DE60128208T2 - Verfahren zum Behandeln von Krebs mit Anti-Neurotrophin-Mitteln - Google Patents

Verfahren zum Behandeln von Krebs mit Anti-Neurotrophin-Mitteln Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Onkologie, insbesondere Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebsarten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Gebiet von Neurotrophinen und die Verwendung von Anti-Neurotrophin-Mitteln, wie zum Beispiel Antikörper, zum Behandeln oder Verhindern von Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebsarten.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Neurotrophine (NTs) sind eine Subfamilie aus spezifischen neurotrophen Faktoren einschließlich vier gut bekannten strukturell und funktionell verwandten Proteinen: Nervenwachstumsfaktor (NGF), Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4/5 (NT-4/5). Kürzlich wurden zwei zusätzliche NTs, Neurotrophin-6 (NT-6) und Neurotrophin-7 (NT-7) entdeckt. Die Neurotrophine binden an und aktivieren spezifisch Zelloberflächen Membranrezeptoren, die Tyrosinkinaseaktivität aufweisen. Diese Rezeptoren sind als trk Rezeptoren bekannt und werden gemäß den drei Subtypen trkA, trkB und trkC klassifiziert. Jeder trk Rezeptor Subtyp bindet vorzugsweise an einen oder mehrere NTs (NGF an trkA, BDNF und NT-4/5 an trkB und NT-3 an trkC). Es ist jedoch bekannt, dass NT Kreuzreaktivität zwischen Rezeptor Subtypen auftritt. Die Aktivierung von trk Rezeptoren durch NTs führt zur Rezeptor Oligomerisierung und Tyrosin Phosphorylierung von spezifischen intrazellulären Substraten. Zusätzlich zu den trk Rezeptoren ist von einem zweiten Typ eines Zelloberflächen Membranrezeptors bekannt, dass er an NTs bindet. Dieser Rezeptor ist der niedrig affine Nervenwachsturnsrezeptor p75NTR (p75), von dem angenommen wird, dass er in die Modulation der NT Affinität und/oder die Verfügbarkeit für das Binden an höher affine trk Re zeptoren involviert ist. Eine spezifische physiologische Rolle für den Rezeptor p75 verbleibt jedoch in der Diskussion.
  • Es wurde vielfältig erkannt, dass NTs eine essentielle Rolle im Wachstum, der Differenzierung und dem Überleben von zentralen und peripheren Nervensystemzellen spielen. Es gibt jedoch neueren Beweis, dass NTs auch zur Tumorbiologie außerhalb des Nervensystems beitragen.
  • Neurotrophine und ihre Rezeptor Subtypen wurden in verschiedene Krebsarten, einschließlich Prostata-, Brust-, Schilddrüsen-, Dickdarm- und Lungenkarzinome ebenso wie in maligne Melanome, Bauchspeicheldrüsenkarzinoide und Glioblastome einbezogen. Insbesondere wurde eine abweichende Expression der trk Rezeptoren A, B und C in Bauchspeicheldrüsen duktaler Adenokarzinome (PDAC) gefunden, und NTs können die Invasivität dieses Tumortyps beeinflussen (Miknyoczki et al., Int. J. Cancer, 1999, 81, 417). Zusätzlich wurden NGF mit perineuraler Invasion und Schmerzen korreliert, die mit PDAC assoziiert sind (Zhu et al., J. Clan. Onco/., 1999, 17, 2419). Von trkA ist auch bekannt, dass es in epithelialem Gewebe der Prostata exprimiert wird, und das entsprechende Neurotrophin NGF wird mit der Stimulation von Prostatakrebswachstum in Verbindung gebracht. Walch et al., (Clinical and Experimental Metastasis, 1999, 17, 307-314) offenbart, dass Neurotrophine die Invasion in Prostatatumormetastasen steigert. Die Immunreaktivität für NGF wurde in menschlichen Prostatakarzinomen (De Schryver-Kecskemeti et al., Arch. Pathol., 1987, 111, 833) und von Tumoren abgeleiteten Zelllinien (MacGrogan et al., J. Neurochem., 1992, 59, 1381), was eine mögliche mitogene oder Überlebensrolle für NGF in diesem Krebs nahe legt, gezeigt. Weiterhin wurde gezeigt, dass Prostatakarzinomzellen chemotaktisch (Djakiew et al., Cancer Res., 1993, 53, 1416) und invasiv (Geldof, et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 1997, 123, 107) als Antwort auf NGF in vitro sind.
  • Von trks wurde gezeigt, dass sie eine Rolle sowohl im Prostatakrebs (Delsite et al., J. Androl., 1996, 17, 481, Pflug et al., Endocrinology, 1995, 136, 262, Pflug et al., Cancer Res., 1992, 52, 5403, Djakiew et al., Cancer Res., 1991, 51, 3304, Passaniti et al., Int. J. Cancer, 1992, 51, 318, MacGrogan et al., J. Neurochem., 1992, 59, 1381, Geldof et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 1997, 123, 107, Pflug et al., Mol. Carcin., 1998, 12, 106 und George et al., The Prostrate, 1998, 36, 172) als auch im Bauchspeicheldrüsenkrebs (Oikawa, et al., Int. J. Pancreat., 1995, 18, 15, Ohta et al., J. Pathol., 1997, 181, 405, Miralles et al., J. Endocrinology, 1998, 156, 431 und Miknyoczki et al., Crit. Rev. Oncogenesis, 1996, 7, 89) spielen.
  • Aufgrund der möglichen Rolle von trk Aktivität in der Entwicklung und Progression von bestimmten Krebsarten wurde auf die selektive Zerstörung von NT-trk Achsen als ein mögliches therapeutisches Mittel abgezielt. Insbesondere wurden kleine Moleküle entwickelt und getestet, welche die Fähigkeit zeigen, trk Rezeptoren zu inhibieren (Ruggeri, et al., Current Medicinal Chemistry, 1999, 6, 845). Von den glykosylierten Indolcarbazolalkaloiden K-252a und K-252b ist bekannt, dass sie die biologischen Wirkungen von NGF und anderen Neurotrophinen inhibieren. Von K-252a wurde berichtet, dass es spezifisch die Autophosphorylierung von trkA ebenso wie von trkB und trkC und anderen verwandten Neurotrophin Rezeptoren in niedrig nanomolaren Konzentrationen inhibiert (Hashimoto, Cell Biol., 1988, 107, 1531; Berg, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 13; Tarpley, et al. Oncogene, 1992, 7, 371; Ohmichi, et al., Biochemistry, 1992, 31, 4034; Muroya et al., Biochim. Biophys. Acta., 1992, 1135, 353 und Nye, et al., Mol. Biol. Cell, 1992, 3, 677). Durch Modifikation des Zuckerrests von K-252a wurden zwei zusätzliche potente trk Inhibitoren entwickelt. Insbesondere wurde von CEP-751, einem Hydroxymethylderivat von K-252a, gefunden, dass es ein potenter Inhibitor von trkA (IC50 von 3 nM in einem ELISA), trkB und trkC ist. Ein Dipeptid Derivat, CEP-2563, wurde ebenfalls synthetisiert, das eine ähnliche Aktivität und verbesserte Wasserlöslichkeit zeigte. Von einer verwandten Verbindung, CEP-701, wurde ebenfalls gefunden, dass es eine gute trkA inhibitorische Aktivität aufweist, und dass es einen 1050 von 4 nM zeigt. Von sowohl CEP-751 als auch CEP-701 wurde gezeigt, dass sie signifikant humane und Rattenprostatakarzinome in präklinischen Modellen inhibieren (Dionne, et al., Clin. Cancer Res., 1998, 4, 1887 und George, et al., Cancer Research, 1999, 59, 2395). Von CEP-751 wurde ebenfalls gezeigt, dass es Antitumoraktivität in Neuroblastomen und Medulloblastom Xe notransplantaten (Evans, et al., Clin. Cancer Res., 1999, 5, 3594) ebenso wie in Eierstockkrebs und Melanommodellen zeigt. Weiterhin wurde eine signifikante Antitumoraktivität von CEP-701 in präklinischen Xenotransplantatmodellen von humanen Bauchspeicheldrüsen duktalen Adenokarzinomen ebenfalls gezeigt (Miknyoczki, et al., Clin. Cancer Res., 1999, 5, 2205). CEP-701 befindet sich gegenwärtig in humanen klinischen Versuchen.
  • Obwohl diese trk Inhibitoren als kleine Moleküle als Werkzeuge für die Behandlung von Prostata-, Bauchspeicheldrüsen- und anderen Krebsarten verwendet werden können, ist es schwierig, kleine Moleküle mit einer Spezifität für ein bestimmtes Zielmolekül zu entwickeln. Eines der Hauptprobleme im Allgemeinen bei kleinen Molekülen ist die Unspezifität für Zielrezeptoren und Rezeptorwege, was zu ungewünschter Aktivierung oder Inaktivierung von anderen Rezeptoren und möglicher Toxizität führt. Zum Beispiel wurde für K-252a gezeigt, dass es vielfältige biochemische Eigenschaften einschließlich neurotropher Aktivität in Kombination mit trk und Proteinkinase C Aktivitäten aufweist (Kaneko, et al., J. Med. Chem., 1997, 40, 1863). Somit sind therapeutische Mittel mit hoher Spezifität für biologische Ziele, die in trk Rezeptoraktivität involviert sind, als mögliche Arzneimittel Kandidaten für die Behandlung von Prostata-, Bauchspeicheldrüsen- und anderen Krebsarten wünschenswert. Zu diesem Zweck wurde von Antikörpern, die gegen einen bestimmten trk Rezeptor gerichtet sind, gezeigt, dass sie weniger wünschenswert sind als kleine Moleküle (LeSauteur et al., Nature Biotech., 1996, 14, 1120). Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung mindestens eines neutralisierenden Neurotrophin Antikörpers in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Bauchspeicheldrüsen- oder Prostatakrebs in einem Säuger bereit. Der Antikörper stellt eine sehr gewünschte Spezifität bereit, welche kleine Moleküle tatsächlich nicht bieten können.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung eines Neurotrophin Antikörpers in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs in einem Säuger gerichtet. Anti-Neurotrophin Antikörper schließen jene ein, die gegen NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 gerichtet sind und schließen humanisierte Antikörper ebenso wie Fragmente davon ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dient das Medikament der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einem der folgenden neutralisierenden Neurotrophin Antikörper, NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 an Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumore.
  • In einigen Ausführungsformen dient das Medikament dem Reduzieren von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumorvolumen.
  • In einigen Ausführungsformen dient das Medikament dem Reduzieren der Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumorwachstumsrate.
  • BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung eines Anti-Neurotrophin-Antikörpers in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs in einem Säuger gerichtet. Der AntiNeurotrophin-Antikörper bindet mit hoher Spezifität an Neurotrophine, was zur Inhibition von trk Rezeptoren durch Neutralisation von aktivierenden Neurotrophin Liganden führt.
  • Verschiedene Definitionen werden in diesem Dokument angegeben. Die meisten Wörter weisen eine Bedeutung auf, die diesen Wörtern von dem Fachmann zugewiesen würde. Wörter, die spezifisch entweder weiter unten oder anderswo in diesem Dokument definiert sind, weisen die Bedeutung auf, die ihnen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Ganzes zugewiesen wird und wie sie typischerweise vom Fachmann verstanden werden.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Krebs" auf ein persistierendes Neoplasma irgendeines Gewebes in einem biologischen Organismus beziehen. Das Neoplasma ist als allgemein maligne charakterisiert, oder es ist wahrscheinlich, dass es maligne wird, möglicherweise invasiv, oder dass es wahrscheinlich ist, dass es an neuen Stellen metastasiert. Die Krebsarten der vorliegenden Erfindung sind mit der Expression von Neurotrophin Rezeptoren und Neurotrophinen assoziiert, und es sind Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Tumor" auf ein Wachstum beziehen, das von einem existierenden Gewebe stammt, das mit einer abweichenden Rate im Vergleich zu dem Gewebe wächst, von dem es stammt, und das keiner normalen physiologischen Funktion dient. Das Wachstum kann, muss aber nicht maligne sein, aber es ist häufig assoziiert mit, oder es zeigt einen kanzerösen oder präkanzerösen Zustand an.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Säuger" entweder auf humane oder nicht-humane lebende Organismen beziehen, die von Krebs betroffen sind, zuvor von Krebs betroffen waren oder eine Prädisposition für Krebs aufweisen.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" auf eine Menge eines therapeutischen oder prophylaktischen Anti-Neutrotrophin-Mittels beziehen, wie einem Neurotrophin Antikörper, der für eine erfindungsgemäße Ausführungsform geeignet wäre, der die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung oder Antwort zeigen wird, wenn er in Übereinstimmung mit dem gewünschten Behandlungsplan verabreicht wird.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Antikörper" auf vollständige, intakte Antikörper ebenso wie auf F(ab)-Fragmente und F(ab)2-Fragmente davon beziehen. Vollständige, intakte Antikörper schließen monoklonale Antikörper wie murine monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper und Derivate all der vorgenannten ein.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Neurotrophin" oder "NT" auf irgendwelche nativen oder nicht nativen Neurotrophine beziehen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 und NT-7 und ihre funktionellen Derivate oder Äquivalente, egal ob sie aus einer natürlichen Quelle stammen, durch Verfahren der rekombinanten DNA Technologie oder durch chemische Synthese oder durch irgendeine Kombination dieser oder anderer Verfahren hergestellt wurden.
