JPH01128781A - 生菌数測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分！ｌｒＰ］ 本発明は生菌数の測定ならびに菌種同定方法および該方
法を実施するのに使用される生菌数ｆｌｌｌｌ定・菌種
同定システムに関する。史に詳細には、本発明は液体選
択培地を用いて検体中の特定の微生物種のみを増殖させ
、該微生物から発せられる蛍光を捕捉することからなる
生菌数の測定ならびに菌種同定方法および生菌数の測定
・菌種同定システムに関する。

［従来の技術］ 従来、このような微生物種の同定は生理学的、生化学的
性伏に基づいて行われており、一方、生菌数はサンプル
を１０−／、１０−２．　　・・・・。

１０−８倍に希釈し、この希釈液の・定ニア１を変人甲
板培地Ｉ―に接種塗抹し、　・定時間（２４〜４８時間
）の培養後に、この寒天・ｌｉ、板１ユに出現したコロ
ニー数に希釈倍率を乗じて求められていた。

しかし、このような全くの手作業による微生物検査法で
は、２〜５０間の検査期間と、かなりの熟練技術とを必
要とし、また、技術者あるいは検査１１による測定差が
生じることも知られている。

川に、人眼の培地およびンヤーレの使用および熟練技術
者の高価な人件費のため、検査にヅする費用は高価格に
なっている。

微生物種の同定、生菌数の測定などの微生物検査は、臨
床検査、食品検査、医薬品検査等の部門で必須であり、
迅速化、省人化、自動化に対するニーズは高い。

このため、臨床検査部門では各種の自動化機械の開発が
行われている。例えば、５０ｐｐｍで回転している寒天
・１１５板培地に、サンプル液を中心から外側に向かっ
て塗抹するプレーグ、塗抹された寒天培地を培養し、甲
板培地−１−に形成されたコロニーをＨｅ−Ｎｅレーザ
光で計数するコロニーカウンタおよびデータプロセンサ
の３機器からなる生菌数測定装置、あるいは、性状検査
用の各種培地が入ったカートリッジを用いて微生物種の
同定と、比濁法による菌頃測定を完全自動で行える生菌
数／１υ１定装置または、このカートリ、ジの代わりに
マイクロプレートを用いた同様な装置が試作されている
。

しかし、これらの機器の大部分は尿路感染などの微生物
検査に用いられているにすぎず、食品検査のようにサン
プルが混濁物であることが多い場合には測定が不可能で
あり、また、１−分な精度が得られなかったりする。史
に、いずれの方法も２４〜４８時間の培養期間を必要と
するので、迅速な測定は不＋ｉＪ能であり、緊急に検査
しなければならないようなニーズには対応できない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は広範な分野で使用でき、高精度かつ低コストで
、検査時間が数時間程度で済む生菌数測定・菌種同定方
法および生菌ｆｉ−菌種の、−１速検定システムを提供
することをｌ［的とする。

［問題点を解決するためのＴ段］ 本発明者らが長年にわたり広範な実験と研究を続けた結
果、液体選択培地中の微生物に励起光を照射し、該微生
物から発せられる蛍光の強度を測定し、次いで、該液体
選択培地中の微生物を培養し、増殖した微生物に励起光
を照射し、該微生物から発せられる蛍光の強度を測定し
、培養前後の蛍光強度の差を求めることにより微生物種
を同定し、かつ該微生物の生菌数を高精度で、しかも、
短時間に計測できることが発見された。本発明は斯かる
知見に基づき完成された。

［作用コ 微生物の生細胞は補酵素ＮＡＤＨにコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドの還元型）およびＮＡＤＰＨにコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元型）を、Ｉ
Ｉ（遍的に有する。これらの補酵素に励起光を１１（１
射すると蛍光を発生する。

蛍光の強度は各微生物種、生菌数、生細胞１個゛１りに
含まれる補酵素の１灸に依存するので、微生物種および
培養前の生菌数がｒめわかっている検体について培養前
および培養後の蛍光強度を測定し、その差（ΔＩ）を求
める。培養前の生細胞１個当りに含まれる補酵素のけは
、前記培養前の蛍光強度から液体選択培地由来のバンク
グラウンド蛍光強度を差し引き、これを前記の既知生菌
数で除した値と比例関係にあるので、この値を培養前の
生菌数１個当りの補酵素けとみなすことができる。

