AT505003A4

AT505003A4 - Antikörper verwendbar für die therapie und diagnose von krebs

Info

Publication number: AT505003A4
Application number: AT0083007A
Authority: AT
Inventors: Johannes Humer; Bernd Mayer; Thomas Muster; Andrea Waltenberger
Original assignee: Avir Green Hills Biotechnology
Priority date: 2007-05-24
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2008-10-15
Also published as: AT505003B1

Description

Neuer Antikörper verwendbar für die Therapie und Diagnose von Krebs
Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzelllinie und einen monoklonalen Antikörper der von der Hybridomzelle hergestellt wird, zur Verfügung, der spezifisch an ein Epitop eines endogenen Retrovirus bindet. Der Antikörper ist besonders nützlich für die Behandlung und Diagnose von Krebs.
Weiters umfasst die vorliegende Erfindung diagnostische Kits für den Nachweis von Krebszellen, im Besonderen von Melanomzellen und Verfahren für die Krebsdiagnose unter Verwendung des Antikörpers.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist die allgemeine Bezeichnung für mehr als 100 medizinische Zustände die unkontrolliertes und gefährliches Zellwachstum beinhalten.

Krebs der Haut, Harnblase, Brust, des Darms, der Lunge und des Pankreas werden mit der grössten Häufigkeit diagnostiziert und werden als allgemeiner Krebs bezeichnet.
Melanom ist ein Krebs der Haut, bis zu 30% der Patienten werden systemische Metastasen entwickeln und die Mehrheit wird sterben (Kirkwood et al.). Klassische Verfahren zur Behandlung von Melanom beinhalten Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie. Hautkrebs ist eine Erkrankung, die sich langsam entwickelt und die durch Beobachtung von Läsionen, die das Potential haben, krebsartig zu werden, mittels Routinescreening vermieden werden kann. Dabei gibt es trotzdem eine Grenze im Hinblick auf den Aufwand an Zeit, Geld oder Unbequemlichkeit welcher ein im Prinzip gesunder Patient für Routinescreening-Verfahren auf sich nehmen will.

Daher muss der Test in der Lage sein, verlässlich gefährliche Tumore zu identifizieren und gefährliche Tumore von gutartigen Muttermalen (pigmentierte Zellen) rasch, günstig und sicher zu unterscheiden.
In Muster et al. (Cancer Res., 2003, 63(24): 8735) wurde eine neue Gruppe von Melanom-assoziierten Antigenen vorgestellt, MERV (Melaji rjri-assoziiertes endogenes Retrovirus) - ein endogenes Retrovirus mit hoher Homologie zu HERVK.
[ ACHGEREICHT Monoklonale Antikörper haben ein grosses Potential in der Krebstherapie da sie an Tumorantigene mit hoher Selektivität binden können und zytotoxische Aktivitäten zu den Krebszellen führen können.

Auch nackte Antikörper können als natürliche Verteidigungsmechanismen verwendet werden, wie Antikörper-abhängige Zytotoxizität (ADCC) oder Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) gegen dieTumorzellen.
Der Grad des Erfolgs in Diagnosen und Therapien bei Verwendung monoklonaler Antikörper hängt von vielen Faktoren ab, aber ein wichtiger Faktor ist die eingeschränkte Expression des Antigens, das durch den Antikörper gegen die Tumorzellen erkannt wird. Ebenfalls sehr wichtig ist der Umfang der Kreuzreaktivität des Antikörpers mit anderen molekularen Strukturen und normalen Geweben. Daher würde der ideale Antikörper nur an Antigene binden, die auf Tumorzellen exprimiert werden und nicht an irgendwelche normale Zellen.

Da die meisten, wenn nicht alle tumorassoziierten Antigene sowohl auf normalen Zellen als auch auf Tumorzellen exprimiert werden, war das Problem in der Technik, Antikörper gegen Antigene zu entwickeln, die zu einem wesentlich höheren Grad auf Tumorzellen exprimiert werden als auf normalen Zellen.
Das wird besonders für die Diagnose von Melanomzellen aus Biopsieproben benötigt.
Im Hinblick auf die Schwierigkeiten, Krebs in einem frühen Stadium nachzuweisen und den Erhalt falsch positiver Resultate besonders bei der Diagnose von Melanomzellen zu vermeiden, existiert ein weit anerkanntes Bedürfnis nach spezifischen Antikörpern um pathologische Hautkonditionen und im besonderen frühe Krebsvorläufer zu identifizieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Antikörper zur Verfügung zu stellen,

