JPH04346780A - 大腸菌およびサルモネラ用選択培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生菌数の測定ならびに菌
種同定方法に使用される特定の選択培地に関する。更に
詳細には、本発明は、大腸菌およびサルモネラを選択的
に生長させることのできる培地に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物種の同定は、バージー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ）のマニュアルなどに従い、培養物の形態学
的および生理学的性質を調べることにより行われている
。一方、生菌数はサンプル（検体）を１０−１，１０−
２，・・・，１０−ｎ倍に等倍希釈し、この希釈液の一
定量を寒天平板培地上に塗抹接種し、一定時間（例えば
、２４〜４８時間）培養した後、この寒天平板上に出現
したコロニー数に希釈倍率を乗じることにより求められ
ていた。

【０００３】しかし、このような全くの手作業による微
生物検査法では、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟
練技術とを必要とし、また、技術者あるいは検査員によ
る測定差が生じることも知られている。更に、大量の培
地およびシャーレの使用および熟練技術者の高い人件費
のため、検査に要する費用も非常に高いものになってい
る。

【０００４】微生物種の同定、生菌数の測定などの微生
物検査は、臨床検査、食品検査、医薬品検査などの部門
で必須であり、迅速化、省人化、自動化に対するニーズ
は高い。特に、臨床検査部門では各種の自動化機器の開
発が行われている。例えば、５０ｒｐｍ　で回転してい
る寒天平板培地に、サンプル液を中心から外側に向かっ
て塗抹するプレータ、塗抹された寒天培地を培養し、コ
ロニーの形成された平板培地をＨｅ−Ｎｅ　レーザでコ
ロニー計数するスパイラルシステム社のスパイラルシス
テム、各種の基質が入ったカートリッジを用い、比色法
で微生物種の同定、比濁吸光法による薬剤感受性試験を
自動で行えるＡｕｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｃ　Ｓｙｓｔｅ
ｍ，　ＭＳ−ＩＩ　，Ａｖａｎｔａｇｅなどのシステム
、カートリッジの代わりにマイクロプレートを用いたダ
イナテック社のＭＩＣ−２０００システムなどが、アメ
リカを中心に開発されている。

【０００５】しかし、これらの機器の大部分は尿路感染
などの微生物検査に用いられているに過ぎず、食品検査
のようなサンプルが混濁物であることが多い場合には測
定が不可能であり、また、十分な精度が得られなかった
。更に、何れの方法も、２４〜４８時間の培養時間を必
要とするので、迅速測定が困難である。このため、現場
の切実なニーズに十分応えられる段階には達していない
。また、これらの自動機器、測定方法に関する研究は、
臨床医学分野、医用工学分野などで盛んに行われている
が、実用化されているものは極めて少ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、広範な分野で使用でき、高精度で、しかも、低コス
トで、更に検査時間が数時間程度で済む、生菌数測定・
菌種同定方法の実施に使用する特定の選択培地を提供す
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明では、Ｋ２　ＨＰＯ４　、ＫＨ２　ＰＯ４　
、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、（ＮＨ４　）２　ＳＯ４
　、ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅおよびグルコースからなるこ
とを特徴とする大腸菌およびサルモネラ用選択培地を提
供する。前記培地は下記の組成、Ｋ２　ＨＰＯ４　　　
　　　　　　　　７　　　　ｇ／ｌ，ＫＨ２　ＰＯ４　
　　　　　　　　３　　　　ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４　・７
Ｈ２　Ｏ　　０．１ｇ／ｌ，（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　
　　０．１ｇ／ｌ，ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　　１　　　
　ｇ／ｌ，グルコース　　　　　　　　　　２　　　　
ｇ／ｌ，を有することが好ましい。

【０００８】

【作用】前記選択培地を使用すると、検体中の大腸菌お
よびサルモネラだけを選択的に生育させることができる
。換言すれば、前記培地により生育するものがあれば、
大腸菌またはサルモネラの何れかであると推定できる。

