ES2286110T3 - Procedimiento para tratar cancer con agentes enti-neurotrofina. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti-neurotrofina en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer de próstata o páncreas en un mamífero.
Description
Procedimiento para tratar cáncer con agentes
anti-neurotrofina.
La presente invención se refiere al campo de la
oncología, particularmente a los cánceres de próstata y páncreas.
La presente invención también se refiere al área de las
neurotrofinas y al uso de agentes anti-neurotrofina
tales como, por ejemplo, anticuerpos, en el tratamiento o la
prevención de los cánceres de próstata y páncreas.
Las neurotrofinas (NT) son una subfamilia de
factores neurotróficos específicos que incluyen cuatro proteínas
bien conocidas estructuralmente y funcionalmente relacionadas:
factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado
del cerebro (BDNF), neurotrofina-3
(NT-3), neurotrofina-4/5
(NT-4/5). Recientemente, se han descubierto dos NT
adicionales, neurotrofina-6 (NT-6) y
neurotrofina-7 (NT-7). Las
neurotrofinas se unen a y activan los receptores de la membrana de
la superficie celular específicos que tienen actividad tirosina
quinasa. Estos receptores se conocen como receptores trk y se
clasifican según los tres subtipos trkA, trkB, y trkC. Cada subtipo
de receptor trk se une preferiblemente a una o más NT (NGF a trkA,
BDNF y NT-4/5 a trkB, y NT-3 a trk
C). Sin embargo, se sabe que se produce reactividad cruzada de NT,
entre los subtipos de receptor. La activación de los receptores trk
mediante NT da como resultado la oligomerización de receptor y la
fosforilación de la tirosina de sustratos intracelulares
específicos. Además de los receptores trk, se sabe que un segundo
tipo de receptor de membrana de la superficie celular se une a NT.
Este receptor es el receptor de crecimiento nervioso de baja
afinidad p75^{NTR} (p75) que se cree que participa en la
modulación de la afinidad de NT y/o la disponibilidad para unirse a
receptores trk de mayor afinidad. Sin embargo, continúa debatiéndose
un papel fisiológico específico para el receptor p75.
Se reconoce ampliamente que las NT desempeñan un
papel fundamental en el crecimiento, la diferenciación y la
supervivencia de las células del sistema nervioso central y
periférico. Sin embargo, existen pruebas recientes de que las NT
también contribuyen a la biología tumoral fuera del sistema
nervioso. Las neurotrofinas y sus subtipos de receptor se han
implicado en diversos cánceres, incluyendo carcinomas de próstata,
mama, tiroides, colon y pulmón, así como melanomas malignos,
carcinoides pancreáticos y glioblastomas. Específicamente, se ha
encontrado expresión aberrante de los receptores trk A, B, y C en el
adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y las NT pueden influir
en la capacidad de invasión de este tipo de tumor (Miknyoczki, et
al., Int. J. Cáncer, 1999, 81, 417). Además, el NGF se ha
correlacionado con invasión perineural y dolor que está asociado
con el PDAC (Zhu, et al., J Clin. Oncol., 1999, 17, 2419).
También se sabe que trkA se expresa en el tejido epitelial
prostático, y la neurotrofina NGF correspondiente se ha implicado en
la estimulación del crecimiento del cáncer de próstata. Walch et
al. (Clinical and Experimental Metastasis) 1999, 17,
307-314 describen aumento de la invasión de
anti-neurotrofinas en la metástasis tumoral de
próstata. Se ha demostrado inmunorreactividad para el NGF en
carcinomas prostáticos humanos (De
Schryver-Kecskemeti et al., Arch. Pathol.,
1987, 111, 833) y líneas celulares derivadas de tumores (MacGrogan
et al., J. Neurochem., 1992, 59, 1381), lo que sugiere un
posible papel de supervivencia o mitogénico para el NGF en este
cáncer. Además, se ha demostrado que las células del carcinoma
prostático son quimiotácticas (Djakiew, et al., Cáncer Res.,
1993, 53, 1416) e invasivas (Geldof, et al., J. Cáncer Res. Clin.
Oncol., 1997, 123, 107) en respuesta al NGF in
vitro.
Se ha demostrado que las trk desempeñan un papel
tanto en el cáncer prostático (Delsite et al., J Androl.,
1996, 17, 481, Pflug et al., Endocrinology, 1995, 136, 262,
Pflug et al., Cáncer Res., 1992, 52, 5403, Djakiew et
al., Cáncer Res., 1991, 51, 3304, Passaniti et al., Int. J.
Cáncer, 1992, 51, 318, MacGrogan et al., J Neurochem.,
1992, 59, 1381, Geldof et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol.
1997, 123, 107, Pflug et al., Mol. Carcin., 1998, 12, 106, y
George et al., The Prostrate, 1998, 36, 172) como en el
cáncer pancreático (Oikawa, et al., Int. J. Pancreat., 1995,
18, 15, Ohta et al., J. Pathol., 1997, 181, 405, Miralles
et al., J. Endocrinology, 1998, 156, 431, y Miknyoczki et
al., Crit. Rev. Oncogenesis, 1996, 7, 89).
Debido al posible papel de la actividad de trk
en el desarrollo y la progresión de ciertos cánceres, se ha
seleccionado como objetivo la alteración selectiva de ejes de
NT-trk como un posible medio terapéutico.
Específicamente, se han desarrollado y probado pequeñas moléculas
que muestran capacidad para inhibir a los receptores trk (Ruggeri,
et al., Current Medicinal Chemistry, 1999, 6, 845). Se sabe
que los alcaloides de indolocarbazol glucosilado
K-252a y K-252b inhiben las acciones
biológicas del NGF y otras neurotrofinas. Se ha notificado que
K-252a inhibe específicamente la autofosforilación
de trkA, así como de trkB y trkC y otros receptores de neurotrofina
relacionados a concentraciones nanomolares bajas (Hashimoto, Cell
Biol., 1988, 107, 1531; Berg, et al., J Biol. Chem.,
1992, 267, 13; Tarpley, et al., Oncogene, 1992, 7, 371;
Ohmichi, et al., Biochemistry, 1992, 31, 4034; Muroya, et
al., Biochim. Biophys. Acta., 1992, 1135, 353; y Nye, et
al., Mol. Biol. Cell, 1992, 3, 677.) Mediante la modificación
del resto de azúcar de K-252a, se han desarrollado
dos inhibidores potentes adicionales de trk. Específicamente, se ha
encontrado que CEP-751, un derivado de
hidroximetilo de K-252a, es un potente inhibidor de
trkA (CI_{50} de 3 nM en un ELISA), trkB, y trkC. También se
sintetizó un derivado dipeptídico, CEP-2563, que
demostró actividad similar y solubilidad en agua mejorada. También
se encontró que otro compuesto relacionado, CEP-701,
tenía buena actividad inhibidora de trkA mostrando una CI_{50} de
4 nM. Se ha demostrado que tanto CEP-751 como
CEP-701 inhiben significativamente carcinomas
prostáticos en seres humanos y ratas en modelos preclínicos (Dionne,
et al., Clin. Cáncer Res., 1998, 4, 1887 y George, et
al., Cáncer Research, 1999, 59, 2395). También se ha demostrado
que CEP-751 desempeña actividad antitumoral en
xenoinjertos de neuroblastoma y meduloblastoma (Evans, et al.,
Clin. Cáncer Res., 1999, 5, 3594), así como en modelos de
cáncer de ovario y melanoma. Además, también se ha demostrado
actividad antitumoral significativa mediante CEP-701
en modelos preclínicos de xenoinjerto de adenocarcinoma ductal
pancreático humano (Miknyoczki, et al., Clin. Cáncer Res.,
1999, 5, 2205). Actualmente, CEP-701 se está
sometiendo a ensayos clínicos humanos.
Aunque estos inhibidores de trk que son
moléculas pequeñas pueden usarse como herramientas para tratar
cánceres de próstata, páncreas y otros, es difícil desarrollar
pequeñas moléculas con especificidad para una molécula objetivo
particular. Una de las principales preocupaciones en general para
las pequeñas moléculas es la no especificidad por receptores
objetivo o rutas de receptores, lo que conduce a una activación o
inactivación indeseable de otros receptores y posible toxicidad.
Por ejemplo, se ha demostrado que K-252a tiene
múltiples propiedades bioquímicas, incluyendo actividad
neurotrófica en combinación con actividades de inhibición de trk y
proteína quinasa C (Kaneko, et al., J. Med. Chem., 1997, 40,
1863). Por tanto, son deseables agentes terapéuticos con alta
especificidad por objetivos biológicos que participan en la
actividad del receptor trk como posibles candidatos farmacológicos
para el tratamiento del cáncer de próstata, páncreas y otros. Para
este fin, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos frente a un
receptor trk particular son menos deseables que las moléculas
pequeñas (LeSauteur et al., Nature Biotech., 1996, 14, 1120).
