO92/01.047,
en la cual una colonia individual, que contiene el clon de la
cadena H o L, se usa para infectar una biblioteca completa de clones
que codifican la otra cadena (L o H), y el miembro de unión
específica de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con
las técnicas de exhibición sobre fagos, tales como aquéllas
descritas en esa referencia. Esta técnica también se descubre en
Marks et al., ibid.
Los miembros de unión específica de la presente
invención podrían comprender además regiones constantes de
anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL tal
como el VL de SL15A o el VL de S15S podría unirse por su extremo
C-terminal a dominios constantes de cadena ligera,
incluyendo las cadenas C\kappa y C\lambda humanas,
preferiblemente las cadenas C\lambda. Similarmente, los miembros
de unión específica basado en el VH del SL15 podrían unirse por su
extremo C-terminal a la totalidad o parte de una
cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de
anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, y de cualquiera de
las subclases de isotipo, particularmente de IgG1 e IgG4. IgG4 es
la preferida.
Los anticuerpos de la invención podrían marcarse
con una marca detectable o funcional. Las marcas detectables
incluyen los marcadores radiactivos tales como el ^{131}I o el
^{99}Tc, los cuales podrían unirse a anticuerpos de la invención
usando técnicas químicas convencionales conocidas en el campo de la
visualización de anticuerpos. Las marcas también podrían incluir
marcadores enzimáticos, tales como la peroxidasa de rábano
silvestre. Las marcas incluyen además grupos químicos tales como la
biotina, la cual puede detectarse a través de la unión a un grupo
afín específico detectable, por ejemplo, avidina marcada.
Los anticuerpos de la presente invención se
diseñan para usarse en procedimientos de diagnosis y tratamiento en
sujetos humanos o animales, preferiblemente humanos.
Se ha mostrado que los anticuerpos específicos
para el TGF\beta_{1} humano son efectivos en modelos animales
para el tratamiento de las enfermedades fibróticas y otras
enfermedades en las que el TGF\beta_{1} está sobreexpresado,
tales como la artritis reumatoide o el cáncer. Se ha mostrado que
los anticuerpos contra el TGF\beta_{1} son efectivos en el
tratamiento de la glomerulonefritis (W.A. Border et al.,
Nature 346:371-374 (1990)); la cicatrización
neural (A. Logan, et al., Eur. J. Neurosci.
6:335-363 (1994)); la cicatrización dérmica (M.
Shah et al., Lancet 339:213-214
(1992); M. Shah et al., J. Cell. Science
107:1137-1157 (1994); M. Shah et al.,
108:985-1002 (1995)), y en la fibrosis pulmonar
(Giri et al., Thorax 48:959-966
(1993)). Además, se ha observado que los anticuerpos que reaccionan
de forma cruzada con las isoformas del TGF\beta, 1, 2 y 3, son
efectivo en modelos de la fibrosis pulmonar, la fibrosis inducida
por radiación (Barcellos-Hoff, patente
estadounidense nº 5.616.561 (1997)), la mielofibrosis, las
quemaduras, la contractura de Dupuyen, las úlceras gástricas y la
artritis reumatoide (Wahl et al., J. Exp. Medicine
177:225-230 (1993)).
Hay un cierto número de condiciones adicionales
asociadas con la deposición de matriz extracelular que podrían
mejorar mediante la administración de un anticuerpo dirigido con el
TGF\beta_{1}. Éstas incluyen la esclerosis sistémica, las
adhesiones posteriores a operaciones, la cicatrización queloide e
hipertrófica, la vitreoretinopatía proliferativa, la cirugía de
drenaje del glaucoma, la lesión corneal, las cataratas, la
enfermedad de Peyronie, la nefropatía diabética, el síndrome de la
molestia respiratoria humana, la cirrosis del hígado, el infarto de
miocardio posterior, la restenosis posterior a la angioplastia, las
cicatrices queloides, la cicatrización después de una hemorragia
subaracnoidea, la esclerosis múltiple, la fibrosis después de la
laminectomía, la fibrosis después de la reparación de tendones y
otras reparaciones, la supresión de tatuajes, la colangitis
esclerotizante, la pericarditis, la pleuresia, la traqueostomía, la
lesión penetrante del CNS, el síndrome miálgico eosinofílico, la
restenosis vascular, la enfermedad oclusiva de venas, la
pancreatitis y la artropatía psoriática. En algunos casos, el
tratamiento en combinación con un anticuerpo dirigido contra el
TGF\beta_{2}, tal como la IgG4 de 6B1 (CAT-152)
(ver WO97/13.844) podría emplearse de forma valiosa, por ejemplo,
en el tratamiento de la cicatrización dérmica. La eficacia de la
IgG4 del SL15A en el tratamiento de las heridas del epitelio
corneal se demuestra en el Ejemplo 6.
El éxito del CAT-192 para
promover la curación de las heridas de la córnea proporciona una
indicación de su utilidad en otras condiciones en las que la
promoción de la re-epitelización es beneficiosa.
Estas incluyen las enfermedades de la piel, tales como las úlceras
venenosas, las úlceras isquémicas (llagas por presión), úlceras
diabéticas, sitios de injertos, sitios donantes de injertos,
abrasiones y quemaduras, enfermedades del epitelio bronquial, tales
como el asma, la ARDS, las enfermedades del epitelio intestinal,
tales como la mucositis asociada con el tratamiento citotóxico, las
úlceras esofágicas (enfermedad del reflejo), las úlceras
estomacales, las lesiones del intestino delgado e intestino grueso
(enfermedad inflamatoria intestinal).
El TGF\beta también inhibe la proliferación
endotelial, por tanto los anticuerpos
anti-TGF\beta podrían usarse para estabilizar
placas ateroescleróticas y acelerar la curación de la anastomosis
vascular. El TGF\beta podría estimular la proliferación del
músculo liso de forma que el tratamiento
anti-TGF\beta podría ser adicionalmente apropiado
para la enfermedad arterial y para el asma.
El asma es una alteración inflamatoria crónica de
las vías aéreas que se manifiesta como una obstrucción intermitente
del flujo de aire, la cual a lo largo del tiempo podría devenir
progresiva. Tanto en la forma alérgica de la enfermedad como en la
no-alérgica hay evidencia de una respuesta local de
células T alterada en favor de la liberación de la citoquina
Th-2, lo que resulta en que el isotipo de las
células B cambian a IgE, en la reclutamiento de mastocitos,
eosinófilos y basófilos, y en la activación y liberación de un
amplio rango de mediadores inflamatorios. No obstante, ha pasado a
estar claro que la inflamación, por sí misma, no es capaz de
explicar muchas de las características del asma crónico y que la
también se requiere la reestructuración de la pared de las vías
aéreas (Holgate, S.T. et al., J. Allergy Clin.
Immunol. 2000 (en prensa)). Esta respuesta "remodeladora"
es la responsable de la incompleta eficacia terapéutica de los
corticosteroides, con una hipersensibilidad bronquial persistente
(BHR) (Lundgren R. et al., Eur. Respir. J.
1(10):883-889 (1988)), y una disminución
progresiva de la función pulmonar a lo largo del tiempo, la cual
ocurre en aquellos asmáticos con una enfermedad más crónica y grave
(Lange, P. et al., N. Engl. J. Med.
339(7):1194-1200 (1998)).
La fibrosis subepitelial y submucosa está
implicada en el asma. Cuando se examinan mediante CT de alta
resolución, los pacientes con asma grave tienen vías aéreas más
gruesas en comparación con los sujetos normales o aquéllos con una
enfermedad suave (Awadh, N. et al., Thorax
53(4):248-253 (1998)). Esto implica el
engrosamiento y una densidad creciente de la capa de colágeno de la
SBM, incrementos en el músculo liso y en las redes microvasculares
(Carroll, N., et al., Am. Rev. Respir. Dis.
147(2):405-410 (1993)). En base a las
mediciones realizadas en las vías humanas y en modelos en conejillo
de indias de exposición crónica a antígeno, el engrosamiento de la
SBM refleja el de la pared entera de la vía aérea. Se ha observado
que el engrosamiento del colágeno de la SBM se correlaciona con la
gravedad, cronicidad y BHR de la enfermedad.
El engrosamiento de la SBM se debe a la
deposición de colágenos intersticiales de los Tipos I, III y V y de
fibronectina en la lamina reticularis y se origina a partir
de los miofibroblastos, cuyo número y actividad está incrementada en
el asma (Brewster, C.E., et al., Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol. 3(5):507-511 (1990)) y
adicionalmente potenciados por la exposición a alérgeno (Gizycki,
M.J., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.
16(6):664-673 (1997)). Los estudios de
biopsias y lavados bronquiales han proporcionado un argumento
convincente del epitelio como una fuente potencial de factores de
crecimiento profibrogénico. En el asma, la inmunotinción para el
TGF\beta y el b-FGF muestra tanto la ubicación
epitelial como la tinción extensiva de la matriz, indicativas de
importantes interacciones entre estos factores de crecimiento y los
proteoglicanos de la matriz a través de sitio de unión específicos
para glicosaminoglicanos (GAG) (Redington, A.E. et al.,
J. Pathol. 186(4):410-415 (1998)).
Ambos, el TGF\beta_{1} y el b-FGF se hallan en
concentraciones incrementadas en el fluido de lavado, con
incrementos adicionales que ocurren después de la exposición a
alérgeno (Redington, A.E., et al., Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 156(2, Pt. 1):642-647 (1997)).
El análisis en tejidos de los factores de crecimiento, de las
citoquinas y de las quimioquinas ha mostrado que éstos están
principalmente presentes en formas complejas, de elevado peso
molecular. Se ha identificado el péptido asociado a la latencia
como la molécula unidora de TGF\beta, y, usando un modelo de
explante bronquial, se ha mostrado que la exposición a alérgeno de
tejido mucosal asmático resulta en la activación del TGF\beta que
depende de la actividad de plasmina, mientras que el
b-FGF se libera en forma soluble mediante heparina
y heparinasa respectivamente a partir de mastocitos y eosinófilos
(McConnell, W., et al., Eur. Respir. J. 152s (1999),
tipo de referencia: resumen).