  • So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "neutralisierend" allgemein das Unwirksammachen, wenn er verwendet wird, um einen Antikörper zu beschreiben, bedeutet weiterhin einen Antikörper, der das Molekül, an das er bindet, unwirksam macht. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen bindet ein "neutralisierender" Antikörper an einen bestimmten Liganden und verhindert oder interferiert mit der Bindung des Liganden an seinen Rezeptor.
  • So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Inkontaktbringen" das Zusammenbringen, entweder direkt oder indirekt, eines oder mehrerer Moleküle miteinander, wodurch intermolekulare Interaktionen ermöglicht werden. Das Inkontaktbringen kann in vitro, ex vivo oder in vivo stattfinden.
  • So wie hier verwendet, soll sich der Begriff "Neurotrophin Rezeptor" auf einen Rezeptor beziehen, der an einen Neurotrophin Liganden bindet. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Neurotrophin Rezeptor ein Mitglied der Tyrosinkinasefamilie von Rezeptoren, die allgemein als "trk" Rezeptoren oder "trks" bezeichnet werden, die an zellulären Oberflächen exprimiert werden. Die trk Familie schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf trkA, trkB und trkC. In anderen Ausführungsformen ist der Neurotrophin Rezeptor p75NTR, der auch als p75 oder niedrig affiner Nervenwachstumsfaktor Rezeptor bezeichnet wird. Diese Rezeptoren können von irgendeiner Tierspezies (z.B. human, murin, Kaninchen, Schwein, Pferd, etc.) stammen und schließen Gesamtlängen Rezeptoren und ihre verkürzten und varianten Formen ein, wie jene, die durch alternatives Spleißen und/oder Insertion entstehen, und natürlich vorkommende allelische Varianten ebenso wie funktionelle Derivate von solchen Rezeptoren.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Medikamente für das Behandeln von neoplastischen Erkrankungszuständen gerichtet, die ausgewählt sind aus Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebsarten.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen können nicht maligne Tumore, präkanzeröse Läsionen, präkanzeröse Tumore und andere präkanzeröse Zustände, die mit den zuvor genannten neoplastischen Erkrankungszuständen assoziiert sind, auch durch die erfindungsgemäßen Verfahren behandelt oder verhindert werden. Eine solche Behandlung würde zu der Verhinderung von Krebs in Patienten mit klinischen Anzeichen von bevorstehendem Krebs oder einer Prädisposition für Krebs beitragen.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Säuger sind Menschen mit Empfänglichkeit für oder einer klinischen Diagnose für Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Natürlicherweise fallen auch nicht-humane Säuger, die von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs betroffen sind, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Säuger schließen auch Menschen oder Nicht-Menschen ein, die prädisponiert sind, von diesen Krebsarten betroffen zu werden. Beispiele schließen Menschen ein, die gegenüber bekannten Kanzerogenen ausgesetzt sind oder Männer in einem Alter mit einem Risiko, Prostatakrebs zu entwickeln. Auch eingeschlossen sind Patienten mit einer Familiengeschichte von Krebs oder die genetisch hinsichtlich dem Entwickeln bestimmter Krebsarten prädisponiert sind.
  • Bevorzugte Antikörper schließen alte gegenwärtig bekannten Neurotrophin Antikörper ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Anti-NGF (Katalog Nr. 500-P85, Pepro Tech Inc.; Katalog Nr. AF-256-NA, R&D Systems, Inc.), Anti-BDNF (Katalog Nr. 500-P84, Pepro Tech Inc.; Katalog Nr. MAB248, R&D Systems, Inc.), Anti-NT-3 (Katalog Nr. 500-P82, Pepro Tech Inc.; Katalog Nr. AF-267-NA, R&D Systems, Inc.), Anti-NT4 (Katalog Nr. 500-P83, Pepro Tech Inc.; Katalog Nr. AF- 268-NA, R&D Systems, Inc.), Anti-NT-4/5, Anti-NT-6 und Anti-NT-7 und ihre funktionellen Äquivalente. Vorzugsweise werden diese Antikörper in einer affinitätsgereinigten Form verwendet. Mischungen von zwei oder mehr verschiedenen neutralisierenden Antikörpern fallen auch innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel können Krebsarten, wie Bauchspeicheldrüsen duktales Adenokarzinom, das mehr als eine Art eines Neurotrophin Rezeptors exprimiert, wirksamer mit einer Mischung aus Antikörpern gegen mehr als einen Rezeptor behandelt werden.
  • Erfindungsgemäße Antikörper können von einem kommerziellen Lieferanten, wie Pepro Tech Inc. (Rocky Hill, NJ), R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) erhalten werden, oder sie können gemäß Standardverfahren hergestellt werden. Kommerziell erhältliche neutralisierende Neurotrophin Antikörper schließen anti-human b-NGF, anti-human BDNF, anti-human NT-4 und anti-human NT-3 aus Kaninchen Antiserum ein.
  • Die Herstellung und die Reinigung von Antikörpern kann auch im Labor gemäß Standardverfahren, die in Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage, Greene and Wiley-Interscience, NY und Current Protocols in Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons, NY. durchgeführt werden, von denen jedes hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist.
  • Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung sind Antikörper (z.B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Single Chain Antikörper, chimäre Antikörper, bifunktionelle/bispezifische Antikörper, humanisierte Antikörper, humane Antikörper und Complementary Determining Region (CDR)-grafted Antikörper, einschließlich Verbindungen, die CDR Sequenzen einschließen, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen, das spezifisch für ein Neurotrophin oder Fragmente davon ist. Antikörper Fragmente, einschließlich Fab, Fab', F(ab')2 und Fv werden ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt. Screening Assays zum Bestimmen der Bindungsspezifität eines erfindungsgemäßen Antikörpers sind gut bekannt und werden routinemäßig im Stand der Technik durchgeführt. Für eine umfassende Diskussion solcher Assays, siehe Harlow et al. (Hrsg.), Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Kapitel 6, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist. Antikörper, die Fragmente eines Neurotrophins erkennen und binden, sind ebenfalls umfasst. Erfindungsgemäße Antikörper können unter Verwendung irgendeines Verfahrens, das gut bekannt ist und routinemäßig im Stand der Technik durchgeführt wird, hergestellt werden.
  • Zum Beispiel kann ein rekombinantes oder natürlich vorkommendes Neurotrophin oder ein Fragment davon verwendet werden, um eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (oder ein größerer Säuger, wie ein Kaninchen für polyklonale Antikörper) zu immunisieren. Um die Antigenität zu erhöhen, können Peptide an Schlüssellochnapfschnecken (engl. keyhole limpet) Hämocyanin (Pierce) gemäß den Empfehlungen des Herstellers konjugiert werden. Für eine Anfangsinjektion kann das Antigen mit Freund'schem vollständigem Adjuvans emulgiert und subkutan injiziert werden. In Intervallen von zwei oder drei Wochen können zusätzliche Aliquots von Neurotrophin Antigen mit Freund'schem unvollständigem Adjuvans emulgiert und subkutan injiziert werden. Vor der abschließenden Booster Injektion kann eine Serumprobe aus den immunisierten Mäusen entnommen und durch Western Blot untersucht werden, um die Anwesenheit von Antikörpern zu bestätigen, die mit Neurotrophin immunreagieren. Das Serum der immunisierten Tiere kann als ein polyklonales Antiserum verwendet werden, oder es kann verwendet werden, um polyklonale Antikörper zu isolieren, die Neurotrophin erkennen. Alternativ dazu können die Mäuse getötet und ihre Milz für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden.
  • Um monoklonale Antikörper herzustellen, können die Milzen in ein 10 ml serumfreies RPMI 1640 gegeben werden, und Einzelzellsuspensionen werden durch Zermahlen der Milzen in serumfreiem RPMI 1640, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (RPMI) (Gibco, Kanada) ergänzt ist, gebildet werden. Die Zellsuspensionen können gefiltert und durch Zentrifugation gewaschen und in serumfreien RPMI re suspendiert werden. Thymozyten, die aus drei unbehandelten Balb/c Mäusen entnommen werden, werden in einer ähnlichen Weise hergestellt und als Futterschicht verwendet. NS-1 Myelomzellen, die in der log Phase in RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone Laborstories, Inc., Logan, Utah) für Tage vor der Fusion gehalten wurden, werden ebenfalls zentrifugiert und gewaschen.
  • Um Hybridomfusionen herzustellen, werden Milzzellen von den immunisierten Mäusen mit NS-1 Zellen vereinigt und zentrifugiert, und der Überstand wird aspiriert. Das Zellpellet wird durch Klopfen an das Gefäß abgelöst, und 2 ml 37 °C PEG 1500 (50 % in 75 mM HEPES, pH 8,0) (Boehringer-Mannheim) wird in das Pellet gerührt, gefolgt von der Zugabe von serumfreiem RPMI. Danach werden die Zellen zentrifugiert, in RPMI, das 15 % FBS, 100 μM Natriumhypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 16 μM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Einheiten/ml IL-6 (Boehringer-Mannheim) und 1,5 × 106 Thymozyten/ml enthält, resuspendiert, und auf 10 Corning Flachboden 96 Vertiefungsgewebekultur Platten (Corning, Corning New York) ausplattiert.
  • An den Tagen 2, 4 und 6 nach der Fusion werden 100 μl Medium aus den Vertiefungen der Fusionsplatten entfernt und gegen frisches Medium ausgetauscht. Am Tag 8 werden die Fusionen mittels ELISA gescreent, wodurch hinsichtlich der Anwesenheit von Maus IgG, das an Neurotrophin bindet, getestet wird. Ausgewählte Fusionsvertiefungen werden durch Verdünnung weiter kloniert, bis monoklonale Kulturen, die Anti-Neurotrophin-Antikörper bilden, erhalten werden.
  • Nicht-humane Antikörper können durch irgendeines der Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, humanisiert werden. In einem Verfahren werden die nicht-humanen CDRs in einen humanen Antikörper oder eine Konsensus Antikörper Rahmensequenz eingebaut. Weitere Änderungen können anschließend in den Antikörper Rahmen eingeführt werden, um die Affinität oder Immunogenität zu modulieren. Die Folgenden sind Protokolle, um die Verwendbarkeit von Anti-Neurotrophin monoklonalen Antikörpern als Therapeutika in Menschen durch "Humanisieren" der monoklonalen Antikörper zu verbessern, um ihre Serum Halbwertszeit zu verbessern und um sie weniger immunogen in menschlichen Wirten zu machen (d.h. um eine humane Antikörper Antwort gegenüber nicht-humanen Anti-Neurotrophin-Antikörpern zu verhindern).
  • Die Prinzipien der Humanisierung wurden in der Literatur beschrieben und werden durch die modulare Anordnung von Antikörper Proteinen gefördert. Um die Möglichkeit der Komplementbindung zu minimieren, ist ein humanisierter Antikörper des IgG4 Isotyps bevorzugt.
  • Zum Beispiel wird ein Niveau der Humanisierung durch das Bilden chimärer Antikörper erreicht, welche die variablen Domänen von interessierenden nicht-humanen Antikörper Proteinen mit den konstanten Domänen von humanen Antikörper Molekülen umfassen. (Siehe z.B. Morrison et al., Adv. Immunol., 1989, 44, 65-92, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist). Die variablen Domänen von Neurotrophin-neutralisierenden Anti-Neurotrophin-Antikörpern werden aus der genomischen DNA eines B-Zell Hybridoms oder aus cDNA, die aus mRNA gebildet wird, die aus dem interessierenden Hybridom isoliert wurde, kloniert. Die Genfragmente der V Region sind mit Exons verbunden, die konstante Domänen von humanem Antikörper kodieren, und das resultierende Konstrukt wird in geeigneten Säuger Wirtszellen (z.B. Myelom oder CHO Zellen) exprimiert.