La presente invención proporciona el uso de al menos un anticuerpo
neutralizante frente a neurotrofina en la fabricación de un
medicamento para tratar el cáncer de páncreas o próstata en un
mamífero. El anticuerpo proporciona gran parte de la especificidad
deseada que las moléculas pequeñas de hecho no ofrecen.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo anti-neurotrofina en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata o páncreas
en un mamífero. Los anticuerpos anti-neurotrofina
incluyen los dirigidos frente a NGF, BDNF, NT-3, y
NT-4/5 e incluyen anticuerpos humanizados así como
fragmentos de los mismos. En una realización preferida, el
medicamento es para la administración de una cantidad
terapéuticamente eficaz de al menos uno de los siguientes
anticuerpos neutralizantes frente a neurotrofina, NGF, BDNF,
NT-3, y NT-4/5 para tumores
prostáticos o pancreáticos.
En algunas realizaciones, el medicamento es para
reducir el volumen tumoral prostático o pancreático.
En algunas realizaciones, el medicamento es para
reducir la tasa de crecimiento del tumor prostático o
pancreático.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo anti-neurotrofina en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata o páncreas
en un mamífero. El anticuerpo anti-neurotrofina se
une con alta especificidad a las neurotrofinas, conduciendo así a
la inhibición de los receptores trk mediante la neutralización de
los ligandos de activación de la neurotrofina.
A lo largo de este documento se facilitan
diversas definiciones. La mayor parte de las palabras tienen el
significado que un experto en la técnica atribuiría a esas palabras.
Las palabras definidas específicamente a continuación o bien en
otra parte de este documento tienen el significado facilitado en el
contexto de la presente invención como conjunto y normalmente se
entienden por los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "cáncer" pretende referirse a un neoplasma persistente
de cualquier tejido en un organismo biológico. El neoplasma se
caracteriza como generalmente maligno o con posibilidad de llegar a
ser maligno, potencialmente invasivo, o con posibilidad de
metastatizar a nuevos sitios. Los cánceres de la presente invención
están asociados con la expresión de receptores de neurotrofina y
neurotrofinas y son el cáncer de próstata y páncreas.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "tumor" pretende referirse a un crecimiento que surge
de un tejido existente, crecimiento a una tasa anómala en
comparación con el tejido del que surgió, y que no realiza la
función fisiológica normal. El crecimiento puede o no ser maligno,
pero a menudo está asociado con, o es indicativo de, un estado
canceroso o precanceroso.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "mamífero" pretende referirse a organismos vivos
humanos o bien a no humanos que están aquejados de cáncer, han
estado previamente aquejados con cáncer, o están predispuestos a
padecer cáncer.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" pretende referirse
a una cantidad de agente anti-neurotrofina
terapéutico o profiláctico, tal como un anticuerpo
anti-neurotrofina, que podría ser apropiado para
una realización de la presente invención, que provocará el efecto o
la respuesta terapéuticos o profilácticos deseados cuando se
administra según el régimen de tratamiento deseado.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anticuerpo" pretende referirse a anticuerpos
completos, intactos, así como a fragmentos F(ab) y
fragmentos F(ab)_{2} de los mismos. Los anticuerpos
completos, intactos, incluyen anticuerpos monoclonales tales como
anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos policlonales,
anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y derivados de
todos los mencionados anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "neurotrofina" o "NT" pretende referirse a
cualquier neurotrofina natural o no natural incluyendo, pero sin
limitarse a, NGF, BDNF, NT-3,
NT-4/5, NT-6, y
NT-7, y sus derivados o equivalentes funcionales,
ya estén purificados a partir de una fuente natural, preparados
mediante procedimientos de tecnología de ADN recombinante o síntesis
química, o cualquier combinación de estos u otros
procedimientos.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "neutralizante" generalmente significa que se vuelve
ineficaz, y cuando se usa para describir un anticuerpo, significa
además un anticuerpo que vuelve ineficaz a la molécula a la que se
une. En las realizaciones preferidas de la invención, un anticuerpo
"neutralizante" se une a un ligando particular y evita o
interfiere en la unión del ligando a su receptor.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "poner en contacto" significa llevar juntos, directa
o bien indirectamente, una o más moléculas entre sí, facilitando así
las interacciones intermoleculares. La puesta en contacto puede
producirse in vitro, ex vivo o in vivo.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "receptor de neurotrofina" pretende referirse a un
receptor que se une a un ligando de neurotrofina. En las
realizaciones preferidas, el receptor de neurotrofina es un miembro
de la familia de receptores de tirosina quinasa, denominados
generalmente receptores "trk" o "trk", que se expresan en
las superficies celulares. La familia de trk incluye, pero sin
limitarse a, trkA, trkB; y trkC. En otras realizaciones, el
receptor de neurotrofina es p75^{NTR}, también denominado p75 o
receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad. Estos
receptores pueden proceder de cualquier especie animal (por
ejemplo, ser humano, ratón, conejo, cerdo, caballo, etc.), e
incluyen receptores de longitud completa, sus formas truncadas y
variantes, tales como las que surgen mediante corte y empalme y/o
inserción alternos, y las variantes alélicas que se producen en la
naturaleza, así como derivados funcionales de tales receptores.
La presente invención se refiere a medicamentos
para tratar estados de enfermedad neoplásica seleccionados de
cáncer de próstata o páncreas.
En otras realizaciones preferidas, también
pueden tratarse o evitarse según los procedimientos de la presente
invención tumores no malignos, lesiones precancerosas, tumores
precancerosos u otros estados precancerosos que están asociados con
los estados de enfermedad neoplásica mencionados anteriormente. Tal
tratamiento contribuiría a la prevención del cáncer en pacientes
con signos clínicos de cáncer inminente o con una predisposición al
cáncer.
Los mamíferos preferidos de la presente
invención son seres humanos con propensión a o con diagnóstico
clínico de cáncer de próstata o páncreas. Naturalmente, los
mamíferos no humanos aquejados de cáncer de próstata o páncreas
también caen dentro del alcance de la presente invención. Los
mamíferos también incluyen seres humanos o no humanos que son
propensos a llegar a estar aquejados de estos cánceres. Los ejemplos
incluyen seres humanos expuestos a carcinógenos conocidos o seres
humanos masculinos en una edad de riesgo de desarrollo de cáncer de
próstata. También se incluyen pacientes con una historia familiar de
cáncer o que genéticamente son propensos a desarrollar ciertos
tipos de cánceres.
Los anticuerpos preferidos incluyen todos los
anticuerpos frente a neurotrofina conocidos en la actualidad
incluyendo, pero sin limitarse a, anti-NGF (número
de catálogo 500-P85, Pepro Tech Inc.; número de
catálogo AF-256-NA, R&D
Systems, Inc.), anti-BDNF (número de catálogo
500-P84, Pepro Tech Inc.; número de catálogo
MAB248, R&D Systems, Inc.),
anti-NT-3 (número de catálogo
500-P82, Pepro Tech Inc.; número de catálogo
AF-267-NA, R&D Systems, Inc.),
anti-NT4 (número de catálogo
500-P83, Pepro Tech Inc.; número de catálogo
AF-268-NA, R&D Systems, Inc.),
anti-NT-4/5,
anti-NT-6 y
anti-NT-7 y sus equivalentes
funcionales. Preferiblemente, estos anticuerpos se utilizan en una
forma purificada por afinidad. También están dentro del alcance de
la invención las mezclas de dos o más anticuerpos neutralizantes
diferentes. Por ejemplo, cánceres tales como el adenocarcinoma
ductal pancreático, que expresa más de un tipo de receptor de
neurotrofina, pueden tratarse más eficazmente con una mezcla de
anticuerpos para más de un receptor.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
obtenerse de un proveedor comercial, tal como Pepro Tech, Inc.
(Rocky Hill, NJ), R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) o
generarse según procedimientos convencionales. Los anticuerpos
neutralizantes frente a neurotrofina comercialmente disponibles
incluyen anti-b-NGF humano,
anti-BDNF humano,
anti-NT-4 humano, y
anti-NT-3 humano procedentes de
antisuero de conejo.
La generación y la purificación de anticuerpos
también puede realizarse en el laboratorio según los procedimientos
convencionales descritos en Ausubel, et al., 1999, Short
Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, Greene y
Wiley-Interscience, NY y Current Protocols in
Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons, NY, incorporado
cada uno de ellos al presente documento como referencia en su
totalidad.
También están comprendidos mediante la presente
invención, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y
policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos
quiméricos, anticuerpos bifuncionales/biespecíficos, anticuerpos
humanizados, anticuerpos humanos y anticuerpos injertados con región
determinante de complementariedad (CDR), incluyendo compuestos que
incluyen secuencias de CDR que reconocen específicamente un
polipéptido de la invención) específico para una neurotrofina o
fragmentos de la misma. La invención también proporciona fragmentos
de anticuerpos, incluyendo Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv. Los
ensayos de exploración para determinar la especificidad de unión de
un anticuerpo de la invención se conocen bien y se ponen en práctica
de manera rutinaria en la técnica. Para un análisis exhaustivo de
tales ensayos, véase Harlow et al. (Eds.), Antibodies A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1988), capítulo 6, que se incorpora al presente
documento como referencia en su totalidad. También se contemplan los
anticuerpos que reconocen y se unen a fragmentos de una
neurotrofina. Los anticuerpos de la invención pueden producirse
usando cualquier procedimiento bien conocido y puesto en práctica
de manera rutinaria en la técnica.