【０００９】菌種の同定と共に、生菌数の推定も可能で
ある。例えば、前記選択培地で微生物を培養し、該培養
物に励起光を照射し、既知の微生物種について予め作成
された生菌数と該菌数に対応する蛍光強度との検量線に
前記測定値を当てはめることにより求める生菌数推定値
が得られる。微生物種と培地との組み合わせは予め既知
なので、この培地で該当微生物を標準的な手法により培
養し、公知の確立された方法により各培養時間毎の生菌
数を計数し、同時に、該菌数に対応する蛍光強度を測定
し、検量線を作成し、データベースとして保存する。未
知検体を選択培地で培養し、生育するものがあれば、そ
の培地の種類から菌種は容易に同定できる。それと共に
、所定の培養時間時点における蛍光強度を該当する培地
／微生物のデータベースと照合すれば、その微生物の生
菌数が即座に求められる。

【００１０】通常市販されている選択培地の蛍光強度は
極めて強いので、前記の方法により培養物の蛍光強度変
化を捉えることは極めて困難であるか、または不可能で
ある。培地成分中、肉エキス、ペプトン、酵母エキス等
は蛍光強度が極めて強い。しかし、これらの成分は一般
的に、微生物の生長に欠くことのできない栄養成分であ
る。本発明者らの研究によれば、大腸菌およびサルモネ
ラの栄養要求度は高くないので、これらを除いても生育
することが確認された。従って、前記の大腸菌およびサ
ルモネラ用の培地は実質的に無蛍光培地であると言うこ
とができる。

【００１１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。培地の調製法自体は特に限定されない。一般的に
当業者に周知の任意の方法により調製することができる
。例えば、成分を適当な順序で混合し、得られた混合物
をオートクレーブなどで滅菌し、最後に適当な容器に無
菌条件下で貯蔵する。

【００１２】前記のようにして調製された培地を３枚の
滅菌済シャーレに無菌条件下で分注し、各シャーレに大
腸菌、サルモネラおよび黄色ブドウ球菌をそれぞれ接種
し、３７℃、大気中雰囲気で所定時間培養したところ、
大腸菌およびサルモネラを接種したシャーレにだけコロ
ニーが発生した。これにより、本発明の培地は大腸菌お
よびサルモネラに対して特異的な選択性を有することが
確認された。

【００１３】次に、図面を参照しながら本発明の選択培
地の具体的な使用法について説明する。図１は本発明の
選択培地を使用するためのマイクロプレート１の一例の
模式的平面図である。プレート自体の材質は特に限定さ
れないが、励起光の散乱が極力少なく、蛍光の発生およ
び受光を阻害しないような材質ならば全て使用できる。 例えば、透明ポリカーボネートなどが使用できる。しか
し、これに限定されないことは当然である。図示されて
いるプレートは９６穴のものである。穴の使用態様は特
に限定されない。一例として、図示されているように、
１２列の内、第１列目と第７列目に菌液または検体を入
れ、第２列目から第６列目まで、および第８列目から第
１２列目までを段階希釈用として使用する。この例では
、第１列目から第６列目までを対照用（例えば、培養前
の蛍光のバックグラウンド値を測定するためのもの）と
して使用し、第７列目以降を培養後の蛍光測定に使用す
る。Ａ行からＨ行までは同一の菌あるいは培地をいれる
こともできるし、Ａ〜Ｄ行とＥ〜Ｈ行に２分割し前記の
各培地を入れることもできる。このような穴の具体的使
用態様は当業者には周知であり、これ以上の説明は特に
必要ないであろう。

