DE60020353T2

DE60020353T2 - Gegen menschliches mcm3-protein gerichtete monoklonale antikörper, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung

Info

Publication number: DE60020353T2
Application number: DE60020353T
Authority: DE
Inventors: Johannes Gerdes; Thomas Scholzen; Elmar Endl; Claudia Wohlenberg; Bettina Baron-Luhr; Margrit Hahn; Patricia Prilla; Johanna Szuwinski; Rolf Knippers
Original assignee: DakoCytomation Denmark AS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: WO2000059943A3; JP2002541157A; DK1165615T3; EP1165615A2; US20040146513A1; WO2000059943A2; AU4114800A; ATE296316T1; JP4980516B2; DE60020353D1; DE19915057A1; ES2239594T3; EP1165615B1; US6777194B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die zu einer spezifischen Bindung an menschliches Protein Mcm3 in der Lage sind, Prozesse für ihre Herstellung und ihre Verwendung.
Stand der Technik
Mcm-Proteine wurden zuerst in der Bierhefe S. cerevisiae beschrieben. Es ist bekannt, dass diese Proteine eine wichtige Rolle bei der Initiierung der DNA-Replikation spielen, was in der Bierhefe durch ihre entscheidende Rolle bei der Transmission von zusätzlichen Chromosom-DNA-Segmenten, Minichromosomen, gezeigt wurde (Maine et al., Genetics, 1984, 106: 365–385). Diese Eigenschaft war die Basis für die Benennung dieser Proteine, minichromosome maintenance, Mcm. Die Proteine der Mcm-Familie sind im Hinblick auf die Evolution hoch konserviert.
Zur Zeit werden sechs Proteine (Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6, Mcm7) in dem menschlichen System beschrieben, die mit anderen Zellzyklus-abhängigen Strukturen einen Proteinkomplex bilden, der für die DNA-Replikation notwendig ist und die bereits als DNA-Replikationslizenzfaktoren durch J. J. Blow und R. A. Laskey, 1988 (Nature, 332: 546–548) postuliert wurden. Mcm3-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung einer biochemischen starken Bindung mit Mcm5 (A. Richter, R. Knippers, Eur. J. Biochem., 1997, 247: 136–141). Da Mcm3 und die anderen Mitglieder der Mcm-Familie eine solch grundlegende Funktion in dem Zellzyklus aufweisen, sind Nachweissysteme erwünscht, vorzugsweise immunbiochemische und immunhistologische Nachweise. Solche Nachweise sind notwendig, da mit ihnen neue Parameter für die medizinische Diagnose, vorzugsweise bei der Krebsdiagnose, erhalten werden können.
Es ist bekannt, dass menschliches Mcm-Protein bei dem Kaninchen immunogen ist (Thommes et al., Nucleic Acid Res., 1992, 20: 1069–1074). Aber die bekannten polyklonalen Antiseren reagieren entweder nicht monospezifisch in immunbiochemischen Analysen (Western-Blot) und/oder sind nicht schnell und ohne Probleme bei der Routine-Immunhistologie anwendbar (Hu, B., et al., Nucleic Acid Res., 1993, 21: 5289–5293). Daher ist kein Werkzeug zur Hand, das als ein Nachweisverfahren für Mcm3 bei der medizinischen Diagnose dienen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, Mittel bereitzustellen, die schnell und monospezifisch Mcm3-Protein in biochemischen und auch in histologischen Systemen, allein oder zusammen in Kombination durchgeführt, nachweisen. Dieser Nachweis kann alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Markern durchgeführt werden.
Gemäß der Erfindung wird dies durch einen monoklonalen Antikörper erreicht, der in der Lage ist, an menschliches Mcm3 spezifisch zu binden, wobei der monoklonale Antikörper mit dem gleichen Epitop von menschlichem Mcm3 reagiert, wie der monoklonale Antikörper, der von einer Hybridom-Zelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2388 erhältlich ist.
Weiter werden Hybridome, die monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung erzeugen, offenbart.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung diagnostischer Zusammensetzungen und Nachweiskits, die den monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
Noch eine andere Aufgabe ist die Verwendung des monoklonalen Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung für den Nachweis von Mcm3 in einer Probe.
Darüber hinaus werden Prozesse offenbart, die die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers bzw. eines Hybridoms gemäß der vorliegenden Erfindung betreffen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate und Arzneimittel, die den monoklonalen Antikörper enthalten, und die Verwendung des monoklonalen Antikörpers für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung bestimmter Krankheiten.