Por ejemplo, puede utilizarse neurotrofina
recombinante o que se produce en la naturaleza, o un fragmento de
la misma, para inmunizar a un ratón u otro animal adecuado, para la
generación de anticuerpos monoclonales (o un mamífero más grande,
tal como un conejo, para los anticuerpos policlonales). Para
aumentar la antigenicidad, los péptidos pueden conjugarse con
hemocianina de lapa californiana (Pierce), según las recomendaciones
del fabricante. Para una inyección inicial, el antígeno puede
emulsionarse con adyuvante completo de Freund e inyectarse
subcutáneamente. A intervalos de dos o tres semanas, pueden
emulsionarse alícuotas adicionales de antígeno de neurotrofina con
adyuvante incompleto de Freund e inyectarse subcutáneamente. Antes
de la inyección de refuerzo final, puede tomarse una muestra de
suero de los ratones inmunizados y someterse a ensayo mediante
inmunotransferencia de tipo Western para confirmar la presencia de
anticuerpos que reaccionan inmunológicamente con la neurotrofina.
El suero de los animales inmunizados puede usarse como antisuero
policlonal o usarse para aislar anticuerpos policlonales que
reconocen a la neurotrofina. Alternativamente, puede sacrificarse a
los ratones y extraerse su bazo para la generación de anticuerpos
monoclonales.
Para generar anticuerpos monoclonales, los bazos
puede colocarse en 10 ml de RPMI 1640 sin suero, y se forman
suspensiones de células individuales triturando los bazos en RPMI
1640 sin suero, complementado con L-glutamina 2 mM,
piruvato de sodio 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá). Las
suspensiones celulares pueden filtrarse y lavarse mediante
centrifugación y resuspenderse en RPMI sin suero. Se preparan de
una manera similar timocitos tomados de tres ratones Balb/c no
tratados previamente y se usan como capa de alimentación. También
se centrifugan y se lavan células de mieloma NS-1,
mantenidas en fase logarítmica en RPMI con suero bovino fetal (SBF)
al 10% (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) durante tres días
antes de la fusión.
Para producir fusiones de hibridoma, se combinan
células de bazo procedentes de ratones inmunizados con células
NS-1 y se centrifugan, y se aspira el sobrenadante.
El sedimento celular se extrae golpeando el tubo y se agita con 2
ml de PEG 1500 a 37ºC (50% en HEPES 75 mM, pH 8,0)
(Boehringer-Mannheim) en el sedimento, seguido por
la adición de RPMI sin suero. A continuación, las células se
centrifugan, se resuspenden en RPMI que contiene SBF al 15%,
hipoxantina de sodio 100 \muM, aminopterina 0,4 \muM, timidina
16 \muM (HAT) (Gibco), 25 unidades/ml de IL-6
(Boehringer-Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml,
y se siembran en 10 placa en placas de cultivo tisular Corning, de
96 pocillos, de fondo plano (Corning, Corning New York).
En los días 2, 4, y 6 tras la fusión se
extrajeron 100 \mul de medio de los pocillos de las placas de
fusión y se sustituyeron con medio reciente. En el día 8, las
fusiones se exploran mediante ELISA, se someten a prueba para
determinar la presencia de IgG de ratón que se une a neurotrofina.
Los pocillos de fusión seleccionados se clonan adicionalmente
mediante dilución hasta que se obtienen cultivos monoclonales que
producen anticuerpos anti-neurotrofina.
Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse
mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica.
En un procedimiento, se insertan CDR no humanas en un anticuerpo
humano o secuencia marco de anticuerpo consenso. Entonces pueden
introducirse cambios adicionales en la región marco del anticuerpo
para modular la afinidad o la inmunogenicidad. A continuación se
muestran protocolos para mejorar la utilidad de los anticuerpos
monoclonales anti-neurotrofina como agentes
terapéuticos en seres humanos mediante la "humanización" de los
anticuerpos monoclonales para mejorar su semivida sérica y
volverlos menos inmunogénicos en los huéspedes humanos (es decir,
para evitar la respuesta del anticuerpo humano frente a anticuerpos
anti-neurotrofina no humanos).
Los principios de la humanización se han
descrito en la bibliografía y se facilitan mediante la disposición
modular de proteínas de anticuerpo. Para minimizar la posibilidad de
unión del complemento, se prefiere un anticuerpo humanizado del
isotipo IgG4.
Por ejemplo, se logra un nivel de humanización
mediante la generación de anticuerpos quiméricos que comprenden los
dominios variables de las proteínas de anticuerpo no humano de
interés con los dominios constantes de las moléculas de anticuerpo
humano. (Véase, por ejemplo, Morrison et al., Adv. Immunol.,
1989, 44, 65-92, que se incorpora al presente
documento como referencia en su totalidad). Los dominios variables
de los anticuerpos anti-neurotrofina neutralizantes
de neurotrofina se clonan a partir del ADN genómico de un hibridoma
de célula B o a partir de ADNc generado a partir de ARNm aislado
del hibridoma de interés. Los fragmentos génicos de la región V se
unen a exones que codifican los dominios constantes del anticuerpo
humano, y el constructo resultante se expresa en las células
huésped del mamífero adecuado (por ejemplo, células CHO o de
mieloma).
Para lograr un nivel de humanización incluso
mayor, sólo se clonan en las secuencias del anticuerpo humano
aquellas partes de los fragmentos génicos de la región variable de
los genes de los anticuerpos monoclonales no humanos que codifican
regiones determinantes de complementariedad ("CDR") que se unen
al antígeno (Véase, por ejemplo, Jones et al., Nature, 1986,
321, 522-525, Riechmann et al., Nature, 1988,
332, 323-327, Verhoeyen et al., Science,
1988, 239, 1534-36, y Tempest et al., Biol
Technology, 1991, 9, 266-71). Si es necesario,
también se modifica la región marco en lámina \beta del anticuerpo
humano que rodea a las regiones CDR3 para reflejar más
estrechamente la estructura tridimensional del dominio de unión al
antígeno del anticuerpo monoclonal original. (Véase, Kettleborough
et al., Protein Engin., 1991, 4, 773-783, y
Foote et al., J Mol. Biol., 1992, 224,
487-499, cada uno de los cuales se incorpora al
presente documento como referencia en su totalidad).
En un enfoque alternativo, la superficie de un
anticuerpo monoclonal no humano de interés se humaniza mediante la
alteración de residuos de superficie seleccionados del anticuerpo no
humano, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio,
mientras conservan todos los residuos interiores y de contacto del
anticuerpo no humano. Véase, Padlan, Molecular Immunol.,
1991, 28, 489-98.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
formularse para su administración a un mamífero en una variedad de
formas. En algunas realizaciones, los anticuerpos están en
disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero.
Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y
tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes
adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica,
conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes
antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes
incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas, y minerales.
Alternativamente, los anticuerpos pueden prepararse para su
administración en forma sólida. Los anticuerpos pueden combinarse
con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin
limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma
de tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o
lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico, Primogel,
o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio,
deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes
edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes
tales como menta o salicilato de metilo.
Los anticuerpos o sus formulaciones pueden
administrarse a un mamífero mediante cualquier medio eficaz para
administrar los anticuerpos al tejido enfermo. Tales medios
incluyen, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso,
intramuscular, subcutáneo, intratecal, intraventricular, oral,
enteral, parenteral, intranasal, o dérmico. En particular, los
anticuerpos o las formulaciones de anticuerpo pueden administrarse
mediante la inyección parenteral de las formulaciones líquidas o
mediante la ingestión de formulaciones sólidas tales como en
píldoras, comprimidos, cápsulas, o formulaciones líquidas tales como
emulsiones y disoluciones. Otros sistemas de administración de
fármacos incluyen hidrogeles, hidroximetilcelulosa, microcápsulas,
liposomas, microemulsiones, microesferas, y similares. La inyección
localizada de los anticuerpos directamente en el tejido enfermo tal
como un tumor es un procedimiento preferido para la administración
de los anticuerpos de la presente invención. La solución salina
tamponada con fosfato (PBS) es un vehículo preferido para las
formulaciones inyectables.
