MXPA02008465A - Metodo de tratamiento del cancer con agentes anti-neurotrofina. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para tratar o prevenir cancer mediante la administracion a un mamifero de una cantidad efectiva terapeuticamente de al menos un agente anti- neurotrofina. El agente anti-neurotrofina de preferencia es un anticuerpo anti-neurotrofina, una molecula antisentido dirigida a una neurotrofina, una molecula organica peque+- a que enlaza a una neurotrofina o una mutacion dominante- negativa de un receptor trk que enlaza una neurotrofina. Este metodo es particularmente preferido para el tratamiento de la prostata o cancer pancreatico. Los angentes anti- neurotroficos neutralizan a los NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 o NT-7 e incluyen anticuerpos humanizados asi como sus fragmentos.

Description

OZ, «y&r MÉTODO DE TRATAMIENTO DEL CÁNCER CON AGENTES ANTI-NEUROTROFINA CAMPO DE LA INVENCIÓN 5 La presente invención se refiere al campo de la oncología y está dirigida a un método para el tratamiento y prevención del cáncer, particularmente los cánceres de próstata y pancreático. La presente invención se refiere también al área de las neurotrofinas y al uso de agentes 10 anti-neurotrofinas tales como, por ejemplo, anticuerpos en el tratamiento o prevención del cáncer y/o el dolor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las neurotrofinas (NT) son una subfamilia de los 15 factores neurotróficos específicos que incluyen cuatro proteínas relacionadas funcional y estructuralmente bien conocidas : factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , neurotrofina-3 (NT- 3), neurotrofina-4/5 (NT-4/5) . Recientemente, se han 20 descubierto dos NT adicionales, neurotrofina-6 (NT-6) y neurotrofina- 7 (NT- 7) . Las neurotrofinas se unen y activan los receptores de membrana superficial de células específicas que tienen actividad quinasa tirosina. Estos receptores son conocidos como receptores trk y están clasificados de acuerdo 25 con los tres subtipos trkA, trkB y trkC. Cada subtipo de receptor trk se une preferentemente a uno o más NT (NGF a trkA, BDNF y NT-4/5 a trkB, y NT-3 a trk C) . No obstante, la reactividad cruzada NT, es conocida por producirse entre los subtipos de receptores. La actividad de receptores trk por 30 los resultados NT en la oligomerización del receptor y la fosforilación de tirosina de substratos intracelulares específicos. Además de los receptores trk, un segundo tipo de HMBy^ ~^..-J.J>-..^.-„.J,..,____^.. J,.^^^.^...^^^ s, ^M*h *.á , i . té* *»,. receptor de membrana superficial de células es conocido por unirse a las NT. Este receptor es el receptor de crecimiento nervioso de baja afinidad p75NTR (p75) que se cree que está implicado en la modulación de la afinidad NT y/o disponibilidad para unirse a receptores trk de mayor afinidad. Un papel fisiológico específico para el receptor p75, sigue están, no obstante, en debate. Se reconoce ampliamente que la NT juega un papel esencial en el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de células del sistema nervioso central y periférico. No obstante, existe una evidencia reciente de que las NT contribuyen también a biología del tumor fuera del sistema nervioso. Las neurotrofinas y sus subtipos receptores han estado implicadas en varios cánceres, incluyendo próstata, estómago, tiroides, colon y carcinomas de pulmón, así como en melanomas malignos, carcinóides pancreáticos, y glioblastomas. Específicamente, la expresión aberrante de receptores trk A, B y C se ha encontrado en adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y las NT pueden influir en la invasividad de este tipo de tumor (Miknyoczki, y col . , Int . J. Cáncer, 1999, 81 , 417).

Adicionalmente, el NGF ha estado en correlación con la invasión perineural y el dolor que está asociado con PDAC (Zhu, y col . , J. Clin . Oncol . , 1999, 11 2419). El TrkA es conocido por ser expresado en el tejido epitelial prostático, y la correspondiente neurotrofina NGF ha estado implicada en la estimulación del crecimiento del cáncer de próstata. La inmunoreactividad para el NGF ha estado demostrada en los carcinomas prostáticos humanos (De Schryver-Kecskematic y col . , Arch . Pathol . , 1987, 111 , 833) y las líneas de células derivadas del tumor (MacGrogan y col . , J. Neurochem . , 1992, 59, 1381) que sugiere un posible papel mitogénico o de supervivencia para el NGF en este cáncer. Adicionalmente, las células de carcinoma prostático se han mostrado por ser quemotácticas (Djakiew, y col., Cáncer Res., 1993, 53, 1416) e invasivas (Geldolf, y col . , J . Cáncer Res. Clin. Oncol . , 5 1997, 123, 107) en respuesta a NGF in vitro. Los Trk se han mostrado por jugar un papel tanto en el cáncer prostático (Delsite y col., J. Androl . , 1996, 17, 481, Pflug y col., Endocrinology, 1995, 136,262, Pflug y col., Cáncer Res., 1992, 52, 5403, Djkiew y col., Cáncer Res., ^ 10 1991, 51, 3304, Passaniti y col., Int. J. Cáncer, 1992, 51 318, MacGrogan y col., J. Neurochem. , 1992, 59, 1381, Geldof y col., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 1997, 123, 107, Pflug y col., Mol. Ca cin. , 1998, 12, 106, y George y col., The Prostate, 1998, 36, 172) y cáncer pancreático (Oikawa y col., 15 Int. J. Pancreat. , 1995, 18, 15, Ohta y col., J. Pathol, 1997, 181,405, iralles y col., J. Endocrinology, 1998, 156, 431, y Miknyoczki y col., Crt. Rev. Onocgenesis, 1996, 7, 89) . Debido al posible papel que juega la actividad trk en el 20 desarrollo y progresión de ciertos cánceres, la alteración selectiva de los ejes NT-trk ha sido objetivo como posibles medios terapéuticos. Específicamente, las pequeñas moléculas que se han creado y sometido a ensayo, que muestran capacidad para inhibir los receptores trk (Ruggeri, y col., Current 25 Medicinal Chemistry, 1999, 6, 845) . Los alcaloides indolocarbazol glicosilados K-252a y K-252b son conocidos por inhibir las acciones biológicas de NGF y otras neurotrofinas. K-252a ha sido indicada por inhibir específicamente la autofosforilación de trkA, así como trkB y trkC y otros 30 receptores de neurotrofina relacionados a bajas concentraciones nanomolares (Hashimoto, Cell Biol., 1988, 107, 1531; Berg, y col., J. Biol. Chem., 1992, 267, 13; jg^^Hgj^ ^¿?^a .«A_ _, _Í Tarpley y col . , Oncogene, 1992, 7, 371; Oh ichi, y col . , Biochemistry, 1992, 31 , 4034; Muroya y col . , Biochim. Biophys . Acta . , 1992, 1135, 353; y Nye, y col . , Mol . Biol . Cell , 1992, 3, 677). Por modificación de la fracción de 5 azúcar de K-252a, se han desarrollado dos inhibidores de trk potentes adicionales. Específicamente, CEP-751, un derivado de hidroximetil de K-252a, se ha encontrado un inhibidor potente de trkA (IC50 de 3 nM en una ELISA), trkB, y TrkC. Un derivado dipépticdo, CEP-2563, fue sintetizado también, el • 10 cual mostró actividad similar y mejor la solubilidad en agua. Otro compuesto relacionado, CEP-701, se encontró también que tenía buena actividad inhibidora de trkA que muestra un IC50 de 4 nM. Tanto CEP-751 como CEP-701 se han mostrado por inhibir significativamente a los carcinomas prostáticos de 15 humanos y ratas en modelos preclínicos (Dionne, y col . , Clin . Cáncer Res . , 1998, 4, 1887 y George, y col . , Cáncer Research, 1999, 59, 2395) . CEP-751 se ha mostrado también por representar actividad anti-tumor en los xenoinjertos de neuroblastoma y meduloblastoma (Evans, y col . , Clin . Cáncer 20 Res . , 1999, 5, 3594), así como cáncer de ovario y modelos melanoma. Adicionalmente, se ha mostrado también la actividad anti-tumor significativa por CEP-701 en los modelos xenoinjertos preclínicos de adenocarcinomas ductales pancreáticos (Miknyoczki, y col . , Clin . Cáncer Res . , 1999, 5, 25 2205) . CEP-701 se está sometiendo actualmente a ensayos clínicos humanos. Aunque estos inhibidores trk de molécula pequeña pueden utilizarse como herramientas para el tratamiento de cánceres de próstata, pancreático y otros cánceres, es difícil crear 30 pequeñas moléculas con especificidad para una molécula objetiva particular. Una de las cuestiones importantes, en general para las moléculas pequeñas, es la no-especificidad a.¿,¿, ,£,*&*< para receptores o trayectorias de receptores objetivos, conduciendo a la actividad no deseada o la no actividad de otros receptores y la posible toxicidad. Por ejemplo, K-252a se ha mostrado por tener múltiples propiedades bioquímicas incluyendo la actividad neurotrófica en combinación con trk y las actividades de inhibición de proteína kinasa C (Kaneko, y col . , J. Med . Chem. , 1997, 40, 1863). Por tanto, los agentes terapéuticos con alta especificidad para los objetivos biológicos que están implicados en la actividad de receptor trk son deseados como candidatos de fármaco potencial para el tratamiento de cánceres de próstata, pancreático y otros cánceres. Para este fin, los anticuerpos dirigidos a un receptor de trk particular se ha mostrado por ser menos deseados que las moléculas pequeñas (LeSauteur y col , Nature Biotech . , 1996, 14 , 1120). La presente invención, proporciona un método para el tratamiento de cánceres mediados por receptor trk, tales como, por ejemplo, cáncer pancreático o de próstata, por la administración de al menos un anticuerpo de neurotrofina neutralizante a un mamífero. El tratamiento de anticuerpo proporciona mucha especificidad deseada que las moléciulas pequeñas efectivamente, no pueden ofrecer.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de cáncer que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente anti-neurotrofina . El agente anti-neurotrofina es preferentemente o bien anticuerpo anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una pequeña molécula orgánica que se une a una neurotrofina, y una mutación negativa dominante de un receptor trk que se une a una neurotrofina . Este método es M &á particularmente preferido para el tratamiento de cáncer de próstata o pancreático. Los agentes anti -neurotrofina incluyen aquellos dirigidos a NGF, BDNF, NT-3, y NT-4/5, e incluyen los anticuerpos humanizados así como sus fragmentos. 5 En una forma de realización preferida, el método de tratamiento o de prevención de cáncer implica el susministro de una cantidad terapéuticamente efectiva de almenos uno de los siguientes anticuerpos de neurotrofina neutralizante, NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5, para tumores de prostático o • 10 pancreático. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de reducción del volumen del tumor prostático o pancreático comprendiendo poner en contacto el tumor con al menos un angente anti-neurotrofina . 15 Un aspecto adicional de la invención implica un método de reducción de velocidad de crecimiento del tumor prostático o pancreático que comprende poner en contacto el tumor con al menos un agente anti-neurotrofina . Otro aspecto de la invención se refiere a un método de 20 reducción del dolor, comprendiendo administrar a un mamífero al menos un agente anti-neurotrofina .