El asma también está implicado en la lesión
epitelial y en el remodelado de la vías aéreas. Un rasgo
característico de las vías aéreas remodeladas en el asma el la gran
lesión epitelial causada por los productos de las células
inflamatorias (Laitinen, L.A., et al., Am. Rev. Respir.
Dis. 131(4):599-606 (1985)). La lesión
mucosal no sólo permite que pasen sin impedimentos las moléculas
lesivas para el tejido hacia las vías aéreas, sino que también
causa que el epitelio pase a estar "activado" con la expresión
de una variedad de quimioquinas pro-inflamatorias,
mediadores autacoides, y moléculas de adhesión, los cuales
contribuyen a la inflamación crónica (Holgate, S.T. et al.,
J. Allergy Clin. Immunol. 2000 (en prensa)). Las células
epiteliales lesionadas y las reparadoras son también reguladoras
importantes de la remodelación de las vías aéreas a través de la
producción incrementada de factores de crecimiento
fibroproliferantes y profibrogénicos, incluyendo las isoformas del
TGF\beta (Zhang, S., et al., Lab. Invest.
79(4):395-405 (1999)). Recientemente se ha
hallado que el perjuicio de la reparación epitelial mediada por el
factor de crecimiento epidérmico (EGFR) causa una liberación
altamente incrementada de TGF\beta_{2} por parte de las células
epiteliales dañadas, y una marcada mejora de la expresión del gen
del colágeno III cuando el medio condicionado se añade a cultivos
de miofibroblastos. Puesto que la isoformas del TGF\beta son
potentes inhibidores de la proliferación de células epiteliales, la
producción excesiva de TGF\beta en el asma podría ser responsable
de los valores inesperadamente bajos de expresión del PCNA marcador
de proliferación hallado en el epitelio asmático (Demoly, P., et
al., Am. J. Respir. Crit. Care Med.
150(1):214-217 (1994)). De esta forma, las
condiciones que favorecen la biosíntesis del colágeno por parte de
los miofibroblastos subepiteliales también podrían contribuir a la
cronicidad de la enfermedad retardando la reparación del epitelio.
Por tanto, se esperaría que la reducción de los niveles de
TGF\beta, mediante el uso de miembros de unión específica de la
presente invención, tratara la necesidad en el asma crónico y grave
de impedir la biosíntesis de matrix proteica por parte de los
miofibroblastos bronquiales, así como la promoción de la reparación
del epitelio bronquial con objeto de restaurar un fenotipo
epitelial no activado y la función de barrera normal.
El TGF\beta_{1} también modula las respuestas
inmune e inflamatoria, por ejemplo, en respuesta al cáncer o a las
infecciones. Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría usarse
para mejorar la respuesta inmune contra infecciones tales como la
hepatitis B, la hepatitis C, o la tuberculosis, o para reducir la
inmunosupresión inducida por, por ejemplo, tumores, infección del
SIDA, o las enfermedades granulomatosas. Un anticuerpo contra el
TGF\beta_{1} podría ser útil para el tratamiento del rechazo
agudo y crónico del transplante de órganos, y de tumores malignos,
y podría usarse en la prevención de la extensión de las células
cancerosas inducida por el tratamiento con ciclosporina.
Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría
usarse como un adyuvante para la inmunoterapia.
Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría
usarse para la inhibición de la angiogénesis, por ejemplo, en el
tratamiento de tumores. La gran mayoría de células tumorales
expresan niveles detectables de TGF\beta_{1}
(Wojtowicz-Praga, J. Immunother.
20(3):165-177 (1997)). Más aún, las células
que producen niveles más elevados de TGF\beta_{1} tienen un
potencial metastásico (Blanckaert et al., Cancer Res.
53(17):4075-4081 (1993)) o invasor (Arteaga,
et al., Cell Growth and Differentiation
4(3):193-201 (1993) más elevado. En muchos
cánceres, los niveles de TGF\beta_{1} en plasma se
correlacionan con la progresión de la enfermedad. Por tanto, la
fuente de TGF\beta_{1} pueden ser las células tumorales así
como el tejido que las rodea.
El TGF\beta es un potente supresor de la
transformación maligna en tejido epitelial sano normal y puede
inhibir la proliferación. No obstante, muchos cánceres avanzados
devienen resistentes a las acciones inhibidoras del crecimiento del
TGF\beta a resultas de anormalidades en el receptor del
TGF\beta del Tipo II (Markowitz et al., Science
268(5215):1336-1338 (1995)) o de la
transducción de la señal SMAD (Hata et al., Mol. Med.
Today 4(6):257-262 (1998)).
Los tumores requieren un aporte de sangre para su
crecimiento por encima de 1 mm^{3} y para la metástasis (Folkman,
Breast Cancer Res. 36(2):109-118
(1995)). Esto ha conducido al rápido desarrollo de tratamientos
anti-angiogénicos para tumores sólidos.
Se ha observado que el TGF\beta_{1} causa
directamente angiogénesis mediante regulación hacia arriba de la
producción de VEGF in vitro e in vivo. Los cánceres
de mama contienen cantidades elevadas de macrófagos infiltrantes. El
papel y función de estas células dentro del tumor permanece sin
aclarar, pero un cierto número de estudios han hallado una
asociación con una prognosis pobre. Tantos las células tumorales
como los macrófagos del tumor producen VEGF in vitro y la
producción es regulada hacia arriba por el TGF\beta_{1}. Los
niveles de VEGF en suero están potenciados en pacientes con cáncer
de mama, y estos niveles se correlacionan directamente con los
niveles de TGF\beta_{1} en suero. Por tanto, la expresión del
TGF\beta_{1} por parte de las células del cáncer de mama y de
los macrófagos asociados al cáncer podría elegirse como una
respuesta angiogénica a través de la generación de VEGF (Donovan
et al., Ann. Surg. Oncol.
4(8):621-627 (1997); Harmey et al.,
Ann. Surg. Oncol. 5(3):271-278
(1998)).
Ueki et al. (Japanese Journal of Cancer
Research 84(6):589-593 (1992))
demostraron que el TGF\beta_{1} potenciaba el crecimiento
tumoral in vivo. Este grupo transfectó células CHO con el
gen del TGF\beta_{1}, lo que resultó en la sobreexpresión de
TGF\beta_{1}, se observó que las células de CHO que secretaban
TGF\beta_{1} crecían más rápidamente que las células no
transfectadas cuando se inyectaban subcutáneamente en ratones
inmunosuprimidos. Se observó una vascularización prominente en
tumores derivados de células transfectadas con TGF\beta_{1}; la
vascularización estaba disminuida en las células no transfectadas.
Además, el anticuerpo neutralizante
anti-TGF\beta_{1} fue capaz de inhibir tanto el
crecimiento como la angiogénesis en los tumores derivados de
células transfectadas con el TGF\beta_{1}. Por tanto, la
sobreproducción de TGF\beta_{1} por parte de células tumorales
contribuyó al crecimiento tumoral y a la neovascularización.
Se sabe que los pacientes que tienen cáncer
también tienen un sistema inmunitario defectuoso. Recientemente, se
ha sugerido que el TGF\beta_{1} juega un papel clave en la
inmunosupresión asociada a tumores. Este tópico ha sido el foco de
una reciente revisión (Wojtowicz-Praga, 1997,
ibid). Ciertamente, el TGF\beta_{1} parece ser un
potente inmunosupresor, y se ha detectado consistentemente a partir
de una variedad de líneas celulares y en plasma de huéspedes
portadores de tumores.
La neutralización del TGF\beta_{1} por parte
de anticuerpos monoclonales o la inhibición de la producción por
parte de genes anti-sentido resulta en una
atenuación del crecimiento tumoral y de la capacidad metastásica en
modelos animales. El crecimiento de células de cáncer de mama
MCF-7 transfectadas con el TGF\beta_{1} en
ratones es impedida por el 2G7 (dosis i.p. repetidas), un
anticuerpo anti-TGF\beta_{1,2,3} (Arteaga et
al., ibid). El crecimiento de células
MCF-7 normales es impedido por el 2G7 pero sólo
cuando el tratamiento se inició en el momento de la inoculación de
las células tumorales. Además, se ha proporcionado una evidencia
más convincente de una acción de los anticuerpos
anti-TGF\beta para suprimir la inmunosupresión
inducida por el tumor (Arteaga, et al., J. Clin.
Invest. 92(6):2569-2576). La
MDA-231, una línea ce células de cáncer de mama
humanas, causó una disminución en la actividad de las células
asesinas naturales ("natural killer", NK) de bazo en ratones
inmunosuprimidos a continuación de su inoculación i.p. El 2G7 (200
\mug cada dos días, i.p.) atenuó los tumores
intra-abdominales y las metástasis en pulmón, así
como incrementó marcadamente la actividad de la actividad de las
células NK de bazo. Más aún, el medio condicionado a partir de
cultivos de células tumorales de MDA-231 inhibió la
actividad de células NK procedentes de sangre humana; de nuevo, el
2G7 impidió esto. El crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de
células MDA-231 sólo fue inhibido transitoriamente
por el 2G7. La acción del 2G7 sobre el crecimiento tumoral, la
metástasis, y la actividad de células NK estuvo ausente en ratones
inmunosuprimidos deficientes en células NK beige (Arteaga, et
al., J. Clin. Invest.
92(6):2569-2576).
92(6):2569-2576).
En un estudio adicional, el anticuerpo 2G7
anti-TGF\beta_{1} (500 \mug i.p. cada dos
días), en combinación con la IL-2 (10.000 U i.p.,
2\times diariamente), fue capaz de reducir las metástasis
pulmonares de melanoma de B16, pero no fue tan efectivo como la
inoculación i.v. El 2G7 solo también redujo el número de metástasis
pulmonares pero no fue tan efectivo como la terapia combinada. Los
niveles de TGF\beta_{1} en plasma se redujeron
significativamente en los animales tratados con anticuerpo
(Wojtowicz-Praga, et al., J. Immunother.
Emphasis Tumour Immunol. 19(3):169-175
(1996)). Dos estudios previos, o bien no consiguieron mostrar un
efecto, o sólo causaron un pequeño efecto usando la combinación de
anti-TGF\beta_{1} e IL-2
(Gridley, et al., Cancer Biother.
8(2):159-170 (1993); Mao et al.,
Cancer Biother.