der die oben genannten Bedürfnisse befriedigt.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder haben einen monoklonalen Antikörper entwickelt, der selektiv an ein retrovirales Epitop eines endogenen Retrovirus, bevorzugt eines Melanomassoziierten endogenen Retrovirus (MERV) bindet. Es wurde erfolgreich gezeigt, dass dieser Antikörper bösartige Melanomzellen nachweisen kann.
NACHGEREICHT Im Besonderen wird der Antikörper der Erfindung durch eine als 1A1-5B10-B3 beim DSMZ in Deutschland am 10 Mai, 2007 hinterlegte Hybridomzelllinie hergestellt. Weiters werden auch diagnostische Kits enthaltend den Antikörper und Verfahren zum Nachweis von Melanomzellen durch die Erfindung zur Verfügung gestellt.
Figuren:
Figur 1: In vivo Effekt der Behandlung mit dem 5B10 Antikörper auf die Tumorentwicklung.

Die Tumoren wurden auf einem stabilen Zustand während der mAb-5B10 Behandlung gehalten, während sich die Tumoren in der Kontrollgruppe ausdehnten.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt eine Hybridomzelllinie zur Verfügung, die als 1A1-5B10-B3 gemäss dem Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) am 10. Mai, 2007 hinterlegt wurde, sowie einen monoklonalen Antikörper, der durch die Hybridomzelllinie hergestellt wird. Gemäss der Erfindung sind auch Mutanten, Derivate oder Fragmente des Antikörpers mitumfasst. Bevorzugt umfasst das Antikörperderivat mindestens Teile des Fab Fragments, bevorzugt zusammen mit mindestens Teilen des F(ab)2 Fragments und/oder Teilen der Gelenksregion und/oder des Fc Teils eines lambda oder kappa Antikörpers.

Beispielsweise sind die Antikörpermoleküle intakte Immunglobulinmoleküle und jene Teile eines Immunglobulinmoleküls die das Paratop enthalten, inklusive jener Teile die als Fab, F(ab)2and F (v) bekannt sind.
Gemäss der Erfindung bindet der Antikörper spezifisch an eine immundominante Region der Hülle eines endogenen Retrovirus, bevorzugt an die Hülle des Melanomassoziierten endogenen Retrovirus, bevorzugt an das Epitop enthaltend die Aminosäuresequenz YQRSLKFRPKGKPCPKE oder an eine Variante oder ein Fragment davon, mit mindestens 80% Aminosäureidentität, bevorzugt mindestens 90% Aminosäureidentität, bevorzugt mindestens 95% Aminosäureidentität.
NACHGEREICHT Der Antikörper gemäss der Erfindung kann auch für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung oder Diagnose einer Krebserkrankung, bevorzugt einer Melanomerkrankung in einem Tier,

vorzugsweise einem Menschen verwendet werden.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform kann der Antikörper an eine zytotoxische Verbindung gebunden werden oder an eine Markierung, um selektiv in vivo Krebszellen zu töten oder nachweisen zu können. Die zytotoxische Verbindung kann zum Beispiel ein Radioisotop sein, ein Medikament oder ein Toxin.

Um Einsicht in therapeutische Eingriffe in lebenden Mäusen oder Menschen zu erhalten, können Techniken wie Bioluminiszenz Abbildung (BLI), Fluoreszenz Abbildung oder Positronen Emissions-Tomographie (PET) unter Verwendung des entsprechenden mAb angewendet werden.
Alternativ wird ein diagnostischer Kit für die Detektion von Melanomzellen zur Verfügung gestellt, umfassend mindestens ein Behältnis das mindestens einen Antikörper gemäss der Erfindung enthält.
Der Nachweis von Krebs, im Besonderen von Melanom bleibt eine schwierige Herausforderung in der chirurgischen Pathologie, teilweise wegen seiner histologischen Variabilität, der Zytomorphologie, Architektur und stromalen Komponenten.