Diese Krankheiten oder Störungen sind mit einem anormalen Mcm3-Spiegel oder einer anormalen Aktivität vergesellschaftet oder können aus der Modulation der Aktivität oder des Spiegels von Mcm3 Nutzen ziehen. Das Medikament kann in einer pharmazeutisch effektiven Menge einer Zusammensetzung, die einen Mcm3-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, z.B. entweder lokal oder systemisch an einen Patienten verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Western-Blot, der einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung (rechte Seite) und einen polyklonalen Antikörper, der auf dem Fachgebiet bekannt ist, (linke Seite) verwendet. Es wird klar gezeigt, dass der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung nur eine Bande erkennt, während der polyklonale Antikörper weitere Banden in dem Bereich von 90 bis 50 kDa nachweist. H bezeichnet HeLa-Zellen und C bezeichnet CHO-Zellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der zu einer spezifischen Bindung an ein menschliches Mcm3 fähig ist, worin der monoklonale Antikörper mit demselben Epitop von menschlichem Mcm3 reagiert wie der monoklonale Antikörper, der von einer Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2388 erhältlich ist.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann von irgendeinem Tier oder dem Menschen erhalten werden, wobei die monoklonalen Antikörper der Maus vorgezogen werden.
Weiter kann der monoklonale Antikörper biochemisch, durch Genmanipulation, verändert werden oder er kann synthetisch sein, wobei dem Antikörper möglicherweise Anteile vollständig oder teilweise fehlen, wobei die Anteile für die Wiedererkennung von Mcm3 notwendig sind und durch andere ersetzt werden, die weitere vorteilhafte Eigenschaften auf den Antikörper übertragen.
Es wurde eine Hybridomzelllinie, die einen bevorzugten monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugt, namentlich einen monoklonalen Maus-Antikörper mit dem oben erwähnten Nachweis, bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig unter der Nummer DSM ACC2388 am 16. Februar 1999 hinterlegt.
Die Bezeichnung "Antikörper", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, sprich Moleküle, die eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die spezifisch Mcm3 binden (damit immunreagieren). Beispiele für immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen beinhalten F(ab) und F(ab')₂-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit einem Enzym wie Pepsin, erzeugt werden können. Die Erfindung stellt monoklonale Antikörper, die Mcm3 binden, bereit. Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörper-Zusammensetzung", wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art einer Antigen-Bindungsstelle enthalten, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop von Mcm3 immunologisch zu reagieren. Eine monoklonale Antikörper-Zusammensetzung zeigt so typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für Mcm3, womit sie immunologisch reagiert.
Eine Krankheit, eine Störung oder ein Zustand, der mit einer anormalen Mcm3-Aktivität "vergesellschaftet" oder durch eine anormale Mcm3-Aktivität "charakterisiert" ist, bezieht sich auf eine Krankheit, Störung oder einen Zustand bei einem Patienten, die durch eine anormale Mcm3-Aktivität hervorgerufen werden oder zu denen durch eine anormale Mcm3-Aktivität beigetragen wird.
Die Bezeichnung "Behandlung", wie sie hier verwendet wird, soll die Heilung wie auch die Linderung von mindestens einem Symptom des Zustandes oder der Krankheit umfassen.
Monoklonale anti-Mcm3-Antikörper können durch Immunisierung eines geeigneten Versuchsobjektes mit einem Mcm3-Immunogen hergestellt werden. Eine geeignete immunogene Zubereitung kann z.B. rekombinant exprimiertes Mcm3-Protein oder ein chemisch synthetisiertes Mcm3-Polypeptid enthalten. Die Zubereitung kann weiter ein Adjuvans, wie komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, oder ähnliche immunstimulierende Wirkstoffe beinhalten. Die Immunisierung eines geeigneten Versuchsobjektes mit einer immunogenen Mcm3-Zubereitung induziert eine anti-Mcm3-Antikörper-Antwort.
Der anti-Mcm3-Antikörpertiter bei dem immunisierten Versuchsobjekt kann über die Zeit durch Standardtechniken, wie einem enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem Mcm3 überwacht werden. Wenn erwünscht, können die Antikörpermoleküle, die gegen Mcm3 gerichtet sind, aus dem Säugetier (z.B. aus dem Blut) isoliert werden und durch gut bekannte Techniken, wie Protein-A-Chromatographie, weiter gereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Zu einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z.B. wenn die Antikörpertiter am höchsten sind, können die Antikörper-produzierenden Zellen von dem Versuchsobjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale Antikörper durch Standardtechniken, wie die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Koehler und Milstein (1975) Nature 256: 495–497) (siehe auch Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539–46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980–83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. US.4 76: 2997-3 1 und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75) beschrieben wurde, die neuere menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4: 72), die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96) oder Triom-Techniken, herzustellen. Die Technologie für die Herstellung von monoklonalen Antikörper-Hybridomen ist gut bekannt (siehe im Allgemeinen R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A new Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N. Y. (1980); E. A.
Lerner (1981) Yale J: Biol. Med., 54: 387402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 23136). Kurz gefasst wird eine unsterbliche Zelllinie (typischerweise ein Myelom) an Lymphozyten (typischerweise Splenozyten) von einem Säugetier, das mit Mcm3-Immunogen, wie oben beschrieben, immunisiert wurde, fusioniert und die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomzellen werden gescreent, um ein Hybridom zu identifizieren, das einen monoklonalen Antikörper, der Mcm3 bindet, produziert.
