JPH04293497A

JPH04293497A - 生菌数測定・菌種同定システム

Info

Publication number: JPH04293497A
Application number: JP3084739A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Hasegawa; 長谷川　秀行; Takao Kutsuno; 久津野　孝夫; Rika Kasuga; 春日　里佳; Shinpei Suzuki; 鈴木　新平; Fukuo Iwatani; 岩谷　福雄; Isao Endo; 遠藤　勲; Teruyuki Nagamune; 輝行長棟; Hajime Asama; 浅間　一; Yoshimi Benno; 義己辨野
Original assignee: Research Development Corp of Japan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Hitachi Electronics Engineering Co Ltd
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 1991-03-25
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 1992-10-19
Anticipated expiration: 2014-10-04
Also published as: JP2957301B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生菌数の測定ならびに菌
種同定方法および該方法を実施するのに使用される装置
に関する。更に詳細には、本発明は、特定の選択培地を
用いて検体中の、大腸菌、サルモネラ菌および黄色ブド
ウ球菌からなる群から選択される特定の菌のみを増殖さ
せ、該菌の培養物から発せられる蛍光を捕捉することか
らなる生菌数の測定および菌種の同定方法と装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物種の同定は、バージー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ）のマニュアルなどに従い、培養物の形態学
的および生理学的性質を調べることにより行われている
。一方、生菌数はサンプル（検体）を１０−１，１０−
２，・・・，１０−ｎ倍に等倍希釈し、この希釈液の一
定量を寒天平板培地上に塗抹接種し、一定時間（例えば
、２４〜４８時間）培養した後、この寒天平板上に出現
したコロニー数に希釈倍率を乗じることにより求められ
ていた。

【０００３】しかし、このような全くの手作業による微
生物検査法では、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟
練技術とを必要とし、また、技術者あるいは検査員によ
る測定差が生じることも知られている。更に、大量の培
地およびシャーレの使用および熟練技術者の高い人件費
のため、検査に要する費用も非常に高いものになってい
る。

【０００４】微生物種の同定、生菌数の測定などの微生
物検査は、臨床検査、食品検査、医薬品検査などの部門
で必須であり、迅速化、省人化、自動化に対するニーズ
は高い。特に、臨床検査部門では各種の自動化機器の開
発が行われている。例えば、５０ｒｐｍ　で回転してい
る寒天平板培地に、サンプル液を中心から外側に向かっ
て塗抹するプレータ、塗抹された寒天培地を培養し、コ
ロニーの形成された平板培地をＨｅ−Ｎｅ　レーザでコ
ロニー計数するスパイラルシステム社のスパイラルシス
テム、各種の基質が入ったカートリッジを用い、比色法
で微生物種の同定、比濁吸光法による薬剤感受性試験を
自動で行えるＡｕｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｃ　Ｓｙｓｔｅ
ｍ，　ＭＳ−ＩＩ，　Ａｖａｎｔａｇｅ　などのシステ
ム、カートリッジの代わりにマイクロプレートを用いた
ダイナテック社のＭＩＣ−２０００システムなどが、ア
メリカを中心に開発されている。