Derzeit erhältliche Biomarker die auf die Unterstützung der Diagnose gerichtet sind, fehlt die Sensitivität und Spezifität.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Krebsdiagnose, insbesondere der Melanomdiagnose unter Verwendung des Antikörpers, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens der Probe von möglichem Krebsursprung, bevorzugt von Melanomursprung mit dem Antikörper, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen der Probe und dem Antikörper führt und Delektieren und wahlweisesQuantifizieren der Antikörper-Antigen Reaktion, wobei die Antigen-Antikörper Bindung auf das Vorhandensein von Krebszellen hinweist. In einer alternativen Ausführungsform ist der Antikörper auf einer Oberfläche gebunden.
Die vorangegangene Beschreibung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele vollkommen verstanden.

Diese Beispiele sind dennoch lediglich
NACHGEREICHT beispielhaft für Verfahren zur Durchführung einer oder mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als limitierend auf den Umfang der Erfindung gelesen werden.
Beispiele:
Beispiel 1 :
Material und Methoden: Antikörper
Ein monoklonaler Antikörper der den immundominanten Sequenzbereich eines MERV Hüllproteins erkennt (YQRSLKFRPKGKPCPKE , National Center for Biotechnology Information, Zugangsnummer AX743231, Aminosäuresequenz Bereich Hülle 214-230) wurde durch Immunisieren von weiblichen Balb/c Mäusen mit dem Peptid das mit der immundominanten Hüllregion korrespondiert, gekoppelt an KLH (PiCHEM, Graz, Österreich) hergestellt. Die Hybridome wurden auf Basis der Reaktivität des Überstands gegen das Peptid im ELISA selektiert.

Das am stärksten reaktive Hybridom, 1A1-5B10-B3, hinterlegt am DSMZ am 10. Mai 2007 wurde verwendet, um den monoklonalen Antikörper 5B10 (Genovac GmbH, Freiburg, Deutschland) herzustellen. Isotypisieren wurde mittels Isostrip Kit (Röche, Basel, Schweiz) gemäss den Herstellervorschriften durchgeführt. Der Isotyp des mAb 5B10 war lgG1[kappa] und die Endkonzentration war 1 mg/ml in PBS.

Ein gereinigter Maus lgG1k(Becton Dickinson, San Jose, CA) wurde als Isotypenkontrolle verwendet.
Zelllinien
Melanomzelllinien 518A2 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Peter Schrier, Universität Leiden, Niederlande), A375 und SKMel28 (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA), MelJuso (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur, DSMZ, Braunschweig, Deutschland), 6F (primäre Melanomzellen, Abteilung für Dermatologie, medizinische Universität Wien, Österreich) wurden in DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und 1% Antibiotikum- AntimycotikumMischung (beide Gibco, Paisley, UK) aufbewahrt.
NACHGEREICHT NHEM-Neo (Normale Humane Epidermale Melanozyten-Neonatal, ATCC)

wurden in Melanozyten-Basalmedium enthaltend 1% Antibiotika und 10% epidermalen Melanozyten Wachstumszusatz (Cell Systems Biotechnologies, St. Katharinen, Deutschland) kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37[deg.]C in einer 5% C02luftbefeuchteten Atmosphäre kultiviert.
Vero Zellen (Afrikanische Green Monkey Niere, ECACC WHO Keim 0693) wurden in DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) enthaltend 10% hitzinaktiviertes fötales Rinderserum und 1% Antibiotikum- Antimycotikum-Mischung (beide Gibco, Paisley, UK) aufbewahrt.
MERV-env Transfektion von Vero Zellen
Eine transiente Transfektion von Vero Zellen mit MERV env-Plasmid wurde unter Verwendung von VeroFect (OZ Biosciences, Marseille, Frankreich) durchgeführt. 2x10<4>Zellen wurden in einem Näpfchen einer 6-Näpfchen-Platte angesät und über Nacht inkubiert.

Für die Transfektion wurden 2 Lösungen hergestellt, eine enthielt 4[mu]g Plasmid DNA in 100[mu]l of DMEM (Gibco, Paisley, UK) ohne FCS und Antibiotika und die andere enthielt 8[mu]l VeroFect in 100[mu]l DMEM ohne FCS und Antibiotika. Diese zwei Lösungen wurden zusammengeführt und bei Raumtemperatur für 20 Min inkubiert um DNA-VeroFect-Komplexe zu bilden. Den Zellen wurden 2ml frisches DMEM mit FCS zugegeben, und Antibiotika und DNA-VeroFect-Komplexe wurden zugefügt. Die Zellen wurden vor der Färbung bei 37[deg.]C für 24 Stunden inkubiert.