Es kann irgendeines der vielen gut bekannten Protokolle, die für die Fusionierung von Lymphozyten und unsterblichen Zelllinien verwendet werden, für die Zwecke der Erzeugung von monoklonalen anti-Mcm3-Antikörpern angewendet werden (siehe z.B. G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., oben zitiert; Lerner, Yale J. Biol. Med, oben zitiert; Kenneth, Monoclonal Antibodies, oben zitiert). Darüber hinaus wird der normale Fachmann erkennen, dass es viele Variationen solcher Verfahren gibt, die auch nützlich sein würden. Typischerweise stammt die unsterbliche Zelllinie (z.B. eine Myelomzelllinie) von der gleichen Säugetierart wie die Lymphozyten. Es können z.B. Mäuse-Hybridome durch Fusionierung von Lymphozyten von einer Maus, die mit einer immunogenen Zubereitung der vorliegenden Erfindung immunisiert wurde, mit einer unsterblichen Maus-Zelllinie hergestellt werden. Unsterbliche Zelllinien sind Maus-Myelom-Zelllinien, die für Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium") enthält, sensibel sind. Es kann irgendeine Anzahl von Myelomzelllinien als Fusionspartner gemäß den Standardtechniken verwendet werden, z.B. die P3-NS l/l-Ag4-1; P3 × 63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14 Myelomlinien. Typischerweise werden HAT-sensible Maus-Myelomzellen an Maus-Splenozyten unter Verwendung von Polyethylenglykol ("PEG") fusioniert. Die Hybridomzellen, die aus der Fusion resultieren, werden dann unter Verwendung von HAT-Medium selektiert, was unfusionierte Myelomzellen tötet (unfusionierte Splenozyten sterben nach mehreren Tagen, da sie nicht transformiert sind). Es werden Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung produzieren, durch Screening der Hybridom-Kulturüberstände auf Antikörper, die Mcm3 binden, z.B. unter Verwendung eines Standard-ELISA-Assays, nachgewiesen.
Alternativ zu der Herstellung monoklonaler Antikörper sezernierender Hybridome kann ein monoklonaler anti-Mcm3-Antikörper identifiziert und durch Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulin-Bibliothek (z.B. einer Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek) mit Mcm3 isoliert werden, um dadurch Immunglobulin-Bibliotheksmitglieder zu isolieren, die Mcm3 binden. Kits für die Erzeugung und das Screening von Phagen-Dis play-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (z.B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog Nr. 27-9400-01 und das Stratagene Surf-ZAP^® Phage Display Kit, Katalog Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die besonders zugänglich für die Verwendung bei der Erzeugung und dem Screening einer Antikörper-Display-Bibliothek sind, z.B. bei Ladner et al. US-Patent Nr. 5,223,409; Kang et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18619; Dower et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17271; Winter et al., internationale PCT-Veröffentlichung WO 92/20791; Markland et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/15679; Breitling et al., internationale PCT-Veröffentlichung WO 93/01288; McCafferty et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/01047; Garrard et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/09690; Ladner et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370–1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81–85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275–1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725–734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889–896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624–628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576–3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373–1377; Hoogenboom et al. (1991) J\tUC. Acid Res. 19: 4133–4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978–7982 und McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552–554 gefunden werden.
Zusätzlich sind rekombinante anti-Mcm3-Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche wie auch nicht-menschliche Anteile umfassen, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardtechniken hergestellt werden können, innerhalb des Umfanges der Erfindung. Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch rekombinante DNA-Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden, z.B. unter Verwendung von Verfahren, die in Robinson et al., WO 87/02671 (internationale Anmeldung Nr. PCT/US86/02269); Akira, et al. europäische Patentanmeldung 184,187; Taniguchi, M., europäische Patentanmeldung 171,496; Morrison et al., europäische Patentanmeldung 173,494; Neuberger et al., internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533; Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,S67; Cabilly et al., europäische Patentanmeldung 12 S,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041–1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446–449 und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202–1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4: 214; Winter, US-Patent Nr. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534 und Seidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053–4060 beschrieben werden. Ein monoklonaler anti-Mcm3-Antikörper kann verwendet werden, um Mcm3 durch Standardtechniken, wie Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation, zu isolieren. Ein anti-Mcm3-Antikörper kann verwendet werden, um Mcm3-Protein nachzuweisen (z.B. in einem zellulären Lysat oder Zellüberstand), um die Menge und das Muster der Expression von Mcm3 zu beurteilen. Anti-Mcm3-Antikörper können diagnostisch verwendet werden, um Proteinspiegel in Gewebe als Teil eines klinischen Testvorgehens zu überwachen, z.B. um die Effizienz eines gegebenen Behandlungsregimes zu bestimmen. Der Nachweis kann durch Kopplung (sprich, physikalische Verbindung) des Antikörpers an eine nachweisbare Substanz erleichtert werden. Beispiele für nachweisbare Substanzen beinhalten verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme beinhalten Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, (-Galactosidase oder Acetylcholinesterase); Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe beinhalten Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien beinhalten Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszein-Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid, Cy-Farbstoffe, Alexa-Farbstoffe oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material beinhaltet Luminol; Beispiele für biolumineszierende Materialien beinhalten Luciferase, Luciferin und Aequorin und Beispiele für ein geeignetes radioaktives Material beinhalten ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
Bevorzugt können monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung mit der initialen Screening-Strategie, die weiter unten beschrieben wird, hergestellt werden. Da eine Vielzahl von vorbereiteten Hybridomen entweder nicht monospezifisch gegen Mcm3-Protein sind oder nur in immunbiochemischen Nachweissystemen, aber nicht in immunhistologischen Systemen und anders herum anwendbar sind, erfordert die initiale Untersuchung der erzeugten Hybridomzellen diese Strategie, um monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung herzustellen, die beide Eigenschaften aufweisen.