  • Um ein noch größeres Niveau der Humanisierung zu erreichen, werden nur jene Abschnitte der Genfragmente der variablen Region, welche die Antigen bindenden Komplementaritäts-bestimmenden Regionen ("CDR") der nicht-humanen monoklonalen Antikörper Gene kodieren, in humane Antikörper Sequenzen kloniert (siehe z.B. Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525, Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-327, Verhoeyen et al., Science, 1988, 239, 1534-36 und Tempest et al., Bio/Technology, 1991, 9, 266-71). Falls es notwendig ist, wird der β-Faltblattrahmen des humanen Antikörpers, der die CDR3 Regionen umgibt, ebenfalls modifiziert, um die dreidimensionale Struktur der Antigen bindenden Domäne des original monoklonalen Antikörpers besser wiederzuspiegeln (siehe Kettlebo rough et al., Protein Engin., 1991, 4, 773-783 und Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499, von denen jedes hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist).
  • In einem alternativen Ansatz wird die Oberfläche eines interessierenden nicht-humanen monoklonalen Antikörpers durch Verändern ausgewählter Oberflächenreste des nicht-humanen Antikörpers, z.B. durch seitengerichtete Mutagenese, verändert, während alle inneren und Kontaktreste des nicht-humanen Antikörpers erhalten bleiben. Siehe Padlan, Molecular Immunol., 1991, 28, 489-98.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können für die Verabreichung an einen Säuger in einer Vielzahl von Wegen formuliert werden. In einigen Ausführungsformen liegen die Antikörper in steriler wässriger Lösung oder in biologischen Fluiden, wie Serum, vor. Wässrige Lösungen können gepuffert oder ungepuffert sein und können zusätzliche aktive oder inaktive Bestandteile aufweisen. Zusätzliche Bestandteile schließen Salz für das Modulieren der Ionenstärke, Konservierungsstoffe einschließlich, aber nicht beschränkt auf Antimikrobiotika, Antioxidanzien, chelatierende Mittel und ähnliches, und Nährstoffe, einschließlich Glucose, Dextrose, Vitamine und Mineralien, ein. Alternativ dazu können Antikörper zur Verabreichung in fester Form hergestellt werden. Die Antikörper können mit einer Vielzahl von inerten Trägern oder Trägerstoffen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Bindemittel, wie mikrokristalline Zellulose, Gummi Tragacanth oder Gelatine; Trägerstoffe, wie Stärke oder Lactose; dispergierende Mittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; Schmiermittel, wie Magnesiumstearat; Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; Süßmittel wie Sucrose oder Saccharin; oder Geschmacksmittel, wie Pfefferminz oder Methylsalicylat, kombiniert werden.
  • Antikörper oder ihre Formulierungen können an einen Säuger durch irgendein Mittel verabreicht werden, das zum Verabreichen von Antikörpern an das erkrankte Gewebe wirksam ist. Solche Mittel schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intrathekal, intraventrikulär, oral, enteral, parenteral, intranasal oder dermal. Insbesondere können Antikörper oder Antikörper Formulierungen durch parenterale Injektion von flüssigen Formulierungen oder durch Aufnahme von festen Formulierungen, wie Pillen, Tabletten, Kapseln oder flüssigen Formulierungen, wie Emulsionen und Lösungen, verabreicht werden. Andere Arzneimittel Verabreichungssysteme schließen Hydrogele, Hydroxymethylzellulose, Mikrokapseln, Liposomen, Mikroemulsionen, Mikrosphären und ähnliches ein. Die lokalisierte Injektion von Antikörpern direkt in das erkrankte Gewebe, wie einem Tumor, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Verabreichen von erfindungsgemäßen Antikörpern. Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) ist ein bevorzugter Träger für injizierbare Formulierungen.
  • Das Dosieren von Antikörpern, um eine pharmazeutisch wirksame Menge eines therapeutischen Mittels zu erhalten, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Zum Beispiel werden das Alter, die Sensitivität, die Toleranz und andere Merkmale des Patienten die Dosierungsmengen beeinflussen. Die Art des Neoplasmas oder Tumors, die Erkrankungsstufe und das Tumorvolumen werden auch die Dosierungen beeinflussen. Darüber hinaus müssen der Plasmaspiegel und die Halbwertszeit der eingesetzten Antikörper und die Affinität für ihre Erkennungsstellen und andere ähnliche Faktoren, die routinemäßig durch den überwachenden Arzt in Betracht gezogen werden, für eine wirksame Dosierung beachtet werden. Für die systemische Verabreichung der Neurotrophin Antikörper können Dosen im Bereich von ungefähr 0,05 mg/kg Patient/Tag bis ungefähr 500 mg/kg Patient/Tag verwendet werden, obwohl Dosierungen am unteren Ende des Bereichs bevorzugt sind, einfach aufgrund der einfachen Verabreichung und der Kosteneffektivität. Die Dosierungen können eingestellt werden, zum Beispiel um einen bestimmten Plasmaspiegel eines Antikörpers bereitzustellen, z.B. im Bereich von ungefähr 5-30 mg/ml, weiter bevorzugt ungefähr 10-15 mg/ml, und um den Spiegel aufrecht zu erhalten, z.B. für einen Zeitraum oder bis klinische Ergebnisse erreicht werden. Chimäre und humanisierte Antikörper, von denen erwartet würde, dass sie langsamer eliminiert werden, würden geringere Dosierungen benötigen, um einen wirksamen Plasmaspiegel aufrecht zu erhalten. Ebenso werden Antikörper mit hoher Affinität für Neurotrophine vorzugsweise weniger häufig oder in geringeren Dosen verabreicht als Antikörper mit geringerer Affinität. Eine therapeutisch wirk same Dosierung eines Antikörpers kann bestimmt werden durch das Nachweisen während des Behandlungsverlaufs einer Reduktion im Tumorvolumen, einer Reduktion in der Wachstumsrate des Tumors oder idealerweise dem vollständigen Verschwinden des kanzerösen Erkrankungszustands. Wirksame Mittel zum Messen oder Bestimmen des Stadiums von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs ist das Messen des Prostata spezifischen Antigens (PSA) im Blut, das Messen der Überlebenszeit von Bauchspeicheldrüsenkrebs, das Messen der Verzögerung oder Inhibierung der metastatischen Ausbreitung für sowohl Prostata- als auch Bauchspeicheldrüsenkrebs, das Messen der histologischen Beurteilung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und das CT für Bauchspeicheldrüsenkrebs. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zum Reduzieren des Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumorvolumens. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Medikament zum Verhindern weiteren Tumorwachstums oder zum Verringern der Tumorwachstumsrate. Das Medikament dient vorzugsweise der Verabreichung des Mittels an die Tumorstelle durch direkte, lokalisierte Injektion in das Gewebe an der oder nahe der Tumorstelle. Medikamente für die systemische Verabreichung von Mitteln durch oben diskutierte Mittel liegen jedoch ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Eine lokale Injektion an der Stelle des Tumors kann intratumoral oder peritumoral oder als eine Kombination von beiden stattfinden.
  • Für die direkte Injektion an der Tumorstelle hängt die Dosierung des Mittels von vielen Faktoren, einschließlich Art des Tumors, Stufe des Tumors, und Tumorvolumen unter anderen Variablen, ab. Typische therapeutische Dosen der Mittel gemäß dem Tumorvolumen können von ungefähr 0,01 mg/mm3 bis ungefähr 10 mg/mm3 pro Injektion rangieren, und die Injektionen können so häufig wie benötigt verabreicht werden. Zum Beispiel können Injektionen einmal täglich für die Zeit während der ein Tumor- oder Erkrankungszustand vorliegt, geeignet sein, aber sie werden gemäß der Art des Krebses, dem Verlauf der Erkrankung und dem Patienten variieren. Die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung wird durch entwe der eine Reduktion im Tumorvolumen während des Behandlungsverlaufs oder einer Inhibierung der Tumorwachstumsrate angezeigt. Die Messung des Tumorvolumens aus den Tumorausmaßen ist dem Fachmann gut bekannt. Tumorvolumenberechnungen können mit der folgenden Formel durchgeführt werden: V(mm3) = 0,5236 × Länge (mm) × Breite (mm) [Länge (mm) + Breite (mm)/2].
  • Ein anderes Verfahren zum Bewerten der Wirksamkeit einer bestimmten Behandlung ist es, die Inhibierung von Neurotrophin Rezeptoren durch Mittel zu bewerten, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel kann trkA hinsichtlich Aktivität unter Verwendung eines ELISA basierten Enzym Assays getestet werden, wie in Angeles, et al., Anal. Biochem., 1996, 236, 49 angegeben ist, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist. Ein anderes Verfahren zur Bewertung ist es, die ChAT Aktivität im basalen Vorderhirn der Ratte zu messen.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen an den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gemacht werden können, und dass solche Änderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne den Schutzbereich der angehängten Ansprüche zu verlassen.
  • Die folgenden Beispiele sind alle real, und sie beabsichtigen nicht, den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Neutralisation von trk Rezeptoren durch Anti-NGF
  • Antikörper wurden in PC-3 und/oder TSU-pr1 Xenotransplantate injiziert, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie auf CEP-751 antworten (Dionne et al., Clin. Canc. Res., 1998, 4, 1887-1898). Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die neutralisierende Fähigkeit der Anti-Neurotrophin-Antikörper zu bestätigen.
  • Der Anti-NGF Antikörper reduziert die Liganden stimulierte Autophosphorylierung von trk in NIH3T3-trkA Zellen. NGF (10 ng/ml) wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Antikörper in 6 ml Gewebekulturmedien vorinkubiert. Das NGF/Antikörper Gemisch wurde zu den NIH3T3-trkA Zellen zugegeben. Trk Proteine wurden aus den Lysaten mit pan-trk Antikörper CEP-21 immunpräzipitiert, und die Proben wurden auf einem Immunoblot mit dem Anti-Phosphotyrosin Antikörper 4G10 als Sonde inkubiert. Die densitometrischen Scanwerte (integrierte OD Einheiten) waren wie folgt (gezeigt als NGF (10 ng/ml) Anti-NGF (μg/ml): –/– Spur, 0,3; +/– Spur, 6,5; 0,001 mg/ml, 5,0; 0,01 mg/ml, 4,5; 0,1 mg/ml, 2,5; 1,0 mg/ml, 3,1; 10,0 mg/ml, 2,1; 100 mg/ml, 1.1. Somit reduziert Anti-NGF (PeproTech Inc., 500-P85) bei 100 μg/ml die trk Phosphorylierung um ungefähr 80 % relativ zu der Nicht-Anti-NGF Behandlung in Zellen, die für Minuten mit 10 ng/ml NGF behandelt wurden.
  • Beispiel 2: Neutralisierung von trk Rezeptoren durch Anti-NT-3
  • Der Anti-NT-3 Antikörper reduziert die Liganden stimulierte Autophosphorylierung von trk in NIH3T3-trkC Zellen. NGF-3 (10 ng/ml) wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Antikörper in 6 ml Gewebekulturmedien vorinkubiert. Das NT-3/Antikörper Gemisch wurde zu den NIH3T3-trkA Zellen zugegeben. Trk Proteine wurden aus den Lysaten mit pan-trk Antikörper CEP-21 immunpräzipitiert, und die Proben wurden auf einem Immunoblot mit dem Anti-Phosphotyrosin Antikörper 4G10 als Sonde inkubiert. Die densitometrischen Scanwerte (integrierte CD Einheiten) waren wie folgt (gezeigt als NT-3 (10 ng/ml) Anti-NT-3 (μg/ml): –/– Spur, 0,1; +/– Spur, 4,0; IgG, 7,5; 0,001 mg/ml, 6,2; 0,01 mg/ml, 4,0; 0,1 mg/ml, 3,6; 1,0 mg/ml, 7,8; 10,0 mg/ml, 1,2. Somit reduziert Anti-NT-3 (PeproTech Inc., 500-P82) bei 10 μg/ml die trk Phosphorylierung um ungefähr 70 % relativ zu der Nicht-Anti-NT-3 Behandlung in Zellen, die für Minuten mit 10 ng/ml NT-3 behandelt wurden.