9(4):317-327 (1994), respectivamente), no obstante, las dosis de anticuerpos anti-TGF\beta_{1} usadas en estos estudios fueron pequeñas (100 ng y 1 \mug respectivamente). Por tanto, la combinación de terapia anti-TGF\beta_{1} con inmunoestimulación parecería, a partir de datos de modelos animales, proporcionar una prueba de concepto para esta estrategia terapéutica contra el cáncer.
9(4):317-327 (1994), respectivamente), no obstante, las dosis de anticuerpos anti-TGF\beta_{1} usadas en estos estudios fueron pequeñas (100 ng y 1 \mug respectivamente). Por tanto, la combinación de terapia anti-TGF\beta_{1} con inmunoestimulación parecería, a partir de datos de modelos animales, proporcionar una prueba de concepto para esta estrategia terapéutica contra el cáncer.
Hoefer y Anderer (Cancer Immunol.
Immunother. 41(5):302-308 (1995))
demostraron que la línea celular de carcinoma humana,
SLU-1, y la sublínea altamente metastásica
SLU-M1, resultaban en metástasis en ratones
inmunosuprimidos a continuación de su inoculación s.c. La incidencia
de la metástasis así como el crecimiento del tumor primario se
redujeron mediante tratamiento con anticuerpos
anti-TGF\beta_{1} (tratamiento desde el día 3,
cada 3-4 días, con 100 \mug s.c. en el sitio del
tumor). Los autores sugirieron que los anticuerpos invertían la
inmunosupresión inducida por el TGF\beta_{1} conduciendo a la
inhibición del crecimiento tumoral y de la metástasis.
Trabajos previos han demostrado también que los
anticuerpos anti-TGF\beta_{1} pueden reducir la
metástasis de tumor in vivo (Arteaga et al., J.
Clin. Invest. 92(6):2569-2576 (1993);
Hoefer y Anderer, 1995, ibid.;
Wojtowicz-Praga et al., 1996, ibid.).
Las conclusiones iniciales a partir de estos estudios sugieren que
la inmunosupresión inducida por el TGF\beta_{1} permitió la
metástasis de estos xenoinjertos de tumor. No obstante, un artículo
reciente sugiere que el TGF\beta_{1} podría potenciar
directamente el potencial invasor y metastásico de las células (Hojo
et al., Nature 397:530-534 (1999)).
La ciclosporina induce de forma dependiente de la dosis la
liberación del TGF\beta_{1} a partir de células de
adenocarcinoma pulmonar humano en cultivo, sin embargo, el mecanismo
de producción del TGF\beta_{1} por parte de la ciclosporina no
se conoce. El tratamiento de células de adenocarcinoma con
ciclosporina (o TGF\beta_{1}) resulta en el arrugado de la
membrana, la formación de seudópodos, el crecimiento independiente
del anclaje (invasor) y la motilidad. Un anticuerpo
anti-TGF\beta_{1} inhibe in vitro estos
cambios de morfología y motilidad celular. Se efectuaron
observaciones similares para adenocarcinoma de células renales,
para células epiteliales de la glándula mamaria, y células
pulmonares epiteliales del pulmón de visón. En ratones
beige-SCID inmunodeficientes (deficientes en
células T, células B, células NK), la ciclosporina incrementó el
número de metástasis a continuación de la incubación (i.v.) de
células de adenocarcinoma de células renales de ratón, de carcinoma
pulmonar de Lewis, o de cáncer de vejiga humana. El tratamiento con
el anticuerpo neutralizador
anti-TGF\beta_{1,2,3}, 1D11.16 (200 \mug por
día, dosis inicial 1 día antes de la inoculación con células
tumorales) redujo significativamente el número de metástasis
pulmonares en ratones tratados con ciclosporina (hasta niveles
inferiores a los del grupo control no tratado con ciclosporina).
Por tanto, parece ser que la ciclosporina puede, a través de una
acción dependiente de la producción de TGF\beta_{1}, incrementar
la invasión y metástasis en modelos animales con independencia del
sistema inmune del huésped (Hojo et al., 1999,
ibid.).
La evidencia procedente de los modelos in
vitro e in vivo sugiere que el TGF\beta_{1} puede
potenciar la formación del tumor utilizando tres mecanismos
principales: la angiogénesis, la inmunosupresión y los cambios
fenotípicos de células tumorales para incrementar el comportamiento
invasor y metastásico. Por tanto, se esperaría que la inhibición del
TGF\beta_{1} inhibiera el cáncer en humanos y, en una única
molécula, proporcionara una terapia anti-cáncer
combinada.
Los cánceres en los que se ha implicado el
TGF\beta_{1} incluyen los cánceres de mama, próstata, ovario,
estómago, colorectal, de piel, pulmón, cervical y de vejiga, así
como varias leucemias y sarcomas, tales como el Sarcoma de Kaposi.
En consecuencia, los anticuerpos de la invención podrían
administrarse para el tratamiento de cánceres en los que el
TGF\beta_{1} está implicado, bien en la angiogénesis, en la
metástasis o en la progresión del tumor, incluyendo los cánceres de
las condiciones anteriores. Por supuesto, se apreciará que en el
contexto de la terapia del cáncer, "tratamiento" incluye
cualquier intervención médica que resulta en una ralentización del
crecimiento del tumor o una reducción en la metástasis del tumor,
así como en la remisión parcial del cáncer con objeto de prolongar
la esperanza de vida de un paciente.
La terapia con anticuerpo para el tratamiento del
cáncer es un tratamiento establecido en la técnica. Actualmente,
hay tres anticuerpos anti-cáncer autorizados para
su uso clínico en los Estados Unidos de Norteamérica y/o Europa
(Panorex para el tratamiento del cáncer colorectal, Rituxan para el
linfoma de células-B, y Herceptin para el cáncer de
mama), además de otros numerosos anticuerpos
anti-cáncer actualmente en ensayos clínicos de la
Fase I, II o III. Estos anticuerpos se usan a menudo en la última
etapa del tratamiento y se consideran efectivos según el criterio
del parágrafo precedente, así como, en algunos casos,
proporcionando una total remisión del tumor.
En consecuencia, los aspectos adicionales de la
invención proporcionan procedimientos de tratamiento que comprenden
la administración de un miembro de unión específica según tal como
se proporcionan, composiciones farmacéuticas que comprenden tal
miembro de unión específica, y el uso de tal miembro de unión
específica en la fabricación de un medicamento para su
administración, por ejemplo, en un procedimiento de fabricación de
un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el
miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
De acuerdo con la presente invención, las
composiciones proporcionadas podrían administrarse a individuos. La
administración lo es preferiblemente en una "cantidad
terapéuticamente aceptable", siendo esta suficiente para mostrar
un beneficio para un paciente. Tal beneficio podría ser al menos
una mejora de al menos un síntoma. La cantidad actual administrada,
y la velocidad y programa de administración, dependerán de la
naturaleza y gravedad de lo que se está tratando, La prescripción
del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre dosificación, etc,
se halla dentro de las responsabilidades del médico practicante y
otros doctores médicos. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien
conocidas en la técnica; consultar Ledermann, J.A., et al.,
Int. J. Cancer 47:659-664 (1991); Bagshawe,
K.D., et al., Antibody, Immunoconjugates and
Radiopharmaceuticals 4:915-922 (1991).
Una composición podría administrarse sola o en
combinación con otros tratamientos, bien simultánea o
secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar.
Los anticuerpos de la presente invención podrían
administrarse a un paciente que precisa un tratamiento a través de
cualquier ruta apropiada, usualmente mediante inyección en la
circulación sanguínea o directamente en el sitio a tratar, por
ejemplo, córnea, herida, tumor, etc. La dosis precisa dependerá de
un cierto número de factores, incluyendo si el anticuerpo es para
diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y ubicación del área a
tratar (por ejemplo, herida), la naturaleza exacta del anticuerpo
(por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la
naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al
anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el rango de 0,5
mg a 100 g para aplicaciones sistémicas, tales como el tratamiento
de la fibrosis en la glomerulonefritis o
en el tratamiento de cánceres, y de 10 \mug a 1 mg para aplicaciones locales, tales como el tratamiento de la cicatri-
zación dérmica. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, preferiblemente del isotipo IgG4. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, la cual podría ajustarse proporcionalmente para niños y
adolescentes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción a su peso molecular. Los tratamientos podrían repetirse diariamente, dos veces por semana, semanalmente o a intervalos de meses, a la discreción del médico.
en el tratamiento de cánceres, y de 10 \mug a 1 mg para aplicaciones locales, tales como el tratamiento de la cicatri-
zación dérmica. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, preferiblemente del isotipo IgG4. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, la cual podría ajustarse proporcionalmente para niños y
adolescentes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción a su peso molecular. Los tratamientos podrían repetirse diariamente, dos veces por semana, semanalmente o a intervalos de meses, a la discreción del médico.
Actualmente se prefiere el uso de un anticuerpo
entero del isotipo IgG4 para las aplicaciones sistémicas y locales,
pero para las aplicaciones locales podría ser particularmente
valioso un anticuerpo scFv.
Los miembros de unión específica de la presente
invención usualmente se administrarán en forma de una composición
farmacéutica, la cual podría comprender al menos un componente
además del miembro de unión específica.
Por tanto, las composiciones farmacéuticas
acordes con la presente invención, y para su uso de acuerdo con la
presente invención, podrían comprender, además del ingrediente
activo, una excipiente, portador, tampón, estabilizador u otro
material farmacéuticamente aceptable bien conocidos por los
especialistas en la técnica. Tales materiales no deberían ser
tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente
activo. La naturaleza precisa del portador u otro material
dependerá de la ruta de administración, la cual podría ser oral, o
mediante inyección, por ejemplo, intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para
administración oral podrían estar en forma de tableta, cápsula,
polvo o líquido. Una tableta podría comprender un portador sólido,
tal como la gelatina, o un adyuvante. Las composiciones
farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido
tal como el agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite
mineral o aceite sintético. Podrían incluirse la solución salina
fisiológica, la solución de dextrosa u otro sacárido, o glicoles
tales como el etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol. Las
formulación como gotas para los ojos también podría ser valiosa para
la prevención y tratamiento de la fibrosis o cicatrización
ocular.