【０００５】しかし、これらの機器の大部分は尿路感染
などの微生物検査に用いられているに過ぎず、食品検査
のようなサンプルが混濁物であることが多い場合には測
定が不可能であり、また、十分な精度が得られなかった
。更に、何れの方法も、２４〜４８時間の培養時間を必
要とするので、迅速測定が困難である。このため、現場
の切実なニーズに十分応えられる段階には達していない
。また、これらの自動機器、測定方法に関する研究は、
臨床医学分野、医用工学分野などで盛んに行われている
が、実用化されているものは極めて少ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、広範な分野で使用でき、高精度で、しかも、低コス
トで、更に検査時間が数時間程度で済む、生菌数測定・
菌種同定方法および該方法の実施に使用する装置を提供
することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明では、選択培地で微生物を培養し、該培養物
に励起光を照射し、該培養物からの蛍光の強度を測定し
、既知の微生物種について予め作成された生菌数と該菌
数に対応する蛍光強度との検量線に前記測定値を当ては
めることからなる生菌数の測定および該菌の同定方法を
提供する。本発明の対象となる微生物は、大腸菌、サル
モネラ菌および黄色ブドウ球菌に限られる。また、被測
定微生物を含む検体を複数の段階に希釈し、蛍光プロー
ブを添加する装置と、培養前および培養後の検体に励起
光を照射し、該検体から発せられる蛍光の強度を測定す
る蛍光測定装置と、既知の微生物種について予め作成さ
れた生菌数と該菌数に対応する蛍光強度との検量線がデ
ータベースとして記憶された外部記憶装置と、前記蛍光
測定装置による検出値に基づき外部記憶装置のデータベ
ースを検索、参照しデータ処理を行うと共に、希釈・プ
ローブ添加装置および蛍光測定装置を制御する装置とか
らなる生菌数測定・菌種同定システムも提供する。蛍光
測定装置は、少なくとも、励起光を発生する発光手段と
；励起光を被測定物に照射する手段と；被測定物から発
生される蛍光を受光する手段と；蛍光と共に進入してく
る迷光励起光をカットするバンドパスフィルタと；前記
バンドパスフィルタを通過した蛍光を捕捉する光電子増
倍管とを有する。蛍光を受光する手段は例えば、光ファ
イバである。

【０００８】

【作用】前記のように、本発明の方法では大腸菌、サル
モネラ菌および黄色ブドウ球菌に特化して、その生菌数
および菌種の同定を行う。下記で詳細に説明する特定の
選択培地を使用し、前記菌類を含有すると思われる検体
を培養すると、各菌により生育するものと、しないもの
とが現れる。従って、その培地の種類により生育した微
生物種、すなわち、検体中に存在している微生物種を同
定することができる。

【０００９】微生物種と培地との組み合わせは予め既知
なので、この培地で該当微生物を標準的な手法により培
養し、公知の確立された方法により各培養時間毎の生菌
数を計数し、同時に、該菌数に対応する蛍光強度を測定
し、検量線を作成し、データベースとして保存する。未
知検体を選択培地で培養し、生育するものがあれば、そ
の培地の種類から菌種は容易に同定できる。それと共に
、所定の培養時間時点における蛍光強度を該当する培地
／微生物のデータベースと照合すれば、その微生物の生
菌数が即座に求められる。

【００１０】蛍光受光手段として光ファイバーを使用す
ると、従来のダイクロイックミラーに比べて、微弱な蛍
光もキャッチすることができ、測定感度が増大する。

【００１１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。本発明の方法の特徴はその選択培地の使用にある
。前記のように、本発明の方法は大腸菌、サルモネラ菌
および黄色ブドウ球菌に特化して用いられるが、大腸菌
およびサルモネラ菌だけを選択的に生育させることがで
きる培地は例えば、下記の組成を有する。　　Ｋ２　ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　７　　　　
ｇ／ｌ，ＫＨ２　ＰＯ４　　　　　　　　　３　　　　
ｇ／ｌ，　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．１ｇ／
ｌ，（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　０．１ｇ／ｌ，　　
トリプチカーセ　　　　　　　　１　　　　ｇ／ｌ，グ
ルコース　　　　　　　　　　２　　　　ｇ／ｌ，この
培地をＡ培地と呼ぶ。この培地では大腸菌とサルモネラ
菌だけが選択的に生育する。従って、この培地に検体を
接種し、培養して、コロニーが出現すれば、それは大腸
菌およびサルモネラ菌によるものと推定できる。