Für die Herstellung von genetisch veränderten und/oder synthetischen Antikörpern, die die Eigenschaften gemäß der Erfindung aufweisen, kann man z.B. von monoklonalen Antikörpern, die wie oben beschrieben erhalten werden, ausgehen. Dafür ist es passend, die Mcm3-Bindungsregionen der monoklonalen Antikörper zu analysieren und die Teile zu identifizieren, die notwendig und unnötig für den Nachweis, der oben beschrieben wird, sind. Dann können die notwendigen Teile modifiziert werden und die unnötigen Teile können vollständig oder teilweise eliminiert bzw. können durch Anteile, die weitere vorteilhafte Eigenschaften auf die Antikörper übertragen, ersetzt werden. Es können auch Anteile, die nicht innerhalb der Bindungsregionen der Antikörper liegen, modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die DNA-Rekombinationstechnologie für die obigen Maßnahmen geeignet ist.
Monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung zeichnen sich durch monospezifischen Nachweis von Mcm3 sowohl in biochemischen wie auch histologischen Nachweissystemen aus. Die Antikörper sind daher für den schnellen Nachweis einer Mcm3-Expression in sehr unterschiedlichen Proben geeignet.
In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Probe" alle Arten von Proben, die für den Zweck der Erfindung geeignet sind, abdecken. Beispiele für solche Proben sind Serum, Sputum, Urin, Liquor, Gewebe und Biopsien. Insbesondere kann die Probe eine Blutprobe oder eine gynäkologische Probe sein.
Aufgrund dieser Eigenschaften sind die Antikörper gemäß der Erfindung ausgezeichnet geeignet für die Anwendung bei diagnostischen Problemen, bei denen vergleichend die topologische Gewebeverteilungsanalyse, bestimmt z.B. durch Immunhistochemie mit quantitativen Expressionsparametern, z.B. durch Western-Blot oder Immunpräzipitation erhalten, analysiert werden soll.
Mit den Antikörpern gemäß der Erfindung kann der monospezifische Nachweis der Mcm3-Expression bei immunbiochemischen Nachweisverfahren, die eins nach dem anderen durchgeführt werden, wie ELISA, Western-Blot und Immunpräzipitation, wobei hier der Western-Blot vorgezogen wird, oder bei immunhistochemischen Geweben, vorzugsweise bei routinefixierten und in Paraffin eingebettetem Gewebe, zuverlässig durchgeführt werden. Dafür können die Antikörper gemäß der Erfindung markiert werden, wenn es angemessen ist, wie oben beschrieben, oder in Kombination mit markierten Antikörpern, die gegen sie oder andere Reagenzien gerichtet sind, verwendet werden.
Monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung können in vivo die Versammlung von DNA-Vorläufern inhibieren und können daher Zellproliferation inhibieren. So sind diese Antikörper oder die oben erwähnten Derivate derselben für die Therapie von Stadien einer Erkrankung geeignet, die von er höhter Zellproliferation begleitet werden. Beispiele für solche Erkrankungen sind Tumore, Allergien, Autoimmunerkrankungen, Narbenbildung, Entzündungen und rheumatische Erkrankungen wie auch die Unterdrückung von Abwehrreaktionen bei Transplantationen.
Für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Medikamentes können die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung allein oder in Verbindung mit gewöhnlichen Trägern, Adjuvantien und/oder Zusatzstoffen verwendet werden. Die Antikörper sind für die systemische, lokale, subkutane, intrathekale und topische Anwendung und für die Anwendung durch Einlauf geeignet. Dafür können sie aufgelöst in geeigneten Lösungsmitteln, vorzugsweise als wässrige Lösung, in der Form von Liposomen, als Emulsion oder im festen Zustand, z.B. als Pulver oder in der Form von Mikrokapseln, angewendet werden.