DESCRIPCIÓN DE FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS El método de la presente invención se refiere al 25 tratamiento y/o prevención de cáncer en un mamífero administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente anti-neurotrofina . El agente anti-neurotrofina es preferentemente o bien un anticuerpo anti-neurotrofina, una molécula anti-sentido dirigida a una 30 neurotrofina, una molécula orgánica pequeña que se une a una neurotrofma, y una mutación negativa dominante de un receptor trk que se une a una neurotrofina . Los agentes anti- A»A. neurotrofina se unen con alta especificidad a las neurotrofinas, conduciendo por tanto a la inhibición de los receptores trk por la neutralización de la activación de los ligandos de neurotrofina. 5 Se hacen varias definiciones a lo largo de este documento. La mayoría de las palabras tienen el significado que sería atribuido por aquellas palabras por un técnico en la materia. Las palabras definidas específicamente o bien a continuación o en alguna parte de este documento tienen el • 10 significado previsto en el contexto de la presente invención, en general, y son entendidas típicamente por aquellos técnicos en la materia. Como se utiliza aquí, la frase "agente anti- neurotrofina" se entiende que hace referencia a cualquier 15 molécula que previene la síntesis o reduce la cantidad de síntesis de una neurotrofina o cualquier molécula que inhiba • o reduzca la bioactividad de una neurotrofina. Los ejemplos preferidos de los agentes anti-neurotrofina incluyen, pero no están limitados a, un anticuerpo de anti-neurotrofina, una 20 molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una pequeña molécula orgánica que se une a una neurotrofina, y una mutación negativa-dominante de un receptor trk que se une a una neurotrofina. Como se utiliza aquí, el término "cáncer" es entendido 25 por hacer referencia a un neoplasmo persistente de cualquier tejido en un organismo biológico. El neoplasmo es caracterizado generalmente como maligno o problemente llegue a ser maligno, potencialmente invasivo, o probablemente forme metástasis en nuevos sitios. Los cánceres preferidos de la 30 presente invención incluyen aquellos que están asociados con la expresión de los receptores de neurotrofina y las neurotrofinas que incluyen, pero no están limitadas a cáncer de próstata y y pancreático. Como se utiliza aquí, el término "tumor" es entendido por hacer referencia a un crecimiento que surje a partir de 5 tejido existente, crecimiento a una velocidad anormal comparado con el tejido surgido del mismo, y que sirve para función fisiológica normal . El crecimiento puede ser o no maligno, pero está asociado con frecuencia a o es indicativo del estado canceroso o precanceroso . • 10 Como se utiliza aquí, el término "mamífero" es entendido por hacer referencia a organismos vivos humanos o no humanos que están afligidos por cáncer, afligidos previamente con cáncer, o predispuestos para cáncer. Como se utiliza aquí, la frase "cantidad 15 terapéuticamente efectiva" es entendida por hacer referencia a una cantidad de agente de anti-neurotrofina terapéutico o profiláctico, tal como un anticuerpo neurotrofina, que sería adecuado para una forma de realización de la presente invención, que provocará el efecto o respuesta terapéutica o 20 profiláctica deseada cuando se administra de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado. Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" es entendido por hacer referencia a anticuerpos completos, intactos, así como fragmentos F(ab), y sus fragmentos F(ab)2. 25 Los anticuerpos intactos, completos incluyen anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y los derivados de todos los mencionados anteriormente . 30 Como se utiliza aquí, el término "neurotrofina" o "NT" es entendido por hacer referencia a neurotrofinas nativa o no nativa que incluyen, pero no están limitadas a, NGF, BDNF, t? .É.zi jí áíi ¿¿1 . -AA - .^1^ .,^^^^ ...»,,.,. ....^^ , , .jaUMa?teaatfcaa a ,! .