  • Die folgenden Beispiele zeigen experimentelle Ergebnisse für Antitumoraktivität der erfindungsgemäßen Antikörper. Die Tumormodelle, die in diesen Experimenten verwendet wurden, sind Prostatakrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs Xe notransplantate in Nacktmäusen, die dem Fachmann als bevorzugte präklinische Tiermodelle gut bekannt sind, die mit in vivo klinischen Ergebnissen korrelieren. Gegenwärtige Referenzen, welche die besondere Relevanz dieser Xenotransplantmodelle in den entsprechenden humanen Erkrankungen zeigen, schließen Plonowski et al., Cancer Res., 1999, 59, 1947, Joseph et al., Cancer Res., 1997, 57, 1054, Pinski, et al., Int. J. Cancer, 1993, 55, 963, Gao et al., Cancer Res., 1998, 58, 1391 und Tan, et al., Tumour Biology, 1985, 6, 89, ein.
  • Beispiel 3: Inhibition des PC-3 Prostatakrebs Xenotransplantatwachstums durch Neurotrophin Antikörper
  • Die folgenden Neurotrophin Antikörper wurden verwendet: Anti-NGF (PeproTech 500-P85), Anti-BDNF (PeproTech 500-P84), Anti-NT-3 (PeproTech 500-P82) und Anti-NT-4/5 (PeproTech 500-P83). Die Anti-NGF und Anti-NT-3 Antikörper blockieren die trkA und trkC Autophosphorylierung, die der Neurotrophin Behandlung von kultivierten Zellen folgt. Von jedem der Antikörper wurde gezeigt, dass er die Aktivität seines verwandten Neurotrophins in einem Biosassay blockiert, indem die ChAT Aktivität in Ratten basalen Vorderhirnzellkulturen gemessen wird.
  • PC-3 humane Prostatatumorzellen (5 × 106 Zellen/Maus) wurden subkutan in die Flanke von acht bis zehn Wochen alten, weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus (nu/nu, Charles River, Raleigh, NC) injiziert. Die Mäuse wogen zwischen 22-25 Gramm am Tag der Tumorimplantation. Nachdem die Xenotransplantate 100-500 mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse randomisiert und in experimentelle Gruppen eingeteilt. Einigen experimentellen Gruppen wurde ein Cocktail aus Neurotrophin Antikörpern (jeweils 4 × 25 μg oder jeweils 4 × 100 μg Anti-NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5) oder normales Kaninchen IgG (100 μg oder 400 μg; PeproTech 500-P00) in sterilem 1 × PBS (Gesamtvolumen von 100 μl) verabreicht. Alle Antikörper wurden intratumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen und peritumoral, subkutan (50 μl) an fünf Injektionsstellen verabreicht. In Experiment #1 erhielten die Mäuse Injektionen des Antikörpers einmal täglich an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10, 12 und 15. Es wurde kein Antikörper nach dem Tag 15 verabreicht. In Experiment #2 erhielten die Mäuse eine Injektion des Antikörpers einmal täglich an den Tagen 1, 3, 6, 8, 10, 13. Eine Maus, die 4 × 100 μg Neurotrophin Antikörper erhielt, verstarb aus unklaren Gründen am Tag 13. Die Tumorlänge und -breite wurde alle zwei bis drei Tage gemessen. CEP-751 wurde an eine getrennte experimentelle Gruppe als eine Kontrolle verabreicht, um zu verifizieren, dass die Tumoren gegenüber CEP-751 responsiv waren, wie zuvor für PC-3 Xenotransplantate gezeigt wurde, die an einer anderen Institution angezogen wurden. Die Mäuse erhielten einen Träger (40 % Polyethylenglykol, 10 % Povidon C30 und 2 % Benzylalkohol; 100 μl) oder CEP-751 (10 mg/kg s.c. 81D) in dem Träger (100 μl) sieben Tage pro Woche für 22 Tage. Die Tumorlänge und -breite wurden alle zwei bis drei Tage gemessen (an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19 und 22).
  • Die Tumorvolumina wurden berechnet als (Länge × Breite (Länge + Breite)/2)) × 0,526 (Isaacs, Cancer Res., 1989, 49, 6290-6294). Die durchschnittlichen Tumorvolumina und Standardfehler wurden berechnet (SigmaStat, Jandel Scientific, San Rafel, CA). Jede Maus mit einem Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse, der von dem durchschnittlichen Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse um mehr als zwei Standardabweichungen abwich, wurde aus der Analyse an jedem Datenpunkt entfernt. Die relativen Tumorvolumina wurden berechnet als (Durchschnitt vt/Durchschnitt vo), wobei sich vt auf das Tumorvolumen an einem gegebenen Tag bezieht, und vo ist das Volumen desselben Tumors zu Beginn der Dosierung (Tag 1). Jede Maus mit einem relativen Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse, das von dem durchschnittlichen relativen Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse um mehr als zwei Standardabweichungen abwich, wurde von der Analyse zu jedem Datenpunkt entfernt. Die Wahrscheinlichkeitswerte wurden durch den Mann-Whitney Rank Sum Test (SigmaStat) berechnet.
  • Experiment #1 Die Verabreichung der Neurotrophin Antikörper inhibierte das Wachstum von PC-3 Tumoren relativ zu Tumoren, die mit der IgG Kontrolle behandelt wurden. Die relativen Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) als die IgG Kontrollgruppe am Tag 3, und sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments am Tag 22 (p ≤ 0,05, Tag 5, p ≤ 0,01, Tag 8; p ≤ 0,001, Tage 10-22). Eine signifikante Regression der Tumore wurde an den Tagen 10 (35 %; p ≤ 0,001) und 12 (25 %; p ≤ 0,05) beobachtet. Nachdem die Behandlung mit neuralisierendem Antikörper beendet wurde (Tag 15), wurde erneutes Tumorwachstum am Tag 22 beobachtet (0,95 relatives Tumorvolumen, Tag 22, gegenüber 0,77 relatives Tumorvolumen, Tag 15). Die absoluten Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu der IgG Kontrollgruppe, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) am Tag 15, sie verblieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,05, Tag 17; p ≤ 0,01, Tage 19 und 22), und sie erreichten ein Minimum T/C von 0,33 am Tag 17.
  • Die Verabreichung von CEP-751 inhibierte das Wachstum von PC-3 Tumoren relativ zu der Trägerkontrolle. Die relativen Volumina der Tumore, die mit CEP-751 behandelt wurden, waren signifikant kleiner als die Trägerkontrollgruppe an den Tagen 12 (p ≤ 0,05), 17 (p ≤ 0,01), 19 (p ≤ 0,05) und 22 (p ≤ 0,01). Die absoluten Volumina der Tumore, die mit CEP-751 behandelt wurden, waren signifikant kleiner im Vergleich zu der Trägerkontrollgruppe am Tag 17 (p ≤ 0,01) und Tag 22 (p ≤ 0,05) und erreichten ein Minimum T/C von 0,44 am Tag 19.
  • Experiment #2 Die Verabreichung der Antikörper (jeweils 4 × 25 μg, oder jeweils 4 × 100 μg Anti-NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5) inhibierte das Wachstum von PC-3 Tumoren relativ zu Tumoren, die mit der IgG Kontrolle behandelt wurden. Die relativen Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05; 100 mg Neurotrophin Cocktail gegenüber 100 μg normalem IgG; 400 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 400 μg normalem IgG) als die IgG Kontrollgruppe am Tag 3, und sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments. Eine signifikante Regression der Tumore (400 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 400 μg normalem IgG) wurde am Tag 10 (31 %; p ≤ 0,05) und Tag 13 (19 %; p ≤ 0,05) beobachtet. Die absoluten Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu der IgG Kontrollgruppe, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) am Tag 8 (100 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 100 μg normalem IgG) und Tag 6 (400 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 400 μg normalem IgG), sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,005, Tage 10, 13, 15 für sowohl 100 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 100 μg normalem IgG und 400 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 400 μg normalem IgG), und sie erreichten ein Minimum T/C von 0,26 am Tag 15 (100 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 100 μg normalem IgG) oder ein Minimum T/C von 0,17 am Tag 13 (400 μg Neurotrophin Cocktail gegenüber 400 μg normalem IgG).
  • Beispiel 4: Inhibition von TSU-Pr1 Prostatakrebs Xenotransplantatwachstum durch Neurotrophin Antikörper
  • Experiment #1 Die folgenden Neurotrophin Antikörper wurden verwendet: Anti-NGF (PeproTech 500-P85), Anti-BDNF (PeproTech 500P84) und Anti-NT-3 (PeproTech 500-P82) und Anti-NT4/5 (PeproTech 500-P83).
  • TSU-Pr1 humane Prostatatumorzellen wurden subkutan in die Flanke von weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus (nu/nu; 5 × 106 Zellen/Mäuse) injiziert. Nachdem die Xenotransplantate 100-500 mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse randomisiert und in vier experimentelle Gruppen aufgeteilt. Einer Gruppe wurde ein Cocktail aus Neurotrophin Antikörpern (Anti-NGF, BDNF, NT-3 und NT4/5) verabreicht. Jede Dosis des Antikörper Cocktails (100 μl) enthielt 100 μg jedes Neurotrophin Antikörpers. Der zweiten experimentellen Gruppe wurde normales Kaninchen IgG (400 μg/100 μl; PeproTech 500-P00) als eine Kontrolle verabreicht. Alle Antikörper wurden intratumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen und peritumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen verabreicht. Die Mäuse erhielten Injektionen mit Antikörper einmal täglich, drei Tage pro Woche an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12. Die Tumorlänge und die -breite wurden alle zwei bis 3 Tage (Tage 1, 3, 5, 8, 10, 12 und 15) gemessen.
  • Die dritte experimentelle Gruppe erhielt CEP-701 in einem Träger (40 % Polyethylenglykol, 10 % Povidon C30 und 2 % Benzylalkohol), 10 mg/kg s.c. BID, fünf Ta ge pro Woche für 14 Tage. Die vierte experimentelle Gruppe erhielt nur den Träger (100 μl) gemäß dem Dosierungsplan der dritten experimentellen Gruppe. Tumorlänge und -breite wurden alle zwei bis drei Tage (Tage 1, 3, 5, 8, 10, 12 und 15) gemessen.
  • Die Tumorvolumina wurden wie oben beschrieben berechnet. Die durchschnittlichen Tumorvolumina und Standardfehler wurden wie oben beschrieben berechnet. Jede Maus mit Tumorvolumina, die von den durchschnittlichen Tumorvolumina um mehr als zwei Standardabweichungen abwichen, wurden von der Analyse an jedem Datenpunkt entfernt. Für die relativen Tumorvolumina wurde jeder Datenpunkt für eine gegebene Maus mit dem Tumorvolumen dieser Maus zu Beginn der Dosierung (Tag 1) normalisiert. Wahrscheinlichkeitswerte wurden wie oben beschrieben berechnet. Es wurden keine Todesfälle oder Morbidität in irgendeiner der experimentellen Gruppen beobachtet, was anzeigte, dass CEP-701 und die neutralisierenden Antikörper in diesen Tieren gut toleriert wurden.
  • Die Verabreichung der Neurotrophin Antikörper führte zu geringeren relativen Tumorvolumina relativ zu den Tumorvolumina in der IgG Kontrollgruppe. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,0001) als die relativen Tumorvolumina in der IgG behandelten Kontrollgruppe am Tag 5, und sie verbleiben kleiner während der verbleibenden Zeit des Experiments (p ≤ 0,01 Tage 8 und 10; p ≤ 0,0001 Tage 12 und 15). Die absoluten Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu der IgG Kontrollgruppe waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) am Tag 10, sie verblieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,001 Tag 12; p ≤ 0,01 Tag 15) und erreichten ein Minimum T/C von 0,41 am Tag 15.
  • Die Verabreichung von CEP-701 führte zu geringeren relativen Tumorvolumina relativ zu den Tumorvolumina in der Trägerkontrollgruppe. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit CEP-701 behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) am Tag 3 als die mit dem Träger behandelte Kontrollgruppe, und sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,01, Tag 5; p ≤ 0,05, Tag 8; p ≤ 0,01, Tage 10 und 12; p ≤ 0,001 Tag 15). Die absoluten Volumina der Tumore, die mit CEP-701 behandelt wurden, waren signifikant kleiner im Vergleich zu der Trägerkontrollgruppe am Tag 8 (p ≤ 0,05), sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,05, Tag 10; p ≤ 0,001, Tage 12 und 15), und sie erreichten ein Minimum T/C von 0,29 an den Tagen 12 und 15.