従って、既知試料に基づき蛍光強度差ΔＩｓのデータベ
ースを作成する場合、例えば、二次元記憶テーブルを使
用する。このテーブルにおいて、縦の欄に生菌数を取り
、横の欄に前記の方法によって求めた培養前の生菌数１
個当りの補酵素量を取る。既知生菌数を例えば、１０／
、１０２゜ＩＱＪ、＊・・・、１０”に区分し、補酵素
量をその最大値で規格化し、例えば、０，０．１，０．
２，０．３゜・・・・・、０．９，１．０に区分する。

そして、例えば、生菌数１０７で補酵素量０の既知微生
物種をｎ段階（例えば、１１段階）に等倍希釈し、各希
釈段階について培養前および培養後の蛍光強度を測定し
、その蛍光強度差Δｌ５７ｔ　ΔＩｓ２＊　　・・・・
・、Δｌ５ｔｔを求める。このデータ収集を各生菌数と
各補酵素けについて行いデータベースとする。希釈段階
は使用されるマイクロプレートに応じて変化する。例え
ば、９６六マイクロプレートならば、可能な希釈段階は
最大１１段階である。

同一の微生物種で菌数が未知の検体について、同一希釈
段階で培養前および培養後の蛍光強度を測定し、その蛍
光強度差ΔＩｕ７ｔ　ΔＩ　ｕ　２　ｓ　　・・・・、
ΔＩｕｌＩを求める。

未知検体中の微生物の生菌数を求めるには、前記既知試
料の標準データと未知検体の実測データとの“へだたり
（距離）”を定義しておき、それが０もしくは０に最も
近い標をデータに対応する菌数をもって未知検体中の微
生物の生菌数と推定する。

例えば、いま特徴（ΔＩ　ｕｌ　、ΔＩ　ｕ　２　ｖ　
　の・・・、ΔＩｕｎ）をもった一つの未知検体Ｕを、
特徴が（ΔＩｓ７．ΔＩｓ２．　　・・・拳・、Δ■ｓ
ｎ）である既知標準試料Ｓと比較すると１そのＵへだた
り（距＃）”Ｄは次の関係式により求められる。

各微生物種について前記のようなデータマトリックスを
作成し、データベース化しておけば、未知検体の測定値
からデータベースを検索、参照することにより生菌数を
１催、かつ、迅速に推定でキル。従って、データベース
のデータ酸が豊富になるほど本発明の測定方法の信頼性
が高まる。

微生物の生育過程は一般的に、誘導期、対数期。

停市期および死滅期に区分できるが、各段階で微生物が
有する細胞１個当りの補酵素量も変化する。

前記データベースは、微生物種、生菌数および培養前の
補酵素にが既知の検体を用いて作成されている。従って
、未知検体中の微生物種が同定され、その生菌数が推定
されるとともに、副次的にその補酵素量も推定され、検
体中の微生物の生育段階を［１１することも１１■能と
なる。

本発明による未知検体中の微生物種の同定と、その生菌
数の測定は、特定の微生物種のみを生長・増殖させるこ
とができる選択培地を使用することにより可能となる。

選択培地とは特定の基質。

抗生物質などを添加することにより、特定の微生物種を
他の微生物種よりも有利に生長できるようにした培地で
ある。

例えば、未知検体中にビヒドバクテリウム（Ｂｌｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌（いわゆるビフィズス菌
）が存在するか否か、存在するとすれば、その生菌数は
幾らかという場合、選択培地として次の組成を有するも
のを使用する。ラブーレムコ（Ｌａｂ−ｔｅｌｌｃｏ）
粉末（Ｏｘｏｌｄ社製）　２．４ｇ／　Ｊ！　、プロテ
オースペプトン　Ｎｏ、３（旧ｆｃｏ社製）ＩＯ，Ｏｇ
／　Ｊ、　　）リプチケース（ＢＢＬ社製）５ｇ／Ｊ！
　、酸１号エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５．０ｇ／Ｊ　、
肝臓浸出液（光岡、　　１９６９）　１５０＋ｓＪ！／
λ、ラフィノース４ｇ／　Ｊ　、塩類溶液Ａ（光岡ら。