NT- 3, NT-4/5, NT-6 y NT- 7, y sus derivados o equivalentes funcionales, o bien purificados a partir de unafuente nativa, preparada por métodos de tecnología de ADN recombinante, o síntesis química o cualquier combinación de estos y otros 5 métodos . Como se utiliza aquí, el término "neutralización" significa generalmente hacerlos efectivos, cuando se utilizan para describir un anticuerpo, significa adicionalmente un anticuerpo que hace inefectiva la molécula a la que se une. • 10 En las formas de realización preferidas de la invención, un anticuerpo de "neutralización" se une a un ligando particular y previene o interfiere con la unión del ligando a su receptor. Como se utiliza aquí, el término "poner en contacto" 15 significa que llevan juntas, o bien directa o indirectamente una o más moléculas entre sí, facilitando así las • interacciones intermoleculares . El contacto puede producirse in vi tro, ex vivo o in vivo. Como se utiliza aquí, el término "receptor de 20 neurotrofina" es entendido por hacer referencia a un receptor que se une a un ligando de neurotrofina. En las formas de realización preferidas, el receptor de neurotrofina es un elemento de la familia de receptores de kinasa tirosina, referidos generalmente como los receptores "trk" o "trks" , 25 que son expresados sobre superficies celulares. La familia • trk incluye, pero no está limitado a trkA, trkB; y trkC. En otras formas de realización, el receptor de neurotrofina es p75NTR, denominado también, p75 o receptor de factor de crecimiento nerviosos de baja afinidad. Estos receptores 30 pueden ser de cuaqluiera de las especies animales (por ejemplo, humana, murino, conejo, porcina, equina etc. ,)e incluyen receptores de longitud completa, sus formas truncadas y variantes, tales como aquellas que surgen por troceado y/o inserción alternativo, y variantes alélicas que se producen de forma natural, así como derivados funcionales de tales receptores. 5 En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de cánceres de próstata o pancreáticos. Otros estados de enfermedad neoplástica, que pueden estar caracterizados por la expresión de receptores de neurotrofina tales como 10 receptores trk, pueden ser tratables o prevenibles de acuerdo con el presente método. Los neoplasmas que expresan los receptores de neurotrofina incluyen, pero no están limitados a, cánceres asociados con el estómago, tiroides, colon, pulmón, ovarios, piel, músculo, riñon, órganos reproductores, 15 sangre, tejidos del sistema inmune (por ejemplo, bazo, timo y hueso con tuétano) y cerebro y tejidos del sistema nervioso • periférico . En otras formas de realización preferidas, los tumores no malignos, las lesiones pre-cancerígenas, los tumores 20 precancerosos, u otros estadod precancerosos, que están asociados con la expresión de receptores de neurotrofina o asociados con los estados de enfermedad neoplástica mencionada anteriormente pueden tratarse también o prevenirse de acuerdo con los métodos de la presente invención. Dicho 25 tratamiento contribuiría a la prevención de cáncer en • pacientes con signos clínicos de cáncer inminente o una predisposición para el cáncer. Los mamíferos preferidos de la presente invención son humanos con susceptibilidad para o diagnósticos clínicos de 30 cáncer de próstata o pancreático. Naturalmente, los mamífernos no humanos afectados con cáncer de próstata o pancreático entran también dentro del alcance de la presente invención. Adicionalmente, tanto los humanos como no humanos afectados con la neoplastia indicada anteriormente en lugar de los cánceres de próstata y pancreático están incluidos en la presente invención. Los mamíferos incluyen también humanos 5 o no humanos que están predispuestos a estar afectados por cáncer. Los ejemplos incluyen humanos expuestos a carcinógenos conocidos o humanos macho de una edad para riesgo de desarrollo del cáncer de próstata. Se incluyeron también pacientes con un historial familiar de cáncer o • 10 quiénes están predispuestos genéticamente a desarrollar ciertos tipos de cánceres. En muchas formas de realización de la invención, el agente anti-neurotrofina es una molécula anti-sentido dirigida a una neurotrofina. Las secuencias de nucleótidos de 15 las neurotrofinas son las siguientes: NGF (Borsani y col . , Nuc . Acids Res . , 1990, 18 , 4020; Número de Acceso NM 002506), • BDNF (Maisonpierre y col . , Genomics, 1991, 10, 558; Número de Acceso M 61181), NT-3 (Jones y col . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA; 1990, 87, 8060; Número de Acceso M 37763; y Maisonpierre 20 y col . , Genomics, 1991, 10, 558; Número de Acceso M 61180), NT-4 (Ip y col . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 1992, 89, 3060; Número de Acceso M 86528), y NT-5 (Ip y col . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 1992, 89, 3060 y Berkemeier y col . , Somat . Cell Mol . Genet . , 1992, 18, 233; Número de Acceso NM 006179), 25 cada una de estas referencias está incorporada aquí por • referencia en su totalidad. Un técnico en la materia puede preparar moléculas de oligonucleótidos antisentido que se unirán específicamente a una neurotrofina particular sin reacción cruzada con otros polinucleótidos. Los sitios 30 preferidos de destino incluyen, pero no están limitados a, el codón de inicio, las 5' regiones reguladoras, la secuencia de codificación y la región no trasladada 3 ' . Los oligonucleótidos son preferentemente de 10 a 100 nucleótidos de largo, más preferentemente 15 a 50 nucleótidos de largo, y más preferentemente de 18 a 25 mucleótidos de largo. Los oligonucleótidos pueden comprender modificaciones de columna 5 vertebral, tales como, por ejemplo, enlaces fosforotionato, y modificaciones de azúcar 2 ' -0 bien conocidas por aquellos técnicos en la materia. Los oligonucleótidos pueden administrarse de forma intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, • 10 oral, enteral, parenteral, intranasal o dermal . En otras formas de realización de la invención, el agente anti-neurotrofina es una pequeña molécula orgánica dirigida a una neurotrofina. Un técnico en la materia puede preparar pequeñas moléculas orgánicas que se unirán 15 específicamente a una neurotrofina particular sin adherirse a otros polipéptidos. Los sitios preferidos del destino • incluyen, pero no están limitados a, la porción de la neurotrofina que se adhiere al receptor de neurotrofina y aquellas porciones de la molécula de neurotrofina que son 20 adyacentes a la región de adhesión al receptor y que son responsables, en parte, de la correcta configuración tridimensional de la porción de adhesión del receptor. Las pequeñas moléculas orgánicas tienen preferentemente un peso molecular de 100 a 20.000 daltons, más preferentemente 500 a 25 15.000 daltons, y más preferentemente, de 1000 a 10.000 • daltons. Bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas están disponibles comercialmente. Las pequeñas moléculas orgánicas pueden administrarse de manera intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, 30 oral , enteral , parenteral , intranasal o dermal . En otras formas de realización de la invención, el agente anti-neurotrofina es un mutante dominante negativo de un receptor trk. Un técnico en la materia puede preparar mutantes negativos dominantes de un receptor trk particular tal que el receptor unirá la neurotrofina que se produce de forma natural y, por tanto, actúa como un "sumidero" para capturar las neurotrofinas. Los mutantes dominantes-negativos, no obstante, no tendrán la bioactividad normal del receptor trk después de la adhesión a una neurotrofina. Los mutantes negativos dominantes, preferidos incluyen, pero no están limitados a los mutantes descritos en lo siguiente: Li y col . , Proc . , Nati . Acad . Sci . USA, 1998, 95, 10884; Eide y col . , J. Nurosci . , 1996, 16, 3123;: Liu y col . , J. Neurosci , 1997, 17, 8749; Klein y col . , Cell , 1990, 61 , 647; Valenzuela y col . , Neuron, 1993, 10, 963; Tsouflas y col . , Neuron, 1993, 10, 975; y Lamaballe y col . , EMBO J. , 1993, 12, 3083, cada uno de los cuales están incorporado aquí por referencia en su totalidad. Los mutantes negativos dominantes pueden administrarse en forma de proteína o en forma de un vector de expresión tal que el receptor trk mutante es expresado in vivo. La proteína o vector expresión puede administrarse de forma interaperitoneal , intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, o dermal. Un técnico en la materia está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo . En muchas formas de realización de la invención, el agente anti-neurotrofina comprende al menos un anticuerpo de neurotrofina neutralizante. Los anticuerpos preferidos incluyen todos anticuerpos neurotrofinas conocidos actualmente que incluyen, pero no están limitados a, anti-NGF (N° de Catálogo 500-P85) , Pepro Tech Inc., N° de Catálogo AF-256-NA, R&D Systems, Inc.), anti-BDNF (N° de Catálogo 500- P84, Petro Tech Inc.; N° de Catálogo MAB248, R&D Systems Inc.), anti-NT-3 (N° de Catálogo 500-P82, Pepro Tech Inc.; N° de Catálogo AF-267-NA, R&D Systems, Inc.), anti-NT4 (N° de Catálogo 500-P83, Petrp Tech Inc.; N° de Catálogo AF-268 NA, 5 R&D Systems, Inc.), anti-NT-4/5, anti-NT-6 y anti-NT-7, y sus equivalentes funcionales. Preferentemente, estos anticuerpos son utilizados en una forma purificada de afinidad. Las mezclas de dos o más anticuerpos neutralizantes diferentes están también dentro del alcance de la presente invención. • 10 Por ejemplo, los cánceres tales como adenocarcinoma ductal pancreático, que expresan más de un tipo de receptor de neurotrofina, pueden tratarse de manera más efectiva con una mezcla de anticuerpos a más de un receptor. Los anticuerpos de la presente invención pueden 15 obtenerse a partir de un proveedor comercial, . Tal como Pepro, Tech, Inc. (Rocky Hill, NJ) , R&D Systems Inc. (Mineápolis, MN) o generados de acuerdo con los procedimientos estándar. Los anticuerpos de neurotrofina de neutralización disponibles comercialmente incluyen b-NGF 20 anti-humano, BDNF anti-humano, NT-4 anti-humano y NT-3 antihumano de antisuero de conejo. La generación y purificación de anticuerpos puede llevarse a cabo también en el laboratorio de acuerdo con los procedimientos estándar descritos en Ausubel, y col . , 1999, 25 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Edición, Greene y Wiley- Interscience, Ny, y Current Protocols in Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons, NY, cada uno de los cuales está incorporado aquí por referencia en su totalidad. También son entendidos por la presente invención los 30 anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bifuncionales/biespecífieos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de humanos, y anticuerpos injertados (CDR) de región de determinación complementaria, incluyendo compuestos que incluyen secuencias CDR que reconocen específicamente un polipéptido de la 5 invención) específico para una neurotrofina o sus fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo, incluyendo Fab, Fab ' , F(ab')2, y Fv, son proporcionados también por la invención. Los ensayos de selección para determinar la especificidad de la adhesión de un anticuerpo de la invención son bien conocidos • 10 y se ponen en práctica de forma rutinaria en la técnica. Para una descripción comprensible de tales ensayos, ver Harlow y col. (Eds.) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los 15 anticuerpos que reconocen y unen fragmentos de una neurotrofina se contemplan también. Los anticuerpos de la • invención pueden producirse utilizando cualquier método bien conocido y puesto en práctica de forma rutinaria en la técnica. 20 Por ejemplo, la neurotrofina recombinante o que se produce de forma natural, o un fragmento de la misma, puede utilizarse para inmunizar un ratón, u otro animal adecuado, para la generación de anticuerpos monoclonales (o mamíferos más grandes, tal como un conejo, para anticuerpos 25 policlonales) . Para incrementar la antigenicidad, los • péptidos pueden conjugarse hasta keyhole lympet hemocyanin (Pierce), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para una inyección inicial, el antígeno puede emulsionarse con Adyuvante Completo Freund e inyectado de forma 30 subcutánea . A intervalos de dos a tres semanas, las alícuotas adicionales de antígeno de neurotrofina pueden emulsionarse con Adyuvante Incompleto de Freund e inyectarse de forma subcutánea. Antes de la inyección de impulso final, una muestra de suero puede tomarse desde los ratones inmunizados y someterse a ensayo por Blot Western para confirmar la 5 presencia de anticuerpos que inmunoreaccionan con la neurotrofina. El suero procedente de los animales inmunizados puede utilizarse como un antisuero policlonal o utilizarse para aislar los anticuerpos policlonales que reconocen la neurotrofina. Alternativamente, los ratones pueden ser 10 sacrificados y pueden retirarse sus bazos para generación de anticuerpos monoclonales. Para generar anticuerpos monoclonales, los bazos pueden colocarse en 10 ml de RPMI 1640 libre de suero y se forman las suspensiones de células individuales aplastando los bazos 15 en RPMI 1640 libre de suero, suplementado con 2 mM de L- glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 unidades/ml de • penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá) . Las suspensiones de células pueden filtrarse y lavarse por centrifugación y re-suspenderse en RPMI libre de 20 suero. Los timocitos tomados de tres ratones Balb/c naive son preparados de un modo similar y utilizados como una capa de alimentación. Las células de NS-1 mieloma, mantenidas en fase log en RPMI con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) durante tres días antes de 25 la fusión, son centrifugadas y lavadas también. • Para producir fusiones de hibridoma, las células de bazo procedente de ratones inmunizados son combinadas con células NS-1 y centrifugadas, y el sobrenadante es aspirado. El granulo de células es desalojado tapando el tubo, y 2 ml de 30 PEG 1500 a 37°C (50 % en 75 mM de HEPES, pH 8,0) (Boehringer- Mannheim) es agitado en el granulo, seguido por la adición de RPMI libre de suero. Después de esto, las células son £¿a&&£í ffiÉÉÉ¡í& . .. jaJaimaiu .^j, .a , . - * ** * -*"l^?¿L tjU. centrifugadas, resuspendidos en RPMI que contiene 15 % de FBS, 100 µM de hipoxantina de sodio, 0,4 µM de aminopterina, 16 µM de tii idina (HAT) (Gibco) , 25 unidades/ml de IL-6 (Boehringer-Mannheim) y 1,5 x 106 timocitos/ml , y 5 galvanizados en 10 placas de cultivo de tejido de cavidad 96 de fondo plano Corning (Corning, Corning Nueva York) . Dos, cuatro y seis días después de la fusión, se retiraron 100 µl de medio de las cavidades de las placas de fusión y se sustituyó con medio nuevo. Después del día 8, las • 10 fusiones fueron tamizadas por ELISA; sometiendo a ensayo la presencia del ratón IgG que se une a neurotrofino . Las cavidades de fusión seleccionadas son clonadas adicionalmente por dilución hasta que se obtienen los cultivos monoclonales que producen los anticuerpos de antineurotrofina. 15 Los anticuerpos no humanos pueden estar humanizados por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. En un • método, los CDR no humanos son insertados en una secuencia de armazón de anticuerpo de consensus o anticuerpo humano. Pueden introducirse entonces cambios adicionales en el 20 armazón del anticuerpo para modular la afinidad o inmunogenicidad. Se siguen los protocolos para mejorar la utilidad de los anticuerpos monoclonales anti-neurotrofina como terapéuticos en humanos por la "humanización" de los anticuerpos monoclonales para mejorar la vida media del suero 25 y hacerla menos inmunogénica en huéspedes humanos (es decir, • para prevenir la respuesta del anticuerpo humano a anticuerpos de anti-neurotrofina no humana) . Los principios de humanización se han descrito en la bibliografía y se facilitan por la disposición modular de las 30 proteínas de anticuerpo. Para reducir al mínimo la posibilidad de complemento de adhesión, es preferido un anticuerpo humanizado del isotipo IgG4.