La dosificación de anticuerpos para obtener una
cantidad farmacéuticamente eficaz de agente terapéutico depende de
una variedad de factores. Por ejemplo, la edad, la sensibilidad, la
tolerancia y otras características del paciente afectarán a las
cantidades de dosificación. El tipo de neoplasia o tumor, el estadio
de la enfermedad, y el volumen tumoral también afectarán a las
dosificaciones. Además, para obtener la dosificación eficaz es
necesario que el médico que atiende considere el nivel en plasma y
la semivida de los anticuerpos empleados y la afinidad por sus
sitios de reconocimiento, y otros factores similares. Para la
administración sistémica de los anticuerpos frente a neurotrofina
pueden usarse dosis que oscilan desde aproximadamente 0,05
mg/kg-paciente/día hasta aproximadamente 500
mg/kg-paciente/día, aunque se prefieren
dosificaciones en el extremo inferior del intervalo simplemente
para facilitar la administración y el rendimiento. Las
dosificaciones pueden ajustarse, por ejemplo, para proporcionar un
nivel en plasma particular de un anticuerpo, por ejemplo, en el
intervalo de aproximadamente 5-30 mg/ml, más
preferiblemente de aproximadamente 10-15 mg/ml, y
para mantener el nivel, por ejemplo, durante un periodo de tiempo o
hasta que se logren los resultados clínicos. Los anticuerpos
quiméricos y humanizados, que se esperaría que se aclararan más
lentamente, requerirían menores dosificaciones para mantener un
nivel en plasma eficaz. Además, los anticuerpos que tienen alta
afinidad por neurotrofinas, preferiblemente se administran menos
frecuentemente o en dosis inferiores que los anticuerpos con menos
afinidad. Puede determinarse una dosificación terapéuticamente
eficaz del anticuerpo mostrando, durante el transcurso del
tratamiento, reducción en el volumen tumoral, reducción en la tasa
de crecimiento del tumor, o, idealmente, desaparición completa del
estado de enfermedad cancerosa. Un medio eficaz para medir o evaluar
el estadio del cáncer de próstata o páncreas es mediante la
medición del antígeno específico de próstata (PSA) en la sangre, la
medición del tiempo de supervivencia para el cáncer pancreático, la
medición del retraso o inhibición de la diseminación metastásica
tanto para el cáncer de próstata como de páncreas, medición de la
clasificación histológica del cáncer pancreático, y TC para el
cáncer pancreático. El experto en la técnica conoce tales
procedimientos.
La presente invención también contempla un
medicamento para reducir el volumen tumoral prostático o
pancreático. La presente invención también engloba un medicamento
para evitar el crecimiento adicional del tumor o para reducir la
tasa de crecimiento del tumor. El medicamento es preferiblemente
para administrar el agente al sitio del tumor mediante la inyección
localizada, directa, en el tejido en o cerca del sitio del tumor.
Sin embargo, los medicamentos para la administración sistémica de
los agentes mediante los medios tratados anteriormente también
están dentro del alcance de la presente invención. La inyección
local en el sitio del tumor puede realizarse por vía intratumoral o
peritumoral o una combinación de ambas.
Para la inyección directa en el sitio del tumor,
la dosificación del agente depende de varios factores, incluyendo
el tipo de tumor, el estadio del tumor, y el volumen tumoral, entre
otras variables. Las dosis terapéuticas típicas de los agentes
según el volumen tumoral puede oscilar desde aproximadamente 0,01
mg/mm^{3} hasta aproximadamente 10 mg/mm^{3} por inyección, y
las inyecciones pueden administrarse tan frecuentemente como sea
necesario. Por ejemplo, pueden ser apropiadas las inyecciones una
vez al día durante el tiempo en que un tumor o estado de enfermedad
esté presente, pero variarán según el tipo de cáncer, el transcurso
de la enfermedad y el paciente. La eficacia terapéutica del
tratamiento está indicada mediante, una reducción en el volumen
tumoral durante el transcurso del tratamiento, o bien una inhibición
en la tasa de crecimiento del tumor. El experto en la técnica
conoce bien la medición del volumen tumoral a partir de las
dimensiones del tumor. Pueden realizarse cálculos del volumen
tumoral con la siguiente fórmula:
V(mm^{3}) = 0,5236 x
longitud (mm) x anchura (mm) [longitud (mm) + anchura
(mm)/2].
Otro procedimiento para evaluar la eficacia de
un tratamiento particular es evaluar la inhibición de los receptores
de neurotrofina mediante medios bien conocidos en la técnica. Por
ejemplo, puede someterse a prueba trkA para determinar su actividad
utilizando un ensayo de enzimas basado en ELISA tal como se explica
en Angeles, et al., Anal. Biochem., 1996, 236, 49,
incorporado al presente documento como referencia en su totalidad.
Otro procedimiento de evaluación es medir la actividad de ChAT en
el prosencéfalo basal de la rata.
Los expertos en la técnica apreciarán que pueden
realizarse numerosos cambios y modificaciones a las realizaciones
preferidas de la invención y que tales cambios y modificaciones
pueden realizarse sin apartarse del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Los siguientes ejemplos son todos reales y no
pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo
1
Los anticuerpos se inyectaron en xenoinjertos de
PC-3 y/o TSU-pr1 que previamente han
demostrado que responden a CEP-751 (Dionne et
al., Clin. Canc. Res., 1998, 4, 187-1898). Los
siguientes experimentos se llevaron a cabo para confirmar la
capacidad neutralizante de los anticuerpos
anti-neurotrofina.
El anticuerpo anti-NGF reduce la
autofosforilación de trk estimulada por ligando en las células
NIH3T3-trkA. Se preincubó NGF (10 ng/ml) con
diversas concentraciones de anticuerpo en 6 ml de medio de cultivo
tisular. La mezcla NGF/anticuerpo se añadió a las células
NIH3T3-trkA. Se inmunoprecipitaron las proteínas trk
de los lisados con anticuerpo
anti-pan-Trk,
CEP-21, y las muestras se sondaron en una
inmunotransferencia con el anticuerpo
anti-fosfotirosina, 4G10. Los valores de la
exploración densitométrica (unidades de DO integradas) fueron los
siguientes (mostrados como NGF (10 ng/ml)/Anti-NGF
(\mug/ml): carril -/-; 0,3; carril +/-, 6,5; 0,001 mg/ml, 5,0;
0,01 mg/ml, 4,5; 0,1 mg/ml, 2,5; 1,0 mg/ml, 3,1; 10,0 mg/ml, 2,1;
100 mg/ml, 1,1. Por tanto, anti-NGF (PeproTech,
Inc., 500-P85) a 100 \mug/ml reduce la
fosforilación de trk en aproximadamente el 80% con respecto a la
ausencia de tratamiento con anti-NGF en las células
tratadas durante cinco minutos con NGF 10 ng/ml.
Ejemplo
2
El anticuerpo
anti-NT-3 reduce la
autofosforilación de trk estimulada por ligando en células
NIH3T3-trkC. Se preincubó NT-3 (10
ng/ml) con diversas concentraciones de anticuerpo en 6 ml de medio
de cultivo tisular. La mezcla NT-3/anticuerpo se
añadió a las células NIH3T3-trkC. Se
inmunoprecipitaron las proteínas trk de los lisados con anticuerpo
anti-pan-Trk,
CEP-21, y las muestras se sondaron en una
inmunotransferencia con el anticuerpo
anti-fosfotirosina, 4G10. Los valores de la
exploración densitométrica (unidades de DO integradas) fueron los
siguientes (mostrados como NT-3 (10
ng/ml)/Anti-NT-3 (\mug/ml): carril
-/-, 0,1; carril +/-, 4,0; IgG, 7,5; 0,001 mg/ml, 6,2; 0,01 mg/ml,
4,0; 0,1 mg/ml, 3,6; 1,0 mg/ml, 7,8; 10,0 mg/ml, 1,2. Por tanto,
anti-NT-3 (PeproTech
500-P82) a 10 \mug/ml reduce la fosforilación de
trk en aproximadamente el 70% con respecto a la ausencia de
tratamiento con anti-NGF tratamiento en las células
tratadas durante cinco minutos con NT-3 10
ng/ml.
Los siguientes ejemplos muestran los resultados
experimentales para la actividad antitumoral de los anticuerpos de
la presente invención. Los modelos tumorales usados en estos
experimentos son xenoinjertos de cáncer de próstata y cáncer
pancreático en ratones desnudos que los expertos en la técnica
conocen bien como modelos animales preclínicos preferidos, que
están correlacionados con resultados clínicos in vivo. La
bibliografía actual que indica la relevancia particular de estos
modelos de xenoinjerto para las enfermedades humanas
correspondientes incluyen Plonowski, et al., Cáncer Res.,
1999, 59, 1947, Joseph, et al., Cáncer Res., 1997, 57, 1054,
Pinski, et al., Int. J. Cáncer, 1993, 55, 963, Gao et al.,
Cáncer Res., 1998, 58, 1391, y Tan, et al., Tumour
Biology, 1985, 6, 89.
Ejemplo
3
Se utilizaron los siguientes anticuerpos frente
a neurotrofina: anti-NGF (PeproTech
500-P85), anti-BDNF (PeproTech
500-P84), anti-NT-3
(PeproTech 500-P82), y anti-NT4/5
(PeproTech 500-P83). Los anticuerpos
anti-NGF y anti-NT3 bloquean la
autofosforilación de trkA y trkC tras el tratamiento con
neurotrofina de células en cultivo. Se ha demostrado que cada uno
de los anticuerpos bloquea la actividad de su neurotrofina cognada
en un bioensayo en el que se mide la actividad de ChAT en cultivos
de células de prosencéfalo basal de rata.