１９６５）ＩＯｍ　１／λ塩類溶液Ｂ（光岡ら、１９６
５）５ｎ＋λ／、１１．消泡剤（ダウコーニング社製。

１０％）５ａＪ／Ｊ、ツイーン８０Ｉｇ／　Ｊ！、　　
Ｌ−システィンＨＣＩ・Ｈ２００，５ｇ／　Ｊｌ　、プ
ロピオン酸ナトリウム１５ｇム１　コリマイシン（ＩＱ
　ｔ　ｔｌｊ位、１％）１２ｓＪＩ／Ｊ。この選択培地
を作製する場合、コリマイシン以外の成分を混合し、１
１５℃で２０分間滅菌する。コリマイシンは使用直前に
無菌的に添加する。この選択培地中ではビヒドバクテリ
ウム属の菌しか生育できないので、未知検体が蛍光を発
すれば、未知検体中の微生物種はビヒドバクテリウム属
の菌と同定される。

前記のように特定の微生物種のみしか生育できない選択
培地に未知検体を接種し、培養し、蛍光強度を測定し、
培養の前後で蛍光強度に差が出れば、該当する微生物種
が未知検体中に存在し増殖したためであり、容易に未知
検体中の微生物種を同定することができる。

実際には、未知検体中にどのような微生物種が存在して
いるか予測することは困難なので、未知検体を全ての選
択培地に接種し、培養し、どの選択培地で生育したか、
培養前後の蛍光強度差に基づき確認し、微生物種を同定
することとなる。

本発明者らの研究によれば、ド記の組成の選択培地を使
用することにより大腸菌のみを特異的に生育させること
ができる。

肉エキス　　　　　　　　　　　３．０ｇペプトン　　
　　　　　　　　ｉｏ、０ｇカゼイン　　　　　　　　
　　　　５．０ｇ乳糖　　　　　　　　　　　　　１５
．０ｇ白糖　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇデオ
キシコール酸ナトリウム　　１．０ｇチオ硫酸ナトリウ
ム　　　　　　２．５ｇクエン酸ナトリウム　　　　　
　　１．０ｇクエン酸アンモニウム　　　　　１．０ｇ
精製水　　　　　　　　　　１０００ｍλサルモネラ閑
の場合、ド記の組成の選択培地中で特異的に生育する。

肉エキス　　　　　　　　　　　３．０ｇプロテオーズ
ペプトン　　　　１２．０ｇ乳糖　　　　　　　　　　
　　１２．０ｇ白糖　　　　　　　　　　　　　１２．
０ｇサリシン　　　　　　　　　　　２．０ｇ胆汁酸塩
　　　　　　　　　　１５．０ｇ塩化ナトリウム　　　
　　　　　５．０ｇチオ硫酸ナトリウム　　　　　　６
．８ｇクエン酸アンモニウム　　　　　０．８ｇデオキ
シコール酸ナトリウム　　２．０ｇ精製水　　　　　　
　　　　１０１００Ｏ黄色ブドウ状球菌について使用さ
れる選択培地は下記の組成を有する。

酵母エキス　　　　　　　　　　２．５ｇペプトン　　
　　　　　　　　ｌＯ，０ｇケラチン　　　　　　　　
　　　３０．０ｇ乳糖　　　　　　　　　　　　　２．
０ｇマンニット　　　　　　　　　　ｉｏ、０ｇ塩化ナ
トリウム　　　　　　　７５．０ｇリン酸２カリウム　
　　　　　　５．０ｇ塩化リチウム　　　　　　　　　
５．０ｇフェノールエチルアルコール　　２５ｍＪｌ精
製水　　　　　　　　　　１０１００Ｏキヤンピロバク
ター川の選択培地は一ド記の組成をイｒする。

プロテオーズペプトン　　　　１５．０ｇ酵ｌ：）エキ
ス　　　　　　　　　　５．０ｇ肝臓エキス　　　　　
　　　　　２．５ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　５
．０ｇヴアンコマイシン　　　　　　　１０ｍｇポリミ
キシンＢ　　　　　　　２５００中４位トリムドブリム
　　　　　　　　　　５ｍｇセファロシン　　　　　　
　　　１５ｍｇアンフォテリシン８　　　　　　　２ｍ
ｇ精製水　　　　　　　　　　１０００ｍλまた、酵母
菌についてはド記の組成の選択培地が使用される。