【００１４】次に、図２を参照しながら本発明の選択培
地による菌種の同定と生菌数の推定方法を実施する際の
一連の手順を説明する。先ず始めに、図１に示されたよ
うなマイクロプレート１を準備し、培地分注ゾーン２で
、プレートの所定の穴に所定の選択培地を分注する。 分注は手作業でも、自動機械でもいずれによっても実施
できることは当業者に周知である。次に、菌液分注ゾー
ン３で、検体（固体または液体）または菌液を市販のブ
レンダーまたはストマッカーなどにより調整／乳状化し
、前記のようにプレートの第１列目と第７列目に分注す
る。この分注も手作業あるいは自動機械により行うこと
ができる。ただし、特に限定されるわけではないが、培
地分注と菌液分注は図示された自動生菌数測定・菌種同
定システムには組み込まれていない。従って、このシス
テムを使用する者が前処理として行うべきものである。

【００１５】その後、このプレート１は段階希釈・蛍光
プローブ添加装置４にローデイングされる。ここで、第
１列目と第７列目の菌液を例えば、１０μｌをそれぞれ
自動的に採取し、２列目と８列目の穴にそれぞれ注入す
る。次に、この２列目と８列目の穴からそれぞれ１０μ
ｌ量を自動的に採取し、３列目と９列目の穴にそれぞれ
注入する。以後、これを６列目と１２列目まで順に繰り
返す。そうすると、１００　，１０−１，１０−２，１
０−３，１０−４，１０−５，１０−６の７段階の希釈
列が得られる。 本発明者らが実験したところでは、１０−６以上の希釈
はコロニーの発生が見られず、無意味であることが確認
された。

【００１６】段階希釈が完了したら、このプレートを蛍
光測定装置５に移送する。ここで、培養前の蛍光強度を
測定し、バックグラウンド値として、データ処理・制御
装置６の外部記憶装置に記憶させる。その後、このプレ
ートをインキュベータ７に移し、所定時間にわたって所
定条件の下で培養する。培養後、プレートを再び蛍光測
定装置に戻し、プレートの培養側の蛍光強度を測定し、
測定結果をデータ処理・制御装置６の外部記憶装置に伝
達する。ここで培養後の蛍光強度から培養前のバックグ
ラウンド値を引き算すると、真の蛍光強度が求められる
。この引き算の結果を外部記憶装置内のデータベースと
照合することにより菌種および生菌数が決定される。

【００１７】前記の処理手順を図３にフローチャートと
して示す。培地分注と菌液分注の前処理１０を経て、段
階希釈１１に入る。次いで、初期蛍光強度測定１２を行
う。測定値はライン１３でデータ処理・制御装置１４に
伝達される。初期蛍光強度測定後、培養１４を行う。そ
の後、培養後蛍光強度測定１５を行う。測定値はライン
１６でデータ処理・制御装置１４に伝達される。データ
処理・制御装置１４は外部記憶装置としてデータベース
１７を有する。伝達された測定蛍光値をデータベースと
照合し、菌数・菌種を決定し１８で出力する。

【００１８】図４に本発明の選択培地を使用する生菌数
測定・菌種同定システム２０の模式的構成を示す。図示
されたシステムは前記のように、基本的には段階希釈装
置４と蛍光測定装置５とデータ処理・制御装置６から構
成されている。特に排除するわけではないが、インキュ
ベータは７は一般的に、図示されたシステム２０には含
まれない。すなわち、このシステム２０を使用する者が
自ら準備するべきものとしている。図示された態様では
段階希釈装置４と蛍光測定装置５とがあたかも別個の分
離した装置のようになっているが、両者を結合して単一
のシステムとして構成できることは当業者に自明である
。図中、白抜太矢線Ｉ　〜ＩＩＩ　はプレートの搬送方
向を示すが、Ｉ　についてはシステム内で自動ハンドリ
ング機構（図示されていない）により行うことができる
。ＩＩおよびＩＩＩ　は手作業になる。

【００１９】段階希釈装置４の具体的装置構成自体は特
に限定されない。段階希釈の所期の目的を達成できるよ
うな装置構成であればよい。一例として、図示されてい
るように、Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｚ´軸移動機構２２を使用し、
Ｚ´軸に４連チップ分注機構２４を配設することができ
る。また、図示されていないが、チップは使い捨てなの
で、チップ供給・廃棄機構も配設することができる。段
階希釈装置は密閉ボックス内に収容し、ＵＶ（紫外線）
殺菌ランプ２８によりボックス内を無菌状態に維持する
ことが好ましい。