  • Es schien, dass die Tumore, die mit dem normalen IgG behandelt wurden, langsamer wuchsen als jene, die mit dem Träger für CEP-701 behandelt wurden; jedoch gab es keinen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied in den Tumorvolumina oder den relativen Tumorvolumina zwischen den zwei Gruppen zu irgendeiner Zeit während des Experiments.
  • Dieses Experiment zeigte, dass die Neurotrophin Antikörper das TSU-Pr1 Xenotransplantatwachstum inhibieren. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit neutralisierenden Antikörpern behandelt wurden, waren signifikant kleiner als die Kontrollgruppe, die mit normalem IgG behandelt wurde, am Tag 5 (p ≤ 0,0001), den Tagen 8 und 10 (p ≤ 0,01) und den Tagen 12 und 15 (p ≤ 0,0001). Weil die Neurotrophin Antikörper das Tumorwachstum relativ zu normalem IgG inhibierten, ist es wahrscheinlich, dass die Wirkung der Neurotrophin Antikörper in dem Blockieren der Neurotrophin Signalweiterleitung durch trk Neurotrophin Rezeptoren begründet ist, im Gegensatz zu einer allgemeinen Wirkung von der Injektion des IgG in Tumore.
  • Experiment #2 Die folgenden Neurotrophin Antikörper wurden verwendet: Anti-NGF (PeproTech 500-P85), Anti-BDNF (PeproTech 500-P84), Anti-NT-3 (Pepro-Tech 500-P82) Anti-NT4/5 (PeproTech 500-P83).
  • TSU-Pr1 humane Prostatatumorzellen wurden subkutan in die Flanke von weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus (nu/nu; 5 × 106 Zellen/Mäuse) injiziert. Nachdem die Xenotransplantate 100-500 mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse randomi siert und in sechs experimentelle Gruppen eingeteilt. Der ersten Gruppe wurde anti-NGF (100 μg) + normales Kaninchen IgG (300 μg) pro Dosis verabreicht. Der zweiten Gruppe wurde Anti-NT-3 (100 μg) + normales Kaninchen IgG (300 μg) pro Dosis verabreicht. Der dritten Gruppe wurde Anti-NT4/5 (100 μg) + normales Kaninchen IgG (300 μg) pro Dosis verabreicht. Der vierten Gruppe wurde Anti-BDNF (100 μg) + normales Kaninchen IgG (300 μg) pro Dosis verabreicht. Der fünften Gruppe wurde ein Cocktail aus Neurotrophin Antikörpern (Anti-NGF, BDNF, NT-3 und NT4/5 (100 μg jedes Antikörpers pro Dosis)) verabreicht. Der sechsten experimentellen Gruppe wurde normales Kaninchen IgG (400 μg pro Dosis; PeproTech 500-P00) als eine Kontrolle verabreicht. Jede Dosis (400 μg Gesamtprotein pro 100 μl PBS) wurde intratumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen und peritumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen, einmal täglich, drei Tage pro Woche an den Tagen 1, 3, 6, 8, 10 und 13 injiziert. Die Tumorlänge und -breite wurden alle zwei bis drei Tage (Tage 1, 3, 6, 8, 10, 13 und 15) gemessen.
  • Die Tumorvolumina wurden wie oben beschrieben berechnet. Die durchschnittlichen Tumorvolumina und Standardfehler wurden ebenfalls wie oben beschrieben berechnet. Jede Maus mit Tumorvolumina, die von den durchschnittlichen Tumorvolumina um mehr als zwei Standardabweichungen abwichen, wurden aus der Analyse an jedem Datenpunkt entfernt. Für die relativen Tumorvolumina wurde jeder Datenpunkt für eine gegebene Maus mit dem Tumorvolumen dieser Maus zu Beginn der Dosierung (Tag 1) normalisiert. Wahrscheinlichkeitswerte wurden wie oben beschrieben errechnet. Es wurden keine Todesfälle oder Morbidität in irgendeiner der experimentellen Gruppen beobachtet, was anzeigt, dass die neutralisierenden Antikörper in diesen Tieren gut toleriert werden.
  • Der Cocktail aus Neurotrophin Antikörpern (Anti-NGF, Anti-NT-3, Anti-BDNF und Anti-NT4/5), Anti-NGF oder Anti-NT-3 inhibierten das Tumorwachstum relativ zu normalem Kaninchen IgG. Weder Anti-NT-415 noch Anti-BDNF wiesen eine signifikante Wirkung auf das Tumorwachstum relativ zu normalem Kaninchen IgG auf. Die relativen Tumorvolumina für die Gruppe, die den Neurotrophin Antikörper Cocktail erhielt, waren signifikant kleiner als die relativen Tumorvolumina für die IgG Kontrollgruppe am Tag 3 (p ≤ 0,01) und Tag 8 (p ≤ 0,05), sie blieben kleiner während der verbleibenden Zeit des Experiments (p ≤ 0,01 Tage 10, 13 und 15). Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit Anti-NGF behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,001) als das relative Tumorvolumen in der mit IgG behandelten Kontrollgruppe am Tag 3, und sie blieben kleiner während der verbleibenden Zeit des Experiments (p ≤ 0,001 Tag 6; p ≤ 0,01 Tag 8; p ≤ 0,001 Tag 10; p ≤ 0,01 Tag 13; p ≤ 0,001 Tag 15). Das relative Tumorvolumen der Tumore, die mit Anti-NT-3 behandelt wurden, war signifikant kleiner (p ≤ 0,05) als die Tumore in der IgG Kontrollgruppe am Tag 6, und sie blieben kleiner während der verbleibenden Zeit des Experiments (p ≤ 0,01 Tag 8; p ≤ 0,001 Tag 10; p ≤ 0,01 Tag 13; p ≤ 0,001 Tag 15).
  • Die absoluten Tumorvolumina der Gruppe mit dem Neurotrophin Antikörper Cocktail waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05 Tag 8; p ≤ 0,01 Tage 10, 13 und 15) im Vergleich zu der mit IgG behandelten Kontrollgruppe und erreichten ein Minimum T/C von 0,52 am Tag 13. Die absoluten Tumorvolumina der Gruppe, die Anti-NGF erhielten, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05, Tag 3; p ≤ 0,001, Tage 6, 8, 10, 13; und p ≤ 0,01 Tag 15) im Vergleich zu der mit IgG behandelten Kontrollgruppe und erreichten ein Minimum T/C von 0,34 am Tag 13. Eine Regression wurde in der Anti-NGF Gruppe am Tag 3 (20 %, p ≤ 0,001), am Tag 6 (31 %, p ≤ 0,01), am Tag 8 (35 %, p ≤ 0,001), am Tag 10 (35 %, ≤ 0,01) und am Tag 13 (37 %, p ≤ 0,01) beobachtet. Die absoluten Tumorvolumina der Gruppe, die Anti-NT-3 erhielten, war signifikant kleiner (p ≤ 0,05, Tag 6; p ≤ 0,01, Tage 8, 10, 13 und 15) im Vergleich zu den mit IgG behandelten Kontrollen und erreichte ein Minimum T/C von 0,38 am Tag 13. Eine Regression wurde in der Anti-NT-3 Gruppe am Tag 8 (16 %, p ≤ 0,001), am Tag 10 (33 %, p ≤ 0,001) und am Tag 13 (29%, p ≤ 0,01) beobachtet.
  • Ein Vergleich der Wirkungen von Anti-NGF oder Anti-NT-3 relativ zu dem Neurotrophin Antikörper Cocktail zeigte, dass jeder dieser individuellen Neurotrophin Antikörper transient das Tumorwachstum wirksamer inhibierte als der Neurotrophin Antikörper Cocktail. Die relativen und absoluten Tumorvolumina der Anti- NGF Gruppe waren signifikant kleiner als die der Gruppe mit dem Neurotrophin Antikörper Cocktail am Tag 8 (p ≤ 0,01) und Tag 10 (p ≤ 0,05). Das Anti-NGF inhibierte das Tumorwachstum jeweils um 57 und 64 Prozent, relativ zu normalem Kaninchen IgG an den Tagen 8 und 10, während der Neurotrophin Antikörper Cocktail das Wachstum jeweils um 32 und 43 Prozent relativ zu dem normalen Kaninchen IgG an den Tagen 8 und 10 inhibierte. Das relative Tumorvolumen der Anti-NT-3 Gruppe war signifikant kleiner als der Gruppe mit dem Neurotrophin Antikörper Cocktail am Tag 10 (p ≤ 0,05). Der Anti-NT-3 inhibierte das Tumorwachstum um 60 Prozent relativ zu normalem Kaninchen IgG am Tag 10, während der Neurotrophin Antikörper Cocktail das Wachstum um 43 Prozent relativ zu normalem Kaninchen IgG am Tag 10 inhibierte. Die Ergebnisse aus diesem Experiment zeigen, dass Anti-NGF oder Anti-NT-3 das Wachstum von TSU-Pr1 Xenotransplantaten ebenso und transient besser inhibiert als der Antikörper Cocktail (Anti-NGF, Anti-NT-3, Anti-BDNF und Anti-NT-4/5).
  • Bei einer Dosis von 100 μg weisen weder Anti-NT-4/5 noch Anti-BDNF eine signifikante Wirkung auf das Wachstum von TSU-Pr1 Tumoren in Nacktmäusen auf, obwohl es möglich ist, dass verschiedene NT-4/5 oder BDNF neutralisierende Antikkörper oder eine andere Konzentration dieser Antikörper zu einer signifikanten Wirkung auf das Tumorwachstum führen könnte. Vorherige Daten, welche die trkB Expression in TSU-Pr1 Zellen analysierten, zeigten, dass trkB in dieser Zelllinie nicht exprimiert wird (Dionne et al., 1998). Weil BDNF und NT-4/5 ihr Signal hauptsächlich durch trkB (Barbacid, 1995; Ibanez, 1995) weiterleiten, stimmt der Mangel einer Wirkung, der in unserem Experiment beobachtet wurde, mit der Abwesenheit des Rezeptors überein.
  • Beispiel 5: Inhibition von AsPC-1 Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenotransplantatwachstum durch Neurotrophin Antikörper
  • Die folgenden Neurotrophin Antikörper wurden verwendet: Anti-NGF (PeproTech 500-P85), Anti-BDNF (PeproTech 500-P84), Anti-NT-3 (PeproTech 500-P82) Anti-NT4/5 (PeproTech 500-P83).
  • AsPC-1 humane Bauchspeicheldrüsentumorzellen wurden subkutan in die Flanke von weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus (nu/nu; 5 × 106 Zellen/Mäuse) injiziert. Nachdem das Xenotransplantat 100-500 mm3 erreicht hatte, wurden die Mäuse randomisiert und in vier experimentelle Gruppen eingeteilt. Einer Gruppe wurde ein Cocktail aus Neurotrophin Antikörpern (Anti-NGF, BDNF, NT-3 und NT4/5) verabreicht. Jede Dosis des Antikörper Cocktails (100 μl) enthielt 10.0 μg jedes Neurotrophin Antikörpers. Der zweiten experimentellen Gruppe wurde normales Kaninchen IgG (400 μg/100 μl; PeproTech 500-P00) als eine Kontrolle verabreicht. Alle Antikörper wurden intratumoral (50 μl) an fünf Injektionsstellen und peritumoral (50 μl) and fünf Injektionsstellen verabreicht. Die Mäuse erhielten die Injektionen des Antikörpers einmal täglich, drei Tage pro Woche an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12. Die Tumorlänge und -breite wurde alle zwei bis drei Tage (Tage 1, 3, 5, 8, 10, 12 und 15) gemessen. Die dritte experimentelle Gruppe erhielt CEP-701 in einem Träger (40 % Polyethylenglykol, 10 % Povidon 030 und 2 % Benzylalkohol), 10 mg/kg s.c. BID, fünf Tage pro Woche für 14 Tage. Die vierte experimentelle Gruppe erhielt nur Träger (100 μl) gemäß dem Dosierungsplan der dritten experimentellen Gruppe. Die Tumorlänge und -breite wurden alle zwei bis drei Tage (Tage 1, 3, 5, 8, 10, 12 und 15) gemessen.