Alternativ kann ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung in einem kombinierten Behandlungsverfahren mit einem unterschiedlichen pharmazeutisch aktiven Wirkstoff verabreicht werden. Pharmazeutisch aktive Wirkstoffe, die mit den monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung formuliert werden können, oder alternativ in einem kombinierten Behandlungsverfahren verabreicht werden können, können z.B. Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen andere Antigene sein, so dass ein "Cocktail" bereitgestellt wird, der einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung und einen oder mehrere (monoklonale) Antikörper gegen andere Antigene, die in die Pathogenese des relevanten Erkrankungszustandes verwickelt sind, enthält.
Weitere aktive Wirkstoffe, die mit den monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung formuliert werden können oder alternativ in einem kombinierten Verhandlungsverfahren verabreicht werden können, insbesondere um einen therapeutisch nützlichen Effekt hervorzurufen, hängen von dem Erkrankungszustand, der geheilt werden soll, ab und sind z.B. kommerziell erhältliche Y-Globulin- und Immunglobulinprodukte, Antibiotika, antimikrobielle Produkte, antibakterielle und Anti-Tumor-Wirkstoffe oder eine Mischung von zweien oder mehr von ihnen.
Monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung können auf eine besonders vorteilhafte Weise bei der Therapie von Tumoren, die resistent gegen konventionelle Tumortherapeutika sind, nämlich als solche oder in Kombination mit anderen Therapeutika bzw. Therapieformen wie Bestrahlung, angewendet werden. Solche Resistenzen treten bei unspezifischen Zytostatika, wie Vinblastin oder Cisplatin entweder sekundär, sprich nach wiederholter An wendung, auf oder sie existieren primär bei bestimmten Tumoren, wie beim Karzinom der Nieren.
Die Dosierungen solcher Antikörper werden von dem Zustand, der behandelt werden soll, und dem Empfänger der Behandlung abhängen, aber sie werden in dem Bereich von 1 bis ungefähr 100 mg für einen erwachsenen Patienten, vorzugsweise 1 bis 10 mg, gewöhnlich täglich für einen bestimmten Zeitraum verabreicht, liegen. Ein zweiteiliges Dosierungsregime kann bevorzugt werden, worin 1 bis 5 mg verabreicht werden.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsart wird der Nachweis von Mcm3 in Kombination mit dem Nachweis der Proteine Ki-67 und p27 durchgeführt.
Eines der am meisten zitierten Zellzyklus-assoziierten Proteine, das für die histopathologische Diagnostik innerhalb der letzten 16 Jahre verwendet wurde, ist das Ki-67-Protein (Scholzen T und Gerdes J (2000) J Cell Physiol 182: 311–322; Gerdes J, Schwab U, Lemke H und Stein H (1983). Int. J. Cancer 31, 13–20). Das Ki-67-Protein wird in proliferierenden Zellen exprimiert, aber verschwindet schnell, wenn die Zelle in ein Ruhestadium eintritt (Baisch, H. und Gerdes, J (1987). Cell Tissue Kinet. 20(4), 387–391). Klinische Studien haben gezeigt, dass das Ki-67-Antigen ein unabhängiger prognostischer Marker bei vielen verschiedenen menschlichen Neoplasmen ist, z.B. Brustkrebs (Jansen RL, Hupperets PS, Arends JW, Joosten-Achjanie SR, Volovics A, Schouten HC und Hillen HF (1998). Br. J. Cancer, 78: 460–465), Weichteilsarkom, Meningeomen (Perry A, Stafford SL, Scheithauer BW, Suman VJ und Lohse CM (1998). Cancer 82: 2262–2269), Prostatakrebs (Mashal RD, Lester S, Corless C, Richie JP, Chandra R, Propert KJ und Dutta A (1996) Cancer Res 56(18): 4159–63) und Non-Hodgkin-Lymphom (Gerdes et al. (1984), J. Immunol. 133: 1710–1715).
Das Protein p27 gehört zu der Familie von cyclinabhängigen Kinase-Inhibitoren (CDKI), die die Zellzyklusprogression durch Bindung und Inaktivierung von cyclinabhängigen Kinasekomplexen an definierten Kontrollpunkten innerhalb des Zellzyklus regulieren (Toyoshima H und Hunter T (1994) Cell 78(1): 67–74). Die Expression von p27 dient als ein stabiler Marker für die Differenzierung in sich normal entwickelndem Gewebe und auch bei Tumoren, die unreguliertes Wachstum zeigen (Lloyd RV, Jin L, Qian X und Kulig E (1997) Am J Path 150: 401–407, Zhang P, Wong C, DePinho RA, Harper JW und Elledge SJ (1998) Genes Dev 12(20): 3162–3167).
Die Durchführung kombinierter Färbung von Geweben mit simultanem Nachweis der drei Proteine erlaubt eine detailliertere Beurteilung von Zellproliferation und Differenzierungsprozessen, die das individuelle Tumorwachstum bestimmen. Mcm3-Protein wird in Zellen exprimiert, die aufgehört haben zu proliferieren, die aber nicht entsprechend der Abwesenheit der p27-Proteinexpression endgültig differenziert sind, während Ki-67 nur in proliferierenden Zellen exprimiert wird. p27 kann in ruhenden Zellen, aber nicht in proliferierenden Zellen gefunden werden. Ki-67, Mcm3 und p27 stellen einen Satz an Parametern bereit, die komplementäre biologische Eigenschaften definieren, die für eine detaillierte Charakterisierung von ungeordnetem Zellwachstum und Tumorgenese geeignet sind. Die Tumordiagnostik kann auch von einer kombinierten Beurteilung dieser Marker profitieren, was eine Hilfe bei der Auswahl des am besten geeigneten Therapiekonzeptes für einen individuellen Patienten sein kann.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung.