【００２０】蛍光測定装置５の具体的装置構成自体も特
に限定されない。しかし、システム２０では、下記の図
５に示すような光学系を有する測定装置を使用すること
が好ましい。図示された蛍光測定装置５は例えば、光学
系ユニット３０とプレートを移動させるためのＸ−Ｙテ
ーブル３２を有する。この図示された光学系ユニット３
０の特徴は、下記で詳細に説明するが、ホルダ３４に保
持された光ファイバー３６で蛍光を受光することである
。蛍光測定装置も密閉ボックス内に収容し、ＵＶ（紫外
線）殺菌ランプ２８によりボックス内を無菌状態に維持
することが好ましい。また、前記のように、段階希釈装
置４と蛍光測定装置５を一つの密閉ボックス内に収容す
ることもできる。

【００２１】前記のシステム２０では、段階希釈装置４
と蛍光測定装置５はデータ処理・制御装置６と結ばれて
いる。必要に応じて、拡張スロットボックス４０を介し
て結ぶこともできる。装置４と装置５が、このデータ処
理・制御装置６内に予めプログラムされた手順に従って
動作するように、データ処理・制御装置６は装置４と装
置５のコントローラの機能も果たしている。データ処理
・制御装置６は本体内のＣＰＵの他に、デーダベースを
格納するＨＤＤのような外部記憶装置４２を有すること
もできる。更に、制御内容を表示したり、測定結果を出
力するためのＣＲＴ４４およびプリンタ４６を備えるこ
とができる。

【００２２】図５に前記生菌数測定・菌種同定システム
２０の蛍光測定装置における光学系の概念構成図を示す
。光源として、例えば、キセンノンランプ５０を使用し
、背後に補助ミラー５２を配置し、前方にコンデンサレ
ンズ５４を配置すると共に、該レンズの前方に熱線吸収
フィルタ５６を配置することにより光源系を構成してい
る。コンデンサレンズ５４で平行にされた光線は特定の
波長の励起光のみを取り出すために励起光バンドパスフ
ィルタ５８を通される。このフィルタはモータにより回
転され、図示されているように０〜３の４種類の波長の
励起光が得られるようになっている。しかし、このフィ
ルタ数に限定されるわけではない。励起光の波長自体は
本発明の必須要件ではないが、一般的な指標として、大
腸菌およびサルモネラの場合、３６５または４７０ｎｍ
の波長の励起光を使用することが好ましい。一方、黄色
ブドウ球菌の場合は４９０ｎｍの波長の励起光を使用す
ることが好ましい。

【００２３】バンドパスフィルタ５８を通過した励起光
はリレーレンズ６２および可変絞り６４を通過する。平
行化励起光は可変絞り６４で絞られ、反射鏡６６で９０
°屈折される。屈折励起光は結像用レンズ６８で焦点合
わせされ、マイクロプレートのウエル（穴）７０内の検
体に照射される。別法として、励起光バンドパスフィル
タ５８を出た励起光は光ファイバ（図示されていない）
により誘導し、検体に照射することもできる。光ファイ
バーを使用すれば、リレーレンズ、可変絞り、反射鏡お
よび結像用レンズが不要になり、励起光のエネルギー減
衰を抑制することができる。

【００２４】検体から発生した蛍光は光ファイバーで受
光される。蛍光受光用光ファイバーの本数は１本以上（
例えば、６本）であればよい。光ファイバーは検体の周
囲を円形に取り囲むように配置することが好ましい。 このため、図４で簡単に示したようなホルダ３４で保持
することが好ましい。垂直入射励起光に対する光ファイ
バーの保持角度は特に限定されない。蛍光を受光するの
に最大の効率を達成できるような角度であればよい。こ
のような角度は当業者が容易に決定することができる。 一般的には、４５°が好ましい。