Por ejemplo, se consigue un nivel de humanización generando anticuerpos quiméricos que comprenden los dominios variables de proteínas de anticuerpo no humanas de interés, con los dominios constantes de moléculas de anticuerpo 5 humano. (Ver, por ejemplo, Morrison y col., Adv. Immunol . , 1989, 44 , 65-92) , que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Los dominios variables de anticuerpos de anti- neurotrofina de neutralización de la neurotrofina están clonados a partir de ADN genómico de un hibridoma célula-B o 10 de ADNC generado de ARNm asilado del hibridoma de interés. Los fragmentos de gen de la región V, son unidos a exones que codifican los dominios constantes de anitucuerpo humano y la construcción resultante es expresada en células huésped de mamíferos adecuados (por ejemplo, mieloma o células CHO) . 15 Para conseguir un nivel de humanización incluso mayor, solamente aquellas porciones de los fragmentos de gen de • región variable que codifican las regiones que determinan la complementariedad de adhesión de antígeno ("CDR") de los genes de anticuerpo monoclonal no humano son clonados en 20 secuencias de anticuerpo humano (Ver, por ejemplo, Jones y col . , Nature, 1986, 321 , 522-525, Riechmann y col . , Nature, 1988, 332, 323-327, Verhoeyen y col . , Science, 1988, 239, 1534-36, y Tempest y col . , Bio/Technology, 1991, 9, 266-71, cada uno de los cuales es incorporado aquí por referencia en 25 su totalidad. Si es necesario, el armazón de lámina-ß del • anticuerpo humano que rodea las regiones CDR3 también es modificado para hacer simétrica más estrechamente la estructura tridimensional del dominio de adhesión de antígeno de los anticuerpos monoclonales originales. (Ver, 30 Kettkeborough y col . , Protein Engin . , 1991, 4 , 773-783, Foote y col . , J. Mol . Biol . 19'92 , 224 , 487-499, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

^^¡¡¡H^Hg En un método alternativo, la superficie de un anticuerpo monoclonal no humano de interés es humanizado por la alteración de residuos superficiales seleccionados del anticuerpo no humano, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio, mientras que se retiene al mismo tiempo todo el interior y se ponen en contacto los residuos del anticuerpo no humano. Ver Padlan, Molecular Immunol . , 1991, 28, 489-98, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los anticuerpos de la presente invención pueden estar formulados para la administración a un mamífero en una variedad de modos. En muchas formas de realización, los anticuerpos están solución acuosa estéril o en fluidos biológicos tales como suero. Las soluciones acuosas pueden ser tamponadas o no tamponadas y tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la resistencia iónica, preservativos, incluyendo, pero sin limitarse a antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser preparados para administración en forma sólida. Los anticuerpos pueden estar combinados con un número de soportes o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes tales como celulosa microcristalina, tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico, Primogel, o amidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio; lubricantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como pipermint o metil salicilato. Anticuerpos o sus formulaciones pueden administrarse a un mamífero por medios efectivos para suministrar los anticuerpos al tejido enfermo. Tales medios incluyen, pero no están limitados a intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intratecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal, o dermal. En particular, los anticuerpos o las formulaciones de anticuerpos pueden administrarse por inyección parenteral de formulaciones líquidas o por la ingestión de formulaciones sólidas tales como en pastillas, en comprimidos, en cápsulas o formulaciones líquidas tales como emulsiones y soluciones. Otros sistemas de suministro de fármaco incluyen hidrogeles, hidroximetilcelulosa, microcápsulas, liposomas, microemulsiones, microesferas y similares. La inyección localizada de anticuerpos directamente en tejido enfermo, tal como un tumor, es un método preferido para administrar los anticuerpos de la presente invención. La solución salina tamponada de fosfato (PBS) es un soporte preferido para formulaciones inyectables. La dosificación de los anticuerpos para obtener una cantidad farmacéuticamente efectiva de agente terapéutico depende de una variedad de factores. Por ejemplo, la edad, sensibilidad, tolerancia, y otras características del paciente afectarán a las cantidades de dosificación. El tipo de neoplasia o tumor, el estado de la enfermedad, y el volumen del tumor afectará también a las dosis. Adicionalmente, el nivel de plasma y la vida media de los anticuerpos empleados y la afinidad para sus sitios de reconocimiento, y otros factores similares considerados rutinariamente por un técnico relacionado debe considerarse para dosificación efectiva. Para administración sistémica de los anticuerpos de neurotrofina, pueden utilizarse las dosis que oscilan desde aproximadamente 0,05 mg/kg-paciente/día hasta aproximadamente 500 mg/kg-paciente/día, aunque las Ijt Aj*.? .i„,.l..t.¡ájl? h^L. X??Js . . -a„«»¿* Hjfca.iaaaaf f ni,.,! - t f dosis en el extremo inferior del intervalo son preferidas simplemente para facilitar la administración y la efectividad del coste. Las dosis pueden ajustarse, por ejemplo, para proporcionar un nivel de plasma particular de un anticuerpo, 5 por ejemplo, en el intervalo de de aproximadamente 5-30 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 10-15 mg/ml, y mantener este nivel, por ejemplo, durante un periodo de tiempo o hasta que se consigan los resultados clínicos. Los anticuerpos quiméricos o humanizados, que se esperan sean ^P 10 eliminados más lentamente, requerirían dosis inferiores para mantener un nivel de plasma efectivo. Además, los anticuerpos que tienen alta afinidad para las neurotrofinas son administrados preferentemente de forma menos frecuente o en dosis inferiores a los anticuerpos con menos afinidad. Una 15 dosis terapéuticamente efectiva de anticuerpo puede determinarse mostrando, durante el curso del tratamiento, la reducción en el volumen del tumor, reducción en la velocidad de crecimiento del tumor, o idealmente, desaparición completa del estado de enfermedad cancerosa. Los medios efectivos para 20 medir o evaluar el estado del cáncer de próstata o pancreático es midiendo el antígeno específico de próstata (PSA) en la sangre, midiendo el tiempo de supervivencia para el cáncer pancreático, midiendo el retraso o inhibición de dispersión metastática tanto para el cáncer de próstata como 25 de páncreas, midiendo la graduación histológica de cáncer pancreático, y CT para cáncer pancreático. Tales procedimientos son conocidos por el técnico en la materia. La presente invención contempla también un método para la reducción del volumen del tumor prostático o pancreático 30 poniendo en contacto el tumor con al menos un agente anti- neurotrofina . La presente invención, abarca también un método para prevenir el crecimiento del tumor adicionalmente o JSM^t..?-J^ reducir la velocidad de crecimiento del tumor, poniendo en contacto el tumor con al menos un agente anti -neurotrofina . El suministro del agente al sitio del tumor es alcanzado preferentemente a través de la inyección directa localizada 5 en el tejido en o próximo al sitio del tumor. La administración sistémica de agentes por medios descritos anteriormente, no obstante, está también dentro del alcance de la presente invención. La inyección local en el sitio del tumor puede producirse de forma intratumoral o peritumoral o 10 una combinación de ambas. Para inyección directa en el sitio del tumor, la dosis del agente depende de varios factores, incluyendo el tipo de tumor, etapa del tumor, y volumen del tumor, entre otras variables. Las dosis terapéuticas típicas de agentes de 15 acuerdo con el volumen del tumor pueden oscilar desde aproximadamente 0,01 mg/mm3 hasta aproximadamente 10 mg/mm3 por inyección, y las inyecciones pueden administrarse como sea necesario frecuentemente. Por ejemplo, las inyecciones una vez al día durante el tiempo en el que está presente un 20 tumor o el estado de la enfermedad puede ser adecuado, pero variará de acuerdo con el tipo de cáncer, por supuesto, de la enfermedad y el paciente. La efectividad terapéutica del tratamiento se indica o bien por la reducción del volumen del tumor durante el curso del tratamiento o una inhibición en la 25 velocidad de crecimiento del tumor. La medición del volumen • del tumor a partir de las dimensiones del tumor es bien conocido por aquellos técnicos en la materia. Los cálculos del volumen del tumor pueden realizarse con la siguiente fórmula: V(mm3)= 0,5236 x longitud (mm) x 30 anchura (mm) [longitud (mm) +anchura (mm) /2] . Otro método de evaluación de la efectividad de un tratamiento particular es evaluar la inhibición de los **= - >«>»e^--''** ** j ~ r m^,^.,^ ^..^ __»_^,^fca___,,. receptores de neurotrofina por medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, trkA puede someterse a ensayo para la actividad utilizando un ensayo de enzima basado en ELISA como se indica en Angeles, y col . , Anal . Biochem . , 1996, 236, 49, 5 incorporado aquí por referencia en su totalidad. Otro método de evaluación es medir la actividad de ChAt en el cerebro delantero basal de la rata. En otrs formas de realización de la invención, los agentes anti-neurotrofina son administrados a un mamífero • 10 para prevenir o reducir el dolor. Los agentes, cantidades, y su administración se describen anteriormente. Los técnicos en la materia apreciarán que pueden realizarse numerosos cambios y modificaciones a las formas de realización preferidas de la invención y que tales cambios y 15 modificaciones pueden realizarse sin separarnos del espíritu de la invención. Por tanto, se pretende que las • reivindicaciones adjuntas cubran todas las variaciones equivalentes dentro del espíritu correcto y alcance de la invención. 20 Los siguientes ejemplos son todos reales y no están destinados a limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS 25 Ejemplo 1: Neutralización de receptores trk por anti-NGF • Los anticuerpos fueron inyectados en xenoinjertos de PC- 3 y/o TSU-prl que se habían mostrado previamente por responder a CEP-751 (Dionne y col., Clin. Canc . Res., 1998, 4, 187-1898) . Los siguientes experimentos fueron llevados a 30 cabo para confirmar la capacidad de neutralización de los anticuerpos de anti -neurotrofina .

El anticuerpo anti-NGF reduce la autofosforilación estimulada con ligando de trk en células NIH3T3-trkA. NGF (10 ng/ml) fue pre-incubado con concentraciones variadas de anticuerpo en 6 ml de medios de cultivo de tejido. La mezcla 5 de NGF/anticuerpo se añadió a las células NIH3T3-trkA. Las proteínas trk fueron inmunoprecipitadas a partir de lisados con anticuerpo pan-Trk CEP-21, y las muestras fueron sondadas sobre un inmunoblot con el anticuerpo antifosfotirosina 4G10. Los valores de exploración densitométricos (unidades OD 10 integradas) fueron los siguientes (mostrado como NGF (10 ng(ml) /Anti-NGF (µg/ml) : -/-paso, 0,3; +/- paso, 6,5; 0,001 mg/ml ; 5,0; 0,01 mg/ml ; 4,5; 0,1 mg/ml ; 2,5; 1,0 mg/ml ; 3,1; 10,0 mg/ml; 2,1; 100 mg/ml, 1,1. Por tanto, el anti-NGF (Pepro Tech, Inc., 500-P85) a 100 µg/ml reduce la 15 fosforilación trk aproximadamente al 80 % relativo a no tratamiento de anti-NGF en células tratadas durante cinco • minutos con 10 ng/ml NGF.