Es wurden Mäuse für die Immunisierung verwendet. Rekombinantes menschliches Mcm3-Protein wurde als Antigen verwendet.
Aufzeichnung der Immunisierung und Fusion
Tag 1: Es wurden 100 μg Mcm3-Protein in 100 μl PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vollständig und gründlich mit 100 μl Freundschem Adjuvans gemischt und darauffolgend in eine Maus injiziert.
Tag 14: Es wurden 50 μg Mcm3-Protein in 100 μl PBS vollständig und gründlich mit 100 μl Freundschem Adjuvans gemischt und darauffolgend in eine Maus injiziert.
Tag 21: Es wurden 50 μg Mcm3-Protein in 100 μl PBS vollständig und gründlich mit 100 μl Freundschem Adjuvans gemischt und darauffolgend in eine Maus injiziert.
Tag 37: Es wurden 50 μg Mcm3-Protein in 100 μl PBS vollständig und gründlich mit 100 μl Freundschem Adjuvans gemischt und darauffolgend in eine Maus injiziert.
Am Tag 39 wurde die Maus schmerzlos getötet. Es wurden Milzzellen entfernt und mit Myelomzellen fusioniert. Man erhielt Hybridome, die vollständig ausgewachsen waren.
Screening des Hybridomdiberstandes und Klonierung
Als erstes wurden die Überstände des Hybridoms, das vollständig ausgewachsen war, in einem Spot-Blot-Assay getestet. Dafür wurde 1 ml rekombi nantes menschliches Mcm3 in PBS (2 ng/ml) auf Stücke einer Nitrozellulosemembran von 1 cm × 0,5 cm Größe platziert. Diese Stücke wurden in eine Platte mit 48 Vertiefungen platziert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Darauffolgende wurde die Inkubation mit Blockierungspuffer (PBS, 0,005 Tween 20, 4% Gelatine) für 45 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach mehreren Waschschritten mit PBS (0,05% Tween 20, 0,5% Gelatine) wurde die Inkubation mit dem Hybridomüberstand für 60 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach mehreren Waschschritten mit PBS (0,05% Tween 20, 0,5% Gelatine) wurde ein kommerziell erhältlicher Phosphatasegekoppelter Ziegen-anti-Maus-Antikörper, Dianova, Hamburg (Verdünnung gemäß der Anleitung des Herstellers 1:10.000) zugegeben. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit PBS (0,05% Tween 20, 0,5% Gelatine) wurde die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit der Entwicklerlösung (36 mM 5'-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat; 400 mM Nitro-Blau-Tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) für 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.
Der Hybridomüberstand, der in dem Spot-Blot positiv getestet wurde, wurde darauffolgend immunhistologisch getestet. Dafür wurden Paraffinschnitte, z.B. Tonsille, gemäß den Standard-Vorgehensweisen dehydriert (2 × 100% Xylen, 2 × 100% EtOH, 2 × 70% EtOH, 2 × 40% EtOH), gefolgt von kurzem Waschen in Wasser. Die Schnitte wurden dann in Citratpuffer, pH 6 (2,1 g Zitronensäuremonohydrat für 1 1, eingestellt mit 2 N NaOH auf pH 6) in einem Druckkochtopf für 1 bis 5 Minuten gekocht. Nach Öffnung des Kochtopfes wurden die Schnitte sofort in kaltem (RT) TBS gewaschen, gefolgt von Inkubation mit Hybridomüberstand in einer feuchten Kammer für 30 Minuten. Nach mehrfachem Waschen in TBS wurden die Antikörper, die an die Schnitte gebunden waren, mit Hilfe des indirekten Immunperoxidase-Verfahrens nachgewiesen, mit Hämalaun gefärbt, eingebettet und mikroskopisch beurteilt.
Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt das folgende Färbungsmuster. Der Antikörper reagiert vorwiegend mit den Kernen von Zellen in proliferativen Regionen, was durch die Tatsache angezeigt wird, dass Zellen der dunklen Zone innerhalb der germinalen Zentren von menschlichen Tonsillen positiv für Mcm3 gefärbt werden. Ebenso reagieren Zellen nahe der basalen Schicht der normalen Mukosa mit dem spezifischen Mcm3-Antikörper. Es sollte beachtet werden, dass Mcm3-Färbung auch in der intermediären und oberen Schicht gesehen wurde, die zu dem nicht-proliferativen Zellkompartiment der oralen Mukosa gehören.
