RU2276190C2 - Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей - Google Patents
Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2276190C2 RU2276190C2 RU2004116675/13A RU2004116675A RU2276190C2 RU 2276190 C2 RU2276190 C2 RU 2276190C2 RU 2004116675/13 A RU2004116675/13 A RU 2004116675/13A RU 2004116675 A RU2004116675 A RU 2004116675A RU 2276190 C2 RU2276190 C2 RU 2276190C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteria
- yeasts
- assay
- fungi
- yeast
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, касается определения микроскопических грибов, бактерий или дрожжей в анализируемой пробе и может быть использовано в медицине, фармацее, пищевой и легкой промышленностях. Изобретение предусматривает использование хемилюминесцентного состава, включающего в себя щелочной раствор люминола, к которому добавляют перекись водорода. Определения присутствия микроскопических грибов, бактерий и дрожжей осуществляют на сертифицированном анализаторе жидкостей хемилюминесцентном ЛИК путем смешения пробы с хемилюминесцентным составом в его реакционной камере с последующей регистрацией кривой кинетики хемилюминесценции, по расчетным параметрам которой определяют принадлежность микроорганизма к бактериям, грибам или дрожжам. Преимуществом предложенного способа являются: отсутствие термостатирования, быстрота (100 с) получения результата, достоверность и точность результатов, а также возможность идентифицировать бактерии, дрожжи, микроскопические грибы. 4 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к способу экспрессного определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции и может быть использовано в медицине, формации, пищевой и легкой промышленности, в сельском хозяйстве, нефтедобывающей промышленности и при защите сырья, материалов и изделий из них от микроорганизмов.
Известен способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей путем высева анализируемых проб на селективные питательные среды в чашки Петри, термостатирования в течение 24-72 часов при температуре (25-37)±1°C. О принадлежности микроорганизмов к данной группе судят по характеру роста на конкретной среде и по виду колоний. Способ весьма трудоемок и продолжителен во времени. (Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология, "ГЭОТАР медицина", М., 1999. - 1183 с.)
Известен быстрый (15-30 мин) способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, основанный на методах окраски с последующим микроскопированием (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований, "Медицина", М., 1978. - 391 с.). Способ включает следующие операции: приготовление фиксированного мазка исследуемого образца, окрашивание препарата, промывание водопроводной водой, подсушивание и микроскопирование с иммерсионной системой. О принадлежности микроорганизмов к бактериям, грибам или дрожжам судят по морфологическим особенностям окрашенного препарата.
Недостатком этого способа является большая трудоемкость, обязательное использование спецлаборатории, дорогостоящих приборов, посуды, оборудования и недостаточная чувствительность.
Техническая задача, на решение которой направлен заявленный экспрессный способ, являлось определение микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции, при контроле повреждений микроорганизмами сырья, материалов и изделий из них, снижение трудоемкости, исключение использования спецлаборатории, спецоборудования и приборов, снижение числа используемой посуды, реактивов, повышение чувствительности.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе, включающем:
1. Растворение исследуемой пробы в стерильном физрастворе.
2. Помещение реактива (0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8), к 100 см3 которого добавляют 0,3-1,0 см3 30%-ной перекиси водорода) в кювету для анализа.
3. Смешение реактива с растворенной пробой в реакционной камере прибора.
4. Контроль параметров кинетики протекающей люминольной реакции.
Вышеперечисленные действия анализа проводят с помощью анализатора жидких проб (Патент №2009466 от 15.03.1994 г., G 01 N 15/02), сертифицированного как анализатор жидкостей хемилюминесцентных ЛИК (сертификат РФ №14433 от 27.03.03, Госреестр РФ №24512-03 от 12.03.03.)
Известно (Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, М.: Ин. лит-ра, 1966. - 728 с.), что абсолютное большинство микробов содержат в своих биохимических системах ферменты группы оксидаз. Эти ферменты ответственны за окислительно-восстановительные процессы, в составе которых имеется железопорфирины.
При смешивании анализируемой пробы, содержащей микробные клетки, с раствором люминола они денатурируют и оксидазные ферменты катализируют распад перекиси водорода по цепному свободно радикальному процессу. Возникает перенос электрона (гомолиз)
Fe2++Н2O2→Fe3++ОН-+ОН*
И последующие реакции
В процессе последних реакций рекомбинации свободных радикалов образуются короткоживущие соединения типа ассоциированного и неассоциированного Ван-дер-Ваальсовского комплексов кислорода, обладающие избыточной энергией, которая трансформируется люминолом в световую по реакции:
Таким образом, люминол выступает в роли трансформатора избыточной энергии комплексов кислорода в световую, а перекись водорода выступает в качестве их источника при ее катализе ферментами группы оксидаз.