Zellen die mit der Transfektionsmischung ohne Plasmid DNA inkubiert worden waren, wurden als Negativkontrolle verwendet.
Immunzvtochemie - Immunhistochemie
Für Immunzytochemie-Untersuchungen wurden die Zellen auf 8-Näpfchen Kammerobjekträgern für 48 Stunden wachsen gelassen (LabTec, Nalge Nunc Int., Rochester, NY) und in 4% kaltem Paraformaldehyd für 15 Minuten fixiert. Immunhistochemie-Untersuchungen wurden auf konventionellem Formalin-fixiertem Paraffin-Gewebsschnitten durchgeführt, vorwiegend hergestellt als Gewebsreihen nach Vorbehandlung in einer Antigen-Freisetzungslösung (DAKO, Glostrup, Dänemark) bei 80[deg.]C ü/N.
[N NAA N NAACHGE[Gamma][Epsilon][Omicron]HT Die Färbung wurde durch Inkubation in einem befeuchteten Behälter mit dem primären Antikörper mAb 5B10 bei einer Endkonzentration von 50[mu]g/ml und 3stündiger Inkubation bei 37[deg.]C durchgeführt.

Der Nachweis wurde unter Verwendung eines 1:25 verdünnten Ziege-anti-Maus HRP-konjugierten sekundären Antikörpers für 30 Min bei Raumtemperatur durchgeführt (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland).
AEC Chromogen (DAKO, Glostrup, Dänemark) wurde als Substrat für 5-10 Minuten verwendet und die Gegenfärbung wurde mit Mayer's Hämatoxylin für 20 Sekunden durchgeführt, gefolgt vom Waschen mit Leitungswasser für 2-5 Minuten. Die Träger wurden unter Verwendung von Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany) eingedeckt. Für die Negativkontrolle wurde der primäre Antikörper durch einen Maus Isotyp IgG mit einer Konzentration gleich der des primären Antikörpers ersetzt.

MERV-negative Zelllinien sowie Gewebsschnitte enthaltend normales benachbartes Gewebe wurden gleichzeitig als zweite negative Kontrolle getestet.
ELISA Screeninq
Das MERV-abgeleitete Peptid das für das ELISA Seren-Screening verwendet wurde (Zugangsnummer AX743231 , Aminosäuresequenz Bereich Hülle 214-230, nachfolgend bezeichnet als G1) sowie ein Referenzpeptid (GGTGMTKTTNTDSGHSG) wurden bei > 90% Reinheit synthetisiert (PiCHEM, Graz, Österreich). Die Reinheit dieser Peptide wurde durch HPLC und MS festgestellt.

Die Peptide wurden mit Dimethylsulfoxid bis zur Endkonzentration von 3mg/ml verdünnt.
Antikörper, die mit den MERV Hüllepitopen reagierten, wurden durch indirekte ELISA nachgewiesen wie bereits beschrieben. 96-Napf Mikrotiterplatten (Nunc, Rochester, NY) wurden mit 0,25 [mu]g/Napf von 17-mer Peptiden (G1, Referenzpeptid) über Nacht beschichtet und mit 2% Rinderserumalbumin in 0,1% v/v Tween 20 enthaltend PBS blockiert. Die Platten wurden dann gewaschen und mit Hybridomproben (1:100 verdünnt) oder humanen Melanom Serumproben (1:200 verdünnt) inkubiert. Für murine Hybridoma wurde die Antikörperbindung mit der Hilfe von AlkalinePhosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG Antikörper nachgewiesen (Tropix, Bedford, MA), und für humane Seren mit Alkaline-Phosphatase konjugierten Ziegeanti-human IgG Antikörper (Bethyl Inc., Bethesda, Maryland).