【００１２】また、サルモネラ菌だけを選択的に生育さ
せることのできる培地は例えば、下記の組成を有する。　　Ｋ２　ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　７　　　　
ｇ／ｌ，ＫＨ２　ＰＯ４　　　　　　　　　３　　　　
ｇ／ｌ，　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．１ｇ／
ｌ，（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　０．１ｇ／ｌ，　　
トリプチカーセ　　　　　　　　１　　　　ｇ／ｌ，グ
ルコース　　　　　　　　　　２　　　　ｇ／ｌ，　　
ノボビオシン　　　　　　　　　　　　適量この培地を
Ｂ培地と呼ぶ。この培地は前記のＡ培地にノボビオシン
を添加配合したものである。ノボビオシンはマクロライ
ド系抗生物質であり、例えば、米国のアップジョン社か
ら“アルバマイシン”の登録商標名で市販されている。Ａ培地自体は大腸菌とサルモネラ菌用の選択培地である
が、これにノボビオシンが加わることにより、大腸菌は
生育せず、サルモネラ菌だけが選択的に生育する。従っ
て、この培地に検体を接種し、培養して、コロニーが出
現すれば、それはサルモネラ菌によるものと推定できる
。ノボビオシンの添加量は一般的に、５μｇ／ｍｌ〜３
０μｇ／ｍｌ、好ましくは、１０μｇ／ｍｌ〜２０μｇ
／ｍｌ、最も好ましくは、１５μｇ／ｍｌである。

【００１３】黄色ブドウ球菌だけを選択的に生育させる
ことのできる培地は例えば、下記の組成を有する。　　トリプチカーセ　　　　　　　　２．５ｇ／ｌ，フ
ィトン　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／ｌ，　　Ｎ
ａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　５　　　　ｇ／ｌ
，Ｔｗｅｅｎ　　８０　　　　１．０ｇ／ｌ，　　アズ
レオナム　　　　　　０．２５μｇ／ｍｌこの培地をＣ
培地と呼ぶ。アズレオナムは米国スクイブ社で開発され
た“モノバクタム”系抗生物質であり、大腸菌およびサ
ルモネラ菌に対して特異的な活性を示すが、黄色ブドウ
球菌に対しては殆ど活性を持たない。従って、この培地
に検体を接種し、培養して、コロニーが出現すれば、そ
れは黄色ブドウ球菌によるものと推定できる。

【００１４】通常市販されている選択培地の蛍光強度は
極めて強いので、本発明の方法により培養物の蛍光強度
変化を捉えることは極めて困難であるか、または不可能
である。培地成分中、肉エキス、ペプトン、酵母エキス
等は蛍光強度が極めて強い。しかし、これらの成分は一
般的に、微生物の生長に欠くことのできない栄養成分で
ある。本発明者らの研究によれば、大腸菌およびサルモ
ネラ菌の栄養要求度は高くないので、これらを除いても
生育することが確認された。従って、前記の大腸菌およ
びサルモネラ菌用のＡ培地は実質的に無蛍光培地である
と言うことができる。

【００１５】一方、黄色ブドウ球菌の場合、培養物だけ
からの蛍光では十分な測定ができないので、培養物にＡ
０−１０ドデシルブロマイドと呼ばれる蛍光標識を添加
し、蛍光強度を測定する。添加されたＡ０−１０ドデシ
ルブロマイドは黄色ブドウ球菌と特異的に結合し、菌数
に応じた蛍光強度を示す。すなわち、Ａ０−１０ドデシ
ルブロマイド自体は蛍光を発せず、黄色ブドウ球菌と結
合した場合にだけ蛍光を発するので本発明の方法におけ
る蛍光標識として使用できる。