Hybridome, die sowohl in dem Spot-Blot wie auch bei der Immunhistologie positiv waren, wurden geklont und wieder geklont, bis sie monoklonal waren. Es wurden unabhängige monoklonale Antikörper erhalten. Es wurde eine Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung erzeugt, bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig unter der Nummer DSM ACC2388 am 16. Februar 1999 hinterlegt.
Beispiel 2
Western-Blot-Analyse von Zelllysaten mit einem polyklonalen Anti-Mcm3-Kaninchen-Antikörper und einem monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung.
Zelllysate der Zelllinie HELA (H) und CHO (C) wurden auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgebracht. Die in dem Gel getrennten Proteine wurden auf eine Nitrocellulosemembran in einer Nass-Blotting-Kammer über Nacht übertragen. Diese Membran wurde dann mit einem verdünnten Anti-Mcm3-Kaninchen-Antiserum (Hu, B., et al., Nucleic Acid Res., 1993, 21: 5289–5293) (0,15 μg/ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten mit PBS (0,05% Tween 20, 0,5% Gelatine) wurde ein kommerziell erhältlicher phosphatasegekoppelter Ziegen-Kaninchen-Antikörper (Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers, Dianova, Hamburg 1:10.000) zugegeben. Nach Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur und nochmaligem Waschen in TNT-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 0,05% Tween 20) wurde der Nachweis mit dem Chemilumineszenzverfahren mit dem ECL-System (Amersham Life Science, Braunschweig) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Wie in 1 festgestellt werden kann, stellte sich heraus, dass der polyklonale Anti-Mcm3-Kaninchen-Antikörper neben der erwarteten prominenten Hauptproteinbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 105 kDa weitere Proteine in dem Molekulargewichtsbereich zwischen 50 kDa und 90 kDa zeigte.
Der monoklonale Anti-Mcm3-Antikörper gemäß der Erfindung zeigte nur die erwartete Proteinbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 105 kDa.
Weiter zeigt der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in immunhistochemischen Studien seine Nützlichkeit für den Nachweis von Mcm3.
Beispiel 3
Immunpräzipitation mit Anti-Mcm3-Antikörpern gemäß der Erfindung
1 μg primärer Anti-Mcm3-Antikörper wird zu 10 μl Dynabeads (Dynal M280 Schaf-anti-Maus, Dynal, Hamburg) zugegeben und für 30 Minuten bei 4°C unter Rollen inkubiert.
Zellzubereitungen (1 × 106 Zellen) werden in Immunpräzipitationspuffer (18 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0,3% Hexadecylmethyl-Ammoniumbromid, 5 mM EDTA und 1 mM DTT), umfassend Proteaseinhibitoren, aufgenommen, für 5 Minuten gekocht, auf Eis gekühlt und zentrifugiert (5 Minuten, 14.000 Upm). Die überschüssige Flüssigkeit wird zu dem Komplex von Dynabeads/primären Antikörpern zugegeben und bei 4°C für 30 Minuten in einem Roller inkubiert.
Dann wird die Röhre für 20 Sekunden in einen magnetischen Dynal-Konzentrator platziert und die überschüssige Flüssigkeit wird entfernt. Die magnetischen Kügelchen werden erneut in 500 μl NET (Tris/HCl 18 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM) suspendiert, wieder in den magnetischen Konzentrator platziert und der Überstand wird nach 20 Sekunden entfernt. Auf diese Weise werden die Kügelchen mehrfach gewaschen.
Das so gereinigte Mcm3 kann dann mit Hilfe von SDS-PAGE analysiert werden.
Beispiel 4
Mikroinjektion von Anti-Mcm3-Antikörpern gemäß der Erfindung in Kerne von permanenten Zelllinenzellen.
HEp-2 wurden auf CELLocate^®-Deckgläsern für Mikroinjektion kultiviert und in der logarithmischen Wachstumsperiode verwendet. Es wurden Anti-Mcm3-Antikörper gemäß der Erfindung bzw. ein irrelevanter Kontroll-Antikörper mit einem Transjektor und Mikromanipulator in die Zellkerne unter Lichtmikroskopkontrolle mikroinjiziert (Injektionsdruck 130 hPa; Injektionszeit zwischen 0,3 und 0,5 Sekunden). Die injizierten Zellen wurden dann mit Bromdesoxyuridin (BrdU), das (0,1 mM) Medium enthielt, für 6 Stunden kultiviert. Nach Fixierung (5 Minuten 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur) wurden die Deckgläser dreimal in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen, in 100% EtOH für 10 Minuten bei –20°C inkubiert, gefolgt von Permeation der anhängenden Zellen durch direkten Transfer in 0,1% Triton X-100 TBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Die injizierten Antikörper wurden dann mit einem kommerziell erhältlichen Cy3-gekoppelten Ziegen-anti-Maus-Antikörper, Dianova, Hamburg, nachgewiesen (Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers in PBS/10% Rinderserumalbumin). Die Zubereitungen wurden zuerst in 2 M HCl für 60 Minuten bei 37°C für den Nachweis von BrdU, fixiert in den Zellen, inkubiert. Darauffolgend wurden die Zubereitungen zuerst mehrere Male mit destilliertem Wasser, dann zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde die Inkubation mit einem kommerziell erhältlichen FITC-markierten Anti-BrdU-Antikörper, Boehringer Mannheim, Mannheim, (Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers) über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer durchgeführt. Dann wurden die Zubereitungen gründlich fünfmal in PBS für 10 Minuten gewaschen, mit DABCO (1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan) in 90% Glycerol bedeckt und durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt.