Nach einer Stunde
<EMI ID=7.1>

NACHGEREICHT wurden die Platten gewaschen und p-Nitrophenylphosphat (Sigma Aldrich) wurde zugegeben. Die Absorption wurde bei 405nm (BDL Immunoskan Plus) gemessen. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung für jedes Peptid (G1 , Referenzpeptid) gemessen. Die Mittelwerte der dreifachen Ausfertigungen wurden berechnet und ein endgültiges ELISA Signal für jede Probe festgelegt als Unterschied zwischen Mittelwerten des MERV Kandidatenepitops und dem Referenzpeptid.
Seren und Gewebesammlung
Seren und Gewebsproben von Melanom-Patienten (die Diagnose wurde durch Routine-Histopathologie in der Abteilung für Dermatologie, Petzelbauer P.

ermittelt) wurden in der Abteilung für Dermatologie, Medizinische Universität Wien, Österreich gesammelt.
Die Verteilung der Patienten und die Klassifizierung der Seren folgteden Richtlinien des 2001 American Joint Committee on Cancer (Balch, CM. et al. CA CancerJ. Clin. 54, 131-49; (2004). Die Verwendung von Patientenseren und klinischen Daten wurde durch das Ethikkommitee der medizinischen Universität Wien gestattet. Vertraulichkeit der Studienpersonen wurde durch Probenkodierung garantiert. S-100positive Melanomgewebe Sammlungen wurden von US Biomax, Rockville, Maryland (Array ME801) als zusätzliche Probenquelle erhalten.
Ergebnisse:
Unter Verwendung eines immundominanten peptids des MERV Hüllproteins (G1) als Antigen, erzeugten wir den monoklonalen Antikörper 5B10. Die Spezifität der mAb 5B10 Färbung gegen MERV env wurde durch zwei unabhängige Verfahren bewiesen.

Unter Verwendung eines Verdrängungssassays durch Präinkubieren mit mAb 5B10 mit einem 100-molaren Überschuss seines Zielpeptids, zeigte G1 keine Reaktivität gegen das Peptid im ELISA und keine Reaktivität in der immunhistochemischen Färbung. Um die G1 Spezifität mit der MERV env Reaktivität zu korrelieren, wurden MERV-negative Vero-Zellen transient mit MERV-env kodierendem pIRES-EGFP-env Plasmid transfiziert, was zu einer starken MERV-env Expression führte, wie in der immunhistochemischen Färbung mit mAb 5B10 gezeigt wurde (Abbildung nicht gezeigt).
<EMI ID=8.1>
Unter Verwendung von mAb 5B10 wurde eine immunzytochemische Färbung von Melanomzelllinien und humanen Melanozyten durchgeführt. Der Antikörper 5B10 reagierte mit allen untersuchten Melanomzelllinien (SKMel28, 518A2, MelJuso, A375 und 6F).

Der Antikörper ergab kein signifikantes Signal mit kultivierten Melanozyten (NHEM) und Vero Zellen, die als negative Kontrolle dienten. Der IsoptypenkontrollAntikörper färbte weder die Melanomzelllinien noch die Melanozyten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Als nächstes testeten wir, ob mAb 5B10 in der Paraffin-Immunhistochemie verwendet werden könnte, um bösartige von gutartigen melanozytischen Läsionen zu unterscheiden. Eine Gesamtheit von 186 melanozytischen Läsionen wurden auf Reaktivität mit dem mAb 5B10 getestet. 58 dermale Mutermale, 81 primäre Melanoma und 47 Melanoma-Metastasen wurden getestet. Immunhistochemie mit dem mAb 5N10 wurde ausschliesslich auf S100-positive Gewebsschnitten durchgeführt, um melanomosalen Ursprung zu garantieren. Die Stärke des 5B10 zytoplasmatischen Färbungsmusters wurde als negativ, moderat oder stark klassifiziert.

Für jeden Gewebsschnitt wurden eine Hämatoxylin Eosin (HE), 5B10, Isotypenkontrolle (ISO) sowie eine S-100 Färbung durchgeführt.
Die Ergebnisse der 5B10 Immunhistochemie sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Färbung für das MERV Hüllprotein war in 75 (93%) von 81 Fällen von primärem Melanom positiv, und in 43 (91%) von 47 Melanom-Metastasen wenn beide, moderate und starke Färbung berücksichtigt wurde. 2 von 58 (3%) Fällen von dermalen Muttermalen waren moderat reaktiv.
Tabelle 1:

Zusammenfassung der Histochemie von melanozytischen Läsionen unter Verwendung von mAb 5B10
Probenart Zahl der Negativ Moderat stark Patienten positiv positiv
Dermal nevi 58 56 (97%) 2 (3%) 0
Primäre melanoma 81 6 (7%) 19 (23%) 56 (70%)
<EMI ID=9.1>
Melanom-Metastasen 47 4 (9%) 15 (32%) 28 (59%)
NACHGEREICHT Dieser Antikörper kann für konventionelle Formalin-fixierte Paraffinschnitte verwendet werden. Mit Hilfe dieses Antikörpers fanden wir eine auffallend hohe Prävalenz für Bösartigkeit; welche anzeigt, dass mAb 5B10 zur Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen melanozytischen Läsionen verwendet werden kann.
Wir untersuchten ob die Reaktivität des Gewebes, die mit mAb 5B10 festgelegt wurde, mit einer humoralen Immunantwort korreliert.