【００１６】次に、図面を参照しながら本発明を更に詳
細に説明する。図１は本発明の方法を実施するのに使用
されるマイクロプレート１の一例の模式的平面図である
。プレート自体の材質は特に限定されないが、励起光の
散乱が極力少なく、蛍光の発生および受光を阻害しない
ような材質ならば全て使用できる。例えば、透明ポリカ
ーボネートなどが使用できる。しかし、これに限定され
ないことは当然である。図示されているプレートは９６
穴のものである。穴の使用態様は特に限定されない。一例として、図示されているように、１２列の内、第１
列目と第７列目に菌液または検体を入れ、第２列目から
第６列目まで、および第８列目から第１２列目までを段
階希釈用として使用する。この例では、第１列目から第
６列目までを対照用（例えば、培養前の蛍光のバックグ
ラウンド値を測定するためのもの）として使用し、第７
列目以降を培養後の蛍光測定に使用する。Ａ行からＨ行
までは同一の菌あるいは培地をいれることもできるし、
Ａ〜Ｄ行とＥ〜Ｈ行に２分割し前記の各培地を入れるこ
ともできる。このような穴の具体的使用態様は当業者に
は周知であり、これ以上の説明は特に必要ないであろう
。

【００１７】次に、図２を参照しながら本発明の方法を
実施する際の一連の手順を説明する。先ず始めに、図１
に示されたようなマイクロプレート１を準備し、培地分
注ゾーン２で、プレートの所定の穴に所定の選択培地を
分注する。分注は手作業でも、自動機械でもいずれによ
っても実施できることは当業者に周知である。次に、菌
液分注ゾーン３で、検体（固体または液体）または菌液
を市販のブレンダーまたはストマッカーなどにより調整
／乳状化し、前記のようにプレートの第１列目と第７列
目に分注する。この分注も手作業あるいは自動機械によ
り行うことができる。ただし、特に限定されるわけでは
ないが、培地分注と菌液分注は本発明の自動生菌数測定
・菌種同定システムには組み込まれていない。従って、
本発明のシステムを使用する者が前処理として行うべき
ものである。

【００１８】その後、このプレート１は本発明のシステ
ムの段階希釈・蛍光プローブ添加装置４にローデイング
される。ここで、第１列目と第７列目の菌液を例えば、
１０μｌをそれぞれ自動的に採取し、２列目と８列目の
穴にそれぞれ注入する。次に、この２列目と８列目の穴
からそれぞれ１０μｌ量を自動的に採取し、３列目と９
列目の穴にそれぞれ注入する。以後、これを６列目と１
２列目まで順に繰り返す。そうすると、１００　，１０
−１，１０−２，１０−３，１０−４，１０−５，１０
−６の７段階の希釈列が得られる。本発明者らが実験し
たところでは、１０−６以上の希釈はコロニーの発生が
見られず、無意味であることが確認された。

【００１９】段階希釈が完了したら、プレートの対照側
の全ての穴にのみＡＯ−１０ドデシルブロマイドプロー
ブ液を分注する。前記のように、ＡＯ−１０ドデシルブ
ロマイドプローブは黄色ブドウ球菌に対してのみ特異的
であるが、バックグラウンド値の正確を期するために、
大腸菌およびサルモネラ菌の場合にも使用することが好
ましい。

【００２０】プレートの対照側の穴にプローブ液を分注
したら、このプレートを蛍光測定装置５に移送する。こ
こで、培養前の蛍光強度を測定し、バックグラウンド値
として、データ処理・制御装置６の外部記憶装置に記憶
させる。その後、このプレートをインキュベータ７に移
し、所定時間にわたって所定条件の下で培養する。培養
後、プレートを再び蛍光プローブ添加装置に戻し、ここ
で、プレートの培養側の全ての穴にＡＯ−１０ドデシル
ブロマイドプローブ液を分注する。菌とプローブとの結
合反応を確実に行わせるために、プローブ分注後、数分
間〜１０分間程度プレートを放置する。その後、蛍光測
定装置でプレートの培養側の蛍光強度を測定し、測定結
果をデータ処理・制御装置６の外部記憶装置に伝達する
。ここで培養後の蛍光強度から培養前のバックグラウン
ド値を引き算すると、真の蛍光強度が求められる。この
引き算の結果を外部記憶装置内のデータベースと照合す
ることにより菌種および生菌数が決定される。