Для регистрации квантов света используют анализатор жидкостей ЛИК, технические характеристики которого позволяют регистрировать кинетику хемилюминесценции, производить расчет ее параметров, по совокупности которых проводят определение либо микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.
На фиг.1 представлена кинетическая кривая хемилюминесценции и ее регистрируемые параметры, где по оси абсцисс отложено t - время, сек; по оси ординат Iхл - интенсивность хемилюминесценции, отн.ед. (1 отн.ед=1,6375×10-11 Лм, люмен); Am - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, отн.ед.; tm - время достижения интенсивности хемилюминесценции своего максимального значения, сек; S - площадь под кривой кинетики хемилюминесценции, отн.ед.×с.
На фиг 2-4 представлены кинетические кривые хемилюминесценции, получаемые от грибов, бактерий и дрожжей:
фиг.2 - форма кривой кинетики, инициируемая микроскопическими грибами;
фиг.3 - форма кривой кинетики, инициируемая дрожжами;
фиг.4 - форма кривой кинетики, инициируемая бактериями.
В таблице 1 приведены конкретные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции при анализе проб, содержащих вышеуказанные микроорганизмы.
Пример: проводили анализ смывов с поверхностей оборудования, которое эксплуатировалось на колбасном заводе, хлебозаводе, продовольственном магазине (поверхности корпуса и лопастей смесителей, поверхности холодильных установок, столов расфасовки и обеденных столов). Смыв осуществляли стерильным физиологическим раствором с соблюдением мер стерильности и проводили анализ смывной жидкости на приборе ЛИК.
Перед проведением анализа отобранных проб готовили разведения чистых культур микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в стерильном физрастворе концентрацией 105-106 клеток/см3. Концентрацию клеток в разведении контролировали с помощью прибора мутности. В качестве чистых культур использовали Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium glaucum. Готовили прибор ЛИК к работе согласно инструкции.
Полученные разведения чистых культур поочередно анализировали на приборе ЛИК, регистрируя при этом значения максимальной интенсивности хемилюминесценции, время достижения хемилюминесценции своего максимального значения и площадь под кривой хемилюминесценции. Каждый анализ культуры проводили десять раз, вычисляли среднее значение контролируемых параметров и запоминали в памяти компьютера. Полученные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции чистых культур в последующем использовали как контрольные при анализе проб, отобранных с поверхностей различных объектов.
Для этого в кювету прибора наливали 0,5 см3 анализируемой пробы и помещали ее в реакционную камеру. Камеру закрывали крышкой-дозатором, в полость которого наливали 0,5 см3 хемилюминесцентного состава. Закрывали крышку прибора, нажимали на кнопку, "Пуск", а затем на крышку прибора. При этом хемилюминесцентный состав из полости крышки-дозатора через калиброванное отверстие вводился в кювету с пробой. При наличии в ней микробных клеток реакционная смесь начинает светиться. Свет преобразуется в электрический сигнал, который обрабатывается по специальному алгоритму и отображается на экране компьютера в виде кривой кинетики, и автоматически компьютер рассчитывает контролируемые ее параметры. Рассчитанные параметры анализируемой пробы сравниваются с представленными в таблице 1 и таким образом определяют наличие в анализируемой пробе микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.
Хемилюминесцентный состав готовят путем смешения 100 см3 0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8) с 0,3-1,0 см3 30%-ной перекиси водорода.
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый способ позволяет проводить экспрессное определение в пробах разной консистенции микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблицах 2-4.
Использование предлагаемого экспрессного способа имеет следующие преимущества:
- нет надобности в сложной подготовке проб к анализу;
- для определения в анализируемых пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей используется хемилюминесцентный состав и прибор отечественного производства с чувствительностью 30-70 КОЕ/см3, а сама кривая кинетики хемилюминесценции отображается в процессе анализа на мониторе компьютера, что позволяет оператору исключить ошибки при проведении анализа;
- определение в пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей по параметрам кривой кинетики хемилюминесценции проводится впервые в микробиологической практике, которые прямо связаны с морфологией и особенностями биохимических систем их клеток, содержащих ферменты группы оксидаз;
- быстрота (100 с) получения аналитического эффекта и отсутствие последствия;
- впервые обеспечена возможность быстро проводить определение указанных микроорганизмов непосредственно на объектах контроля, в том числе и на открытой местности;
- исключены посев проб на селективные питательные среды, их термостатирование и микроскопирование.