Ejemplo 2: Neutralización de receptores trk por anti-NT-3 El 20 anticuerpo anti-NT-3 redujo la autofosforilación estimulada con ligando de trk en células NIH3T3-trkC. NT-3 (10 ng/ml) se preincubó con concentraciones variadas de anticuerpo en 6 ml de medios de cultivo de tejido. La mezcla de NT-3/anticuerpo se añadió a células NIH3T3-trkC. Las proteínas fueron 25 inmunoprecipitadas a partir de lisados con anticuerpo pan-Trk w CEP-21, y las muestras fueron sondadas sobre un inmunoblot con el anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10. Los valores de exploración densitométrica (unidades OD integradas) fueron los siguientes (mostrado como NT-3 (lOng/ml) /Anti-NT-3 30 (µg/ml): -/- paso; 0,1, +/- paso, 4,0; IgG, 7,5; 0,001 mg/ml; 6,2; 0,01 mg/ml , 4,0; 0,1 mg/ml , 3,6 ; 1,0 mg/ml , 7,8; 10,0 mg/ml, 1,2. Por tanto, el anti-NT-3 (Pepro Tech 500-P82) a 10 ug/ml reduce trk fosforilación aproximadamente al 70 % relativo al no tratamiento anti-NGF en células tratadas durante cinco minutos con 10 ng/ml de NT- 3. Los siguientes ejemplos mostraron los resultados experimentales para actividad anti-tumor de los anticuerpos de la presente invención. Los modelos de tumor en estos experimentos fueron xenoinjertos de cáncer de próstata y cáncer pancreático en ratones desnudos que eran bien conocidos por los técnicos en la materia como los modelos de animales pre-clínicos preferidos, que estaban correlativos a los resultados clínicos in vivo . Las referencias acutales que indican la relevancia particular de estos modelos de xenoinjertos respecto a las enfermedades humanas correspondientes incluyeron Plonowski, y col . , Cáncer Res . , 1999, 59, 1947, Joseph y col . , Cáncer Res . , 1997, 57, 1054, Pinski y col . , Int . J. Cáncer, 1993, 55, 963, Gao y col . , Cáncer Res . , 1998, 58 , 1391, y Tan, y col . , Tumour Biology, 1985, 6, 89.

Ejemplo 3: Inhibición del crecimiento del xenoinjerto de cáncer de próstata PC-3 por anticuerpos de neurotrofina Se utilizaron los siguientes anticuerpos de neurotrofina: anti-NGF (Pepro Tech 500-P85) , anti-BDNF (Pepro Tech 500-P84) , anti-NT-3 (Pepro Tech 500-P82) , y anti-NT4/5 (Pepro Tech 500-P83) . Los anticuerpos anti-NGF y anti-NT3 bloquean la autofosforilación de trkA y tkrC siguiendo el tratamiento de neurotrofina de las células cultivadas. Cada uno de los anticuerpos se ha mostrado por bloquear la actividad de su neurotrofma cognada en un bioensayo en el que se midió la actividad ChAT en los cultivos de células de cerebro delantero basal de ratas. ?l &A.lk ?r?„«l^-..

Las células de tumor de próstata humanas PC-3 (5 x 106 células/ratón) fueron inyectadas de forma subcutánea en el costado de ratones desnudos atímicos hembra de ocho a diez semanas de edad (nu/nu; Charles River, Raleigh, NC. Los 5 ratones pesaron entre 22-25 gramos en el día del implante del tumor. Después de que los xenoinjertos alcanzaron 100-500 mm3, los ratones fueron repartidos al azar y divididos en grupos experimentales. Muchos grupos experimentales fueron administrados a un combinado de anticuerpos de neurotrofina ( 10 4 x 25 µg cada uno, o 4 x 100 µg cada uno de anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT4/5) o conejo normal IgG (100 µg o 400 µg; Pepro Tech 500-P00) en IX PBS estéril (volumen total de 100 µl) . Todos los anticuerpos fueron administrados de manera intratumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección y de forma 15 peritumoral, subcutánea (50 µl) en cinco sitios de inyección. En el experimento #1, los ratones recibieron inyecciones de • anticuerpo una vez al día en los días 1, 3, 5, 8, 10, 12 y 15. No se administró anticuerpo después del día 15. En el experimento #2, los ratones recibieron inyección de 20 anticuerpo una vez al día en los días 1, 3, 6, 8, 10, 13. Un ratón que recibió 4 x 100 µg, de anticuerpos de neurotrofina murió por causas inexplicables el día 13. La longitud y anchura del tumor se midieron cada dos a tres días. Se administró CEP- 751 a un grupo experimental separado como un 25 control para verificar que los tumores fueron sensibles a la • CEP-751, como se había mostrado previamente para el crecimiento de xenoinjertos de PC-3 en una institución diferente. Los ratones recibieron el vehículo (40 % de polietileno glicol, 10 % de povidona C30, y 2 % de alcohol 30 bencilo; 100 µl) o CEP-751 (10 mg/kg s . c . BID) en el vehículo (100 µl) siete días por semana durante 22 días. La longitud y * mÉtt itñ tMt ? ' ' ,I JL ,..i6« ^. ^, ..^ ^....».^ ,» .. ^^^.^i^^...,^...^.^ « .^^ ^*... „, . . ., anchura del tumor fueron medidas cada dos o tres días (días 1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19 y 22). Los volúmenes del tumor fueron calculados como (longitud x anchura (longitud + anchura) /2)) x 0,526 (Isaacs, Canc . 5 Res . , 1989, 49, 6290-6294, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Se calcularon los volúmenes medios del tumor y los errores estándar (SigmaStat, Jandel Scientific, San Rafel, CA) : Cualquier ratón con un volumen de tumor en el día final del análisis que se desvió del volumen 10 medio del tumor en el día final del análisis por más de dos desviaciones estándar fue eliminado del análisis en cada punto de datos. Los volúmenes relativos del tumor fueron calculados como (vt medio/v0 medio) , donde vt hace referencia al volumen del tumor en un día dado y vs es el volumen del 15 mismo tumor en el inicio de la dosis (día 1) . Cualquier ratón con un volumen de tumor relativo el día final del análisis • que se desvió del volumen relativo del tumor medio el día final del análisis por más de dos desviaciones estándar fue retirado del análisis en cada punto de datos. Se calcularon 20 los valores de probabilidad por el Ensayo Mann-Whitney Rank Sum (SigmaStat) . Experimento #1 La administración de los anticuerpos de neurotrofina inhibió el crecimiento de tumores PC-3 con respecto a los tumores tratados con el control IgG. Los 25 volúmenes relativos de los tumores tratados con anticuerpo de • neurotrofina fueron significativamente más pequeños (p < 0,05) que el grupo de control IgG por el día 3 y permanecieron más pequeños hasta la finalización del experimento en el día 22 (p<0,05, día 5, p<:0,01, día 8 ; 30 p<0,001, días 10-22) . La regresión significativa de tumores se observó en los días 10 (35 %; p<0,001) y 12 (25 %, p<0,05) . Después de que fue retirado el tratamiento del 'aaiMáMaiM*i^^ - - -***~ ?*i .Í?ABíi¿* !ttt .?^.i,*-^.*m***~.^ anticuerpo de neutralización (día 15) , se observó el recrecimiento del tumor el día 22 (0,95 de volumen total relativo, día 22, respecto al 0,77 de volumen de tumor relativo, día 15) . Los volúmenes absolutos de los tumores 5 tratados con anticuerpo de neurotrofina comparados con el grupo de control IgG fueron significativamente más pequeños (p<0,05) el día 15, permanecieron más pequeños hasta la finalización del experimento (p<;0,05, día 17; p<0,01, días 19 y 22), y alcanzó un mínimo de T/C de 0,33 el día 17. 10 La administración de CEP- 751 inhibió el crecimiento de PC-3 tumores con respecto al control del vehículo. Los volúmenes relativos de los tumores tratados con CEP-751 fueron significativamente más pequeños que el grupo de control del vehículo los días 12 (p<0,05), 17 (p<0,01), 19 15 (p ?,05) y 22 (p 0,01) . Los volúmenes absolutos de los tumores tratados con CEP-751 fueron significativamente más • pequeños en comparación con el grupo de control del vehículo el día 17 (p<0,01) y el día 22 (p ?,05) y alcanzaron un mínimo T/C de 0,44 en día 19. 20 Experimento #2 La administración de los anticuerpos (4 x 25 µg cada uno, o 4 x 100 µg cada uno de anti-NGF, BDNF, NT- 3, NT4/5) inhibieron el crecimiento de tumores PC-3 con respecto a los tumores tratados con el control IgG. Los volúmenes relativos de los tumores tratados con anticuerpo de 25 neurotrofina fueron significativamente más pequeños (p£?,05; • 100 mg de combinado de neurotrofina respecto a 100 µg de IgG normal; 400 µg de combinado de neurotrofina respecto a 400 µg de IgG normal) que los grupos de control IgG el día 3 y permanecieron más pequeños hasta la finalización del 30 experimento. La regresión significativa de tumores (400 µg de combinado de neurotrofina respecto a 400 µg de IgG normal) se observó el día 10 (31 %; p<0,05) y el día 13 (19 % de p<0,05) . Los volúmenes absolutos de los tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina comparado con el grupo de control IgG fueron significativamente más pequeños (p ?,05) el día 8 (100 µg de combinado de neurotrofina respecto a 100 µg de IgG 5 normal) y el día 6 (400 µg de combinado de neurotrofina respecto a 400 µg de IgG normal) , permanecieron más pequeños hasta la finalización del experimento (p<0,005, días 10, 13, 15 para tanto 100 µg de combinado de neurotrofina respecto a 100 µg de IgG normal y 400 µg de combinado de neurotrofina 10 respecto a 400 µg de IgG normal) y alcanzaron un mínimo de T/C de 0,26 el día 15 (100 µg de combinado de neurotrofina respecto a 100 µg de IgG normal) o un mínimo de T/C de 0,17 el día 13 (400 µg de combinado de neurotrofina respecto a 400 µg de IgG normal) . 15 Ejemplo 4: Inhibición de crecimiento de xenoinjerto de cáncer • de próstata TSU-Prl por anticuerpos de neurotrofina Experimento #1 Se utilizaron los siguientes anticuerpos 20 de neurotrofina: anti-NGF (Pepro Tech 500-P85) , anti-BDNF (Pepro Tech 500-P84) , anti-NT-3 (Pepro-Tech 500- P82) , y anti-NT4/5 (Pepro Tech 500-P83) . Las células humanas de tumor de próstata TSU-Prl fueron inyectadas de forma subcutánea en el costado de ratones 25 desnudos atímicos hembra (nu/nu: 5 x 106 células/ratones) .