【００２１】前記の処理手順を図３にフローチャートと
して示す。培地分注と菌液分注の前処理１０を経て、段
階希釈・プローブ分注１１に入る。次いで、初期蛍光強
度測定１２を行う。測定値はライン１３でデータ処理・
制御装置１４に伝達される。初期蛍光強度測定後、培養
１４を行う。培養後、１１に戻り、再びプローブ分注を
行う。その後、培養後蛍光強度測定１５を行う。測定値
はライン１６でデータ処理・制御装置１４に伝達される
。データ処理・制御装置１４は外部記憶装置としてデー
タベース１７を有する。伝達された測定蛍光値をデータ
ベースと照合し、菌数・菌種を決定し１８で出力する。

【００２２】図４に本発明の生菌数測定・菌種同定シス
テム２０の模式的構成を示す。本発明のシステムは前記
のように、基本的には段階希釈・蛍光プローブ添加装置
４と蛍光測定装置５とデータ処理・制御装置６から構成
されている。特に排除するわけではないが、インキュベ
ータは７は一般的に、本発明のシステム２０には含まれ
ない。すなわち、本発明のシステム２０を使用する者が
自ら準備するべきものとしている。図示された態様では
段階希釈・蛍光プローブ添加装置４と蛍光測定装置５と
があたかも別個の分離した装置のようになっているが、
両者を結合して単一のシステムとして構成できることは
当業者に自明である。図中、白抜太矢線Ｉ　〜ＩＶはプ
レートの搬送方向を示すが、Ｉ　およびＩＶについては
システム内で自動ハンドリング機構（図示されていない
）により行うことができる。ＩＩおよびＩＩＩは手作業
になる。

【００２３】段階希釈・蛍光プローブ添加装置４の具体
的装置構成自体は特に限定されない。段階希釈・蛍光プ
ローブ添加の所期の目的を達成できるような装置構成で
あればよい。一例として、図示されているように、Ｘ−
Ｙ−Ｚ−Ｚ´軸移動機構２２を使用し、Ｚ´軸に４連チ
ップ分注機構２４を配設し、プローブ液槽２６を設ける
ことができる。また、図示されていないが、チップは使
い捨てなので、チップ供給・廃棄機構も配設することが
できる。段階希釈・蛍光プローブ添加装置は密閉ボック
ス内に収容し、ＵＶ（紫外線）殺菌ランプ２８によりボ
ックス内を無菌状態に維持することが好ましい。

【００２４】蛍光測定装置５の具体的装置構成自体も特
に限定されない。しかし、本発明のシステム２０では、
下記の図５に示すような光学系を有する測定装置を使用
することが好ましい。図示された蛍光測定装置５は例え
ば、光学系ユニット３０とプレートを移動させるための
Ｘ−Ｙテーブル３２を有する。この図示された光学系ユ
ニット３０の特徴は、下記で詳細に説明するが、ホルダ
３４に保持された光ファイバー３６で蛍光を受光するこ
とである。蛍光測定装置も密閉ボックス内に収容し、Ｕ
Ｖ（紫外線）殺菌ランプ２８によりボックス内を無菌状
態に維持することが好ましい。また、前記のように、段
階希釈・蛍光プローブ添加装置４と蛍光測定装置５を一
つの密閉ボックス内に収容することもできる。

【００２５】本発明のシステム２０では、段階希釈・蛍
光プローブ添加装置４と蛍光測定装置５はデータ処理・
制御装置６と結ばれている。必要に応じて、拡張スロッ
トボックス４０を介して結ぶこともできる。装置４と装
置５が、このデータ処理・制御装置６内に予めプログラ
ムされた手順に従って動作するように、データ処理・制
御装置６は装置４と装置５のコントローラの機能も果た
している。データ処理・制御装置６は本体内のＣＰＵの
他に、デーダベースを格納するＨＤＤのような外部記憶
装置４２を有することもできる。更に、制御内容を表示
したり、測定結果を出力するためのＣＲＴ４４およびプ
リンタ４６を備えることができる。