バクトポテトデキストロース ブイヨン（旧ｆｃｏ社製）　　　　　３９．０ｇ１Ｏ％
酒石酸　　　　　　　１４．０ｍＪ！精製水　　　　　
　　　　　１０１００Ｏ選択培地は液体培地であること
が好ましい。液体培地ならば、マイクロピペット等によ
り定ｉＫ１を自動分注すること力（ｕＪ能である。

［実施例］ 以ド、図面を参照しながら本発明の−・実施例について
史に詳細に説明する。

第１図は本発明の生菌数・菌種の高速検定システムのブ
ロック図である。

本発明の生菌数・菌種の高速検定システムは基本的にマ
イクロプレート希釈番測定部１０とデータ処理部２０と
からなる。

第１図のマイクロプレート希釈・測定部ｌＯにおいて、
マイクロプレートは図中の実線矢印で示されるようにロ
ーダカセット３０から自動希釈・撹拌装置４０に送られ
、ここで検体（サンプル）の接種、希釈、撹拌が同時に
行われ、アンローダカセット３２へ移送される。このア
ンローダカセット３２は隣接する自動蛍光１１１１定装
置５０ヘマイクロプレートを供給するローダカセットも
兼ねている。蛍光測定の済んだマイクロプレートは別の
アンローダカセット３４に移送される。自動蛍光測定装
置５０による蛍光強度測定は、培養前のマイクロプレー
トについて行い、次いでインキュベータ３６に移送して
所定時間培養し、培養後ｉｔｔび蛍光強度−一１定を行
う。インキュベータは本発明のシステム自体に組込む必
要はない。通常の実験室等に備え付けられている常用の
恒温器等を利用すればよい。第１図において、太線矢印
は培養後のマイクロプレートの移動を示す。マイクロプ
レートの移送にはコンベヤ専の慣用手段が使用される。

アンローダ／ローダ兼用カセット３２およびアンローダ
カセット３４とインキュベータ３６との間のカセットの
移送には所望により、ロボット等を使用できる。

自動蛍光測定装置５０からの培養部蛍光強度測定信号（
図中、−点鎖線矢印）および培養後蛍光強度測定信号（
図中、太−点鎖線矢印）はデータ処理部２０のプロセッ
サ６０へ送信される。この測定信号と使用した選択培地
の種類に関する情報とから外部記憶装置７０に記憶され
ているデータベースを検索、参照することにより検体内
に存在する微生物種の同定と、その微生物種の生菌数を
推定する。プロセッサ６０は外部記憶装置７０と、ＣＲ
Ｔおよびキーボードを有するコンソール８０に接続され
ている。全てのオペレーションはコンソール８０からの
命令入力によって行える。図中の破線矢印は制御信号お
よびデータの流れを示す。

培養部蛍光強度測定を行い、培養後蛍光強度測定値から
その値を引くことにより、バックグランドが除かれとと
もに、選択培地中で増殖した特定の微生物種の生菌数の
増加暖に対応する信号が得られる。一方、培養前後の蛍
光強度に差がなければ、その選択培地に該当する微生物
種が未知検体内に存在していないことを意味する。

第２図は本発明で使用されるマイクロプレート９０の斜
視図である。

マイクロプレート９０は例えば、ポリカーボネイトのよ
うな高分子材料またはガラス等の透明な素材から構成さ
れている。マイクロプレート９０は不透明なプラスチッ
ク類、セラミック類または陶器などから構成されていて
もよい。

マイクロプレート９０のおもて而には９６個（８行ｘ１
２列）の穴が設けられている。穴の形杖は特に限定され
ない。スリバチ吠、Ｖ字杖または円柱吠もしくは角柱状
など任意の形伏を使用できる。言うまでもな（，９６穴
以外のマイクロプレートも使用できる。マイクロプレー
ト手前側１列は検体液を注入しておくスペースであり、
希釈用の残列には予め液体選択培地が一定暖注入されて
いる。