• Después de que los xenoinjertos alcanzaron 100-500 mm3, los ratones fueron colocados al azar y divididos en cuatro grupos experimentales. Un grupo fue administrado con un combinado de anticuerpos de neurotrofina (anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT 4/5). 30 Cada dosis de combinado de anticuerpo (100 µl) contenía 100 µg de cada anticuerpo de neurotrofina. El segundo grupo experimental fue administrado con IgG de conejo normal (400 µg/100 µl ; Pepro Tech 500-P00) como un control. Todos los anticuerpos fueron administrados de forma intratumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección y de forma peritumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección. Los ratones recibieron 5 inyecciones de anticuerpo una vez al día, tres días por semana en los Días 1, 3, 5, 8 10 y 12. La longitud y anchura del tumor fueron medidas cada dos o tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12 y 15) . El tercer grupo experimental recibió CEP-701 en el • 10 vehículo (40 % de polietileno glicol, 10 % de povidona C30, y 2 % de alcohol de bencilo) , 10 mg/kg sc BID, cinco días por semana durante 14 días. El cuarto grupo experimental recibió el vehículo solamente (100 µl) de acuerdo con el esquema de dosificación del tercer grupo experimental . La longitud y la 15 anchura del tumor fueron medidas cada dos o tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12 y 15) . • Los volúmenes del tumor fueron calculados como se describió anteriormente. Los volúmenes medios del tumor y los errores estándar fueron calculados como se describió 20 anteriormente. Los ratones con volúmenes de tumor que se desviaron de los volúmenes medios de tumor por más de dos desviaciones estándar fueron retirados del análisis en cada punto de datos. Para los volúmenes relativos del tumor, cada punto de datos para un ratón dado fue normalizado al volumen 25 del tumor de este ratón en el inicio de dosificación (Día 1) . ^w Los valores de probabilidad fueron calculados como se describió anteriormente. No se observaron muertes o morbosidad en ninguno de los grupos experimentales, indicando que la CEP-701 y los anticuerpos de neutralización fueron 30 bien tolerados en estos animales. La administración de los anticuerpos de neurotrofina dieron lugar a volúmenes de tumor relativos inferiores con respecto a los volúmenes de tumor en el grupo de control IgG. Los volúmenes de tumor relativos de los tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina fueron significativamente más pequeños (p£?,0001) que los volúmenes de tumor relativos en el grupo de control tratado con IgG por el Día 5 y permanecieron más pequeños a lo largo del resto del experimento (p<0,01 Días 8 y 10; p<0,0001 Días 12 y 15). Los volúmenes absolutos de tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina comparado con el grupo de control IgG fueron significativamente más pequeños (p<0,05) el Día 10, permanecieron más pequeños hasta la finalización del experimento (p£?,001, Día 12; p<0,01, Día 15) y alcanzaron un mínimo T/C de 0,41 el Día 15. La administración de CEP-701, dio lugar a volúmenes de tumor relativos inferiores con respecto a los volúmenes del tumor en el grupo de control del vehículo. Los volúmenes de tumor relativos de los tumores tratados con CEP-701 fueron significativamente más pequeños (p<0,05) en el Día 3 que el grupo de control tratado del vehículo y permanecieron más pequeños hasta que finalizó el experimento (p£?,01, Día 5; p 0,05, Día 8; p£?,01 Día 10 y 12; p£?,001 Día 15). Los volúmenes absolutos de tumores tratados con CEP-701 fueron significativamente más pequeños en comparación con el grupo de control del vehículo el Día 8 (p<0,05), continuaron pequeños hasta la finalización del experimento (p£?,05, Día 10; p£?,001 Días 12 y 15), y alcanzaron un mínimo T/C de 0,29 los Días 12 y 15. Los tumores tratados con IgG normal aparecieron por tener crecimiento más lentamente que aquellos tratados con el vehículo para CEP- 701; no obstante, no existió una diferencia significativa (p<0,05) en volúmenes de tumor o volúmenes de x. •- - -tfé -Hut ..i. ?->«a*. turmor relativos entre estos dos grupos en cualquier momento durante el experimento. El experimento demostró que los anticuerpos de neurotrofina inhibieron el crecimiento de xenoinjerto de TSU- 5 Prl . Los volúmenes de tumor relativos de los tumores tratados con anticuerpos de neutralización fueron significativamente más pequeños que el grupo de control tratado con IgG el Día 5 (p£?,0001), Días 8 y 10 (p<0,01), y los Días 12 y 15 (p<0,0001). Puesto que los anticuerpos de neurotropia • 10 inhibieron el crecimiento de tumor relativo a IgG normal, es muy probable que el efecto de los anticuerpos de neurotropina fuera debido al bloqueo de señalización de neurotropina a través de los receptores de neurotropina trk, opuesto a un efecto general de la inyección de IgG en tumores. 15 Experimento #2 Fueron utilizados los siguientes • anticuerpos de neurotrofina: anti-NGF (Pepro Tech 500-P85) , anti-BDNF (PeproTech 500-P84) , anti-NT-3 (Pepro Tech 500-P82) y anti-NT4/5 (Pepro Tech 500-P83) . 20 Las células humanas de tumor de próstata TSU-Prl fueron inyectadas de forma subcutánea en el costado de ratones desnudos atímicos hembra (nu/nu; 5 x 106 células/ratones) . Después de que los xenoinjertos alcanzaron 100-500 mm3 , los ratones fueron colocados al azar y divididos en seis grupos 25 experimentales. El primer grupo fue administrado con anti-NGF • (100 µg) + IgG de conejo normal (300 µg) por dosis. El segundo grupo fue administrado con anti-NT-3 (100 µg) = + IgG de conejo normal (300 µg) por dosis. El tercer grupo fue administrado con anti-NT4/5 (100 µg) + IgG de conejo normal 30 (300 µg) por dosis. El cuarto grupo fue administrado con anti-BDNF (100 µg) + IgG de conejo normal (300 µg) por dosis. El quinto grupo fue administrado con un combinado de - m mt m áÉ i ?k^j. ^ *... V?A» *.. * *»^. anticuerpos de neurotrofina ((anti-NGF, BDNF, NT-3 y NT4/5 (100 µg cada anticuerpo por dosis) ) . El sexto grupo experimental fue administrado con IgG de conejo normal (400 µg por dosis; Pepro Tech 500-P00) como un control. Cada dosis 5 (400 µg de proteína total por 100 µl de PBS) fue inyectada de forma intratumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección y de forma peritumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección, una vez al día, tres días por semana los Días 1, 3, 6, 8, 10 y 13. La longitud y volumen del tumor fueron medidos cada dos o 9 10 tres días (Días 1, 3, 6, 8, 10, 13 y 15) . Los volúmenes del tumor fueron calculados como se describió anteriormente. Los volúmenes de tumor medios y los errores estándar fueron calculados también como se describió anteriormente. Los ratones con volúmenes de tumor que se 15 desviaron de los volúmenes de tumor medios por más de dos ^^ desviaciones estándar fueron eliminados del análisis en cada ^ punto de datos. Para volúmenes de tumor relativos, cada punto de datos para un ratón dado fue normalizado respecto al volumen del tumor de este ratón en el inicio de la dosis (Día 20 1) . Los valores de probabilidad fueron calculados como se describió anteriormente . No se observaron muertes ni morbosidad en ninguno de los grupos del experimento, indicando que los anticuerpos de neutralización fueron bien tolerados en estos animales. á^ 25 La combinación de los anticuerpos de neurotrofina (anti-NGF, anti-NT-3, anti-BDNF, y anti-NT-4/5) , anti-NGF, o anti-NT-3 inhibieron el crecimiento del tumor con respecto a IgG del conejo normal. Ni anti-NT-4/5, ni anti-BDNF tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento del tumor con 30 respecto al IgG del conejo normal. Los volúmenes de tumor relativos para el grupo que recibió el combinado de anticuerpo de neurotrofina fueron significativamente más fc ^. A. l¿ pequeños que los volúmenes de tumor relativos para el grupo de control IgG el Día 3 (p<0,01), y Día 8 (p 0,05), después permanecieron pequeños a lo largo del resto del experimento (p<0,01 Días 10, 13 y 15) . Los volúmenes de tumor relativos 5 de los tumores tratados con anti-NGF fueron significativamente más pequeños (p£?,001) que el volumen del tumor relativo en el grupo de control tratado con IgG el Día 3, y permanecieron más pequeños a lo largo del resto del experimento (p£?,001 Día 6; p<0,01 Día 8; p£?,001 Día 10; 10 p£?,01 Día 13; p£?,001 Día 15) . El volumen del tumor relativo de los tumores tratados con anti-NT-3 fueron significativamente más pequeños (p£?,05) que los tumores en el grupo de control IgG el Día 6 y permanecieron más pequeños a lo largo del resto del experimento (p£?,01 Día 8; p£?,001 15 Día 10; p£?,01 Día 13; p£?,001 Día 15). Los volúmenes de tumor absolutos del grupo de • combinación de anticuerpos de neurotrofina fueron significativamente más pequeños (p£?,05 Día 8; p£?,01, Días 10 y 13 y 15) en comparación con el grupo de control tratado 20 con IgG y alcanzaron un mínimo de T/C de 0,52 el Día 13. Los volúmenes de tumor absolutos del grupo que recibió anti-NGF fueron significativamente más pequeños (p£?,05 Día 3; P£?,001 Días 6, 8, 10, 13 y p£?,01 Día 15), en comparación con el grupo de control tratado con IgG y alcanzaron un 25 mínimo T/C de 0,34 el Día 13. Se observó la regresión en el • grupo anti-NGF el día 3 (20 % de p<0,001), Día 6 (31 % P£?,01), Día 8 (35 % p<0,001), Día 10 (35 %, p<0,01), y Día 13 (37 % p£?,01) . Los volúmenes de tumor absolutos del grupo que recibió anti-NT-3 fueron significativamente más pequeños 30 (p£?,05, Día 6; p£?,01 Días 8, 10, 13 y 15) en comparación con los controles tratados con IgG y alcanzaron un mínimo T/C de 0,38 el Día 13. Se observó regresión en el grupo anti-NT-3 el Día 8 (16 %, p<0,001), Día 10 (33 %, p£?,001) y Día 13 (29%, p£?,01) . Una comparación de los efectos de anti-NGF o anti-NT-3 relativa al combinado de anticuerpos de neurotrofina demostró 5 que cada uno de estos anticuerpos de neurotrofina individuales inhibieron de forma transitoria el crecimiento del tumor de manera más efectiva que el combinado de anticuerpos de neurotrofina. Los volúmenes del tumor absolutos y relativos del grupo anti-NGF fueron • 10 significativamente más pequeños que el grupo de combinación de anticuerpos de neurotrofina el Día 8 (p£?,01) y Día 10 (p£?,05) . El anti-NGF inhibió el crecimiento del tumor por 57 y 64 por ciento con respecto al IgG de conejo normal los Días 8 y 10, respectivamente, mientras que el combinado de 15 anticuerpos de neurotrofina inhibió el crecimiento de 32 y 43 por ciento con respecto a IgG de conejo normal los Días 8 y • 10, respectivamente. El volumen relativo del tumor del grupo anti-NT-3 fue significativamente más pequeño que el grupo de combinación de anticuerpos de neurotrofina el Día 10 20 (p£?,05) . El anti-NT-3 inhibió crecimiento del tumor por 60 por ciento con respecto al IgG del conejo normal el Día 10, mientras que el combinado de anticuerpos de neurotrofina inhibió el crecimiento 43 por ciento con respecto al IgG de conejo normal el Día 10. Los resultados a partir de este 25 experimento desmostraron que anti-NGF o anti-NT-3 inhibieron • el crecimiento de xenoinjertos de TSU-Prl así como, y de forma transitoria mejor, la combinación de anticuerpos de neurotrofinas (anti-NGF, anti-NT-3, anti-BDNF, y anti-NT- 4/5) . 30 A una dosis de 100 µg, ni anti-NT-4/5 ni anti-BDNF tenían un efecto significativo sobre el crecimiento de tumores TSU-Prl en ratones desnudos, aunque fue posible que la. i : ... A,.¿ jti? k.±.......... , . . , ^..^Üim^... ^a^. los diferentes NT-4/5 ?o BDNF de neutralización de los anticuerpos o una concentración diferente de estos anticuerpos pudieran dar lugar a un efecto significativo sobre el crecimiento del tumor. Los datos previos que analizaron la expresión trkB en las células TSU-Prl mostraron que trkB no se expresó en esta línea de células (Dionne, y col . , 1998). Puesto que BDNF y NT-4/5 señalizaron principalmente a través de trkB (Barbacid 1995; Ibanez, 1995) , la falta de efecto observado en nuestro experimento estaba de acuerdo con la ausencia del receptor.