【００２６】図５に本発明の生菌数測定・菌種同定シス
テムの蛍光測定装置における光学系の概念構成図を示す
。光源として、例えば、キセンノンランプ５０を使用し
、背後に補助ミラー５２を配置し、前方にコンデンサレ
ンズ５４を配置すると共に、該レンズの前方に熱線吸収
フィルタ５６を配置することにより光源系を構成してい
る。コンデンサレンズ５４で平行にされた光線は特定の
波長の励起光のみを取り出すために励起光バンドパスフ
ィルタ５８を通される。このフィルタはモータにより回
転され、図示されているように０〜３の４種類の波長の
励起光が得られるようになっている。しかし、このフィ
ルタ数に限定されるわけではない。励起光の波長自体は
本発明の必須要件ではないが、一般的な指標として、大
腸菌およびサルモネラ菌の場合、３６５または４７０ｎ
ｍの波長の励起光を使用することが好ましい。一方、黄
色ブドウ球菌の場合は４９０ｎｍの波長の励起光を使用
することが好ましい。　　バンドパスフィルタ５８を通
過した励起光はリレーレンズ６２および可変絞り６４を
通過する。平行化励起光は可変絞り６４で絞られ、反射
鏡６６で９０°屈折される。屈折励起光は結像用レンズ
６８で焦点合わせされ、マイクロプレートのウエル（穴
）７０内の検体に照射される。別法として、励起光バン
ドパスフィルタ５８を出た励起光は光ファイバ（図示さ
れていない）により誘導し、検体に照射することもでき
る。光ファイバーを使用すれば、リレーレンズ、可変絞り、
反射鏡および結像用レンズが不要になり、励起光のエネ
ルギー減衰を抑制することができる。

【００２７】検体から発生した蛍光は光ファイバーで受
光される。蛍光受光用光ファイバーの本数は１本以上（
例えば、６本）であればよい。光ファイバーは検体の周
囲を円形に取り囲むように配置することが好ましい。このため、図４で簡単に示したようなホルダ３４で保持
することが好ましい。垂直入射励起光に対する光ファイ
バーの保持角度は特に限定されない。蛍光を受光するの
に最大の効率を達成できるような角度であればよい。こ
のような角度は当業者が容易に決定することができる。一般的には、４５°が好ましい。

【００２８】光ファイバー７２で受光された蛍光は更に
蛍光側バンドパスフィルタ７４および励起光側バンドパ
スフィルタ７６に誘導される。フィルタ７４および７６
はフィルタ５８と同番号のフィルタを使用しなければな
らない。フィルタ７４およびフィルタ７６も、図示され
ていないが、モータ６０でフィルタ５８と同時に駆動制
御される。蛍光側バンドパスフィルタ７４は大腸菌およ
びサルモネラ菌の場合には５２０および５３０ｎｍの波
長の蛍光を通過させるものを使用し、黄色ブドウ球菌の
場合には、５３５および５４０ｎｍの蛍光を通過させる
ものを使用することが好ましい。フィルタ７６は迷光励
起光が存在していた場合に、蛍光強度の外乱要因になら
ないようにデータから除去するために使用できる。しか
し、このフィルタ７６は必ずしも使用する必要はない。各フィルタの直後には光電子増倍管７８および８０が配
置されている。光電子増倍管からの電気信号は増幅回路
８２および８４を経て、図２および図４に示されるよう
なデータ処理・制御装置に伝達される。