Es stellte sich heraus, dass fast alle Zellen, die mit den Kontroll-Antikörpern injiziert wurden, auch BrdU eingeschlossen hatten, daher während des Experimentes den normalen Zellzyklus durchlaufen hatten. Im Gegensatz dazu schlossen nur zwischen 20% bis 50% der Zellen, denen Anti-Mcm3-Antikörper gemäß der Erfindung injiziert wurden, BrdU ein. Die Proliferation dieser Zellen wurde daher durch die Antikörper gemäß der Erfindung inhibiert.
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Claims

Monoklonaler Antikörper, der zu einer spezifischen Bindung an menschliches Mcm3 fähig ist, worin der monoklonale Antikörper mit demselben Epitop von menschlichem Mcm3 reagiert wie der monoklonale Antikörper, der von einer Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnr. DSM ACC2388 erhältlich ist.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, der sowohl immunhistologisch als auch immunbiochemisch zur Bindung an menschliches Mcm3 fähig ist.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um einen rekombinanten, chimeren, humanisierten, synthetisch oder genetisch veränderten Antikörper handelt.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, der mit einer nachweisbaren Substanz markiert ist.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 4, worin die nachweisbare Substanz eine fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder lumineszierende Markierung umfaßt.
Monoklonaler Antikörper gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, der durch eine Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnr. DSM ACC2388 erzeugt wird.
Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der vorstehenden Ansprüche exprimiert.
Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnr. DSM ACC2388.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Nachweis von menschlichem Mcm3 in vitro.
Verwendung gemäß Anspruch 9 für den immunhistologischen, immunzytologischen oder immunbiochemischen Nachweis von menschlichem Mcm3 in einer Probe.
Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Serum, einer Blutprobe, Sputum, Urin, Liquor, einem Gewebe, einer Biopsie, einer gynäkologischen Probe und einer feinen Nadelaspiration.
Verwendung gemäß Anspruch 9, 10 oder 11, worin das menschliche Mcm3 durch ein Verfahren nachgewiesen wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ELISA, RIA, Western-Blot, Far Western-Blot, Immunpräzipitation, Affinitätschromatographie, FACS und Bindung an magnetische Kügelchen.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für den Nachweis einer proliferierenden Zelle in vitro, weiterhin umfassend den Nachweis von Ki-67 und p27.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 für den Nachweis einer Krebszelle oder einer neoplastischen Zelle in vitro.
Verwendung gemäß Anspruch 13 oder 14, umfassend irgendeines der Merkmale wie ausgeführt in den Ansprüchen 11 oder 12.
Verfahren zur Erzeugung eines Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 exprimieren kann, umfassend das Immortalisieren eines Lymphozyten, erhalten von einem Tier, immunisiert mit menschlichem Mcm3, zur Erzeugung eines Hybridoms und Selektieren eines Hybridoms, das den Antikörper exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin ein Hybridom selektiert wird, das einen monoklonalen Antikörper exprimiert, der sowohl immunbiochemisch als auch immunhistochemisch mit menschlichem Mcm3 reagieren kann.
Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Expression des Antikörpers von einem Hybridom, erhalten durch ein Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Reinigung von menschlichem Mcm3.
Verwendung gemäß Anspruch 19, umfassend die Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Adjuvans oder Additiv.
Monoklonaler Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in einem Diagnose- oder einem Therapieverfahren einer Erkrankung.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung einer Erkrankung.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 23 für eine Verwendung wie darin angegeben oder eine Verwendung gemäß Anspruch 24, worin die Erkrankung eine solche ist, die durch eine Aktivität oder ein Niveau einer Mcm3-Expression ausgelöst wird oder wobei dieselben dazu beitragen.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 23 oder 25 für eine darin definierte Verwendung oder eine Verwendung gemäß Anspruch 24 oder 25, worin die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Tumoren, Allergien, Auto-Immunopathien, Narbenbildung, Entzündungen und rheumatischen Erkrankungen wie auch die Unterdrückung von Verteidigungsreaktionen bei Transplantationen.
Diagnosekit, umfassend einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, zusammen mit einem Mittel, das zum Nachweis von Ki-67 fähig ist, und einem Mittel, das zum Nachweis von p27 fähig ist.
In vitro Verfahren, eine Zelle gegenüber einem monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 auszusetzen, um den Zellzyklus, die DNA-Replikation und/oder die Proliferation durch die Zelle zu unterbrechen oder zu verhindern.