Ejemplo 5: Inhibición de crecimiento de xenoinjerto de cáncer pancreático AsPC-1 por anticuerpos de neurotrofina Fueron utilizados los siguientes anticuerpos de neurotrofina: anti-NGF (Pepro Tech 500-P85) , anti-BDNF (Pepro Tech 500-P84), anti-NT-3 (Pepro Tech 500-P82) , y anti-NT4/5 (Pepro Tech 500-P83) . Las células humanas de tumor pancreático AsPC-1 fueron inyectadas de forma subcutánea en el costado de ratones desnudos atímicos hembra (nu/nu; 5 x 106 células/ratones) . Después de que los xenoinjertos alcanzaron 100-500 mm3, los ratones fueron colocados al azar y divididos en cuatro grupos experimentales. Un grupo fue administrado con un combinado de anticuerpos de neurotrofina (anti-NGF, BDNF, NT-3, y NT 4/5). Cada dosis de combinado de anticuerpo (100 µl) contenía 100 µg de cada anticuerpo de neurotrofina. El segundo grupo experimental fue administrado con IgG de conejo normal (400 µg/100 µl ; Pepro Tech 500-P00) como un control. Todos los anticuerpos fueron administrados de forma intratumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección y de forma peritumoral (50 µl) en cinco sitios de inyección. Los ratones recibieron inyecciones de anticuerpo una vez al día, tres días por Ú& *&**.*.. &t £gL|^iÉd semana en los Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12. La longitud y anchura del tumor fueron medidas cada dos o tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12 y 15) . El tercer grupo experimental recibió CEP-701 en el vehículo (40 % de polietileno glicol, 10 % de povidona 5 C30, y 2 % de alcohol de bencilo) , 10 mg/kg sc BID, cinco días por semana durante 14 días . El cuarto grupo experimental recibió el vehículo solamente (100 µl) de acuerdo con el esquema de dosificación del tercer grupo experimental . La longitud y la anchura del tumor fueron medidas cada dos o • 10 tres días (Días 1, 3, 5, 8, 10, 12 y 15) . Los volúmenes del tumor fueron calculados como se describió anteriormente. Los volúmenes medios del tumor y los errores estándar fueron calculados como se describió anteriormente. Los ratones con volúmenes de tumor que se 15 desviaron de los volúmenes de tumor medios por más de dos desviaciones estándar fueron retirados del análisis en cada punto de datos. Para los volúmenes del tumor relativos, cada punto de datos para un ratón dado fue normalizado al volumen del tumor de este ratón en el inicio de dosificación (Día 1) . 20 Los valores de probabilidad fueron calculados como se describió anteriormente. No se observaron muertes o morbosidad en ninguno de los grupos experimentales, indicando que la CEP- 701 y los anticuerpos de neutralización fueron bien tolerados en estos animales. 25 La administración de los anticuerpos de neurotrofina dieron lugar a volúmenes de tumor relativos inferiores con respecto a los volúmenes de tumor en el grupo de control IgG. Los volúmenes de tumor relativos de los tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina fueron significativamente más 30 pequeños (p£?,05) que el grupo de control tratado con IgG los Día 5, 10, 12 y 15. Los volúmenes absolutos de tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina comparados con el grupo de control IgG fueron significativamente más pequeños (p£?,01) el Día 5, permanecieron más pequeños hasta la finalización del experimento (p<0,01, Días 8, 10, 12 y 15), y alcanzaron un mínimo T/C de 0,43 el Día 15. 5 La administración de CEP-701, dio lugar a volúmenes de tumor relativos inferiores con respecto a los volúmenes del tumor en el grupo de control del vehículo. Los volúmenes de tumor relativos de los tumores tratados con CEP-701 fueron significativamente más pequeños (p=0,01) que el grupo de 10 control tratado del vehículo el Día 3 y permanecieron más pequeños hasta que finalizó el experimento (p£?,001, Día 5; p<0,01, Día 8; p<0,001 Día 10; p£?,01 Día 12; y p<0,001 Día 15) . Los volúmenes absolutos de tumores tratados con CEP-701 fueron significativamente más pequeños en comparación con el 15 grupo de control del vehículo el Día 5 (p<0,05), continuaron pequeños hasta la finalización del experimento (p£?,05, Días 8, 10, 12 y 15), y alcanzaron un mínimo T/C de 0,27 el Día 15. Este experimento demostró que los anticuerpos de 20 neurotrofina inhibieron el crecimiento de xenoinjerto de AsPC-1. Puesto que los anticuerpos de neurotrofina inhibieron el crecimiento de tumor relativo a IgG normal, fue muy probable que el efecto de los anticuerpos de neurotropina fuera debido al bloqueo de señalización de neurotropina a 25 través de los receptores de neurotropina trk, opuesto a un • efecto general de la inyección de IgG en tumores. Los tumores tratados con el IgG normal parecieron tener un crecimiento más lento que aquellos tratados con el vehículo para CEP-701; no obstante, no existió una diferencia significativa (p£?,05) 30 en volúmenes de tumores o volúmenes de tumores relativos entre estos dos grupos en ningún momento durante el experimento .

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Ejemplo 6: Resultados Comparativos para xenoinjertos de tumor pancreático CFPAC tratados con anticuerpos de neurotrofina Se utilizaron los siguientes anticuerpos de 5 neurotrofina: anti-NGF (Pepro Tech 500-P85) , anti-BDNF (PeproTech 500-P84) , anti-NT-3 (Pepro Tech 500-P82) , y anti- NT4/5 (PeproTech 500-P83) . Las líneas de células humanas de carcinoma pancreático AsPC-1 y CFPAC fueron creciendo en los medios RPMI o DMEM, • 10 respectivamente. (Cellgro/Mediatech, Washington, D.C.) que contenía 10 % de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals, Norcoss, GA) a 37 °C en una incubadora humidificada con 95 % de aire/5% de atmósfera de C02. Las células fueron determinadas por estar libres de micoplasma y virus de 15 roedores (ensayo MAP) . Las células que crecieron exponencialmente fueron recolectadas utilizando tripsina/EDTA • (GibcoBRL, Rockville, MD) y calculadas utilizando azul trypan (Fisher Scientific, Malvern, PA) . Las células fueron suspendidas de nuevo en el medio de crecimiento adecuado 1 : 1 20 con Matrigel (Fisher Scientific) . Los ratones nu/nu atímicos hembra (de 8-10 semanas de edad; Charles River, Raleigh, NC) se mantuvieron en cinco por jaula en unidades microaislantes . Los animales tomaron una dieta comercial y agua ad libi tum, alojados en 48 ± 2 % de 25 humedad y 22 +/- 2°C, y se estableció un ciclo luz-oscuridad • a intervalos de 12 horas. Los ratones fueron puestos en cuarentena durante al menos 1 semana antes de la manipulación experimental. Los ratones pesaron entre 22 y 25 g en el día de la inoculación de células de tumor. Las células que 30 crecieron exponencialmente, que fueron cultivadas como se describió anteriormente, fueron recolectadas e inyectadas (5 x 106 células/ratón) en el costado derecho de ratones Mj^^BHB^MIM^IlHMi.j.Aitáa.i .1.....1 . _,>!...--.¿_ .. desnudos. Los animales que tenían tumores de 100-400 mm3 (AsPC-1) o 100-900 mm3 (CFPAC) diez días de postinoculación fueron puestos al azar en los grupos adecuados. El tratamiento se inició con un combinado de anticuerpos de neutralización de la neurotropina (anti-NGF, anti-BDNF, anti-NT-3, y anti-NT4/5; 100 µg de cada anticuerpo en un volumen total de 100 µl , 50 µl , de forma intratumoral y 50 µl de forma peritumoral) o IgG de conejo normal (400 µg/100 µl , 50 µl de forma intratumoral y 50 µl de forma peritumoral) . Los ratones recibieron inyecciones de anticuerpos o IgG de conejo normal una vez al día, tres días a la semana los Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12. Los tumores se midieron cada 2-4 días utilizando un calibrador vernier. Los volúmenes del tumor fueron calculados como se describió anteriormente. Los volúmenes medios del tumor y los errores estándar fueron calculados también como se describió anteriormente. Cualquier ratón con un volumen de tumor en día final del análisis que se desvió del volumen medio del tumor el día final del análisis por más de dos desviaciones estándar, fue retirado del análisis en cada punto de datos . Los análisis estadísticos fueron calculados como se describió anteriormente con p£?,05 considerado significativo. La administración de los anticuerpos de neurotrofina (anti-NGF, anti-BDNF, anti-NT-3, y anti-NT4/5) a los xenoinjertos de AsPC-1 dieron lugar a volúmenes de tumor relativos inferiores en comparación con los volúmenes del tumor en el grupo de control IgG. Los volúmenes del tumor relativos de los tumores tratados con anticuerpo de neurotrofma fueron significativamente más pequeños (p£?,05) que el grupo de control tratado con IgG partiendo del Día 5 y permanecieron más pequeños desde el Día 10 hasta la finalización del experimento. Los volúmenes absolutos de tumores tratados con anticuerpo de neurotrofina comparado con los animales de control tratados con IgG fueron significativamente más pequeños (p£?,01) el Día 5, 5 permanecieron más pequeños hasta la terminación del experimento, y alcanzaron un máximo de 55 por ciento de inhibición del crecimiento del tumor el Día 15. La administración de los anticuerpos de neutralización de neurotrofina no inhibieron el crecimiento de tumores CFPAC ^P 10 con respecto a tumores tratados con el control IgG. La falta de inhibición por los anticuerpos de neutralización de la neurotrofina sugirieron que estos xenoinjertos no dependieran de neurotrofinas para el crecimiento. La insensibilidad de de CFPAC estaba de acuerdo con los datos publicados previamente 15 donde el crecimiento del tumor CFPAC fue insensible al tratamiento con el inhibidor pan-trk CEP-701, mientras que el • crecimiento de tumores AsPC-1 se inhibió por CEP-701. No existieron signos evidentes de anticuerpo de neutralización relacionado con morbosidad o muertes en el 20 grupo experimental, y los pesos corporales fueron comparables entre los animales tratados con anticuerpo de neutralización y los animales tratados con IgG de conejo normal (Tablas 2 y 4) . Estos datos indicaron que los anticuerpos de neutralización fueron bien tolerados por los animales en • 25 dosis en las que se observó la eficacia significativa anti- tumor .