【００２５】光ファイバー７２で受光された蛍光は更に
蛍光側バンドパスフィルタ７４および励起光側バンドパ
スフィルタ７６に誘導される。フィルタ７４および７６
はフィルタ５８と同番号のフィルタを使用しなければな
らない。フィルタ７４およびフィルタ７６も、図示され
ていないが、モータ６０でフィルタ５８と同時に駆動制
御される。蛍光側バンドパスフィルタ７４は大腸菌およ
びサルモネラの場合には５２０および５３０ｎｍの波長
の蛍光を通過させるものを使用することが好ましい。フ
ィルタ７６は迷光励起光が存在していた場合に、蛍光強
度の外乱要因にならないようにデータから除去するため
に使用できる。しかし、このフィルタ７６は必ずしも使
用する必要はない。各フィルタの直後には光電子増倍管
７８および８０が配置されている。光電子増倍管からの
電気信号は増幅回路８２および８４を経て、図２および
図４に示されるようなデータ処理・制御装置に伝達され
る。

【００２６】次に、データベースの作成法について説明
する。生菌数に関するデータは従来の寒天平板法により
得られる。例えば、希釈倍率１０−６倍の検体から０．
１ｍｌ採取し、これを寒天平板に接種し３７℃で大気中
雰囲気で所定時間培養する。また、希釈倍率１０−７倍
の検体から０．１ｍｌ採取し、これを寒天平板に接種し
同様に３７℃で大気中雰囲気で所定時間培養する。培養
後、寒天平板上に出現したコロニー数を計数する。例え
ば、１０−６の検体の場合、コロニーが１００個出現し
、１０−７の検体の場合、コロニーが１０個出現した場
合、１０−６の検体における菌数は、１００×１０６　
×１０＝１０９　個／ｍｌになり、１０−７の検体では
、１０×１０７　×１０＝１０９　個／ｍｌになる。こ
の結果から、検体中の生菌数は１０９と推定される。こ
の測定を、例えば、培養開始から３時間、４．５時間、
６時間、７．５時間目にそれぞれ行うと経時的な菌数の
変化を示す特性曲線が得られる。

【００２７】また、これと同時に、前記の蛍光測定シス
テムを使用し、培養開始から３時間、４．５時間、６時
間、７．５時間目における蛍光強度を測定する。このデ
ータから特性曲線を作成すると、時間の経過により蛍光
強度が増大する様子が確認できる。従って、前記の各培
養時間における生菌数のデータと各培養時間における蛍
光強度のデータを合わせると、生菌数に対する蛍光強度
の検量線が作成できる。これをデータベースとして蓄積
保存する。従って、未知検体の菌種が同定されれば、そ
の菌種の生菌数／蛍光強度検量線データベースに測定蛍
光強度を当てはめれば生菌数が得られる。

【００２８】前記の菌種同定・生菌数推定方法およびシ
ステムで使用するデータベースの作成に関する基本的概
念は前記の通りである。従って、この方法およびシステ
ムの信頼性は取りも直さず、データベースの信頼性に依
存する。このため、出来るだけ多数の培養実験を繰り返
し、得られた結果を統計処理し、バラツキの最小化を図
り、可能な限り普遍的なデータベースを構築することが
好ましい。例えば、大腸菌には多数の種類の菌株および
変異株などが存在するので、培養条件および蛍光測定条
件を同一にしても、各菌または株により、同じ生菌数で
も蛍光強度に若干の変化が生じる。本発明の方法では大
腸菌群の中の特定の菌株までは同定できないので、検体
中に様々な大腸菌株が混在していたとしても、一般的総
称的な大腸菌の生菌数として推定される。サルモネラに
ついても同様である。