第３図は本発明で使用される自動蛍光測定装置の一例を
示す平面図であり、第４図は第３図におけるＡ失視図で
ある。

自動希釈・撹拌装置４０の搬送系４１の両端にローダカ
セット３０（図中、左側）およびアンローダ／ローダ兼
用カセット３２が配設されている。

搬送系４１の駆動伝達系は例えば、コンベヤ、チェーン
、ベルト等の慣用手段により構成できる。

それぞれのカセットはマイクロプレート９０を例えば、
１０枚収納でき、ミニチュア倉庫型構造になっている。

第１図のアンローダカセット３４も同・構造である。マ
イクロプレートはカセットごとインキュベータ３６に入
れることができる。カセットはボールスクリュー機構ま
たはエレベータ等の慣用手段を使用することにより−１
−下動させることができる。第３図において、４８はベ
ースであり、４９は架台である。

ガイドレール４２に沿って前後進ｉｉＪ能な駆動系４３
の先端部にはマイクロプレート９０の検体穴数に対応す
る本数の例えば、マイクロシリンジ等の極微Ｈ１分分注
器４か取り付けられている。この極微頃分注器４４の先
端には滅菌済みの使い捨て子ツブ４５が装着される。チ
ップ４５はチップ供給部４６から供給される。マイクロ
プレート９０は第３図に示されるような横送りだけでな
く、縦送りも可能である。横送りの場合、最大８検体を
１０７１１倍まで希釈することが可能であり、縦送りの
場合には最大１２検体を１０−７倍まで希釈することが
可能である。偏心モータ４７により極微暖分注手段４４
の先端のチップ４５を振動させることにより穴内の液体
を撹拌し濃度を均一化させる。偏心モータ以外の撹拌手
段も当然使用できる。例えば、シリンジで穴内の液体を
吸引・吐出する操作を数回繰り返すことによっても撹拌
の［１的は達せられる。

各人に注入されている選択培地の：１【に合わせて、所
定の希釈倍率になるように検体液の分注器の７リンジス
トロークが設定され、分注器が＋ｌｉｆ後移動を繰返し
ながら滅菌済チップの装填、設定段階の希釈と撹拌、最
後のチップ廃棄までを自動的に行う。希釈方法は例えば
、選択培地列の各穴内に４５μλの選択培地を注入して
おき、検体列の穴から５μλの検体を分注器で採取し、
これを最初の選択培地穴に注ぎ込み、撹拌する。得られ
た１０−１倍希釈液から５μλ採取し、次の選択培地穴
に注ぎ込み、撹拌する。すると１０″″２倍希釈液が得
られる。この１０−２倍希釈液から５μλ採取し、次の
選択培地穴に注ぎ込み、撹拌する。かくして、ｔｏ−３
倍希釈液が得られる。この操作を繰返すことにより、１
Ｏ−７または１Ｑ−１１倍までの希釈液を調製すること
かできる。このように、１検体について多数の希釈倍率
を設けて試験するのは、未知検体中に存在する測定対象
とする菌の生菌数レベルが１０’　−１０”　／ｍｉの
広範囲の場合について検出可能とするとともに、生菌数
の大体の値をｐ測するためである。例えば、１０−？倍
量を二の希釈検体について蛍光強度差が検出されない場
合、未知検体中の生菌数は人体１０８〜１０９程度と１
”　／１ｔｌｌされる。

第５図は自動蛍光測定装置５０内の光学系による蛍光検
出原理を示す！５図である。

蛍光検出の原理自体は公知であり、基本的には照明系に
励起フィルタ、観察系に吸収フィルタを有し、ハーフミ
ラ−の代わりにダイクロイックミラーが使用されている
。

第５図に示されているように、光源５１から発せられた
様々な波長の光を含む照明光は、励起フィルタ５２によ
り、蛍光を発生させるのに７髪な波長域の光だけが抽出
され透過する。この透過光はダイクロイックミラー５３
により９０°　ド方に反射後、対物レンズ５４ａを通常
とは逆の方向で通過し、励起光としてマイクロプレート
９０の穴内の検体に達する。励起光照射により任意方向
に発光した蛍光の一部は対物レンズ５４ａに入る。

ダイクロインクミラー５３は励起光より長波長の蛍光は
反射せずにこれを透過する。従って、対物レンズ５４ａ
に入った蛍光はダイクロイックミラー５３を透過し、吸
収フィルタ５５ａを通る。吸収フィルタ５５ａは励起光
の僅かな迷光もカットし、蛍光のみを光電ｒ増倍管５６
ａに達しさせる。