Para la inyección intravenosa, o para la
inyección en el sitio de lesión, el ingrediente activo estará en
forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, la cual
está libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad
apropiados. Aquellos con formación suficiente en la técnica están
capacitados para preparar soluciones apropiadas usando, por ejemplo,
vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro Sódico, la
Inyección de Ringer, la Inyección de Ringer con Lactato.
Según se precise, podrían incluirse conservantes,
estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.
El anticuerpo podría administrarse a partir de un
sistema de suministro continuado para prevenir la fibrosis, o
podría depositarse sobre dispositivos prostéticos, tales como
recambios de cadera, para prevenir el desarrollo de fibrosis
asociado con su inserción.
Una composición podría administrarse sola o en
combinación con otros tratamientos, bien simultánea o
secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar. Otros
tratamiento podrían incluir la administración de dosis apropiadas
de fármacos calmantes, como los fármacos antiinflamatorios no
esteroideos (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o
cetoprofeno), u opiáceos tales como la morfina, o antiheméticos.
La presente invención proporciona un
procedimiento que comprende causar o permitir la unión de un
miembro de unión específica, tal como se proporciona en ésta, al
TGF\beta_{1}. Tal como se ha destacado, tal unión podría tener
lugar in vivo, por ejemplo, a continuación de la
administración de un miembro de unión específica, o un ácido
nucleico que codifica un \mue, o podría tener lugar in
vitro.
La cantidad de unión del \mue al
TGF\beta_{1} podría determinarse. La cuantificación podría
relacionarse con la cantidad de TGF\beta_{1} en una muestra de
ensayo, la cual podría ser de interés diagnóstico, por ejemplo, la
medición del TGF\beta_{1} se ha propuesto también como un
indicador de la ateroesclerosis, estando correlacionadas las bajas
concentraciones con la ateroesclerosis avanzada.
Las reactividades de los anticuerpos con una
muestra podrían determinarse mediante cualesquier medios
apropiados. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad.
El TGF\beta_{1} marcado radiactivamente se
mezcla con TGF\beta_{1} sin marcar (la muestra de ensayo) y se
deja unir al anticuerpo. El TGF\beta_{1} unido se separa
físicamente del TGF\beta_{1} no unido y se determina la
cantidad de TGF\beta_{1} radiactivo unido al anticuerpo. Cuanto
más TGF\beta_{1} hay en la muestra de ensayo menos
TGF\beta_{1} radiactivo se unirá al anticuerpo. También podría
usarse un ensayo de unión competitivo con TGF\beta_{1} no
radiactivo, usando TGF\beta_{1} o un análogo del
TGF\beta_{1} unido a una molécula informadora. La molécula
informadora podría ser un fluorocromo, un fósforo o un colorante de
láser con características de emisión y absorción espectralmente
aisladas. Los fluorocromos apropiados incluyen la fluoresceína, la
rodamina, la ficoeritrina, y el Rojo de Texas. Los colorantes
cromogénicos apropiados incluyen la diaminobencidina.
Otros informadores incluyen partículas coloidales
macromoleculares o material formado de partículas, tal como cuentas
de látex, que están coloreados, son magnéticos o paramagnéticos, y
agentes biológica o químicamente activos que pueden directa o
indirectamente causar señales detectables para ser observada
visualmente, detectadas electrónicamente, o registradas de otro
modo. Estas moléculas podrían ser enzimas que catalizan reacciones
que, por ejemplo, desarrollan o cambian colores, o causan cambios
en las propiedades eléctricas. Podrían ser molecularmente
excitables, de tal forma que las transiciones electrónicas entre
estados de energía resultan en absorciones o emisiones espectrales
características. Podrían incluir entidades químicas usadas
conjuntamente con biosensores. Podrían emplearse los sistemas de
detección biotina/avidina o biotina/estreptoavidina y fosfatasa
alcalina.
Las señales generadas por conjugados individuales
de anticuerpo-informador podrían usarse para
derivar datos cuantificables absolutos o relativos de la unión del
anticuerpo relevante en muestras (normales y de ensayo).
La presente invención también proporciona el uso
de un \mue como más arriba para medir los niveles de
TGF\beta_{1} en un ensayo de competición, es decir, un
procedimiento para medir el nivel de TGF\beta_{1} en una muestra
empleando un \mue, tal como se proporciona mediante la presente
invención, en un ensayo de competición. Esto podría ser cuando no
se requiere la separación física del TGF\beta_{1} unido del no
unido. Una posibilidad es uniendo una molécula informadora al
\mue de tal forma que con la unión ocurra un cambio físico u
óptico. La molécula informadora podría directa o indirectamente
generar señales detectables y preferiblemente medibles. La unión de
moléculas informadoras podría hacerse directa o indirectamente,
covalentemente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico, o no
covalentemente. La unión a través de un enlace peptídico podría ser
a resultas de la expresión recombinante de un gen de fusión que
codifica el anticuerpo y la molécula informadora.
La presente invención también proporciona la
medición de niveles de TGF\beta_{1} directamente, empleando un
\mue de acuerdo con la invención, por ejemplo, en un sistema
biosensor.
El modo de determinar la unión no es una
característica de la presente invención, y los especialistas en la
técnica son capaces de escoger un modo apropiado de acuerdo con su
preferencia y conocimiento general.
La presente invención se extiende además hasta un
\mue que compite por la unión con el TGF\beta_{1} con
cualquir \mue que se una a TGF\beta_{1} y comprenda un
dominio V, incluyendo un CDR con los aminoácidos sustancialmente
tal como se detallan en ésta, o un dominio V con una secuencia de
aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta. La
competición entre los miembros de unión podría ensayarse in
vitro, por ejemplo, etiquetando con una molécula informadora
específica un miembro de unión, el cual puede detectarse en
presencia de otro(s) miembro(s) no
\hbox{marcado(s),}para permitir la identificación de miembros de unión específica que se unen al mismo epítopo o a un epítopo que se solapa. La competición podría determinarse usando, por ejemplo, el ELISA de TGF\beta_{1} tal como se describe en el Ejemplo 1.
Los miembros de unión específica preferidos para
el TGF\beta_{1} compiten por la unión al TGF\beta_{1} con
el CAT-191, el CAT-192 y/o el
CAT-193.
Las realizaciones preferidas neutralizan
fuertemente el TGF\beta_{1}, y tienen una potencia al menos 5
veces mejor que la del CS37, más preferiblemente aproximadamente 10
veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces o 150
veces mejor, en un ensayo de radioreceptor (Lucas, C., et
al., Meth. in Enzymology 198:303-316
(1991)). La potencia se mide con el anticuerpo objeto de estudio y
el CS37 en formatos moleculares equivalentes, por ejemplo, como
anticuerpos monovalentes (scFv o Fab) o como anticuerpos bivalentes
(IgG1 o IgG4).
En un aspecto, un \mue acorde con la presente
invención une un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de
los residuos 92-98 del TGF\beta_{1} (el mismo
epítopo que el CS37).
Al ensayar esto, podría emplearse un péptido con
esta secuencia más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Un
péptido tal podría decirse que "esencialmente consiste" en la
secuencia especificada. Los miembros de unión específica acordes con
la presente invención también podría ser tales que su unión por el
TGF\beta_{1} fuera inhibida por un péptido con o incluyendo la
secuencia dada. Al ensayar esto, podría emplearse un péptido con
cualquier secuencia más uno o más aminoácidos.
Los miembros de unión específica que se unen a un
péptido específico podrían aislarse, por ejemplo, a partir de una
biblioteca de exhibición sobre fagos mediante cribado con
el(los) péptido(s).
La presente invención proporciona además un ácido
nucleico aislado que codifica un miembro de unión específica de la
presente invención. El ácido nucleico incluye el ADN y el ARN. En
un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido
nucleico que codifica un CDR o el dominio VH o VL de la invención,
tal como se ha definido más arriba.
La presente invención también proporciona
construcciones en forma de plásmidos, vectores, cassettes de
transcripción o expresión, los cuales comprenden al menos un
polinucleótido como más arriba.
La presente invención también proporciona una
célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones
como más arriba. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR,
dominio VH o VL, o miembro de unión específica tal como se
proporciona, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención,
al igual que lo hace un procedimiento para la producción del
producto codificado, procedimiento que comprende la expresión a
partir del ácido nucleico que lo codifica. La expresión podría
conseguirse convenientemente cultivando en las condiciones
apropiadas células huésped recombinantes que contiene el ácido
nucleico. A continuación de la producción mediante expresión, podría
aislarse y/o purificarse un dominio VH o VL, o un \mue, usando
cualquier técnica apropiada, y usarse a continuación según sea
apropiado.
Los miembros de unión específica, los dominios VH
y/o VL, y las moléculas de ácido nucleico codificante, y los
vectores acordes con la presente invención podrían proporcionarse
aislados y/o purificado, por ejemplo, a partir de su entorno
natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso
del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico
o genes con origen distinto del de la secuencia que codifica un
polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico acorde con
la presente invención podría comprender ADN o ARN, y podría ser
total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia
nucleotídica tal como se detalla en ésta abarca una molécula de ADN
con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la
secuencia especificada, en la cual U es sustituida por T, a menos
que el contexto requiera otra cosa.
Los sistemas para la clonación y expresión de un
polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien
conocidos. Las células huésped apropiadas incluyen las bacterias,
las células de mamíferos, las levaduras, y los sistemas de
baculovirus. Las líneas de células de mamífero disponibles en la
técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen las
células ováricas de hámster chino, las células HeLa, las células
renales de cría de hámster, las células del melanoma de ratón NSO,
y muchas otras. Un huésped bacteriano común preferido es E.
coli.
La expresión de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos en células procariotas tales como E. coli está
bien establecida en la técnica. Para una revisión, consultar, por
ejemplo, Plückthun, A., Bio/Technology
9:545-551 (1991). La expresión en células
eucariotas en cultivo también está disponible para aquéllos
especialistas en la técnica como una opción para la producción de un
miembro de unión específica, para revisiones recientes consultar,
por ejemplo, Reff, M.E., Curr. Opinion Biotech.
4:573-576 (1993); Trill, J.J. et al.,
Curr. Opinion Biotech. 6:553-560 (1995).