【００２９】次に、データベースの作成法について説明
する。生菌数に関するデータは従来の寒天平板法により
得られる。例えば、希釈倍率１０−６倍の検体から０．
１ｍｌ採取し、これを寒天平板に接種し３７℃で大気中
雰囲気で所定時間培養する。また、希釈倍率１０−７倍
の検体から０．１ｍｌ採取し、これを寒天平板に接種し
同様に３７℃で大気中雰囲気で所定時間培養する。培養
後、寒天平板上に出現したコロニー数を計数する。例え
ば、１０−６の検体の場合、コロニーが１００個出現し
、１０−７の検体の場合、コロニーが１０個出現した場
合、１０−６の検体における菌数は、１００×１０６　
×１０＝１０９　個／ｍｌになり、１０−７の検体では
、１０×１０７　×１０＝１０９　個／ｍｌになる。こ
の結果から、検体中の生菌数は１０９と推定される。こ
の測定を、例えば、培養開始から３時間、４．５時間、
６時間、７．５時間目にそれぞれ行うと経時的な菌数の
変化を示す特性曲線が得られる。

【００３０】また、これと同時に、本発明の蛍光測定シ
ステムを使用し、培養開始から３時間、４．５時間、６
時間、７．５時間目における蛍光強度を測定する。この
データから特性曲線を作成すると、時間の経過により蛍
光強度が増大する様子が確認できる。従って、前記の各
培養時間における生菌数のデータと各培養時間における
蛍光強度のデータを合わせると、生菌数に対する蛍光強
度の検量線が作成できる。これをデータベースとして蓄
積保存する。従って、未知検体の菌種が同定されれば、
その菌種の生菌数／蛍光強度検量線データベースに測定
蛍光強度を当てはめれば生菌数が得られる。

【００３１】本発明の方法およびシステムで使用するデ
ータベースの作成に関する基本的概念は前記の通りであ
る。従って、本発明の方法およびシステムの信頼性は取
りも直さず、データベースの信頼性に依存する。このた
め、出来るだけ多数の培養実験を繰り返し、得られた結
果を統計処理し、バラツキの最小化を図り、可能な限り
普遍的なデータベースを構築することが好ましい。例え
ば、大腸菌には多数の種類の菌および変異株などが存在
するので、培養条件および蛍光測定条件を同一にしても
、各菌または株により、同じ生菌数でも蛍光強度に若干
の変化が生じる。本発明の方法では大腸菌群の中の特定
の菌株までは同定できないので、検体中に様々な大腸菌
株が混在していたとしても、一般的総称的な大腸菌の生
菌数として推定される。サルモネラ菌および黄色ブドウ
球菌についても同様である。

【００３２】前記のような菌株の相違などのようなファ
クタに起因して、ノイズが初期菌濃度の予測値に大きく
影響することがあるので、確固としたデータベースの確
立と共に、得られた蛍光強度の実測値をファジィ理論に
より処理することもできる。具体的な変数値（蛍光強度
測定値など）と言語によって表現されるファジィ変数（
蛍光強度が「大」など）を関係づける関数をメンバーシ
ップ関数と呼ぶ。また、「蛍光強度変化量が大きければ
、初期菌濃度は非常に大きい」などといった、事象の関
係をルールベースと呼ぶ。ファジィ理論によって、蛍光
強度の変化量から初期菌濃度を推定するには、各同定菌
種・希釈濃度ごとに蛍光強度の変化量から初期菌濃度を
推定するルールのデータベース（すなわち、ルールベー
ス）と各ファジィ変数のメンバーシップ関数を作成し、
データ処理装置内に記憶させる。この手法によれば、蛍
光強度の実測値に誤差が含まれていても、ファジィの特
徴である“あいまい性”の処理によって、期待値からの
ズレをある程度平滑化・補正し、ノイズをキャンセルし
て、初期菌濃度を信頼性高く実測することができる。こ
のルールベースおよびメンバーシップ関数、実験データ
の蓄積に伴い、順次修正・チューニングを行うことによ
って更に測定精度を高めることが可能になる。また、学
習機能を追加することによって、自動的にこれらのチュ
ーニングを行い、機能を向上させることができる。