マイクロプレート９０が透明な光透過性材料で構成され
ているため、励起光照射により任、α方向に発光した蛍
光はマイクロプレート９０のト方およびド方の両方向へ
向かう。従って、マイクロプレート９０の下側にも対物
レンズ５４ｂと吸収フィルタ５５ｂおよび光電ｒ増倍管
５６ｂを配設する。微生物から発生する蛍光は極めて微
弱なため、マイクロプレートの表側および裏側の両側で
蛍光を捕捉し、測定することにより検出精度が向１−す
る。しかし、光透過性マイクロプレートの使用は本発明
の必須要件ではない。従って、光不透過性のマイクロプ
レートを使用し、ニ一方だけで蛍光を捕捉し測定するこ
ともできる。

光源５１としては例えば、超高Ｌ］−水銀幻が用いられ
る。ドとして、波長が３８５ｎｍ　〜５４６ｎｍの範囲
内の輝線スペクトルが励起光として利用されるが、本発
明では約３４０ｎｍ〜約３９０ｎｍの範囲内でピーク波
長が３６６ｎｍの励起光を使用する。

光源としてはその他に、キセノンランプ、ハロゲンラン
プ等も使用できる。光源から発せられた照明光の４００
ｎｍ以１−の波長は励起フィルタ５２でカプトされ、約
３４ＯｎＩ１１〜約３９０ｎｍの範囲内でピーク波長が
約３８６ｎｍとなる励起光を得る。

ダイクロイックミラー５３は光軸に対して４５度の角度
に配置したときに、ある波長より短波長の光は反射し、
長波長の光は透過するような特性を持った干渉フィルタ
である。本発明では短波長側に励起波長城、長波長側に
蛍光波長域がくるように設定した。

吸収フィルタ５５ａおよび５５ｂは微生物により吸収さ
れずに反射ｅ透過した励起光が光電子増信管５６に入射
することを防ぐため、および、蛍光の中でも特定の波長
のみを透過させるために配設されている。本発明では約
４３０ｎｍ〜４９０ｎｍ。

好ましくは約４４０ｎｍ〜約４８０　ｎｍ１　−・層好
まし　　　　　′くは４５０ｎｎｉ〜４７０　ｎｍ１最
も好ましくは４５５ｎｍ〜４Ｅ３５ｎｍの範囲内の波長
を打する蛍光を捕捉する。

光電ｒ増倍管５６ａおよび５８ｂからの測定信号はプロ
セッサ６０へ送信される。プロセッサのＡ／Ｄ変換器（
図示されていない）により測定信シ３・をデジタル値に
変換し、演算回路（図示されていない）で蛍光強度を算
出する。この算出結果に基づき、外部記憶装置に記憶さ
れているデータベースを、前記の“へだたり（距離）”
１）を算出しつつ、検索、参照し、前記りが最も０に近
（なる標準データを見出すことにより生菌数が求められ
る。この結果はコンソールのＣＲＴ画面に表示するか、
あるいは、所望により、プリンタ（図示されていない）
に出力することができる。

本発明の方法およびシステムは好気性菌および嫌気性菌
の何れにも使用できる。嫌気性菌について本発明の方法
を実施する場合、ａｌｌｌｌｌｌナシステムば、炭酸ガ
スまたは窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下で運転するこ
とが必要となる場合もある。

［発明の効果コ 以に説明したように、本発明の方法によれば、液体選択
培地中の微生物に励起光を照射し、該微生物から発せら
れる蛍光の強度を測定し、次いで、該液体選択培地中の
微生物を培養し、増殖した微生物に励起光を廂射し、該
微生物から発せられる蛍光の強度を測定し、培養前後の
蛍光強度の差を求めることにより、未知検体中の微生物
種を同定し、かつ、該微生物種の生菌数を迅速に、しか
も、ＩＦ確に推定できる。

また、本発明の生菌数・菌種の高速検定システムによれ
ば、生菌を含む検体液の正確な希釈ならびに微生物種の
同定と生菌数の測定を人手を介することなく、完全に自
動的に行うことができる。

本発明ではマイクロプレートを使用するため、少量の培
地で多酸の検体を開時に処理できるので従来の寒天平板
法に比べて、ｌ検体あたりの検へコストが約１／２０ま
で軽減される。