Los vectores apropiados pueden escogerse o
construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas,
incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras,
secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes
marcadores, y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores
podrían ser plásmidos, virales, por ejemplo fagos o fagémidos,
según sea apropiado. Para detalles adicionales consultar, por
ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido
nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido
nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción del ADN en las
células, y expresión de genes, y análisis de proteínas, se
describen con detalle en Short Protocols in Molecular
Biology, segunda edición, Eds. Ausubel et al., John Wiley
& Sons, 1992. Los descubrimientos de Sambrook et al. y
Ausubel et al. se incorporan en ésta por referencia.
Por tanto, un aspecto adicional de la presente
invención proporciona una célula huésped que contiene ácido
nucleico tal como se descubre en ésta. Todavía un aspecto ulterior
proporciona un procedimiento que comprende introducir tal ácido
nucleico en una célula huésped. La introducción podría emplear
cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las
técnicas apropiadas podrían incluir la transfección con fosfato
cálcico, el DEAE-dextrano, la electroporación, la
transfección mediada por liposomas, y la transducción usando
retrovirus u otros virus, por ejemplo, el virus de la viruela vacuna
o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas,
las técnicas apropiadas podrían incluir la transformación con
cloruro de calcio, la electroporación y la transfección usando
bacteriófagos.
La introducción podría seguirse causando o
permitiendo la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo,
cultivando las células huésped en condiciones para la expresión del
gen.
En una realización, el ácido nucleico de la
invención se integra en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la
célula huésped. La integración podría promoverse mediante la
inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el
genoma, de acuerdo con las técnicas estándares.
La presente invención también proporciona un
procedimiento que comprende usar una construcción, tal como se
menciona más arriba, en un sistema de expresión con objeto de
expresar un \mue o un polipéptido como más arriba.
Los siguientes ejemplos ilustran aspectos y
realizaciones de la presente invención.
Los presentes inventores han identificado los CDR
de anticuerpo y los dominios VH y VL relacionados con los del
anticuerpo CS37 descubierto en WO97/13.844, pero con
inesperadamente buenas propiedades.
La secuencia del dominio VH del CS37 (31G9) y el
ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en
la SEC. Nº ID.: 2 y SEC. Nº ID.: 1.
La secuencia del dominio VH del SL15 (también
conocido como KYLIE) de la presente invención y el ácido nucleico
que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº
ID.: 4 y SEC. Nº ID.: 3.
Las secuencias de los respectivos CDR3 del VH se
muestran en la Tabla 1, también la Tabla 2 incluye las secuencias
de los CDR1 y CDR2 para ambos dominios VH y VL.
La comparación de los dominios VH del CS37 (31G9)
y del SL15 (Kylie) muestran tres diferencias adicionales en los
residuos estructurales, en los residuos 1 (glutamina en el CS37 a
glutamato en el SL15), 6 (glutamina en el CS37 aglutamato en el
SL15), y 44 (glicina en el CS37 a glutamato en el SL15).
El dominio VH del SL15 podría emparejarse con
diferentes dominios VL, y se han identificado dos variantes tales
del SL15. Una, conocida como SL15A, incluye el VL del CS37. La
otra, conocida como SL15S, incluye un VL que corresponde al VL del
CS37 excepto por la presencia de serina en el residuo 25 en el SL15S
en comparación con la alanina en el SL15A (CS37).
La secuencia del dominio VL del SL15A (CS37) y el
ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en
la SEC. Nº ID.: 6 y SEC. Nº ID.: 5.
La secuencia del dominio VL del SL15S y el ácido
nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la
SEC. Nº ID.: 8 y SEC. Nº ID.: 7.
La secuencia del dominio VH del JT182 (CS37) y el
ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en
la SEC. Nº ID.: 10 y SEC. Nº ID.: 9.
El scFv del SL15S, el scFv del CS37, y un
anticuerpo relacionado, el JT182, se examinaron como sobrenadantes
de fagos en ensayos ELISA por su capacidad para unir el
TGF\beta_{1}. La placas de ELISA (96 pocillos; Falcon) estaban
sin recubrir, o recubiertas con TGF\beta_{1} recombinante (0,2
\mug/ml). Los fagos que se unieron específicamente a la placa
recubierta con antígeno se detectaron usando un antisuero
anti-fd de oveja (Pharmacia) seguido por
anti-oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma)
y p-nitrofenilfosfato (pNPP) como sustrato
(Sigma).
Los fragmentos de scFv se ensayaron
subsiguientemente por su capacidad para neutralizar la unión de
^{125}I-TGF\beta_{1} a células A549 en un
ensayo de unión a radioreceptor (RRA), usando el protocolo descrito
en el Ejemplo 3 (ver más abajo). Para el RRA, los clones
individuales se expresaron como scFv soluble y se purificaron
subsiguientemente a partir de preparaciones periplásmicas mediante
cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) seguida por
fraccionamiento del scFv monomérico mediante FPLC de filtración en
gel con una columna Superdex 75 (Pharmacia).
El scFv del SL15S (VH del SL15/VL del SL15) tiene
la potencia de neutralización más elevada en el RRA, dando una
IC_{50} de 100 pM, la cual es al menos 100 veces mejor que la del
CS37. La especificidad completa del scFv del SL15 por la isoforma
TGF\beta_{1} ha sido confirmada en el ensayo con TF1, en donde
no se ha detectado interacción alguna con el TGF\beta_{2} o
TGF\beta_{3}.
Los anticuerpos scFv del SL15S (VH del SL15/VL
del SL15; CAT-191, también conocido como scFv de
Kylie) y el SL15A (VH del SL15/VL del CS37) se convirtieron en
anticuerpos completos.
Para la construcción de líneas celulares que
expresaran IgG4 humana y anticuerpos K, los dominios variables de
la cadena pesada y ligera del scFv del SL15 se clonaron en vectores
de expresión en mamíferos que contenían respectivamente los dominios
constantes de IgG4 humana y kappa humana. Se prepararon dos
versiones, IgG4 SL15A (CAT-192) e IgG4 SL15S
(CAT-193). Los anticuerpos también se denominan IgG
de Kylie.
El VH procedente del ADN del scFv del SL15S se
amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos P80 (SEC. Nº ID.:
25) y P64 (SECID 22), y se unieron mediante PCR de solapamiento con
un fragmento de ADN de 159 p.b. que contenía una secuencia señal,
sitios de empalme, y el intrón procedente del M13VHPCR1 (Orlandi,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:3833-3837 (1989)) usando los oligonucleótidos
P10 (SECID 20) y P64 (SECID 22). El producto de 558 p.b. de la PCR
se cortó con HindIII y ApaI y se clonó en pGamma4 (obtenido de Lonza
Biologics) cortado con HindIII-ApaI. El ADN ligado
se transformó en E. coli TG1 y se examinaron las colonias
resistentes a la ampicilina. Se identificó un plásmido con la
inserción correcta y se denominó pKylieVH\gamma4.
El V\kappa procedente del ADN del scFv del CS37
o del scFv del SL15S se amplificó mediante PCR con los
oligonucleótidos P65 (SEC. Nº ID.: 23) y P66 (SECID 24), y se
unieron mediante PCR de solapamiento con un fragmento de ADN de 168
p.b. que contenía una secuencia señal, sitios de empalme, y el
intrón procedente del M13VKPCR1 (Orlandi, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837 (1989))
usando los oligonucleótidos P11 (SECID 21) y P66 (SECID 24). El
producto de 510 p.b. de la PCR se cortó con BstBI y BsiWI y se clonó
en pMR15.1 cortado con BstBI-BsiWI. El ADN ligado
se transformó en E. coli TG1 y se examinaron las colonias
resistentes a la ampicilina. Se identificó un plásmido con la
inserción correcta y se denominó pCS37\kappa o pKylie\kappa.
Para cada variante del Kylie se construyó un
plásmido sencillo que contenía ambos, los ADN de la cadena pesada y
ligera, y el marcador seleccionable gs. El vector de la cadena
pesada, pKylieVH\gamma4, se digirió con BamHI y NotI, y se
purificó el fragmento de 4497 p.b. que contenía el ADN de la cadena
H. El vector de la cadena ligera, pCS37\kappa o pKylie\kappa,
se cortó de igual forma con BamHI y NotI, y se aisló el fragmento
de 9611 p.b. que contenía el ADN de la cadena L. Los dos fragmentos
purificados se ligaron juntos, se transformaron en células de E.
coli TG1 y se examinaron las colonias resistentes a la
ampicilina. Se identificó un plásmido con las inserciones correctas
y las regiones V se confirmaron mediante secuenciación. El vector
de expresión final se denominó pKylie4\gammas. Se prepararon dos
versiones conteniendo el VL del SL15S y el VL del CS37.
La IgG4 SL15S y la IgG4 SL15A se expresaron en la
línea celular de mieloma de ratón NS0 (ECEACC 85110503). Se
linearizaron cincuenta \mug de pKylie4\gammas mediante
digestión con Pvul, se precipitaron con etanol, y se disolvieron en
100 \mul de agua. Se lavaron 10^{7} células NS0 en PBS, se
resuspendieron en 0,9 ml de PBS, se mezclaron con el ADN vector, y
se mantuvieron en hielo durante 5 minutos. A continuación, se
electroporaron las células con un único pulso de 250 V a 960
\muFd, y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Las células
transfectadas se añadieron entonces a 30 ml de medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía glutamina 2 mM y un 10%
de suero fetal bovino (FCS) dializado, tal como se describe en
Bebbington et al., Bio/Technology
10:169-175 (1992), y se distribuyeron alícuotas de
50 \mul en placas de 6\times96 pocillos. 24 horas más tarde, se
añadió DMEM sin glutamina/10% de FCS (Bebbington et al.,
1992) a cada pocillo.
De tres a seis semanas después de la
transfección, se examinaron las colonias mediante ELISA por su
capacidad para secretar IgG humana. Los pocillos de las placas de
ELISA (Immulon 4, Dynatech) se recubrieron en bicarbonato/carbonato
sódico 50 mM, pH 9,6, con 100 ng por pocillo de anticuerpos IgG
anti-humanos de cabra (Harlan). El sobrenadante de
los pocillos que contenían colonias transfectadas se añadió a los
pocillos en PBS que contenía un 0,05% (v/v) de Tween 20 (PBST)
durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y la IgG
humana capturada se detectó con 100 \mul de una dilución 1:2000 de
anticuerpos kappa anti-humanos de cabra conjugados
con peroxidasa de rábano silvestre (HRP) en PBST (Harlan).