Se inyectaron por vía subcutánea células de
tumor de próstata humano PC-3 (5 x 10^{6}
células/ratones) en el costado de ocho ratones desnudos atímicos
hembra de diez semanas de edad (nu/nu; Charles River, Raleigh, NC).
Los ratones pesaban entre 22-25 gramos en el día de
la implantación del tumor. Cuando los xenoinjertos alcanzaron
100-500 mm^{3}, los ratones se aleatorizaron y se
dividieron en grupos experimentales. A algunos grupos
experimentales se les administró un cóctel de anticuerpos frente a
neurotrofina (4 x 25 \mug a cada uno, o 4 x 100 \mug a cada uno
de anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT4/5) o
IgG de conejo normal (100 \mug o 400 \mug; PeproTech
500-P00) en PBS 1X estéril (volumen total de 100
\mul). Todos los anticuerpos se administraron por vía
intratumoral (50 \mul) en cinco sitios de inyección y por vía
peritumoral y subcutánea (50 \mul) en cinco sitios de inyección.
En el experimento número 1, los ratones recibieron inyecciones de
anticuerpo una vez al día en los días 1, 3, 5, 8, 10, 12, y 15. No
se administró anticuerpo tras el día 15. En el experimento número
2, los ratones recibieron inyección de anticuerpo una vez al día en
los días 1, 3, 6, 8, 10, 13. Un ratón que recibió 4 x 100 \mug de
anticuerpos frente a neurotrofina murió por causas sin explicar en
el día 13. Se midió la longitud y la anchura del tumor cada dos a
tres días. Se administró CEP-751 a un grupo
experimental separado como control para verificar que los tumores
respondían a CEP-751, tal como se había demostrado
previamente para los xenoinjertos de PC-3 crecidos
en una institución diferente. Los ratones recibieron vehículo
(polietilenglicol al 40%, povidona C30 al 10%, y alcohol bencílico
al 2%; 100 \mul) o CEP-751 (10 mg/kg s.c.
BID) en vehículo (100 \mul) siete días por semana durante
22 días. Se midió la longitud y la anchura del tumor cada dos a
tres días (días 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19 y 22).
Se calcularon los volúmenes tumorales como
(longitud x anchura (longitud+anchura)/2)) x 0,526 (Isaacs, Canc.
Res., 1989, 49, 6290-6294). Se calcularon los
volúmenes tumorales medios y los errores estándar (SigmaStat,
Jandel Scientific, San Rafel, CA). Se eliminó del análisis cualquier
ratón con un volumen tumoral en el día final del análisis que se
desviara del volumen tumoral medio en el día final del análisis en
más de dos desviaciones estándar en cada punto de datos. Se
calcularon los volúmenes tumorales relativos como (v_{t}
medio/v_{o} medio), en el que v_{t} se refiere al volumen
tumoral en un día dado y v_{o} es el volumen del mismo tumor al
inicio de la dosificación (día 1). Se eliminó del análisis cualquier
ratón con un volumen tumoral relativo en el día final del análisis
que se desviara del volumen tumoral relativo medio en el día final
del análisis en más de dos desviaciones estándar en cada punto de
datos. Se calcularon los valores de probabilidad mediante la prueba
de suma de rangos de Mann-Whitney (SigmaStat).
Experimento número 1: La administración
de anticuerpos frente a neurotrofina inhibió el crecimiento de
tumores PC-3 con respecto a los tumores tratados con
el control con IgG. Los volúmenes relativos de los tumores tratados
con anticuerpo frente a neurotrofina fueron significativamente
menores (p \leq 0,05) que los del grupo control con IgG en el día
3 y continuaron siendo menores hasta la terminación del experimento
en el día 22 (p \leq 0,05, día 5, p \leq 0,01, día 8; p \leq
0,001, días 10-22). Se observó regresión
significativa de los tumores en los días 10 (35%; p \leq 0,001) y
12 (25%; p \leq 0,05). Una vez retirado el tratamiento con
anticuerpo neutralizante (día 15), se observó un nuevo crecimiento
del tumor en el día 22, (0,95 de volumen tumoral relativo, día 22,
frente a 0,77 de volumen tumoral relativo, día 15). Los volúmenes
absolutos de los tumores tratados con anticuerpo frente a
neurotrofina en comparación el Grupo control con IgG fueron
significativamente menores (p \leq 0,05) en el día 15, y
continuaron siendo menores hasta la terminación del experimento (p
\leq 0,05, día 17; p \leq 0,01, días 19 y 22), y alcanzaron un
T/C mínimo de 0,33 en el día 17.
La administración de CEP-751
inhibió el crecimiento de tumores PC-3 con respecto
al control con vehículo. Los volúmenes relativos de los tumores
tratados con CEP-751 fueron significativamente
menores que el grupo control con vehículo en los días 12 (p \leq
0,05), 17 (p \leq 0,01), 19 (p \leq 0,05) y 22 (p \leq 0,01).
Los volúmenes absolutos de los tumores tratados con
CEP-751 fueron significativamente menores en
comparación con el grupo control con vehículo en el día 17 (p
\leq 0,01) y el día 22 (p \leq 0,05) y alcanzaron un T/C mínimo
de 0,44 en el día 19.
Experimento número 2: La administración
de los anticuerpos (4 x 25 \mug a cada uno, o 4 x 100 \mug a
cada uno de anti-NGF, BDNF, NT-3, y
NT4/5) inhibió el crecimiento de tumores PC-3 con
respecto a los tumores tratados con el control con IgG. Los
volúmenes relativos de los tumores tratados con anticuerpo frente a
neurotrofina fueron significativamente menores (p \leq 0,05; 100
mg de cóctel de neurotrofina frente a 100 \mug de IgG normal; 400
\mug de cóctel de neurotrofina frente a 400 \mug de IgG normal)
que los de los grupos control con IgG en el día 3 y continuaron
siendo menores hasta la terminación del experimento. Se observó
regresión significativa de los tumores (400 \mug de cóctel de
neurotrofina frente a 400 \mug de IgG normal) en el día 10 (31%;
p \leq 0,05) y el día 13 (19%; p \leq 0,05). Los volúmenes
absolutos de los tumores tratados con anticuerpo frente a
neurotrofina en comparación con el grupo control con IgG fueron
significativamente menores (p \leq 0,05) en el día 8 (100 \mug
de cóctel de neurotrofina frente a 100 \mug de IgG normal) y en el
día 6 (400 \mug de cóctel de neurotrofina frente a 400 \mug de
IgG normal), y continuaron siendo menores hasta la terminación del
experimento (p \leq 0,005, días 10, 13, 15 tanto para 100 \mug
de cóctel de neurotrofina frente a 100 \mug de IgG normal como
para 400 \mug de cóctel de neurotrofina frente a 400 \mug de IgG
normal), y alcanzaron un T/C mínimo de 0,26 en el día 15 (100
\mug de cóctel de neurotrofina frente a 100 \mug de IgG normal)
o un T/C mínimo de 0,17 en el día 13 (400 \mug de cóctel de
neurotrofina frente a 400 \mug de IgG normal).
Ejemplo
4
Experimento número 1: Se utilizaron los
siguientes anticuerpos frente a neurotrofina:
anti-NGF (PeproTech 500-P85),
anti-BDNF (PeproTech 500-P84),
anti-NT-3 (PeproTech
500-P82), y anti-NT4/5 (PeproTech
500-P83).
\newpage
Se inyectaron células del tumor de próstata
humano TSU-Pr1 por vía subcutánea en el costado de
ratones desnudos atímicos hembra (nu/nu; 5 x 10^{6}
células/ratones). Cuando los xenoinjertos alcanzaron
100-500 mm^{3}, los ratones se aleatorizaron y se
dividieron en cuatro grupos experimentales. A un grupo se le
administró un cóctel de anticuerpos frente a neurotrofina
(anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT4/5).
Cada dosis de cóctel de anticuerpos (100 \mul) contenía 100
\mug de cada anticuerpo frente a neurotrofina. Al segundo grupo
experimental se le administró IgG de conejo normal (400 \mug/100
\mul; PeproTech 500-P00) como control. Todos los
anticuerpos se administraron por vía intratumoral (50 \mul) en
cinco sitios de inyección y por vía peritumoral (50 \mul) en
cinco sitios de inyección. Los ratones recibieron inyecciones de
anticuerpo una vez al día, tres días por semana en los días 1, 3,
5, 8, 10, y 12. Se midió la longitud y la anchura del tumor cada dos
a tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12, y 15).
El tercer grupo experimental recibió
CEP-701 en vehículo (polietilenglicol al 40%,
povidona C30 al 10%, y alcohol bencílico al 2%), 10 mg/kg s.c.
BID, cinco días por semana durante 14 días. El cuarto grupo
experimental recibió vehículo únicamente (100 \mul) según el
programa de dosificación del tercer grupo experimental. Se midió la
longitud y la anchura del tumor cada dos a tres días (Días 1, 3, 5,
8, 10, 12, y 15).
Se calcularon los volúmenes tumorales tal como
se describió anteriormente. Se calcularon los volúmenes tumorales
medios y los errores estándar tal como se describió anteriormente.