  • Die Tumorvolumina wurden wie oben beschrieben berechnet. Die durchschnittlichen Tumorvolumina und Standardfehler wurden ebenfalls wie oben beschrieben berechnet. Jede Maus mit Tumorvolumina, die von den durchschnittlichen Tumorvolumina um mehr als zwei Standardabweichungen abwichen, wurden aus der Analyse zu jedem Datenpunkt entfernt. Für die relativen Tumorvolumina wurde jeder Datenpunkt für eine gegebene Maus mit dem Tumorvolumen dieser Maus zu Beginn der Dosierung (Tag 1) normalisiert. Die Wahrscheinlichkeitswerte wurden wie oben beschrieben berechnet. Es wurden keine Todesfälle oder Morbidität in irgendeiner der experimentellen Gruppe beobachtet, was anzeigt, dass CEP-701 und die neutralisierenden Antikörper in diesen Tieren gut toleriert werden.
  • Die Verabreichung der Neurotrophin Antikörper führte zu geringeren relativen Tumorvolumina im Vergleich zu Tumorvolumina in der IgG Kontrollgruppe. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) als die mit IgG behandelte Kontrollgruppe an den Tagen 5, 10, 12 und 15. Die absoluten Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu der IgG Kontrollgruppe, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,01) am Tag 5, sie blieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,01, Tage 8, 10, 12 und 15) und erreichten ein Minimum T/C von 0,43 am Tag 15.
  • Die Verabreichung von CEP-701 führte zu geringeren relativen Tumorvolumina im Vergleich zu den Tumorvolumina in der Trägerkontrollgruppe. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit CEP-701 behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,01) als die mit Träger behandelte Kontrollgruppe am Tag 3 und verblieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,001, Tag 5; p ≤ 0,01, Tag 8; p ≤ 0,001, Tag 10; p ≤ 0,01, Tag 12 und p ≤ 0,001, Tag 15). Die absoluten Volumina der Tumore, die mit CEP-701 behandelt wurden, waren signifikant kleiner im Vergleich zu der Trägerkontrollgruppe am Tag 5 (p ≤ 0,05), verblieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments (p ≤ 0,05, Tage 8, 10, 12 und 15) und erreichten ein Minimum T/C von 0,27 am Tag 15.
  • Dieses Experiment zeigt, dass Neurotrophin Antikörper das AsPC-1 Xenotransplantwachstum inhibieren. Weil die Neurotrophin Antikörper das Tumorwachstum relativ zu normalem IgG inhibierten, ist es wahrscheinlich, dass die Wirkung der Neurotrophin Antikörper in dem Blockieren der Neurotrophin Signalweiterleitung durch die trk Neurotrophin Rezeptoren begründet ist, im Gegensatz zu einer allgemeinen Wirkung von der Injektion von IgG in Tumore. Es erschien, dass die Tumore, die mit normalem IgG behandelt wurden, langsamer wuchsen, als jene, die mit dem Träger für CEP-701 behandelt wurden; jedoch gab es keinen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied in den Tumorvolumina oder relativen Tumor volumina zwischen diesen zwei Gruppen zu irgendeiner Zeit während des Experiments.
  • Beispiel 6: Vergleichende Ergebnisse für CFPAC Bauchspeicheldrüsentumor Xenotransplantate, die mit Neurotrophin Antikörpern behandelt wurden
  • Die folgenden Neurotrophin Antikörper wurden verwendet: Anti-NGF (PeproTech 500-P85), Anti-BDNF (PeproTech 500-P84), Anti-NT-3 (PeproTech 500-P82) Anti-NT4/5 (PeproTech 500-P83).
  • Die humanen Bauchspeicheldrüsenkarzinom Zelllinien AsPC-1 und CFPAC wurden jeweils in RPMI oder DMEM Medien (Cellgro/Mediatech, Washington, D.C.), die 10 % fötales Rinderserum (Altans Biologicals, Norcross, GA) enthielten, bei 37°C in einem angefeuchteten Inkubator mit 95 % Luft/5 % CO2 Atmosphäre angezogen. Die Zellen wurden als frei von Mycoplasmen und Nagerviren (MAP Test) bestimmt. Exponentiell wachsende Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin/EDTA (GibcoBRL, Rockville, MD) geerntet und unter Verwendung von Trypan Blau (Fisher Scientific, Malvern, PA) gezählt. Die Zellen wurden in einem geeigneten Wachstumsmedium 1:1 mit Matrigel (Fisher Scientific) resuspendiert.
  • Weibliche nu/nu Mäuse ohne Thymus (8-10 Wochen alt; Charles River, Raleigh, NC) wurden zu fünft pro Käfig in Mikroisolatoreinheiten gehalten. Die Tiere wurden mit einer herkömmlichen Nahrung und Wasser ad libitum gefüttert, bei 48 ± 2 % Luftfeuchtigkeit und 22 ± 2°C gehalten, und der Licht-Dunkel-Zyklus wurde bei 12 Stunden Intervallen eingestellt. Die Mäuse wurden unter Quarantäne für mindestens 1 Woche vor der experimentellen Manipulation gehalten. Die Mäuse wogen zwischen 22 und 25 g am Tag der Inokulation der Tumorzellen. Exponentiell wachsende Zellen, die wie oben beschrieben kultiviert wurden, wurden geerntet und in die rechte Flanke der Nacktmäuse injiziert (5 × 106 Zellen/Maus). Die Tiere, die Tumore mit 100-400 mm3 (AsPC-1) oder 100-900 mm3 (CFPAC) zehn Tage nach der Inokulation trugen, wurden in die geeigneten Gruppen randomisiert. Die Behandlung wurde mit einem Cocktail aus Neurotrophin neutralisierenden Anti körpern (Anti-NGF, Anti-BDNF, Anti-NT-3 und Anti-NT4/5, 100 μg jedes Antikörpers in einem Gesamtvolumen von 100 μl, 50 μl intratumoral und 50 μl peritumoral) oder normalem Kaninchen IgG (400 μg/100 μl, 50 μl intratumoral und 50 μl peritumoral) begonnen. Die Mäuse erhielten Injektionen mit Antikörpern oder normalem Kaninchen IgG einmal täglich, drei Tage pro Woche an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12.
  • Die Tumore wurden alle 2-4 Tage unter Verwendung eines Vernier Calipers gemessen. Die Tumorvolumina wurden wie oben beschrieben berechnet. Die durchschnittlichen Tumorvolumina und Standardfehler wurden ebenfalls wie oben beschrieben berechnet. Jede Maus mit einem Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse, der von dem durchschnittlichen Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse um mehr als zwei Standardabweichungen abwich, wurde aus der Analyse zu jedem Datenpunkt entfernt. Die statistischen Analysen wurden wie oben beschrieben berechnet, wobei p ≤ 0,05 signifikant erschien.
  • Die Verabreichung der Neurotrophin Antikörper (Anti-NGF, Anti-BDNF, Anti-NT-3, Anti-NT4/5) gegen AsPC-1 Xenotransplantate führte zu geringeren relativen Tumorvolumina im Vergleich zu den Tumorvolumina in der IgG Kontrollgruppe. Die relativen Tumorvolumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, waren signifikant kleiner (p ≤ 0,05) als die mit IgG behandelte Kontrollgruppe zu Beginn von Tag 5 und verblieben kleiner von Tag 10 bis zum Abschluss des Experiments. Die absoluten Volumina der Tumore, die mit Neurotrophin Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu IgG behandelten Kontrolltieren waren signifikant kleiner (p ≤ 0,01) am Tag 5, verblieben kleiner bis zum Abschluss des Experiments und erreichten eine maximale 55 % Inhibition des Tumorwachstums am Tag 15.
  • Die Verabreichung der Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern inhibierte nicht das Wachstum von CFPAC Tumore relativ zu den Tumoren, die mit der IgG Kontrolle behandelt wurden. Der Mangel an Inhibition durch die Neurotrophin neutralisierenden Antikörper legt nahe, dass diese Xenotransplantate für das Wachstum nicht von Neurotrophin abhängig sind. Die CFPAC Nichtantwort ist konsistent mit zuvor publizierten Daten, das CFPAC Tumorwachstum nicht sensitiv gegenüber einer Behandlung mit dem pan-trk Inhibitor CEP-701 war, wohingegen das Wachstum von AsPC-1 Tumore durch CEP-701 inhibiert wurde.
  • Es gab keine offensichtlichen Zeichen für Morbidität oder Todesfälle in den experimentellen Gruppen, die mit dem neutralisierenden Antikörper in Verbindung stehen, und die Körpergewichte waren zwischen den Tieren, die mit neutralisierendem Antikörper und den Tieren, die mit normalem Kaninchen IgG (Tabellen 2 und 4 behandelt wurden), vergleichbar. Diese Daten zeigen, dass neutralisierende Antikörper von diesen Tieren in Dosen gut toleriert wurden, bei denen eine signifikante Antitumorwirksamkeit beobachtet wurde. Tabelle 1 Antitumor Wirksamkeit von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Bauchspeicheldrüsen Xenotransplantate in Nacktmäusen: relatives Tumorvolumen (absolutes Tumorvolumen)
    Gruppe neutralisierender Antikörper (jeweils 100 μg BA/100 μl) normales Kaninchen IgG (400 μg/100 ul)
    Tag 1 1,0 ± 0,0 (212,60 ± 21,30) n = 10 1,0 ± 0,0 (203,90 ± 19,30) n = 9 (n = 10)
    Tag 3 1,14 ± 0,17 (225,57 ± 25,53) n = 10 1,39 ± 0,16 (276,13 ± 1,25) n = 9 (n = 10)
    Tag 5 1,12 ± 0,24* (208,66 ± 28,45**) n = 10 1,70 ± 0,18 (340,29 ± 45,54) n = 9 (n = 10)
    0,0,1 Tag 8 1,23 ± 0,22 (228,87 ± 24,72**) n = 10 1,87 ± 0,20 (381,04 ± 50,90) n = 9 (n = 10)
    Tag 10 1,123 ± 0,31* (199,98 ± 41,90**) n = 10 2,12 ± 0,25 (432,43 ± 51,02) n = 9 (n = 10)
    Tag 12 1,341 ± 0,41* (238,87 ± 58,90**) n = 10 2,64 ± 0,35 (520,87 ± 63,49) n = 9 (n = 10)
    Tag 15 1,66 ± 0,47* (296,31 ± 64,43**) n = 10 3,06 ± 0,42 (659,38 ± 89,35) n = 9 (n = 10)
  • Nacktmäuse, die ASPC1 Tumore trugen, wurden mit neutralisierendem Antikörper (jeweils 100 μg Ab/100 μl, intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) oder normalem Kaninchen IgG in sterilem PBS (100 μg/100 μl intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) behandelt. Die Tumorvolumina wurden für 2-3 Tage bestimmt. Die Werte sind der Durchschnitt ± SE des relativen Tumorvolumens. Die Werte in Klammern sind der Durchschnitt ± SE aktuelles Tumorvolumen (mm3). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 im Mann-Whitney Rank Sum Test. Tabelle 2 Die Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf die Kör pergewichte von Nacktmäusen, die AsPC-1 Xenotransplantate tragen
    Gruppe neutralisierender Antikörper (jeweils 100 μg AB/100 μl) normales Kaninchen IgG (400 μg/100 μl)
    Tag 1 23,1 ± 0,3 n = 10 23,3 ± 0,3 n = 10
    Tag 3 22,9 ± 0,3 n = 10 22,1 ± 0,3 n = 10
    Tag 5 22,9 ± 0,4 n = 10 23,5 ± 0,3 n = 10
    Tag 8 22,9 ± 0,3 n = 10 23,4 ± 0,5 n = 10
    Tag 10 23,0 ± 0,3 n = 10 22,9 ± 0,2 n = 10
    Tag 12 22,8 ± 0,3 n = 10 23,3 ± 0,4 n = 10
    Tag 15 24,4 ± 0,4 n = 10 24,3 ± 0,4 n = 10
  • Nacktmäuse, die ASPC1 Tumore trugen, wurden mit neutralisierendem Antikörper (jeweils 100 μg Ab/100 μl, intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) oder normalem Kaninchen IgG in sterilem PBS (100 μg/100 μl intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) behandelt. Die Werte sind der Durchschnitt ± SE des Körpergewichts. Tabelle 3 Wirkung von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Bauchspeicheldrüsen Xenotransplantate in Nacktmäusen: relatives Tumorvolumen (absolutes Tumorvolumen)
    Gruppe neutralisierender Antikörper (jeweils 100 μg AB/100 μl) normales Kaninchen IgG (400 μg/100 μl)
    Tag 1 1,0 ± 0,0 (430,9 ± 88,3) n = 8 (n = 9) 1,0 ± 0,0 (430,6 ± 81,4) n = 8 (n = 9)
    Tag 4 1,34 ± 0,10 (587,68 ± 136,78) n = 8 (n = 9) 1,24 ± 0,07 (530,76 ± 91,3) n = 8 (n = 9)
    Tag 8 2,07 ± 0,24 (899,45 ± 243,6) n = 8 (n = 9) 2,12 ± 0,18 (850,7 ± 157,1) n = 8 (n = 9)
    Tag 10 2,84 ± 0,34 (1313,1 ± 358,7) n = 8 (n = 9) 2,61 ± 0,24 (1177,2 ± 210,2) n = 8 (n = 9)
    Tag 14 3,58 ± 0,51 (1888,5 ± 544,1) n = 8 (n = 9) 3,06 ± 0,28 (1482,0 ± 298,5) n = 8 (n = 9)
  • Nacktmäuse, die CFPAC Tumore trugen, wurden mit neutralisierendem Antikörper (jeweils 100 μg Ab/100 μl, intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) oder normalem Kaninchen IgG in sterilem PBS (400 μg/100 μl intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) behandelt. Die Tumorvolumina wurden für 3-4 Tage bestimmt. Die Werte sind der Durchschnitt ± SE des relativen Tumorvolumens. Die Werte in Klammern sind der Durchschnitt ± SE aktuelles Tumorvolumen (mm3). Tabelle 4: Die Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf die Kör pergewichte von Nacktmäusen, die CFPAC Xenotransplantate tragen
    Gruppe neutralisierender Antikörper (jeweils 100 μg AB/100 μl) normales Kaninchen IgG (400 μg/100 μl)
    Tag 1 22,6 ± 0,4 n = 9 22,4 ± 0,4 n = 9
    Tag 4 23,3 ± 0,4 n = 9 24,2 ± 0,5 n = 9
    Tag 8 25,1 ± 0,5 n = 9 25,6 ± 0,6 n = 9
    Tag 10 25,5 ± 0,5 n = 9 25,8 ± 0,5 n = 9
    Tag 14 25,9 ± 0,6 n = 9 26,6 ± 0,4 n = 9
  • Nacktmäuse, die CFPAC Tumore trugen, wurden mit neutralisierendem Antikörper (jeweils 100 μg Ab/100 μl, intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) oder normalem Kaninchen IgG in sterilem PBS (400 μg/100 μl intratumoral und peritumoral qd an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12) behandelt. Die Körpergewichte wurden alle 3-4 Tage bestimmt. Die Werte sind der Durchschnitt ± SE des Körpergewichts (g).