Transcurridos 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las
placas 3\times con PBST y se añadieron 100 \mul de sustrato OPD.
Las reacciones se detuvieron después de 5-10
minutos mediante la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico al
12,5% (v/v) y se midió la A 490 nm.
Los transfectantes que secretaban las mayores
cantidades de IgG se expandieron para su crecimiento en medio sin
glutamina en FCS reducido, en FCS libre de gammaglobulina, o sin
FCS. Las líneas celulares se clonaron subsiguientemente mediante
dilución limitada.
Los anticuerpos IgG4 humanos se purificaron
mediante cromatografía de afinidad con proteína A, seguida por
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). El sobrenadante
procedente del cultivo de células NS0 transfectadas que secretaban
IgG se clarificó mediante centrifugación y filtración a través de
una membrana de 0,22 \mum. Se equilibró con NaCl 0,3 M, fosfato
sódico 50 mM, pH 8,0, una columna con matriz de protein A Sepharose
Fast Flow (Pharmacia) y se aplicó el sobrenadante. A continuación
se lavó extensivamente la columna con fosfato sódico 50 mM, pH 8,0.
La IgG humana se eluyó con glicina 0,1 M-HCl pH 3,0.
Las fracciones eluidas se neutralizaron con Tris HCl 1 M, pH 9,0, y
las fracciones que contenían proteína se identificaron midiendo la
absorbancia a 280 nm. La purificación mediante SEC fue con una
columna Superdex 200 en PBS. La IgG se concentró finalmente mediante
diafiltración frente a PBS libre de pirógenos usando un filtro YM30
MWCO (Amicon).
La potencia de neutralización del
TGF\beta_{1} se midió para el scFv del SL15S (scFv del Kylie) y
sus derivados usando un ensayo de radioreceptor y un ensayo de
proliferación celular (TF1).
El ^{125}I-TGF\beta_{1} fue
proporcionado por Amersham (rango de actividad específica
800-2200 Ci/mmol). El TGF\beta_{1},
\beta_{2}, \beta_{3}, TGF\beta_{1} latente,
GM-CSF e IL-5 se obtuvieron de
R&D Systems (Minneapolis, EE.UU.). El mAb de ratón de Genzyme
contra los TGF\beta_{1}, \beta_{2} y \beta_{3} se
obtuvo de Genzyme (Cambridge, MA, EE.UU.). La línea celular TF1 fue
proporcionada por Robin Thorpe (NIBSC, R.U.) y se cultivó tal como
se detalla más abajo. La línea celular de carcinoma epitelial de
pulmón humano se obtuvo de la ATCC y se cultivó en DMEM con 10% de
FCS y glutamina 2 mM. Todos los otros reactivos fueron
proporcionados por Sigma.
Se sembraron células A549 en placas de 24
pocillos a 2\times10^{5} células por pocillo durante 24 horas
con objeto de conseguir >90% de confluencia. Inmediatamente
antes del ensayo, las monocapas se lavaron dos veces con tampón
(1:1 DMEM:Hams-F12) y con 0,5 ml de tampón de ensayo
(1:1 DMEM:Hams-F12 + 0,1% de BSA). Se prepararon
diluciones en serie de dos o tres veces en tampón de ensayo y se
añadieron a un volumen igual de [^{125}I]TGF\beta_{1}
40 pM en tampón de ensayo.
Después de 1 hora a temperatura ambiente, se
añadieron 0,5 ml de esta mezcla de
anticuerpo/[^{125}I]TGF\beta_{1} por duplicado a las
células (que ya estaban en 0,5 ml de tampón de ensayo), y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC. La concentración final de
[^{125}I]TGF\beta_{1} fue de 10 pM. Se incluyeron
controles como unión máxima (a células, sin anticuerpo) y unión
mínima (pocillos incubados con el tampón pero sin células) al menos
por triplicado.
Las placas finales se lavaron 4\times con PBS
enfriado en hielo antes de añadir 0,8 ml de tampón de
solubilización (Tris 25 mM, pH 7,5, 10% de glicerol, 1% de
Triton-X100). Las placas se dejaron durante al menos
20 minutos sobre una plataforma de agitación antes de contar el
contenido de cada pocillo usando un contador de gamma.
Los datos se expresaron, después de restar de la
unión mínima, como % de la unión máxima.
En el estudio con el TGF\beta_{1} latente, el
% del máximo se calculó para cada conjunto de condiciones (por
ejemplo, en presencia de TGF\beta_{1} latente, de
TGF\beta_{1} latente activado con ácido, o de TGF\beta_{1}
activo).
(Lucas, C., et al., Meth. in
Enzymology 198:303-316 (1991))
Las células TF1 se cultivaron rutinariamente en
RPMI1640 que contenía un 5% de FCS y glutamina 2 mM (medio de
cultivo) con 2 ng/ml de GM-CSF. Inmediatamente
antes del experimento, las células se lavaron dos veces y se
resuspendieron a 4\times10^{5} células/ml en medio fresco
suplementado con 4 ng/ml de IL-5, bien con o sin
TGF\beta_{1}, \beta_{2} o \beta_{3} (cada uno a 50 pM)
y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a placas de 96 pocillos.
Las preparaciones de scFv usadas en este ensayo eran fracciones
purificadas mediante FPLC, las cuales tenían la endotoxina
suprimida.
Los anticuerpos (series de dilución por dos
veces) se prepararon en medio de cultivo, y se añadieron 100 \mul
a las células por duplicado. Los controles fueron células sólo con
TGF\beta (sin anticuerpo, máxima inhibición del crecimiento) y
células sin TGF\beta y sin anticuerpo (inhibición mínima). Las
células se incubaron durante 48 horas a 37ºC.
Al final del ensayo se ensayó el número de
células usando CellTiter96 (Promega) y los datos se expresaron como
% de neutralización, es decir:
%
neutralización = \frac{\text{(valor del ensayo - inhibición
máxima)}}{\text{(inhibición mínima - inhibición máxima)}}
x100
En el estudio del TGF\beta_{1} latente, los
datos se expresaron como % del control (crecimiento en ausencia de
TGF\beta_{1}), como la cantidad de TGF\beta_{1} activo en
cada condición de ensayo cambiada.
(Randall, L.A., et al., J. Immunol.
Meth. 164:61-67 (1993)).
Los anticuerpos scFv y los anticuerpos IgG4 se
prepararon y purificaron tal como se describe más arriba.
Se investigó la capacidad del scFv del SL15S
(CAT-191) para reconocer el TGF\beta_{1} pero
no el TGF\beta_{2} o \beta_{3} en el ensayo con TF1.
El scFv del SL15S (también conocido como scFv del
Kylie) neutralizó la inhibición del crecimiento inducida por el
TGF\beta_{1}, pero no la inducida por el TGF\beta_{2} o
TGF\beta_{3} (Figura 1). Como control se usó un anticuerpo
monoclonal, el Mab 1.D.11.15 de Genzyme (Genzyme, Dasch, J.R. et
al., J. Immunol. 142:1536-1541 (1989)),
el cual neutraliza el TGF\beta_{1}, TGF\beta_{2}, y
TGF\beta_{3}. Se ha visto que el Mab 1.D.11.16 es efectivo en
modelos de fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por radiación
(Barcellos-Hoff, patente estadounidense nº
5.616.561, 1997) y de la artritis reumatoide (Wahl et al.,
J. Exp. Medicine 177:225-230 (1993)). El
scFv del SL15S muestra una potencia comparable a la del Mab
1.D.11.16 de Genzyme control contra el TGF\beta_{1}.
La actividad de la IgG4 del SL15A
(CAT-192, también denominada IgG4 de Kylie) también
se observó en el ensayo con TF1 (Figura 5B) en el estudio que usaba
TGF\beta_{1} latente.
La capacidad del scFv del SL15S parar reconocer
el TGF\beta_{1} y neutralizar la unión del TGF\beta_{1} a
células A549 se midió en un ensayo de radioreceptor.
En una comparación de his-preps
de scFv, el SL15S (Kylie) se comparó con los anticuerpos
progenitores CS37 y JT182 (Figura 2), y se halló que era de 100 a
150 veces y 10 veces más activo. El SL15 se reformateó como IgG en
dos formas, IgG4 de SL15A (CAT-192) e IgG4 de SL15S
(CAT-193). También se analizaron las preparaciones
purificadas de scFv de SL15S, IgG4 de SL15A, IgG4 de SL15S, y Mab
1.D.11.16 (mAb de Genzyme) (Figura 3).
El scFv del SL15S tenía una potencia comparable a
la del Mab 1.D.11.16 de Genzyme, el cual es efectivo en modelos
animales. En resumen, el scFv del SL15S es un anticuerpo altamente
potente, neutralizante para el TGF\beta_{1}, con valores de
IC_{50} en el rango de 0,03 a 0,1 nM.
Los experimentos descritos en este ejemplo
demostraron que el scFv del SL15S y la IgG4 del SL15A se unen a y
neutralizan el TGF\beta_{1} activo, pero no el latente.
El TGF\beta_{1} latente es la forma
biológicamente inactiva en la cual el TGF\beta_{1} se secreta
de las células, y está compuesto por un dímero de péptido asociado
a latencia (consistente en dos monómeros de 249 aminoácidos) y un
dímero de TGF\beta_{1} maduro (consistente en dos monómeros de
112 aminoácidos). El TGF\beta_{1} latente no es reconocido por
los receptores del TGF\beta de la superficie celular.
Se cree que el TGF\beta_{1} activo es
liberado por la acción de proteasas in vivo, las cuales
pueden ser imitadas por la acidificación in vitro.
El TGF\beta_{1} latente, tiene una ED50
descrita de 0,43 nM y 0,2 pM respectivamente antes y después de la
acidificación, tal como se ensayó en un ensayo de proliferación. El
TGF\beta_{1} activo tiene una ED50 en un ensayo de proliferación
de 2 pM. Presumiblemente, el efecto del TGF\beta_{1} latente
antes de la acidificación se debe a la presencia de algo de
TGF\beta_{1} activo. Esta actividad residual debe ser tenida en
cuenta en la interpretación de los resultados.