Cualquier ratón con volúmenes tumorales que se desviaran de los
volúmenes tumorales medios en más de dos desviaciones estándar se
eliminó del análisis en cada punto de datos. Para los volúmenes
tumorales relativos, se normalizó cada punto de datos para un ratón
dado para el volumen tumoral de ese ratón en el inicio de la
dosificación (Día 1). Se calcularon los valores de probabilidad tal
como se describió anteriormente. No se observaron muertes ni
morbilidad en ninguno de los grupos experimentales, lo que indicaba
que CEP-701 y los anticuerpos neutralizantes se
toleraban bien en estos animales.
La administración de anticuerpos frente a
neurotrofina dio como resultado volúmenes tumorales relativos
inferiores con respecto a los volúmenes tumorales en el grupo
control con IgG. Los volúmenes tumorales relativos de los tumores
tratados con anticuerpo frente a neurotrofina fueron
significativamente menores (p \leq 0,0001) que los volúmenes
tumorales relativos en el grupo control tratado con IgG en el Día 5
y continuaron siendo menores durante el resto del experimento (p
\leq 0,01 Días 8 y 10; p \leq 0,0001 Días 12 y 15). Los
volúmenes absolutos de los tumores tratados con anticuerpo frente a
neurotrofina en comparación con el grupo control con IgG fueron
significativamente menores (p \leq 0,05) en el Día 10, y
continuaron siendo menores hasta la terminación del experimento (p
\leq 0,001, Día 12; p \leq 0,01, Día 15) y alcanzaron un T/C
mínimo de 0,41 en el día 15.
La administración de CEP-701 dio
como resultado volúmenes tumorales relativos inferiores con respecto
a los volúmenes tumorales en el grupo control con vehículo. Los
volúmenes tumorales relativos de los tumores tratados con
CEP-701 fueron significativamente menores (p \leq
0,05) en el Día 3 que los del grupo control tratado con vehículo y
continuaron siendo menores hasta la terminación del experimento (p
\leq 0,01, Día 5; p \leq 0,05, Día 8; p \leq 0,01 Día 10 y
12; p \leq 0,001 Día 15). Los volúmenes absolutos de los tumores
tratados con CEP-701 fueron significativamente
menores en comparación con el grupo control con vehículo en el día
8 (p \leq 0,05), y continuaron siendo menores hasta la
terminación del experimento (p \leq 0,05, Día 10; p \leq 0,001
Días 12 y 15), y alcanzaron un T/C mínimo de 0,29 en los días 12 y
15.
Los tumores tratados con la IgG normal
parecieron tener un crecimiento más lento que los tratados con el
vehículo para CEP-701; sin embargo, no hubo
diferencia significativa (p \leq 0,05) en los volúmenes tumorales
o los volúmenes tumorales relativos entre estos dos grupos en ningún
momento durante el experimento.
Este experimento demuestra que los anticuerpos
frente a neurotrofina inhiben el crecimiento del xenoinjerto de
TSU-Pr1. Los volúmenes tumorales relativos de los
tumores tratados con anticuerpos neutralizantes fueron
significativamente menores que los del grupo control tratado con IgG
normal en el Día 5 (p \leq 0,0001), Días 8 y 10 (p \leq 0.41),
y los Días 12 y 15 (p \leq 0,0001). Dado que los anticuerpos
frente a neurotrofina inhibieron el crecimiento del tumor con
respecto a IgG normal, es probable que el efecto de los anticuerpos
frente a neurotrofina se deba al bloqueo de la señalización de
neurotrofina a través de los receptores de neurotrofina trk, a
diferencia de un efecto general de la inyección de IgG dentro de los
tumores.
Experimento número 2: Se utilizaron los
siguientes anticuerpos frente a neurotrofina:
anti-NGF (PeproTech 500-P85),
anti-BDNF (PeproTech 500-P84),
anti-NT-3 (PeproTech
500-P82), y anti-NT4/5 (PeproTech
500-P83).
Se inyectaron células del tumor de próstata
humano TSU-Pr1 por vía subcutánea en el costado de
ratones desnudos atímicos hembra (nu/nu; 5 x 10^{6}
células/ratones). Cuando los xenoinjertos alcanzaron
100-500 mm^{3}, los ratones se aleatorizaron y se
dividieron en seis grupos experimentales. Al primer grupo se le
administró anti-NGF (100 \mug) + IgG de conejo
normal (300 \mug) por dosis. Al segundo grupo se le administró
anti-NT-3 (100 \mug) + IgG de
conejo normal (300 \mug) por dosis. Al tercer grupo se le
administró anti-NT4/5 (100 \mug) + IgG de conejo
normal (300 \mug) por dosis. Al cuarto grupo se le administró
anti-BDNF (100 \mug) + IgG de conejo normal (300
\mug) por dosis. Al quinto grupo se le administró un cóctel de
anticuerpos frente a neurotrofina ((anti-NGF, BDNF,
NT-3, y NT4/5 (100 \mug de cada anticuerpo por
dosis)). Al sexto grupo experimental se le administró IgG de conejo
normal (400 \mug por dosis; PeproTech 500-P00)
como control. Se inyectó cada dosis (400 \mug de proteína total
por 100 \mul de PBS) por vía intratumoral (50 \mul) en cinco
sitios de inyección y por vía peritumoral (50 \mul) en cinco
sitios de inyección, una vez al día, tres días por semana en los
días 1, 3, 6, 8, 10, y 13. Se midió la longitud y la anchura del
tumor cada dos a tres días (Días 1, 3, 6, 8, 10, 13, y 15).
Se calcularon los volúmenes tumorales tal como
se describió anteriormente. También se calcularon los volúmenes
tumorales medios y los errores estándar tal como se describió
anteriormente. Se eliminó del análisis cualquier ratón con
volúmenes tumorales que se desviaran de los volúmenes tumorales
medios en más de dos desviaciones estándar en cada punto de datos.
Para los volúmenes tumorales relativos, se normalizó cada punto de
datos para un ratón dado para el volumen tumoral de ese ratón en el
inicio de la dosificación (Día 1). Se calcularon los valores de
probabilidad tal como se describió anteriormente. No se observaron
muertes ni morbilidad en ninguno de los grupos experimentales, lo
que indicaba que los anticuerpos neutralizantes se toleraban bien
en estos animales.
El cóctel de anticuerpos frente a neurotrofina
(anti-NGF,
anti-NT-3,
anti-BDNF, y
anti-NT-4/5),
anti-NGF, o
anti-NT-3 inhibió el crecimiento del
tumor con respecto a IgG de conejo normal. Ni
anti-NT-4/5 ni
anti-BDNF tuvieron un efecto significativo sobre el
crecimiento del tumor con respecto a IgG de conejo normal. Los
volúmenes tumorales relativos para el grupo que recibió el cóctel
de anticuerpos anti-neurotrofina fueron
significativamente menores que los volúmenes tumorales relativos
para el grupo control con IgG en el Día 3 (p \leq 0,01) y Día 8
(p \leq 0,05), entonces continuaron siendo menores durante el
resto del experimento (p \leq 0,01 Días 10, 13, y 15). Los
volúmenes tumorales relativos de los tumores tratados con
anti-NGF fueron significativamente menores (p \leq
0,001) que el volumen tumoral relativo en el grupo control tratado
con IgG en el Día 3 y continuaron siendo menores durante el resto
del experimento (p \leq 0,001 Día 6; p \leq 0,01 Día 8; p
\leq 0,001 Día 10; p \leq 0,01 Día 13; p \leq 0,001 Día 15).
El volumen tumoral relativo de los tumores tratados con
anti-NT-3 fue significativamente
menor (p \leq 0,05) que el de los tumores en el grupo control con
IgG en el Día 6 y continuó siendo menor durante el resto del
experimento (p \leq 0,01 Día 8; p \leq 0,001 Día 10; p \leq
0,01 Día 13; p \leq 0,001 Día 15).
Los volúmenes tumorales absolutos del grupo de
cóctel de anticuerpos anti-neurotrofina fueron
significativamente menores (p \leq 0,05, Día 8; p \leq 0,01,
Días 10, 13, y 15) en comparación con el grupo control tratado con
IgG y alcanzaron un T/C mínimo de 0,52 en el día 13. Los volúmenes
tumorales absolutos del grupo que recibió anti-NGF
fueron significativamente menores (p \leq 0,05, Día 3; p \leq
0,001, Días 6, 8, 10, 13; y p \leq 0,01 Día 15) en comparación con
el grupo control tratado con IgG y alcanzaron un T/C mínimo de 0,34
en el Día 13. Se observó regresión en el grupo de
anti-NGF en el Día 3 (20%, p \leq 0,001), Día 6
(31%, p \leq 0,01), Día 8 (35%, p \leq 0,001), Día 10 (35%, p
\leq 0,01), y Día 13 (37%, p \leq 0,01). Los volúmenes
tumorales absolutos del grupo que recibió
anti-NT-3 fueron significativamente
menores (p \leq 0,05, Día 6; p \leq 0,01 Días 8, 10, 13, y 15)
en comparación con los controles tratados con IgG y alcanzaron un
T/C mínimo de 0,38 en el Día 13. Se observó regresión en el grupo de
anti-NT-3 en el Día 8 (16%, p
\leq 0,001), Día 10 (33%, p \leq 0,001), y Día 13 (29%, p \leq
0,01).