  • Beispiel 7: Einzeln berechnete Tumorvolumina und Körpergewicht
  • Exponentiell wachsende Zellen, die wie oben beschrieben kultiviert wurden, wurden geerntet und in die rechte Flanke von Nacktmäusen injiziert (5 × 106 Zellen/Maus). Tiere, die Tumore mit 100-500 mm3 Größe trugen, wurden in die geeigneten Gruppen randomisiert, und unter Verwendung eines Cocktails aus Neurotrophin (Anti-NGF, Anti-BDNF, Anti-NT-3 und Anti-NT-4/5) neutralisierenden Antikörpern (100 μg jedes Antikörpers in einem Gesamtvolumen von 100 μl, 50 μl intratumoral und 50 μl peritumoral) oder normalem Kaninchen IgG/400 μg/100 μl, 50 μl intratumoral und 50 μl peritumoral) dosiert. Die Mäuse erhalten Injektionen von Antikörpern einmal täglich, drei Tage pro Woche an den Tagen 1, 3, 5, 8, 10 und 12.
  • Die Tumore wurden alle 2-3 Tage unter Verwendung eines Vernier Calipers gemessen. Tumorvolumina, durchschnittliche Tumorvolumina und Standardfehler wurden ebenfalls wie oben beschrieben berechnet. Die relativen Tumorvolumina wurden zu jedem Datenpunkt unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt: durchschnittliches vt/durchschnittliches vo, wobei sich vt auf das Tumorvolumen an einem gegebenen Tag bezieht und vo sich auf das Tumorvolumen zu Beginn der Dosierung (Tag 1) bezieht. Jede Maus mit einem Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse, der von dem durchschnittlichen Tumorvolumen am letzten Tag der Analyse um mehr als zwei Standardabweichungen abwich, wurde aus der Analyse zu jedem Datenpunkt entfernt. Die statistischen Analysen wurden wie oben beschrieben berechnet, wobei p ≤ 0,05 signifikant erschien.
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 1
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 7,60 9,80 339,28 1,00
    100 μg/100 μl L-1 6,60 8,10 205,74 1,00
    it, pt R-2 7,40 5,90 152,02 1,00
    L-2 8,80 7,60 287,15 1,00
    N = 10 Un 5,80 7,20 142,13 1,00
    2 R-1 6,60 7,60 186,47 1,00
    L-1 7,40 8,60 266,58 1,00
    R-2 5,60 8,10 162,69 1,00
    L-2 7,20 6,00 149,29 1,00
    Un 6,60 8,80 234,16 1,00
    Durchschnitt 212,60 1,00
    Std. Fehler 21,30 0,00
    IgG 3 R-1 7,70 7,10 211,83 1,00
    100 μg/100 μl L-1 7,60 8,30 262,58 1,00
    it, pt R-2 7,10 7,30 195,39 1,00
    L-2 6,00 6,80 136,72 1,00
    N = 10 Un 7,60 6,60 186,47 1,00
    4 R-1 5,70 7,40 144,66 1,00
    L-1 8,30 7,70 267,71 1,00
    R-2 7,00 7,50 199,30 1,00
    L-2 6,00 6,40 124,66 1,00
    Un 8,00 8,80 309,64 1,00
    Durchschnitt 203,90 1,00
    Std. Fehler 19,30 0,00
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 3
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 7,00 8,00 219,91 0,65
    100 μg/100 μl L-1 8,90 8,00 315,02 1,53
    it, pt R-2 8,80 6,10 209,40 1,38
    L-2 9,20 7,90 325,37 1,13
    N = 10 Un 6,80 10,00 299,08 2,10
    2 R-1 5,90 7,40 152,02 0,82
    L-1 6,00 8,00 175,93 0,66
    R-2 9,60 7,20 304,01 1,87
    L-2 5,00 6,50 97,85 0,66
    Un 5,70 7,80 157,13 0,67
    Durchschnitt 225,50 1,14
    Std. Fehler 25,50 0,17
    IgG 3 R-1 9,00 7,40 285,95 1,35
    100 μg/100 μl L-1 6,90 7,80 207,12 0,79
    it, pt R-2 7,00 8,30 232,72 1,19
    L-2 6,70 7,00 168,21 1,23
    N = 10 Un 9,80 6,00 243,22 1,30
    4 R-1 10,00 6,80 299,08 2,07
    L-1 11,60 9,60 618,07 2,31
    R-2 6,50 8,00 197,40 0,99
    L-2 6,35 7,90 187,15 1,50
    Un 9,60 7,50 322,33 1,04
    Durchschnitt 276,12 1,37
    Std. Fehler 41,25 0,15
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 5
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 6,90 7,00 175,76 0,52
    100 μg/100 μl L-1 8,90 7,00 259,33 1,26
    it, pt R-2 8,50 6,20 202,81 1,33
    L-2 6,60 7,80 194,08 0,68
    N = 10 Un 7,90 11,00 429,98 3,03
    2 R-1 5,60 6,60 118,05 0,63
    L-1 6,80 7,00 171,97 0,65
    R-2 8,00 7,60 248,31 1,53
    L-2 7,40 6,00 155,76 1,04
    Un 6,00 6,60 130,63 0,56
    Durchschnitt 208,66 1,12
    Std. Fehler 28,40 0,24
    IgG 3 R-1 7,50 8,80 281,64 1,33
    100 μg/100 μl L-1 8,90 6,90 254,02 0,97
    it, pt R-2 7,90 9,50 341,88 1,75
    L-2 9,50 6,20 242,09 1,77
    N = 10 Un 10,00 6,00 251,33 1,35
    4 R-1 9,60 7,50 322,33 2,23
    L-1 10,50 11,60 704,71 2,63
    R-2 8,80 7,00 254,80 1,28
    L-2 9,50 7,00 287,26 2,30
    Un 9,90 9,30 462,80 1,49
    Durchschnitt 340,28 1,71
    Std. Fehler 45,54 0,16
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 8
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 8,00 6,60 201,82 0,59
    100 μg/100 μl L-1 8,80 8,00 309,64 1,50
    it, pt R-2 8,80 7,00 254,80 1,68
    L-2 7,20 7,60 212,02 0,74
    N = 10 Un 6,70 11,00 341,52 2,40
    2 R-1 6,00 7,90 172,49 0,93
    L-1 5,80 6,60 124,27 0,47
    R-2 6,00 8,00 175,93 1,08
    L-2 8,50 8,80 338,78 2,27
    Un 6,60 6,80 157,44 0,67
    Durchschnitt 228,87 1,23
    Std. Fehler 24,70 0,22
    IgG 3 R-1 8,50 8,80 338,78 1,60
    100 μg/100 μl L-1 6,90 8,80 249,57 0,95
    it, pt R-2 10,00 9,20 462,44 2,37
    L-2 10,40 6,90 325,01 2,38
    N = 10 Un 11,40 6,00 311,58 1,67
    4 R-1 10,90 6,35 312,58 2,16
    L-1 11,00 11,80 774,78 2,89
    R-2 8,80 6,90 249,57 1,25
    L-2 9,50 7,00 287,26 2,30
    Un 10,40 9,30 498,83 1,61
    Durchschnitt 381,04 1,92
    Std. Fehler 50,90 0,18
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 10
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 6,30 7,00 153,55 0,45
    100 μg/100 μl L-1 8,00 7,40 238,68 1,16
    it, pt R-2 9,60 10,00 492,60 3,24
    L-2 6,30 6,60 140,42 0,49
    N = 10 Un 8,00 10,00 376,99 2,65
    2 R-1 6,00 6,35 123,19 0,66
    L-1 5,00 6,20 90,90 0,34
    R-2 6,20 6,80 143,49 0,88
    L-2 5,50 7,40 137,45 0,92
    Un 5,00 6,70 102,61 0,44
    Durchschnitt 199,90 1,12
    Std. Fehler 41,90 0,31
    IgG 3 R-1 10,00 8,00 376,99 1,78
    100 μg/100 μl L-1 7,90 6,20 180,80 0,69
    it, pt R-2 11,00 8,80 501,78 2,57
    L-2 11,75 7,80 469,08 3,43
    N = 10 Un 11,20 8,00 450,38 2,42
    4 R-1 11,00 8,00 437,73 3,03
    L-1 11,90 10,90 774,24 2,89
    R-2 9,40 7,00 282,51 1,42
    L-2 9,00 8,00 320,44 2,57
    Un 10,50 9,60 530,43 1,71
    Durchschnitt 432,43 2,25
    Std. Fehler 51,00 0,26
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 12
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 6,60 7,70 190,26 0,56
    100 μg/100 μl L-1 9,80 8,60 405,99 1,97
    it, pt R-2 10,70 11,00 668,66 4,40
    L-2 5,30 7,20 124,88 0,43
    N = 10 Un 7,00 11,00 362,85 2,55
    2 R-1 6,00 7,90 172,49 0,93
    L-1 5,50 5,00 75,59 0,28
    R-2 6,00 6,80 136,72 0,84
    L-2 6,00 7,40 155,76 1,04
    Un 5,00 6,40 95,50 0,41
    Durchschnitt 238,80 1,34
    Std. Fehler 58,91 0,41
    IgG 3 R-1 8,80 10,00 433,12 2,04
    100 μg/100 μl L-1 8,80 6,50 229,12 0,87
    it, pt R-2 12,70 10,00 754,74 3,86
    L-2 7,80 11,80 472,28 3,45
    N = 10 Un 11,20 8,80 516,06 2,77
    4 R-1 11,00 8,00 437,73 3,03
    L-1 12,20 12,20 950,78 3,55
    R-2 8,00 10,00 376,99 1,89
    L-2 12,00 8,00 502,66 4,03
    Un 11,00 9,20 535,18 1,73
    Durchschnitt 520,86 2,72
    Std. Fehler 63,49 0,33
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf ASPC1 Xenotransplantate
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 15
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 7,50 9,30 306,78 0,90
    100 μg/100 μl L-1 10,00 8,40 404,64 1,97
    it, pt R-2 9,40 12,00 631,96 4,16
    L-2 7,30 6,85 185,24 0,65
    N = 10 Un 9,60 12,00 651,44 4,58
    2 R-1 6,50 8,40 212,98 1,14
    L-1 5,00 5,30 71,46 0,27
    R-2 7,80 6,40 185,58 1,14
    L-2 6,80 7,40 187,07 1,25
    Un 5,50 7,00 125,99 0,54
    Durchschnitt 296,31 1,66
    Std. Fehler 64,40 0,47
    IgG 3 R-1 10,20 8,90 453,9345 2,14
    100 μg/100 μl L-1 6,80 9,40 271,0949 1,03
    it, pt R-2 11,60 12,90 959,8059 4,91
    L-2 12,90 12,30 1046,803 7,66
    N = 10 Un 12,70 9,00 649,3452 3,48
    4 R-1 11,30 8,30 481,2628 3,33
    L-1 12,60 12,80 1072,467 4,01
    R-2 10,00 8,40 404,6381 2,03
    L-2 12,00 8,40 538,3446 4,32
    Un 11,10 11,10 716,0916 2,31
    Durchschnitt 659,38 3,52
    Std. Fehler 89,35 0,59
    Wirkungen von neutralisierenden Antikörpern auf die Körpergewichte von Nacktmäusen, die AsPC-1 Xenotransplantate tragen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 1 Tag 3 Tag 5 Tag 8 Tag 10 Tag 12 Tag 15