Tabla 1 Efecto Anti-tumor de Anticuerpos de Neutralización de la 30 Neurotrofina sobre Xenoinjertos Pancreáticos ASPCl en Ratones Desnudos : Volumen Relativo del Tumor (Volumen Absoluto del Absoluto) ^^n^^n .*¿. U&&,- -.-**&J*~'s &SÍ?- BÁsJ? - i " . .¿^tiÉgi Wl^ Los ratones desnudos que llevan tumores ASPCl fueron tratados con anticuerpo de neutralización (100 µg cada Ab/100 µl , de manera intratumoral y peritumoral qd, en los Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12) o IgG de conejo normal en PBS estéril (100 µg/100 µl) de forma intratumoral y peritumoral gd los días 1, 3, 5, 8, 10 y 12. Los volúmenes del tumor se determinaron tsá? L&É "^^-^^.^.¿1^^^,^,^,^ _ ^»»»^.4»__^^_,,^^a ___i_a?__^_i_B?a,,?¡,,ga^fc. cada 2-3 días. Los valores son la Media ± SE de volumen de tumor relativo. Los valores en los paréntesis son la Media ± SE de volumen de tumor real (mm3) ; *p£?,05; **p£?,01 por Mann- . Whitney Rank Su Test .

Tabla 2 : Efectos de Anticuerpos de Neutralización de la Neurotrofina sobre los Pesos Corporales de Ratones Desnudos que llevan Xenoinjertos AsPC-1 Los ratones desnudos que llevan tumores ASPCl fueron tratados con anticuerpo de neutralización (lOOµg cada Ab/100 µl) de forma mtratumoral y peritumoral gd en Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12), o IgG de conejo normal en PBS estéril (100 µg/100 µl de forma intratumoral y peritumoral gd en días 1, 3, 5, 8, 10 y 12) . Los valores son la Media ± SE del peso corporal . Tabla 3 : ÚfefcJüía jg ->* l-a* Í&á±?>..*. . - "-•** -<***** ¿.me ¿..t^ é? - üi -i i u Efecto de Anticuerpos de Neutralización de Neurotrofina sobre Xenoinjertos Pancreáticos CFPAC en Ratones Desnudos: Volumen Relativo del Tumor (Volumen Absoluto del Tumor) • • Los ratones desnudos que llevan tumores CFPAC fueron tratados con anticuerpo de neutralización (lOOµg cada Ab/100 µl) de forma intratumoral y peritumoral gd en Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12) , o IgG de conejo normal en PBS estéril (400 10 µg/100 µl de forma intratumoral y peritumoral gd en días 1, 3, 5, 8, 10 y 12) . Los volúmenes del tumor fueron determinados cada 3-4 días. Los valores son la Media ± SE del volumen del tumor relativo. Los valores entre paréntesis son la Media ± SE del volumen real del tumor (mm3) .

Tabla 4 : Efectos de Anticuerpos de Neutralización de Neurotrofina sobre los Pesos Corporales de Ratones Desnudos que llevan Xenoinjertos CFPAC • 10 Los ratones desnudos que llevan tumores CFPAC fueron tratados con anticuerpo de neutralización (lOOµg cada Ab/100 µl) de forma intratumoral y peritumoral gd en Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12) , o IgG de conejo normal en PBS estéril (400 µg/100 µl de forma intratumoral y peritumoral gd en días 1, 15 3, 5, 8, 10 y 12) . Los pesos corporales fueron determinados cada 3-4 días. Los valores son la Media ± SE de pesos corporales (g) . • Ejemplo 7: Volúmenes de Tumor Calculados Individuales y Peso 20 Corporal Las células que crecieron exponencialmente, que fueron cultivadas como se describió anteriormente, fueron recolectadas e inyectadas (5 x 106 células/ratón) en el costado derecho del ratón desnudos. Los animales que llevan tumores de 100-500 mm3 de tamaño fueron colocados al azar en los grupos adecuados y dosificados utilizando un combinado de anticuerpos de neutralización de la neurotrofina (anti-NGF, anti-BDNF, anti-NT-3, y anti-NT-4/5) (100 µg de cada anticuerpo en un volumen total de 100 µl , 50 µl de forma intratumoral y 50 µl de forma peritumoral) o IgG de conejo normal (400 µg/100 µl , 50 µl de forma intratumoral y 50 µl de forma peritumoral) . Los ratones recibieron inyecciones de anticuerpos una vez al día, tres días a la semana los Días 1, 3, 5, 8, 10 y 12. Los tumores se midieron cada 2-3 días utilizando un calibrador vernier. Los volúmenes del tumor, los volúmenes medios del tumor, y los errores estándar fueron calculados también como se describió anteriormente. Los volúmenes de tumor relativos fueron determinados en cada punto de datos utilizando la siguiente fórmula: vtmedio/v0medio, donde vt hace referencia al volumen del tumor en un día dado y v0 hace referencia al volumen del tumor en el inicio de la dosis (Día 1) . Cualquier ratón con un volumen de tumor el último día que se desvió del volumen medio del tumor el último día del análisis por más de dos desviaciones estándar, era retirado del análisis en cada punto de datos. Los análisis estadísticos fueron calculados como se describió anteriormente, con p£?,05, considerado significativo.

W Efectos de Anticuerpos de Neutralización de Neurotrofina sobre Xenoinjertos ASPCl Tratamiento N° jaula N°ratón Día 3 Efectos de Anticuerpos de Neutralización de Neurotrofina sobre Xenoinjertos ASPCl ... tit?i.1 ~.~* **tak..?.???ium*ii±*»U*t*?' >- "> • • • • • • • iavki.i. ^^ t ¡IÍ^ ^^i¡ ^g^ wMMi& » ?*?t?*t.?t~l. ^^Ülj?^ti^i??ia.. . m^,.^^...^aü_Mto. • i.jt lia • ^^»^¿a>»fc .*fcA,i,

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un método de tratamiento o prevención del cáncer de próstata o pancreático que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente anti-neurotrofina seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una molécula orgánica pequeña 10 que se une a una neurotrofina, y una mutación dominante- negativa de un receptor trk que se une a una neurotrofina.

2. El método según la reivindicación 1, donde dicha neurotrofina es NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 o NT-7. 15

3. El método según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o fragmento F(ab)2. 20

4. El método según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El método según la reivindicación 1, donde dicho mamífero es humano. 25

6. Un método de tratamiento de tumores de próstata o pancreático que comprende poner en contacto dicho tumor con una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo de neurotrofina de neutralización, donde dicha 30 neurotrofina es seleccionada del grupo que consta de NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 y NT-7.

7. Un método de reducción de volumen de tumor prostático o pancreático que comprende poner en contacto dicho tumor con al menos un agente anti-neurotrofina seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo de anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una pequeña molécula orgánica que se une a una neurotrofina, y una mutación negativa dominante de un receptor de trk que se une a una neurotrofina.

8. El método según la reivindicación 7, donde dicho agente anti-neurotrofina es un anticuerpo anti-neurotrofina .

9. El método según la reivindicación 7, donde dicho neurotrofina es NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6, o NT-7.

10. El método según la reivindicación 8, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o fragmento F(ab)2.

11. El método según la reivindicación 8, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

12. Un método de reducción de la velocidad de crecimiento del tumor prostático o pancreático, que comprende poner en contacto dicho tumor con al menos un agente anti- neurotrofina seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una molécula orgánica pequeña que se une a una neurotrofina, y una mutación negativa dominante de un receptor trk que se une a una neurotrofina. '"*'*••*-*"tilratini ?t*~*. iu r..» . ±^*??i*~- *??L.^ >J. * ,- ~

13. El método según la reivindicación 12, donde dicho agente de anti-neurotrofina es un anticuerpo de anti- neurotrofina .

14. El método según la reivindicación 12, donde dicha neurotrofina es NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 o NT-7.

15. El método según la reivindicación 13, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o fragmento F(ab)2.

16. El método según la reivindicación 13, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

17. Un método de tratamiento del dolor asociado con el cáncer, que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente anti- neurotrofina .

18. El método según la reivindicación 17, donde dicho agente anti-neurotrofina es seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo de anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una pequeña molécula orgánica que se une a una neurotrofina, y una mutación negativa dominante de un receptor de trk que se une a una neurotrofina .

19. El método según la reivindicación 17, donde dicha neurotrofina es NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 ó NT-7.

20. El método según la reivindicación 17, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o fragmento F(ab)2.

21. El método según la reivindicación 18, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. El método según la reivindicación 17, donde dicho mamífero es un humano.

23. El método según la reivindicación 6, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmento F(ab), o fragmento F(ab)2.

24. El método según la reivindicación 6, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. ^imAtJiMM T&ái 4 Resumen dejóla Invención Se describe un método para tratar o prevenir cáncer mediante la administración a un mamífero de una cantidad efectiva terapéuticanlepte de al menos un agente anti- neurotrofina. El agente i nti-neurotrofina de preferencia es un anticuerpo anti-neurotrofina, una molécula antisentido dirigida a una neurotrofina, una molécula orgánica pequeña que enlaza a una neurotrofina o una mutación dominante- negativa de un receptor trk que enlaza una neurotrofina. Este método es particularmente preferido para el tratamiento de la próstata o cáncer pancreático. Los angentes anti- neurotróficos neutralizan a los NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 o NT-7 e incluyen anticuerpos humanizados así como sus fragmentos . PA/a/ 2002 \ ^ SG