Una comparación de los efectos de
anti-NGF o anti-NT-3
con respecto al cóctel de anticuerpos
anti-neurotrofina demostró que cada uno de estos
anticuerpos individuales frente a neurotrofina inhibió
transitoriamente el crecimiento del tumor más eficazmente que el
cóctel de anticuerpos anti-neurotrofina. Los
volúmenes tumorales relativo y absoluto del grupo con
anti-NGF fueron significativamente menores que los
del grupo de cóctel de anticuerpos
anti-neurotrofina en el Día 8 (p \leq 0,01) y el
Día 10 (p \leq 0,05). El anti-NGF inhibió el
crecimiento del tumor en el 57 y el 64 por ciento con respecto a la
IgG de conejo normal en los Días 8 y 10, respectivamente, mientras
que el cóctel de anticuerpos anti-neurotrofina
inhibió el crecimiento en el 32 y el 43 por ciento con respecto a
la IgG de conejo normal en los Días 8 y 10, respectivamente. El
volumen tumoral relativo del grupo con
anti-NT-3 fue significativamente
inferior que el del grupo de cóctel de anticuerpos
anti-neurotrofina en el Día 10 (p \leq 0,05). El
anti-NT-3 inhibió el crecimiento
del tumor en el 60 por ciento con respecto a la IgG de conejo normal
en el Día 10, mientras que el cóctel de anticuerpos frente a
neurotrofina inhibió el crecimiento en el 43 por ciento con respecto
a la IgG de conejo normal en el Día 10. Los resultados de este
experimento demuestran que anti-NGF o
anti-NT-3 inhibe el crecimiento de
xenoinjertos de TSU-Pr1 así como, y transitoriamente
mejor que, el cóctel de anticuerpos
anti-neurotrofina (anti-NGF,
anti-NT-3,
anti-BDNF, y
anti-NT-4/5).
A una dosis de 100 \mug, ni
anti-NT-4/5 ni
anti-BDNF tuvieron un efecto significativo sobre el
crecimiento de tumores TSU-Pr1 en ratones desnudos,
aunque es posible que diferentes anticuerpos neutralizantes frente
a NT-4/5 o BDNF o una concentración diferente de
estos anticuerpos podría dar como resultado un efecto significativo
en el crecimiento del tumor. Los datos anteriores que analizaban la
expresión de trkB en células TSUPr1 demostraron que trkB no se
expresa en esta línea celular (Dionne, et al., 1998). Dado
que BDNF y NT-4/5 producen señales principalmente a
través de trkB (Barbacid, 1995; Ibanez, 1995), la falta de efecto
observado en el experimento concuerda con la ausencia del
receptor.
Ejemplo
5
Se utilizaron los siguientes anticuerpos frente
a neurotrofina: anti-NGF (PeproTech
500-P85), anti-BDNF (PeproTech
500-P84), anti-NT-3
(PeproTech 500-P82), y anti-NT4/5
(PeproTech 500-P83).
Se inyectaron células del tumor pancreático
humano AsPC-1 por vía subcutánea en el costado de
ratones desnudos atímicos hembra (nu/nu; 5 x 10^{6}
células/ratones). Cuando los xenoinjertos alcanzaron
100-500 mm^{3}, los ratones se aleatorizaron y se
dividieron en cuatro grupos experimentales. A un grupo se le
administró un cóctel de anticuerpos frente a neurotrofina
(anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT4/5).
Cada dosis de cóctel de anticuerpos (100 \mul) contenía 100
\mug de cada anticuerpo frente a neurotrofina. Al segundo grupo
experimental se le administró IgG de conejo normal (400 \mug/100
\mul; PeproTech 500-P00) como control. Todos los
anticuerpos se administraron por vía intratumoral (50 \mul) en
cinco sitios de inyección y por vía peritumoral (50 \mul) en
cinco sitios de inyección. Los ratones recibieron inyecciones de
anticuerpo una vez al día, tres días por semana en los días 1, 3,
5, 8, 10, y 12. Se midió la longitud y la anchura del tumor cada dos
a tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12, y 15). El tercer grupo
experimental recibió CEP-701 en vehículo
(polietilenglicol al 40%, povidona C30 al 10%, y alcohol bencílico
al 2%), 10 mg/kg s.c. BID, cinco días por semana durante 14
días. El cuarto grupo experimental recibió vehículo únicamente (100
\mul) según el programa de dosificación del tercer grupo
experimental. Se midió la longitud y la anchura del tumor cada dos a
tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12, y 15).
Se calcularon los volúmenes tumorales tal como
se describió anteriormente. También se calcularon los volúmenes
tumorales medios y los errores estándar, tal como se describió
anteriormente. Cualquier ratón con volúmenes tumorales que se
desviaran de los volúmenes tumorales medios en más de dos
desviaciones estándar se eliminó del análisis en cada punto de
datos. Para los volúmenes tumorales relativos, se normalizó cada
punto de datos para un ratón dado para el volumen tumoral de ese
ratón en el inicio de la dosificación (Día 1). Se calcularon los
valores de probabilidad tal como se describió anteriormente. No se
observaron muertes ni morbilidad en ninguno de los grupos
experimentales, lo que indicaba que CEP-701 y los
anticuerpos neutralizantes se toleraban bien en estos animales.
La administración de anticuerpos frente a
neurotrofina dio como resultado volúmenes tumorales relativos
inferiores en comparación con los volúmenes tumorales en el grupo
control con IgG. Los volúmenes tumorales relativos de los tumores
tratados con anticuerpo frente a neurotrofina fueron
significativamente menores (p \leq 0,05) que en el grupo control
tratado con IgG en los días 5, 10, 12 y 15. Los volúmenes absolutos
de los tumores tratados con anticuerpo frente a neurotrofina en
comparación con el grupo control con IgG fueron significativamente
menores (p \leq 0,01) en el Día 5, y continuaron siendo menores
hasta la terminación del experimento (p \leq 0,01, Días 8, 10,
12, y 15), y alcanzaron un T/C mínimo de 0,43 en el día 15.
La administración de CEP-701 dio
como resultado volúmenes tumorales relativos inferiores en
comparación con los volúmenes tumorales en el grupo control con
vehículo. Los volúmenes tumorales relativos de los tumores tratados
con CEP-701 fueron significativamente menores (p
\leq 0,01) que los del grupo control tratado con vehículo en el
Día 3 y continuaron siendo menores hasta la terminación del
experimento (p \leq 0,001, Día 5; p \leq 0,01, Día 8; p \leq
0,001 Día 10, p \leq 0,01 Día 12; y p \leq 0,001 Día 15). Los
volúmenes absolutos de los tumores tratados con
CEP-701 fueron significativamente menores en
comparación con el grupo control con vehículo en el día 5 (p \leq
0,05), y continuaron siendo menores hasta la terminación del
experimento (p \leq 0,05, Días 8, 10, 12, y 15), y alcanzaron un
T/C mínimo de 0,27 en el día 15.
Este experimento demuestra que los anticuerpos
frente a neurotrofina inhiben el crecimiento de xenoinjerto de
AsPC-1. Dado que los anticuerpos
anti-neurotrofina inhibieron el crecimiento del
tumor con respecto a IgG normal, es probable que el efecto de los
anticuerpos frente a neurotrofina se deba al bloqueo de la
señalización de neurotrofina a través de los receptores de
neurotrofina trk, a diferencia de un efecto general de la inyección
de IgG dentro de los tumores. Los tumores tratados con la IgG normal
parecieron tener un crecimiento más lento que los tratados con el
vehículo para CEP-701; sin embargo, no hubo una
diferencia significativa (p \leq 0,05) en los volúmenes tumorales
o los volúmenes tumorales relativos entre estos dos grupos en
ningún momento durante el experimento.
Ejemplo
6
Se utilizaron los siguientes anticuerpos frente
a neurotrofina: anti-NGF (PeproTech
500-P85), anti-BDNF (PeproTech
500-P84), anti-NT-3
(PeproTech 500-P82), y anti-NT4/5
(PeproTech 500-P83).
Las líneas celulares de carcinoma pancreático
humano, AsPC-1 y CFPAC, se hicieron crecer en medios
RPMI o DMEM, respectivamente, (Cellgro/Mediatech, Washington, D.C.)
que contienen suero bovino fetal al 10% (Atlanta Biologicals,
Norcoss, GA) a 37ºC en un incubador humidificado, con una atmósfera
de 95% de aire/5% de CO_{2}. Se determinó que las células estaban
libres de virus de roedores y micoplasmas (pruebas MAP). Las células
que crecían exponencialmente se recogieron utilizando tripsina/EDTA
(GibcoBRL, Rockville, MD), y se contaron utilizando azul de tripano
(Fisher Scientific, Malvern, PA). Las células se resuspendieron en
los medios de crecimiento apropiados 1:1 con Matrigel (Fisher
Scientific).