【００３３】前記のような基本的概念に基づいて作成さ
れた検量線の一例を図６〜図８に示す。図６は大腸菌（
ＪＣＭ１６４６株）の培養における蛍光強度と生菌数の
関係を示すグラフである。白六角スポットは培養時間に
対する生菌数の経時的変化を示す特性曲線である。一方
、●は、培養時間に対する蛍光強度の経時的変化を示す
特性曲線である。図７はサルモネラ菌（Ｓ２０６株）の
培養における蛍光強度と生菌数の関係を示すグラフであ
る。白六角スポットは培養時間に対する生菌数の経時的
変化を示す特性曲線である。一方、●は、培養時間に対
する蛍光強度の経時的変化を示す特性曲線である。また
、図８は黄色ブドウ球菌（ＪＣＭ２４１３株）の培養に
おける蛍光強度と生菌数の関係を示すグラフである。白六角スポットは培養時間に対する生菌数の経時的変化
を示す特性曲線である。一方、●は、培養時間に対する
蛍光強度の経時的変化を示す特性曲線である。

【００３４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法およ
びシステムによれば、約８時間程度の短時間内に大腸菌
、サルモネラ菌または黄色ブドウ球菌の菌種を同定し、
あわせて、これらの菌数を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の方法およびシステムの実施に使
用されるマイクロプレートの一例の模式的平面図である
。

【図２】図２は本発明の方法の処理の進行を示す模式的
概念図である。

【図３】図３は本発明の方法の処理手順の流れを示すフ
ローチャートである。

【図４】図４は本発明のシステムの模式的構成図である
。

【図５】図５は本発明のシステムで使用される蛍光測定
のための光学系の模式的構成図である。

【図６】図６は大腸菌の培養における蛍光強度と生菌数
の関係を示す特性曲線である。

【図７】図７はサルモネラ菌の培養における蛍光強度と
生菌数の関係を示す特性曲線である。

【図８】図８は黄色ブドウ球菌の培養における蛍光強度
と生菌数の関係を示す特性曲線である。

【符号の説明】

１　　マイクロプレート２　　培地分注ゾーン３　　菌液分注ゾーン６　　データ処理・制御装置７　　インキュベータ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　選択培地で微生物を培養し、該培養物
に励起光を照射し、該培養物からの蛍光の強度を測定し
、既知の微生物種について予め作成された生菌数と該菌
数に対応する蛍光強度との検量線に前記測定値を当ては
めることからなる生菌数の測定および該菌の同定方法。
【請求項２】　　微生物は大腸菌、サルモネラ菌および
黄色ブドウ球菌である請求項１の方法。
【請求項３】　　被測定微生物を含む検体を複数の段階
に希釈し、蛍光プローブを添加する装置と、培養前およ
び培養後の検体に励起光を照射し、該検体から発せられ
る蛍光の強度を測定する蛍光測定装置と、既知の微生物
種について予め作成された生菌数と該菌数に対応する蛍
光強度との検量線がデータベースとして記憶された外部
記憶装置と、前記蛍光測定装置による検出値に基づき外
部記憶装置のデータベースを検索、参照しデータ処理を
行うと共に、希釈・プローブ添加装置および蛍光測定装
置を制御する装置とからなる生菌数測定・菌種同定シス
テム。
【請求項４】　　蛍光測定装置は、少なくとも、励起光
を発生する発光手段と；励起光を被測定物に照射する手
段と；被測定物から発生される蛍光を受光する手段と；
蛍光と共に進入してくる迷光励起光をカットするバンド
パスフィルタと；前記バンドパスフィルタを通過した蛍
光を捕捉する光電子増倍管とを有する請求項１のシステ
ム。
【請求項５】　　蛍光受光手段は光ファイバーである請
求項４のシステム。