| Таблица 1 Контролируемые параметры кинетики хемилюминесценции при анализе проб |
|||||||
| Микроорганизмы | Аm, отн.ед. | tm, сек. | S, отн.ед | ||||
| Микроскопические грибы | 5,5±4,5·106 | 0,2±0,1 | 10,3±9,7·108 | ||||
| Бактерии | 4,3±4,2·107 | 4,5±2,5 | 7,8±7,47·109 | ||||
| Дрожжи | 2,1±2,0·107 | 1,15±1,12 | 3,28±3,22·108 | ||||
| Таблица 2 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах колбасного завода |
|||||||
| Контролируемый объект | Am, отн.ед. | tm, сек | S, отн.ед | Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей | |||
| Контрольные пробы | |||||||
| Физиологический раствор | 4,6·105 | 0,04 | 2,7·106 | нет | |||
| Escherichia coli | 1,3·106 | 6,39 | 1,6·107 | бактерии | |||
| Saccharomyces cerevisiae | 1,6·106 | 2,22 | 4,6·107 | дрожжи | |||
| Penicillium glaucum | 1,2·106 | 0,21 | 1,4·107 | грибы | |||
| Пробы с объектов | |||||||
| Разделочный стол | 6,6·105 | 0,05 | 2,3·106 | нет | |||
| Пол | 4,4·106 | 0,24 | 4,3·107 | грибы | |||
| Бак с отходами | 2,6·106 | 6,50 | 7,8·107 | бактерии | |||
| Обеденный стол | 1,2·106 | 6,39 | 1,6·107 | бактерии | |||
| Таблица 3 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах хлебозавода |
||||
| Контролируемый объект | Am, отн.ед. | tm, сек | S, отн.ед | Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей |
| Контрольные пробы | ||||
| Физиологический раствор | 4,6·105 | 0,04 | 2,7·106 | нет |
| Escherichia coli | 1,3·106 | 6,39 | 1,6·107 | бактерии |
| Saccharomyces cerevisiae | 1,6·106 | 2,22 | 4,6·107 | дрожжи |
| Penicillium glaucum | 1,2·106 | 0,21 | 1,4·107 | грибы |
| Пробы с объектов | ||||
| Лопасти смесителя | 4,2·106 | 0,60 | 5,4·107 | дрожжи |
| Поверхность корпуса | 1,0·107 | 2,12 | 2,2·108 | дрожжи |
| Пол в раздевалке | 2,4·106 | 0,12 | 2,3·107 | грибы |
| Таблица 4 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах продовольственного магазина |
||||
| Контролируемый объект | Am, отн.ед | tm, сек | S, отн.ед | Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей |
| Контрольные пробы | ||||
| Физиологический раствор | 5,3·105 | 0,04 | 3,1·106 | нет |
| Escherichia coli | 1,1·106 | 6,82 | 3,2·107 | бактерии |
| Saccharomyces cerevisiae | 2,4·106 | 1,90 | 3,8·107 | дрожжи |
| Penicillium glaucum | 6,9·106 | 0,15 | 5,7·107 | грибы |
| Пробы с объектов | ||||
| Стены | 2,1·106 | 7,02 | 7,9·107 | бактерии |
| Пол | 1,4·107 | 0,12 | 1,5·108 | грибы |
| Стол для резки | 3,6·105 | 0,04 | 1,8·106 | нет |
Claims (1)
- Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в анализируемой пробе, отличающийся тем, что пробу смешивают с реактивом, включающим в себя 0,1-0,8%-ный раствор люминола в щелочи с рН 9,0-13,0 в 100 см3 которого добавляют 0,3-1,0 см3 30%-ной перекиси водорода в кювете анализатора жидкостей хемилюминесцентного ЛИК, регистрируют параметры хемилюминесценции: максимальную ее интенсивность (Аm), время достижения максимума хемилюминесценции (tm) и площадь по кривой хемилюминесценции (S), по совокупности значений которых устанавливают наличие в пробе микроскопических грибов, бактерий и дрожжей.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004116675/13A RU2276190C2 (ru) | 2004-06-02 | 2004-06-02 | Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004116675/13A RU2276190C2 (ru) | 2004-06-02 | 2004-06-02 | Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004116675A RU2004116675A (ru) | 2005-11-10 |
| RU2276190C2 true RU2276190C2 (ru) | 2006-05-10 |
Family
ID=35865242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004116675/13A RU2276190C2 (ru) | 2004-06-02 | 2004-06-02 | Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2276190C2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008013512A1 (fr) * | 2006-07-25 | 2008-01-31 | Gosudarstvennyj Nauchno-Issledovatelskij Kontrolnyj Institut Veterinarnych Preparatov I Kormovych Dobavok | Procédé pour déterminer la quantité d'objets microbiologiques pendant la culture de ceux-ci |