Se mantuvieron ratones nu/nu atímicos hembra
(8-10 semanas de edad; Charles River, Raleigh, NC) a
cinco por jaula en unidades de microaislamiento. Se facilitó a los
animales una dieta comercial y agua a voluntad, se les alojó al 48
\pm 2% de humedad y a 22 \pm 2ºC, y se estableció un ciclo de
luz-oscuridad a intervalos de 12 horas. Los ratones
se pusieron en cuarentena durante al menos 1 semana antes de la
manipulación experimental. Los ratones pesaban entre 22 y 25 g en
el día de la inoculación de las células tumorales. Las células que
crecían exponencialmente, que se pusieron en cultivo tal como se
describió anteriormente, se recogieron y se inyectaron (5 x
10^{6} células/ratón) en el costado derecho de ratones desnudos.
Los animales que portaban tumores de 100-400
mm^{3} (AsPC-1) o 100-900 mm^{3}
(CFPAC) diez días tras la inoculación se aleatorizaron en los
grupos apropiados. El tratamiento se inició con un cóctel de
anticuerpos neutralizantes frente a neurotrofina
(anti-NGF, anti-BDNF,
anti-NT-3, y
anti-NT4/5; 100 \mug de cada anticuerpo en un
volumen total de 100 \mul, 50 \mul por vía intratumoral y 50
\mul por vía peritumoral) o IgG de conejo normal (400 \mug/100
\mul, 50 \mul por vía intratumoral y 50 \mul por vía
peritumoral). Los ratones recibieron inyecciones de anticuerpos o
IgG de conejo normal una vez al día, tres días por semana en los
días 1, 3, 5, 8, 10, y 12.
Los tumores se midieron cada 2-4
días usando un calibre Vernier. Se calcularon los volúmenes
tumorales tal como se describió anteriormente. También se
calcularon los volúmenes tumorales medios y los errores estándar,
tal como se describió anteriormente. Cualquier ratón con un volumen
tumoral en el día final del análisis que se desviaran del volumen
tumoral medio en el día final del análisis en más de dos
desviaciones estándar se eliminó del análisis en cada punto de
datos. Se calcularon los análisis estadísticos tal como se describió
anteriormente, considerándose significativo p \leq 0,05.
La administración de anticuerpos frente a
neurotrofina (anti-NGF, anti-BDNF,
anti-NT-3, y
anti-NT4/5) a xenoinjertos de
AsPC-1 dio como resultado volúmenes tumorales
relativos inferiores en comparación con los volúmenes tumorales en
el grupo control con IgG. Los volúmenes tumorales relativos de los
tumores tratados con anticuerpo frente a neurotrofina fueron
significativamente menores (p \leq 0,05) que los del grupo control
tratado con IgG, comenzando en el Día 5 y continuaron siendo
menores desde el Día 10 hasta la terminación del experimento. Los
volúmenes absolutos de los tumores tratados con anticuerpo frente a
neurotrofina en comparación con los animales control tratados con
IgG fueron significativamente menores (p \leq 0,01) en el Día 5,
y continuaron siendo menores hasta la terminación del experimento, y
alcanzaron una inhibición de crecimiento del tumor máxima del 55
por ciento en el día
15.
15.
La administración de anticuerpos neutralizantes
frente a neurotrofina no inhibió el crecimiento de los tumores
CFPAC con respecto a los tumores tratados con el control con IgG. La
falta de inhibición mediante los anticuerpos neutralizantes frente
a neurotrofina sugiere que estos xenoinjertos no dependen de las
neurotrofinas para su crecimiento. La falta de respuesta de CFPAC
concuerda con los datos publicados anteriormente de que el
crecimiento del tumor CFPAC no era sensible al tratamiento con el
inhibidor de pan-trk, CEP-701,
mientras que el crecimiento de los tumores AsPC-1
se inhibió mediante CEP-701.
No hubo signos evidentes de morbilidad o muertes
relacionadas con el anticuerpo neutralizante en el grupo
experimental, y los pesos corporales fueron comparables entre los
animales tratados con el anticuerpo neutralizante y los animales
tratados con la IgG de conejo normal (tablas 2 y 4). Estos datos
indican que los animales toleraban bien los anticuerpos
neutralizantes a dosis en los que se observó eficacia antitumoral
significativa.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los ratones desnudos que portaban tumores ASPC1
se trataron con anticuerpo neutralizante (100 \mug cada Ac/100
\mul, por vía intratumoral y por vía peritumoral una vez al día en
los Días 1, 3, 5, 8, 10, y 12) o IgG de conejo normal en PBS
estéril (100 \mug/100 \mul por vía intratumoral y por vía
peritumoral una vez al día en los Días 1, 3, 5, 8, 10, y 12). Los
volúmenes tumorales se determinaron cada 2-3 días.
Los valores son la media \pm DE del volumen tumoral relativo. Los
valores entre paréntesis son la media \pm DE del volumen tumoral
real (mm^{3}). *p \leq 0,05, **p \leq 0,01 mediante la prueba
de la suma de rangos de Mann-Whitney.
Los ratones desnudos que portaban tumores ASPC1
se trataron con anticuerpo neutralizante (100 \mug cada Ac/100
\mul, por vía intratumoral y por vía peritumoral una vez al día en
los Días 1, 3, 5, 8, 10, y 12), o IgG de conejo normal en PBS
estéril (100 \mug/100 \mul por vía intratumoral y por vía
peritumoral una vez al día en los Días 1, 3, 5, 8, 10, y 12). Los
valores son la media \pm DE del peso corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones desnudos que portaban tumores CFPAC
se trataron con anticuerpo neutralizante (100 \mug cada Ac/100
\mul, por vía intratumoral y por vía peritumoral una vez al día en
los días 1, 3, 5, 8, 10, y 12) o IgG de conejo normal en PBS
estéril (100 \mug/100 \mul por vía intratumoral y por vía
peritumoral una vez al día en los días 1, 3, 5, 8, 10, y 12). Los
volúmenes tumorales se determinaron cada 3-4 días.
Los valores son la media \pm DE del volumen tumoral relativo. Los
valores entre paréntesis son la media \pm DE del volumen tumoral
real (mm^{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones desnudos que portaban tumores CFPAC
se trataron con anticuerpo neutralizante (100 \mug cada Ac/100
\mul, por vía intratumoral y por vía peritumoral una vez al día en
los días 1, 3, 5, 8, 10, 12) o IgG de conejo normal en PBS estéril
(400 \mug/100 \mul por vía intratumoral y por vía peritumoral
una vez al día en los días 1, 3, 5, 8, 10 y 12). Los pesos
corporales se determinaron cada 3-4 días. Los
valores son la media \pm DE de los pesos corpora-
les (g).
les (g).
Ejemplo
7
Células que crecían exponencialmente, que se
cultivaron tal como se describió anteriormente, se recogieron y se
inyectaron (5 x 10^{6} células/ratón) en el costado derecho de
ratones desnudos. Los animales que portaban tumores de
100-500 mm^{3} de tamaño se aleatorizaron en los
grupos apropiados y se les dosificó utilizando un cóctel de
anticuerpos neutralizantes frente a neurotrofina
(anti-NGF, anti-BDNF,
anti-NT-3, y
anti-NT-4/5) (100 \mug de cada
anticuerpo en un volumen total de 100 \mul, 50 \mul por vía
intratumoral y 50 \mul por vía peritumoral) o IgG de conejo
normal (400 \mug/100 \mul, 50 \mul por vía intratumoral y 50
\mul por vía peritumoral). Los ratones recibieron inyecciones de
anticuerpos una vez al día, tres días por semana en los días 1, 3,
5, 8, 10, y 12.
Los tumores se midieron cada 2-3
días utilizando un calibre Vernier. También se calcularon los
volúmenes tumorales, los volúmenes tumorales medios y los errores
estándar tal como se describió anteriormente. Los volúmenes
tumorales relativos se determinaron en cada punto de datos usando
la fórmula siguiente: v_{t} medio/v_{o} medio, en la que
v_{t} se refiere al volumen tumoral en un día dado y v_{o} se
refiere al volumen tumoral en el inicio de la dosificación (Día 1).
Cualquier ratón con un volumen tumoral en el día final del análisis
que se desviara del volumen tumoral medio en el día final del
análisis en más de dos desviaciones estándar se eliminó de los
análisis en cada punto de datos. Se calcularon los análisis
estadísticos tal como se describió anteriormente, considerándose
significativo
p \leq 0,05.
p \leq 0,05.
Claims (7)
1. Uso de un anticuerpo
anti-neurotrofina en la fabricación de un
medicamento para tratar cáncer de próstata o páncreas en un
mamífero.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para reducir el volumen tumoral prostático o
pancreático.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para reducir la tasa de crecimiento del tumor
prostático o pancreático.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha neurotrofina es NGF, BDNF,
NT-3, NT-4/5, NT-6,
o NT-7.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho mamífero es un ser
humano.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o
fragmento F(ab)_{2}.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
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