La potencia del scFv del SL15S y de la IgG4 del
SL15A se ensayó usando el ensayo de radioreceptor y el ensayo de
proliferación de TF1 en presencia de diferentes cantidades de
TGF\beta_{1} latente, TGF\beta_{1} activado con ácido, y
TGF\beta_{1} activo. Si los anticuerpos reconocen el
TGF\beta_{1} latente, su potencia debería reducirse. La
interpretación de ambos ensayos es complicada por el hecho de que
cualquier TGF\beta_{1} activo presente en la preparación
latente competirá con el [^{125}I]TGF\beta_{1} por la
unión y tendrá actividad biológica sobre las células.
El TGF\beta_{1} latente se activó con ácido
mediante la adición de 2 \mul de HCl 0,5 M a 1 ml de
TGF\beta_{1} latente durante 15 minutos, a temperatura
ambiente, a continuación se neutralizó con 43 \mul de NaOH 0,05
M/HEPES 0,01 M.
Los resultados muestran que en el ensayo de
radioreceptor no hay un efecto significativo del TGF\beta_{1}
latente (0,1 nM) sobre la potencia del scFv de SL15S (scFv de
Kylie) o el IgG4 de SL15A (IgG de Kylie), mientras que la activación
con ácido del TGF\beta_{1} latente, o una concentración
equivalente de TGF\beta_{1} activo, reduce la capacidad del
anticuerpo para neutralizar la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} (Figura 4).
El ensayo de proliferación de TF1 fue muy
sensible a la actividad del TGF\beta_{1} activo en la
preparación de TGF\beta_{1} latente. No obstante, se halló que
el scFv de SL15S o el IgG4 de SL15A eran capaces de neutralizar la
pequeña proporción de TGF\beta_{1} activo de la preparación
latente, y cuando el TGF\beta_{1} latente se activa con ácido lo
neutralizan efectivamente (Figura 5).
Por tanto, el SL15, en el formato scFv o IgG, se
une y neutraliza sólo el TGF\beta_{1} activo pero no el
latente, tal como se midió mediante ambos, el ensayo de
radioreceptor y el de neutralización de TF1.
En este ejemplo se determinó el epítopo sobre el
TGF\beta_{1} al cual se unen los anticuerpos CS37 y SL15S.
El TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} tienen
estructuras similares pero difieren en su afinidad de unión por el
repector del Tipo II del TGF\beta y su potencia en un cierto
número de ensayos biológicos (O.G. Ottmann y L.M. Pelus, J.
Immunol. 140:2661-2665 (1988); J.R. Merwin et
al., Am. J. Pathol. 138:37-51 (1991);
K.C. Flanders et al., Development
113:183-191 (1991); L. Suardet et al.,
Cancer Res. 52:3705-3712 (1992); Qian et
al., J. Biol. Chem. 271:30656-30662
(1996)) se han aprovechado de las diferencias en afinidad para
identificar los residuos clave implicados en la unión con alta
afinidad del TGF\beta_{1} al receptor del Tipo II. Esto se ha
realizado construyendo una serie de moléculas quiméricas entres el
TGF\beta_{1} y el TGF\beta_{2} para identificar aquellas
especies que retienen una unión al receptor con elevada afinidad
in vitro (Qian et al., ver más arriba) e in
vivo (J.K. Burmester et al., Growth Factors
15:231-242 (1998)). De esta forma, se identificó
que la región C-terminal abarcada por los residuos
83-112 del TGF\beta_{1} era suficiente para
retener una unión eficiente al receptor.
La comparación de las secuencias del
TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} identificó varias diferencias,
incluyendo un bucle consistente en los residuos
92-98, el cual incluye 4 diferencias de aminoácidos
entre el TGF\beta_{1} y el TGF\beta_{2}. Cuando estos
residuos del TGF\beta_{2} se introdujeron en el esqueleto del
TGF\beta_{1}, la unión al receptor se redujo enormemente,
identificando éstos como residuos clave en la interacción del
TGF\beta_{1} con el receptor del Tipo II.
Las moléculas quiméricas se usaron de forma
similar para cartografiar el sitio de unión del CS37 y scFv de
SL15S (CAT-191) sobre el TGF\beta_{1}. El
TGF\beta_{1}/\beta_{2} (83-112) corresponde
a la región N-terminal y central del
TGF\beta_{1} procedente de los residuos 1-82,
fusionados con la región C-terminal del
TGF\beta_{2} procedente de los residuos 83-112.
El TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112 corresponde
a la región N-terminal y central del
TGF\beta_{2} procedente de los residuos 1-82,
fusionados con la región C-terminal del
TGF\beta_{1} procedente de los residuos 83-112.
Finalmente, el TGF\beta_{1}-\beta_{2}
(40-112) corresponde a la región
N-terminal del TGF\beta_{1} procedente de los
residuos 1-39, y la región central y
C-terminal del TGF\beta_{2} procedente de los
residuos 40-112. Éstas se denominan en ésta como
1-1-2,
2-2-1 y
1-2-2 respectivamente, para reflejar
la composición relativa de las isoformas.
Estas tres moléculas junto con el
TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} se analizaron mediante la
inhibición de unión del scFv de SL15S y scFv de CS37 a
TGF\beta_{1} inmovilizado, tal como sigue.
Se prepararon fagos que exhibían el scFv de SL15S
o scFv de CS37 a partir de clones en pCANTAB6, mediante
superinfección con M13K07. Los fagos de precipitaron con PEG y se
resuspendieron en PBS que contenía 2% de Marvel. Los fagos (2,5 a
5\times10^{10} en 50 \mul) se añadieron durante 30 minutos a
un placa de ELISA previamente bloqueada y recubierta con
TGF\beta_{1} a 0,5 \mug/ml.
Para el análisis de inhibición, se usó la misma
concentración de fagos y una serie de diluciones de las
concentraciones de TGF\beta_{1} establecidas para cada una de
la moléculas quiméricas de TGF\beta descritas más arriba (obsequio
de J. Burmester, National Institutes of Health) y las isoformas
TGF\beta_{1} y \beta_{2}.
Estas se incubaron durante la noche a 4ºC antes
de añadirlas a la placa de ELISA. Los fagos que se unieron
específicamente a la placa recubierta con antígeno se detectaron
usando un antisuero anti-fd de oveja (Pharmacia)
seguido por inmunoglobulina anti-oveja conjugada con
fosfatasa alcalina (Sigma) y p-nitrofenilfosfato
(pNPP) como sustrato (Sigma).
El valor no inhibido (es decir, 0 nM) para el
Kylie fue de 1,67 (promedio de 3 lecturas) y para el CS37 fue de
1,216 (promedio de 7 lecturas). Los resultados mostrados en las
Figuras 6 y 7 indican que los epítopos reconocidos tanto por el scFv
de CS37 como por el scFv de SL15S residen entre los residuos
83-112 del TGF\beta_{1}. Más aún, la molécula
mutante TGF\beta_{1}-TGF\beta_{2}
(92-98) que comprende el TGF\beta_{1} con la
secuencia del TGF\beta_{2} desde los residuos
92-98 también inhibe la unión del scFv de CS37 y SL15S al TGF\beta_{1}, pero con efecto reducido, especialmente para el scFv de SL15S. Esto demuestra que al menos parte del epítopo reconocido por estos residuos de anticuerpo dentro de la región 92-98 (que tiene cuatro residuos, en las posiciones 92, 94, 95 y 98, que difieren entre el TGF\beta_{1} y el
TGF\beta_{2}).
92-98 también inhibe la unión del scFv de CS37 y SL15S al TGF\beta_{1}, pero con efecto reducido, especialmente para el scFv de SL15S. Esto demuestra que al menos parte del epítopo reconocido por estos residuos de anticuerpo dentro de la región 92-98 (que tiene cuatro residuos, en las posiciones 92, 94, 95 y 98, que difieren entre el TGF\beta_{1} y el
TGF\beta_{2}).
El TGF\beta_{1} ha sido implicado en la
modulación de la curación de cicatrices (tanto oculares como
dérmicas) y se ha observado que inhibe la velocidad de
re-epitelización corneal. Aquí se examinó el efecto
de la aplicación tópica de la IgG4 de SL15A
(CAT-192) sobre la velocidad de curación de heridas
epiteliales corneales usando un modelo de cultivo de órgano (D.M.
Foreman et al., Exp. Eye Res.
62:555-564 (1996)).
Se crearon heridas mediante excisión con trepano
(5 mm de diámetro, 250 \mum de profundidad) sobre córneas
bovinas. Los anillos de esclera corneales mantuvieron en un sistema
de cultivo de órganos con interficie con aire, libre de suero,
durante hasta 96 horas. En el momento de la herida, y dos días más
tarde, se añadieron gota a gota 100 \mul de medio de T8 libre de
suero sobre la superficie epitelial y limbus conteniendo: (i) 10
ng/ml de TGF\beta; (ii) 100 \mug/ml de mAb
anti-TGF\beta_{1}; (iii) una combinación de (i)
y (ii); (iv) 100 mug/ml de anticuerpo nulo (IgG4 de 2G6);
(v)
100 mg/ml de diluyente de anticuerpo; o (vi) sin adiciones (n=9 para cada grupo). La re-epitelización se verificó usando un sistema de análisis de imágenes y se expresó como porcentaje del área lesionada original cubierta por el epitelio.
100 mg/ml de diluyente de anticuerpo; o (vi) sin adiciones (n=9 para cada grupo). La re-epitelización se verificó usando un sistema de análisis de imágenes y se expresó como porcentaje del área lesionada original cubierta por el epitelio.
Las córneas control que recibieron medio solo,
anticuerpo nulo o diluyente de anticuerpo completaron la
re-epitelización transcurridas 72 horas. El
tratamiento con 100 \mug/ml de mAb anti-TGF\beta
incrementó la velocidad de re-epitelización de tal
forma que las córneas estaban completamente
re-epiteliadas a las 48 horas (Figura 8). Las
corneas tratadas con 10 ng/ml de TGF\beta_{1} presentaron una
re-epitelización retrasada en 24 horas, y este
efecto inhibidor fue suprimido por el mAb
anti-TGF\beta_{1} (Figura 9). Todas las
diferencias mencionadas son significativas (p > 0.05). Se realizó
la regresión lineal de los puntos experimentales entre las 2 y 48
horas (ver Figura 8) para determinar la velocidad de
re-epitelización. El CAT-192 causó
un incremento significativo en esta variable (Tabla 3). El análisis
histológico sustentó los resultados del análisis de imágenes, y
confirmó que la adición de mAb
anti-TGF\beta_{1} no afectaba adversamente la
arquitectura corneal.