    Gewicht (g)
    Neut. Ab 1 R-1 22,20 22,90 22,70 22,60 23,20 23,60 25,70
    400 μg/100 μl L-1 24,70 24,70 24,00 24,20 24,20 23,10 25,50
    it, pt R-2 23,00 21,90 21,90 21,70 21,60 21,90 22,00
    L-2 24,20 24,50 24,70 24,90 24,20 24,40 23,70
    Un 22,50 22,10 22,70 21,90 21,40 21,20 22,30
    N = 10 2 R-1 25,20 23,00 23,00 22,80 24,10 24,30 26,10
    L-1 22,30 21,50 22,30 22,40 21,80 22,10 23,30
    R-2 23,10 24,10 24,20 22,40 22,50 22,10 25,50
    L-2 22,40 23,10 23,50 23,10 22,80 21,80 26,10
    Un 21,50 21,10 20,10 23,10 24,10 23,40 23,80
    Durchschnitt 23,10 22,90 22,90 22,90 23,00 22,80 24,40
    Std.Fehler 0,30 0,30 0,40 0,30 0,30 0,30 0,40
    IgG 3 R-1 24,70 21,60 25,10 28,00 23,40 23,60 26,10
    400 μg/100 μl L-1 21,50 21,20 22,50 23,10 24,10 22,40 23,60
    it, pt R-2 22,90 22,10 22,80 23,00 22,90 23,70 24,30
    L-2 21,80 21,30 23,10 21,00 23,10 22,30 25,60
    N = 10 Un 24,00 21,40 23,50 23,20 22,30 25,10 22,10
    4 R-1 22,80 22,10 22,20 23,40 22,00 23,70 22,80
    L-1 22,80 21,00 22,70 24,10 21,50 20,60 22,60
    R-2 23,70 24,00 24,20 22,60 23,30 23,40 25,10
    L-2 25,10 23,60 23,60 21,90 22,70 23,60 24,20
    Un 23,60 23,00 25,00 23,40 23,60 25,00 26,30
    Durchschnitt 23,30 22,10 23,50 23,40 22,90 23,30 24,30
    Std.Fehler 0,30 0,30 0,30 0,50 0,20 0,40 0,40
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Xenotransplantate in Nacktmäusen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 1
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 9,60 13,60 792,99 1,00
    100 μg/100 μl L-1 7,00 6,90 175,76 1,00
    it, pt R-2 8,30 10,00 397,65 1,00
    L-2 8,10 8,50 299,21 1,00
    N = 9 0 8,60 8,80 344,75 1,00
    2 R-1 8,10 12,30 532,10 1,00
    L-1 7,20 6,00 149,29 1,00
    R-2 10,30 13,90 907,06 1,00
    0 9,10 7,20 279,60 1,00
    Durchschnitt 430,90 1,00
    Std. Fehler 88,30 0,00
    IgG 3 R-1 7,00 9,00 263,89 1,00
    400 μg/100 μl L-1 8,30 10,40 422,59 1,00
    it, pt R-2 7,70 6,40 181,91 1,00
    L-2 9,50 13,00 727,48 1,00
    N = 9 4 0 10,50 13,00 839,79 1,00
    R-1 7,00 9,00 263,89 1,00
    L-1 9,00 6,30 227,11 1,00
    R-2 8,80 7,90 303,95 1,00
    0 8,50 13,30 645,20 1,00
    Durchschnitt 430,60 1,00
    Std. Fehler 81,40 1,00
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Xenotransplantate in Nacktmäusen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 4
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 11,30 15,50 1228,89 1,55
    100 μg/100 μl L-1 6,90 7,00 175,76 1,00
    it, pt R-2 10,00 9,70 500,27 1,26
    L-2 8,80 9,90 426,51 1,43
    N = 9 0 7,60 9,40 317,95 0,92
    2 R-1 9,40 12,20 648,50 1,22
    L-1 7,80 8,40 277,88 1,86
    R-2 12,80 14,40 1312,54 1,45
    0 8,90 9,40 400,81 1,43
    Durchschnitt 587,60 1,35
    Std. Fehler 136,70 0,09
    IgG 3 R-1 7,20 10,00 324,21 1,23
    400 μg/100 μl L-1 9,90 10,00 515,77 1,22
    it, pt R-2 8,60 7,30 261,33 1,44
    L-2 9,90 13,30 799,73 1,10
    N = 9 4 0 10,50 15,30 1085,10 1,29
    R-1 8,80 10,00 433,12 1,64
    L-1 9,60 6,00 235,24 1,04
    R-2 9,80 9,90 500,38 1,65
    0 8,50 13,00 621,97 0,96
    Durchschnitt 530,70 1,29
    Std. Fehler 91,30 0,08
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Xenotransplantate in Nacktmäusen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 8
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 13,00 21,50 2524,47 3,18
    100 μg/100 μl L-1 6,85 11,10 357,31 2,03
    it, pt R-2 11,90 14,00 1129,65 2,84
    L-2 10,20 11,10 631,35 2,11
    N = 9 0 8,70 8,80 350,76 1,02
    2 R-1 9,80 13,50 807,02 1,52
    L-1 8,10 9,10 331,91 2,22
    R-2 14,40 14,10 1514,94 1,67
    0 9,00 10,00 447,68 1,60
    Durchschnitt 899,45 2,02
    Std. Fehler 243,60 0,22
    IgG 3 R-1 7,90 10,75 414,65 1,57
    400 μg/100 μl L-1 11,80 13,10 1007,68 2,38
    it, pt R-2 8,90 9,90 433,66 2,38
    L-2 11,90 15,00 1257,07 1,73
    N = 9 4 0 12,40 14,80 1306,84 1,56
    R-1 10,70 12,20 782,616 2,97
    L-1 8,00 10,75 422,153 1,86
    R-2 8,80 9,40 394,141 1,30
    0 11,70 18,00 1637,51 2,54
    Durchschnitt 850,7 2,03
    Std. Fehler 157,1 0,19
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Xenotransplantate in Nacktmäusen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 10
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 14,00 23,00 3119,1 3,93
    100 μg/100 μl L-1 11,60 8,00 476,18 2,71
    it, pt R-2 12,00 14,40 1194,3 3,00
    L-2 11,50 12,60 914,23 3,06
    N = 9 0 8,00 10,50 406,84 1,18
    2 R-1 10,20 13,80 884,42 1,66
    L-1 10,30 10,00 547,4 3,67
    R-2 16,60 20,00 3181,2 3,51
    0 15,00 10,80 1094,2 3,91
    Durchschnitt 1313 2,96
    Std. Fehler 358,7 0,325
    IgG 3 R-1 10,50 8,60 451,53 1,71
    400 μg/100 μl L-1 14,50 14,60 1612,8 3,82
    it, pt R-2 12,60 7,70 515,62 2,83
    L-2 17,60 11,10 1467,9 2,02
    N = 9 4 0 12,70 19,40 2070,5 2,47
    R-1 12,40 10,80 813,4 3,08
    L-1 8,00 11,40 463,2 2,04
    R-2 13,30 14,00 1330,8 4,38
    0 11,80 19,40 1869,9 2,90
    Durchschnitt 1177 2,81
    Std. Fehler 210,2 0,29
    Wirkungen von Neurotrophin neutralisierenden Antikörpern auf CFPAC Xenotransplantate in Nacktmäusen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 14
    Länge Breite V (mm3) fach
    Neut. Ab 1 R-1 15,50 25,60 4269,6 5,38
    100 μg/100 μl L-1 12,10 8,55 559,3 3,18
    it, pt R-2 14,90 12,70 1367,3 3,44
    L-2 12,60 14,00 1228,4 4,11
    N = 9 0 10,80 8,00 425,25 1,23
    2 R-1 14,90 10,20 998,69 1,88
    L-1 11,00 10,30 631,8 4,23
    R-2 18,90 22,70 4672,5 5,15
    0 15,70 19,60 2843,8 10,17
    Durchschnitt 1889 4,31
    Std. Fehler 544,1 0,86
    IgG 3 R-1 8,60 10,80 471,73 1,79
    400 μg/100 μl L-1 14,80 15,30 1784,4 4,22
    it, pt R-2 11,10 8,70 500,58 2,75
    L-2 12,20 17,20 1615,1 2,22
    N = 9 4 0 15,00 21,00 2968,8 3,54
    R-1 13,30 11,00 930,72 3,53
    L-1 12,60 9,00 641,26 2,82
    R-2 14,10 17,70 2077,7 6,84
    0 12,40 21,40 2348,1 3,64
    Durchschnitt 1482 3,48
    Std. Fehler 298,6 0,49
    Wirkung von neutralisierenden Antikörpern auf die Körpergewichte von Nacktmäusen, die CFPAC Xenotransplantate tragen
    Behandlung Käfig # Maus # Tag 1 Tag 4 Tag 8 Tag 10 Tag 14
    Gewicht (g)
    Neut. Ab 1 R-1 23,70 23,90 26,00 26,50 28,00
    100 μg/100 μl L-1 21,80 21,90 23,70 23,50 23,70
    it, pt R-2 23,60 23,30 24,60 25,50 26,10
    L-2 21,10 21,90 24,00 24,50 24,60
    Un 23,80 23,50 25,20 26,00 26,10
    N = 10 2 R-1 23,60 25,80 27,40 26,00 27,90
    L-1 20,50 21,70 23,30 23,70 26,90
    R-2 22,50 24,20 26,40 28,50 23,80
    Un 25,20 22,30 29,90 33,40 32,80
    Durchschnitt 22,60 23,30 25,10 25,50 25,90
    Std. Fehler 0,46 0,49 0,50 0,57 0,60
    IgG 3 R-1 21,50 22,40 24,30 24,10 25,40
    100 μg/100 μl L-1 21,90 23,50 25,00 25,80 27,10
    it, pt R-2 24,30 26,90 28,10 27,70 27,80
    L-2 23,80 25,10 27,10 27,20 27,90
    N = 10 Un 23,00 24,40 25,90 25,90 26,20
    4 R-1 22,90 25,20 26,70 27,60 27,40
    L-1 20,10 22,40 22,50 23,20 24,40
    R-2 21,90 25,50 22,70 26,00 28,60
    Un 21,80 24,00 25,30 24,60 26,20
    Durchschnitt 22,40 24,20 25,60 25,80 26,60
    Std. Fehler 0,48 0,53 0,62 0,59 0,43

Claims (7)

  1. Verwendung eines Anti-Neurotrophin-Antikörpers in der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Prostata- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs in einem Säuger.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zum Reduzieren des Volumens eines Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumors ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zum Reduzieren der Wachstumsrate eines Prostata- oder Bauchspeicheldrüsentumors ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Neurotrophin NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 oder NT-7 ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Säuger ein Mensch ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein F(ab)-Fragment oder ein F(ab)2-Fragment ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
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