Unter Verwendung von Melanomgewebsschnitten und Serenproben, beide zum selben Zeitpunkt entnommen, führten wir eine Immunhistochemie mit mAb 5B10 und einen SerumELISA Assay, unter Verwendung von G1 gegen Referenzpeptid als Antigen. Bei den 16 getesteten Patienten korrelierten eine stark positive Immunhistochemie (n=8) mit höheren Werten im Seren. ELISA (Durchschnittswert der optischen Dichte 0,321), während Patienten mit einer negativen Gewebsfärbung (n=3) geringe Serenreaktivität (Durchschnittswert der optischen Dichte 0,080) hatten.
Beispiel 2: Evaluierung des inhibitorischen Effekts eines monoklonalen Antikörpers 5B10 auf die Tumorentwicklung in nackten Mäusen
Das Ziel dieser ersten Mausstudie war, den monoklonalen Antikörper (5B10) auf seinen inhibitorischen Effekt auf die Melanom-Tumorentwicklung nach intravenöser Verabreichung zu evaluieren.

Nu/nu Mäuse sind ein Standardmodell für die Induktion von humanen Tumorzellen und multiplen in vivo Behandlungsstrategien in der Krebsforschung. Basierend auf ihrer angeborenen NK-Zellaktivität, erlauben uns nu/nu Mäuse, die durch in vivo mAb Behandlung induzierte Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität zu studieren.
Das Inokulieren des Tumors erfolgte unter Verwendung von 7x10E6 Zellen/Maus der Melanomzelllinie 518A2 s.c. in die rechte Schulterblattregion. Es wurden zwei Gruppen von Mäusen mit 8 Mäusen/Gruppe dreimal pro Woche intravenös mit mAb 5B10 gegen PBS sofort nach Tumorzellinokulation (ab Tag 0) in einem Volumen von 100 [mu]l behandelt. Das Tumorwachstum begann zwischen Tag 6 und 17 nach der Tumorzellinokulation.

Im Vergleich der Gruppe 1 (mAb 5B10 behandelt) zu der PBS Kontrollgruppe, wurden die Tumore während der mAb 5B10 Behandlung in einem
10
NACHGEREICHT stabilen Zustand gehalten, während sich die Tumore in der Kontrollgruppe ausdehnten, was auf einen therapeutischen Effekt der mAb 5B10 Behandlung hinweist.
NACHGEREICHT

Claims

<EMI ID=12.1> Ansprüche:

1. Hybridomzelllinie hinterlegt als»1A1-0rl [theta]-B9(bei der DSMZ am 10. Mai 2007.

1. Eine Hybridomzelllinie hinterlegt als 1 A1-5B10-B3 bei der DSMZ am 10. Mai 2007.

2. Monoklonaler Antikö[phi]er hergestellt durch die Hybridomzelllinie gemäss Anspruch 1.

2. Ein monoklonaler Antikörper hergestellt durch die Hybridomzelllinie gemäss Anspruch 1.

3. Antikö[phi]er gemäss Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch an ein Epitop eines endogenen Retrovirus, bevorzugt eines Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus bindet.

3. Ein Antikörper gemäss Anspruch 2 dadurch charakterisiert, dass er spezifisch an ein Epitop eines endogenen Retrovirus, bevorzugt eines Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus bindet.

4. Antikö[phi]er gemäss einem der Ansprüche 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen ein Peptid mit der Aminosäuresequenz YQRSLKFRPKGKPCPKE oder ein Derivat davon mit mindestens 80% Aminosäureidentität, bevorzugt mindestens 90% Aminosäureidentität, mehr bevorzugt mindestens 95% Aminosäureidentität gerichtet ist.