Los resultados confirman el importante papel del
TGF\beta_{1} endógeno en la reparación del epitelio corneal y
proporciona indicación de que la aplicación tópica del mAb
anti-TGF\beta_{1} IgG4 de SL15A
(CAT-192) podría usarse para promover la curación
mejorada de heridas in vivo.
SEC. Nº ID. :1
Ácido nucleico que codifica el VH del CS37
(31G9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. :2
Secuencia de aminoácidos del VH del CS37
(31G9)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. :3
Ácido nucleico que codifica el VH del SL15
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. Nº ID. :4
Secuencia de aminoácidos del VH del SL15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. :5
Ácido nucleico que codifica el VL del SL15A
(CS37)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. Nº ID. :6
Secuencia de aminoácidos del VL del SL15A
(CS37)
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. : 7
Ácido nucleico que codifica el VL del SL15S
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. Nº ID. : 8
Secuencia de aminoácidos del VL del SL15S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. : 9
Ácido nucleico que codifica el VH del JT182
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC. Nº ID. : 10
Secuencia de aminoácidos del VH del JT182
SEC. Nº ID. : 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSYGMH
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID.: 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipVISYDGSIKYYADSVKG
\hfill
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SEC. Nº ID. : 13
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. : 14
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\hfill
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SEC. Nº ID. : 15
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SEC. Nº ID. : 16
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SEC. Nº ID. : 17
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SEC. Nº ID. : 18
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SEC. Nº ID. : 19
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SEC. Nº ID. : 20
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SEC. Nº ID. : 21
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SEC. Nº ID. : 22
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\hfill
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SEC. Nº ID. : 23
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATATCTCTCCACAGGTGTCCACT
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\hskip-.1em\dddseqskipCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCA
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SEC. Nº ID. : 24
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipCTACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTCCGCCGAA
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SEC. Nº ID. : 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATATCTCTCCACAGGTGTCCACT
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Cambridge Antibody Technology
Limited
\hskip1.1cmThompson, Julia E.
\hskip1.1cmLennard, Simon N.
\hskip1.1cmWilton, Alison J.
\hskip1.1cmBraddock, Peta S.H.
\hskip1.1cmDu Fou, Sarah L.
\hskip1.1cmMcCafferty, John G.
\hskip1.1cmConroy, Louise A.
\hskip1.1cmTempest, Philip R.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Miembros de unión específica contra
el TGFbeta1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB/CP5852983
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB00/01679
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-05-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/131.983
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-04-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Tyr Gly Met His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys
Tyr}
\sac{Tyr Ala Asp Ser Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu
Gly}
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser}
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaagcttac tgagcacaca ggacctcacc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattttcgaa ctacagttac tgagcacaca ggacc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgggccctt ggtggaagct gaggagacgg
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaccgtggt cccttg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatatct ctccacaggt gtccactccg
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaattgtgct gactcagtct cca
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaccgtacg tttaatctcc agtcgtgtcc
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccgccgaa
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatatct ctccacaggt gtccactccg
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcagct ggtggagtct gg
\hfill52
Claims (27)
1. Miembro de unión específica aislado capaz de
unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión
específica comprende un dominio de unión a antígeno que comprende
un CDR3 de VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal
como se dispone en el CDR3 del VH del SL15, identificado por la SEC.
Nº ID.: 13, o el CDR3 del VH del JT182, identificado por la SEC. Nº
ID.: 15.
2. Miembro de unión específica según la
reivindicación 1, que además comprende un CDR1 de VH o un CDR2 de
VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se
dispone en uno o ambos del CDR1 de VH de CS37, identificado por la
SEC. Nº ID.: 11, y CDR2 de VH de CS37, identificado por la SEC. Nº
ID.: 12.
3. Miembro de unión específica según la
reivindicación 1 ó 2, el cual comprende además una secuencia de
CDR1 tal como se dispone en el CDR1 de VH de CS37, identificado por
la SEC. Nº ID.: 11, y en el CDR2 de VH de CS37, identificado por la
SEC. Nº ID.: 12.
4. El miembro de unión específico de la
reivindicación 3 en donde dichas secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3
están portadas por una estructura de anticuerpo humano.
5. Miembro de unión específica aislado capaz de
unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión
específica comprende el dominio VH del SL15 sustancialmente tal
como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4.
6. Miembro de unión específica aislado capaz de
unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión
específica comprende el dominio VH del JT182 sustancialmente tal
como se detalla en la SEC. Nº ID.: 10.
7. Miembro de unión específica aislado capaz de
unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión
específica comprende el dominio VL del SL15S sustancialmente tal
como se detalla en la SEC. Nº ID.: 8.
8. Miembro de unión específica aislado capaz de
unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión
específica comprende:
- (i)
- un dominio VH seleccionado de entre el grupo del dominio VH del SL15 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4, y el dominio VH de JT182 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 10; y
- (ii)
- un dominio VL seleccionado de entre el grupo del dominio VL del SL15S sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 8, y el dominio VL de SL15A sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 6.
9. El miembro de unión específica aislado de la
reivindicación 8 en donde el dominio VH es el dominio VH del SL15
sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4.
10. El miembro de unión específica aislado de
cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la forma de un Fv
de cadena sencilla (scFv).
11. El miembro de unión específica aislado de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la forma de una
IgG.
12. El miembro de unión específica aislado de la
reivindicación 11, en donde dicha IgG es una IgG1 o IgG4.
13. Composición farmacéutica que comprende el
miembro de unión específica de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes en asociación con un excipiente, portador, tampón o
estabilizador farmacéuticamente aceptable.
14. Miembro de unión específica de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, o una composición de la reivindicación
13, para su uso en un procedimiento de tratamiento del humano o
animal.
15. Miembro de unión específica o composición
para su uso según la reivindicación 14, en donde dicho tratamiento
es para tratar una condición asociada con la deposición de matriz
extracelular en un paciente, incluyendo la glomerulonefritis, la
cicatrización queloide y hipertrófica, la vitreoretinopatía
proliferativa, la cirugía de drenaje del glaucoma, la lesión
corneal y las cataratas.
16. Miembro de unión específica o composición
para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento para
modular la respuesta inmune o inflamatoria.
17. Miembro de unión específica o composición
para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento de
tratamiento de un tumor.
18. Miembro de unión específica o composición
para su uso según la reivindicación 17, en donde dicho tumor está
asociado con la angiogénesis o metástasis.
19. Miembro de unión específica o composición
para su uso según las reivindicaciones 17 ó 18, en donde dicho
tumor es un tumor de mama, próstata, ovario, estómago, colorectal,
de piel, de pulmón, cervical, y de vejiga urinaria, o una leucemia
o sarcoma.
20. Miembro de unión específica o composición
para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento para
tratar asma.
21. Utilización de un miembro de unión específica
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición
según la reivindicación 13, para la fabricación de un medicamento
destinado al tratamiento de una condición en un paciente, estando la
condición asociada con la expresión del TGF\beta_{1}.
22. Utilización según la reivindicación 21, en
donde dicha condición está asociada con la deposición de matriz
extracelular en un paciente, incluyendo la glomerulonefritis, la
cicatrización queloide e hipertrófica, la vitreoretinopatía
proliferativa, la cirugía de drenaje del glaucoma, la lesión
corneal y las cataratas; un tumor, incluyendo un tumor que está
asociado con la angiogénesis o metástasis y/o un tumor seleccionado
de entre el grupo de tumores de mama, próstata, ovario, estómago,
colorectal, de piel, pulmón, cervical, y de vejiga urinaria, o
leucemias o sarcomas; o asma.
23. Procedimiento para determinar la cantidad de
TGF\beta_{1} en una muestra que comprende, poner en contacto la
muestra con un miembro de unión específica según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, y determinar la cantidad de unión del
miembro de unión específica al TGF\beta_{1} en la muestra.
24. Ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia que codifica el miembro de unión específica de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12.
25. Procedimiento para preparar un miembro de
unión específica capaz de unir el TGF\beta_{1}, comprendiendo
dicho procedimiento in vitro la expresión del ácido nucleico
de la reivindicación 24 en una célula hospedadora en condiciones
que proporcionan la expresión de dicho ácido nucleico, seguida de la
recuperación de dicho miembro de unión específica.
26. Procedimiento para obtener un dominio de
unión de antígeno de anticuerpo específico para el
TGF\beta_{1}, comprendiendo el procedimiento
- proporcionar,
mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o
más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH,
seleccionado de entre la SEC. Nº ID.: 4 y SEC. Nº ID.: 10, un
dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del
dominio VH, y combinar el dominio VH así proporcionado con uno o
más dominios VL para proporcionar una o más
\hbox{combinaciones VH/VL; y/o}
- proporcionar, mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEC. Nº ID.: 8, un dominio VL que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VL, y combinar el dominio VL así proporcionado con uno o más dominios VH para proporcionar una o más combinaciones VH/VL; y
- ensayar la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un dominio de unión de antígeno de anticuerpo específico para el TGF\beta_{1}.
27. Procedimiento para preparar un miembro de
unión específica para el TGF\beta_{1}, procedimiento que
comprende:
- proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH, el cual, o bien incluye un CDR3 a remplazar, o carece de una región codificante de CDR3;
- combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta para el CDR3 del VH del SL15 o JT182, de tal manera que dicho ácido nucleico donante se inserta en la región CDR3 en el repertorio, con el fin de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH; y
- proporcionar un repertorio inicial de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL que incluye un CDR3 a ser sustituido o bien carece de una región codificante de CDR3, combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta para el CDR3 del VL del SL15, de tal manera que dicho ácido nucleico donante se inserta en la región CDR3 en el repertorio, con el fin de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL; y
- expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio;
- seleccionar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}; y
- recuperar dicho miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica.
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