【００２９】前記のような菌株の相違などのようなファ
クタに起因して、ノイズが初期菌濃度の予測値に大きく
影響することがあるので、確固としたデータベースの確
立と共に、得られた蛍光強度の実測値をファジィ理論に
より処理することもできる。具体的な変数値（蛍光強度
測定値など）と言語によって表現されるファジィ変数（
蛍光強度が「大」など）を関係づける関数をメンバーシ
ップ関数と呼ぶ。また、「蛍光強度変化量が大きければ
、初期菌濃度は非常に大きい」などといった、事象の関
係をルールベースと呼ぶ。ファジィ理論によって、蛍光
強度の変化量から初期菌濃度を推定するには、各同定菌
種・希釈濃度ごとに蛍光強度の変化量から初期菌濃度を
推定するルールのデータベース（すなわち、ルールベー
ス）と各ファジィ変数のメンバーシップ関数を作成し、
データ処理装置内に記憶させる。この手法によれば、蛍
光強度の実測値に誤差が含まれていても、ファジィの特
徴である“あいまい性”の処理によって、期待値からの
ズレをある程度平滑化・補正し、ノイズをキャンセルし
て、初期菌濃度を信頼性高く実測することができる。こ
のルールベースおよびメンバーシップ関数、実験データ
の蓄積に伴い、順次修正・チューニングを行うことによ
って更に測定精度を高めることが可能になる。また、学
習機能を追加することによって、自動的にこれらのチュ
ーニングを行い、機能を向上させることができる。

【００３０】前記のような基本的概念に基づいて作成さ
れた検量線の一例を図６に示す。図６は大腸菌（ＪＣＭ
１６４９株）の培養における蛍光強度と生菌数の関係を
示すグラフである。白六角スポットは培養時間に対する
生菌数の経時的変化を示す特性曲線である。一方、●は
、培養時間に対する蛍光強度の経時的変化を示す特性曲
線である。

【００３１】本発明の選択培地では大腸菌とサルモネラ
の両方が生育する。従って、大腸菌だけの生菌数を求め
るには、サルモネラだけが生育できる選択培地（例えば
、本発明の選択培地にノボビオシンを加えたもの）でサ
ルモネラの生菌数をもとめておき、大腸菌とサルモネラ
の両方の生菌数測定値からサルモネラの生菌数を引き算
する必要がある。

【００３２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の選択培地
によれば、約８時間程度の短時間内に大腸菌およびサル
モネラの菌種を同定し、あわせて、これらの菌数を測定
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の選択培地が実際に使用されるマ
イクロプレートの一例の模式的平面図である。

【図２】図２は本発明の選択培地による菌種同定・生菌
数推定方法の処理の進行を示す模式的概念図である。

【図３】図３は本発明の選択培地による菌種同定・生菌
数推定方法の処理手順の流れを示すフローチャートであ
る。

【図４】図４は本発明の選択培地による菌種同定・生菌
数推定方法の実施に使用されるシステムの一例の模式的
構成図である。

【図５】図５は図４のシステムで使用される蛍光測定の
ための光学系の模式的構成図である。

【図６】図６は大腸菌の培養における蛍光強度と生菌数
の関係を示す特性曲線である。

【符号の説明】

１　　マイクロプレート ２　　培地分注ゾーン ３　　菌液分注ゾーン ４　　段階希釈装置 ５　　蛍光測定装置 ６　　データ処理・制御装置 ７　　インキュベータ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ｋ２　ＨＰＯ４　、ＫＨ２　ＰＯ４　
   、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、（ＮＨ４　）２　ＳＯ４
   　、ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅおよびグルコースからなるこ
   とを特徴とする大腸菌およびサルモネラ用選択培地。
2. 【請求項２】　　下記の組成、Ｋ２　ＨＰＯ４　　　　
   　　　　　　　７　　ｇ／ｌ，ＫＨ２　ＰＯ４　　　　
   　　　　　３　　　　ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　
   Ｏ　　０．１ｇ／ｌ，（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　０
   ．１ｇ／ｌ，ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　　１　　　　ｇ／
   ｌ，グルコース　　　　　　　　　　２　　　　ｇ／ｌ
   ，を有することを特徴とする請求項１の大腸菌およびサ
   ルモネラ用選択培地。