4. Ein Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch charakterisiert, dass der Antikörper gegen ein Peptid mit der Aminosäuresequenz YQRSLKFRPKGKPCPKE oder ein Derivat davon mit mindestens 80% Aminosäureidentität, bevorzugt mindestens 90% Aminosäureidentität, mehr bevorzugt mindestens 95% Aminosäureidentität gerichtet ist.

5. Antikörper gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an eine zytotoxische Komponente oder an eine Markierung gebunden ist.

5. Antikörper gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch charakterisiert, dass die Antikörper an eine zytotoxischen Komponente gebunden sind oder an eine Markierung die eine selektive Bindung an Krebszellen ermöglicht, sodass die Krebszellen getötet oder nachgewiesen werden können.

6. Antikörper gemäss Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass die zytotoxische Komponente ein Radioisotop oder ein Toxin ist.

6. Antikörper gemäss Anspruch 5 dadurch charakterisiert, dass die zytotoxische Komponente ein Radioisotop, ein Medikament oder ein Toxin ist.

7. Verwendung eines Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung einer Krebserkrankung, bevorzugt einer Melanomerkrankung.

7. Verwendung eines Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung oder Diagnose einer Krebserkrankung, bevorzugt einer Melanomerkrankung in einem Tier.

8. Verwendung eines Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 zur in vitro Diagnose einer Krebserkrankung, bevorzugt einer Melanomerkrankung.

8. Diagnostischer Kit für den Nachweis von Krebszellen, bevorzugt von Melanomzellen, wobei dieser Kit mindestens ein Behältnis enthaltend mindestens einen Antikörper gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 enthält.

9. Diagnostischer Kit für den Nachweis von Krebszellen, bevorzugt von Melanomzellen, wobei dieser Kit mindestens ein Behältnis enthaltend mindestens einen Antikörper gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 enthält.

9. Verfahren zur Melanomdiagnose unter Verwendung eines Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 umfassend die Schritte

12

NACHGEREICHT a. in Kontaktbringen der Probe von möglichem Krebs , bevorzugt von Melanomursprung mit dem Antikörper, was zu einer Antikörper-Antigen Reaktion zwischen der Probe und dem Antikörper führt, und b. Nachweisen und möglicherweise Quantifizieren der AntikörperAntigenreaktion, wobei die Antigen-Antikörper Bindung auf das Vorhandensein von Krebszellen hinweist.

10. Verfahren zur Melanomdiagnose unter Verwendung eines Antikö[phi]ers gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6 umfassend die Schritte

NACHGEREICHT t < [iota] t [pi] a. in Kontaktbringen der Probe die möglicherweise Krebszellen enthält , bevorzugt Melanomzellen, mit dem Antikörper, was zu einer Antikörper-Antigen Reaktion zwischen der Probe und dem Antikö[phi]er führt, und b. Nachweisen und möglicherweise Quantifizieren der AntikörperAntigenreaktion, wobei die Antigen-Antikörper Bindung auf das Vorhandensein von Krebszellen hinweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9 wobei der Antikörper auf einer Oberfläche gebunden ist.

11.Verfahren nach Anspruch 9 wobei der Antikörper auf einer Oberfläche gebunden ist.

11. Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration oder des Vorhandenseins von Krebszellen in vitro unter Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper assoziiert ist mit einer Markierung, wobei das Verfahren das Exponieren von Zellen in einer Testprobe auf die Antikörper umfasst und der Nachweis des Umfangs der Bindung durch Nachweis der Markierung erfolgt.

NACHGEREICHT A. -i*^

Patentansprüche:

DSMAC Z84Z/

12. Ein Vorfahren zur Bestimmung dor Konzentration oder des Vorhandenseins von Krebszellen in vitro unter Verwejidtjrig des Antikörpers nach einem der Ansprüche ^bi[beta]r67dadurch gekennzeichnet, dass der Aptikör^er eine Markierung trägt, wobei das Verfahren das Experrteren von Zellen in einer Testprobe auf die_ Antiköfpe umfasst und der Nachweis des Umfangs der Bindung durch Nachweis der Markierung erfolgt, j,12. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration oder des Vorhandenseins von Krebszellen in vitro unter Verwendung eines Antikö[phi]ers nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikö[phi]er eine Markierung trägt, wobei die Zellen in einer Testprobe dem Antikö[phi]er ausgesetzt werden und der Nachweis des Ausmasses der Bindung durch Detektion der Markierung erfolgt.

NACHGEREICHT