| RU2522203C2 (ru) * | 2012-06-26 | 2014-07-10 | Василий Александрович Ишутин | Способ контроля стерилизации материалов и изделий |
| RU2549989C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО "ДВГМУ" Минздрава России) | Способ микроскопического исследования нативного соскоба корня языка |
| RU2636623C1 (ru) * | 2017-02-01 | 2017-11-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ДВГМУ Минздрава России) | Микробиома корня языка как прогностическая модель дисбиотического состояния генитального тракта у беременных |
-
2004
- 2004-06-02 RU RU2004116675/13A patent/RU2276190C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЛАБИНСКАЯ А.С. Практическое руководство по микробиологическим методам исследований. - М., 1963, с.421-424. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. БИРГЕРА М.О. - М.: Медицина, 1982, с.114-115. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008013512A1 (fr) * | 2006-07-25 | 2008-01-31 | Gosudarstvennyj Nauchno-Issledovatelskij Kontrolnyj Institut Veterinarnych Preparatov I Kormovych Dobavok | Procédé pour déterminer la quantité d'objets microbiologiques pendant la culture de ceux-ci |
| RU2522203C2 (ru) * | 2012-06-26 | 2014-07-10 | Василий Александрович Ишутин | Способ контроля стерилизации материалов и изделий |
| RU2549989C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО "ДВГМУ" Минздрава России) | Способ микроскопического исследования нативного соскоба корня языка |
| RU2636623C1 (ru) * | 2017-02-01 | 2017-11-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ДВГМУ Минздрава России) | Микробиома корня языка как прогностическая модель дисбиотического состояния генитального тракта у беременных |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004116675A (ru) | 2005-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6019143B2 (ja) | 試料内の微生物因子の迅速な同定および／または特徴付けのためのシステムおよび方法 | |
| CN101819200B (zh) | 微生物检测装置、检测方法、以及用于该装置的试样容器 | |
| EP2455455B1 (en) | Optical method and device for detection and enumeration of microorganisms | |
| CN101978068B (zh) | 用于推测性鉴定培养物内微生物类型的系统和方法 | |
| JPS5991900A (ja) | 微生物細胞中のａｔｐの測定方法 | |
| KR20130038345A (ko) | 미생물 검출 시스템 및 방법 | |
| CN104303055A (zh) | 检测和监测水中毒性的设备和方法 | |
| US5897993A (en) | Method of determining the number of bacteria quickly and a device for determining the number of bacteria | |
| Shi et al. | A qualitative and quantitative high-throughput assay for screening of gluconate high-yield strains by Aspergillus niger | |
| RU2276190C2 (ru) | Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей | |
| US20120122138A1 (en) | Consumable component kit | |
| JP2006509514A (ja) | 細菌を同定するための方法および装置 | |
| NO308545B1 (no) | FremgangsmÕte ved hurtig pÕvisning av soppinfeksjoner, samt et sett for bruk ved en slik fremgangsmÕte | |
| Kadhum et al. | Staphylococcus aureus Incidence in Some Patients with a Topic Dermatitis in Baghdad City | |
| JP2019162034A (ja) | 自動微生物検査装置 | |
| US10822373B2 (en) | Methods for synthesizing phycocyanin using a biological substance | |
| Sieben | Characterization of the permeability of sealing tapes and development of a viscosity measuring technique in shaken reactors | |
| JP4975658B2 (ja) | 微小ウェル内に分配するための容器 | |
| Lange et al. | A new method for the determination of Leuconostoc mesenteroides cell number | |
| JPH01128781A (ja) | 生菌数測定方法 | |
| JP5857430B2 (ja) | 水系への薬注制御方法 | |
| JPH06181743A (ja) | 生菌数測定装置 | |
| CN115466778A (zh) | 一种微生物检测方法及冰箱 | |
| Ceccato-Antonini | Microbiological Techniques and Methods for the Assessment of Microbial Contamination | |
| RU2264467C2 (ru) | Способ обнаружения бактерий группы кишечных палочек |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060603 |