液体選択培地を使用し、かつ、カセットで運搬している
ため、空気中の１７遊雑菌による雑菌汚染の恐れは少な
い。このため、本発明ではクリーンルームあるいはクリ
ーンベンチは特に必要とせず、簡便、迅速＋　＋Ｉ−確
、安価に微生物種を同定し、該微生物種の生菌数を測定
できる。

本発明の方法およびシステムは臨床検査分野に限らず、
食品関係、化粧品関係、流通関係、保健所関係、医薬品
関係等の広範囲な分野で微生物種の同定および該微生物
種の生菌数の測定に利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生菌数・菌種の高速検定システムのブ
ロック図、第２図は本発明で使用されるマイクロプレー
トの斜視図、第３図は本発明で使用される自動希釈・撹
拌装置の一例を示す・μ面図、第４図は第３図における
Ａ失視図、第５図は自動蛍光測定装置内の光学系による
蛍光検出原理を示す概要図である。 １０・・・マイクロプレート希釈・測定部、２０・・・
データ処理部、３０・・・ローダカセット、３２・・・
アンローダ／ローダ兼用カセット、３４・・・アンロー
ダカセント、３６・・・インキュベータ、４０・・・自
動希釈装置、４１・・・搬送系、４２・・・ガイドレー
ル。 ４３・・・駆動系、４４・・・分注器、４５・・・使い
捨てチップ、４６・・・チップ供給部、４７・・・偏心
モータ。 ４８・・・ベース、４９・・・架台、５０・・・自動蛍
光測定装置、５１・・・光源、５２・・・励起フィルタ
、５３・・・ダイクロイックミラー、５４ａおよび５４
ｂ・・・対物レンズ、５５ａおよび５５ｂ・・・吸収フ
ィルタ。 ５６ａおよび５６ｂ・・・光電子増倍管、６０・・・プ
ロセッサ、７０・・・外部記憶装置、８０・・・コンソ
ール。 ９０・・・マイクロプレート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）液体選択培地中の微生物に励起光を照射し、該微
   生物から発せられる蛍光の強度を測定し、次いで、該液
   体選択培地中の微生物を培養し、増殖した微生物に励起
   光を照射し、該微生物から発せられる蛍光の強度を測定
   し、培養前後の蛍光強度の差を求めることからなる生菌
   数測定・菌種同定方法。 （２）微生物にピーク波長が３６６ｎｍの励起光を照射
   し、該微生物から発せられる波長４３０〜４９０ｎｍの
   蛍光を検出し、その強度を測定することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の生菌数測定方法。 （３）被測定微生物を含む検体を液体選択培地により複
   数の段階に希釈し、撹拌する自動希釈・撹拌装置と、該
   希釈検体中の微生物に励起光を照射し、該微生物から発
   せられる蛍光の強度を測定する自動蛍光測定装置と、既
   知の微生物種について予め測定された蛍光強度と生菌数
   とに関するデータベースが記憶された外部記憶装置と、
   前記自動蛍光測定装置による検出値に基づき外部記憶装
   置のデータベースを検索、参照しデータ処理を行うと同
   時に自動希釈・撹拌装置と自動蛍光測定装置を制御する
   プロセッサとからなる生菌数測定・菌種同定システム。 （４）検体の希釈と培養にマイクロプレートを使用する
   特許請求の範囲第３項に記載の生菌数測定・菌種同定シ
   ステム。 （５）自動蛍光測定装置が、励起光を発生する発光手段
   と；前記励起光を受けて微生物に励起光を照射し、該微
   生物から発せられる蛍光を受けて前記励起光とは相違す
   る方向に前記蛍光を分離するダイクロイックミラーと；
   蛍光と共に進入してくる迷光励起光をカットする吸収フ
   ィルタと；前記吸収フィルタを通過した蛍光を捕捉する
   光電子増倍管とを有することを特徴とする特許請求の範
   囲第３項に記載の生菌数測定・菌種同定システム。 （８）マイクロプレートが透明な光透過性材料により構
   成されていて、マイクロプレートの表側および裏側の両
   側で蛍光を捕捉する特許請求の範囲第３項または第５項
   に記載の生菌数測定・菌種同定システム。