JPH03272697A - 微生物生細胞の計数方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物細胞の計数方法に関し、特に食品プラン
ト、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質管理
や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法に関す
る。

〔従来の技術〕

生細胞の計数方法として従来量も広く用いられているの
は寒天培養法である。この方法は微生物の栄養源を溶か
し込んだ寒天に試料を分散させて培養し、寒天にコロニ
ーを形成させ、このコロニー数を計数することにより生
細胞数を求めるものであるが、培養操作を伴うため測定
に必要な時間は１〜数日と長時間必要であり、原料や製
品の品質管理、殺菌管理に支障をきたす場合が多゛い。

そこで、生細胞を短時間で計測しようとする試みがいく
つかなされている。例えば、■生細胞中に存在するＡＴ
Ｐ　（アデノシン三リン酸）と、ホタル酵素であるルシ
フェリンルシフェラーゼを作用させることにより生ずる
発光量を測定し、その発光量から間接的に生細胞数を求
める方法、■ウンベリフェロン誘導体を試料に作用させ
、生細胞に含まれる加水分解酵素との反応により生ずる
蛍光性のウンベリフェロンの蛍光強度を測定し、その蛍
光強度から生細胞数を間接的に求める方法などがある。

しかし、これらの方法は細胞濃度が約１０’個／−以上
存在しないと発光量が少ないため計測が難しく、これ以
下の細胞濃度の試料の場合、４〜５時間以上かけて培養
を行い濃度を高めてから測定するか、又は遠心分離によ
り細胞を濃縮するなどの前処理が必要であり、低濃度（
数個／−〉の細胞試料を短時間に計測する目的からする
と適用することは難しかった。

さらに、上述のいずれの従来法も連続的に計測すること
ができないため、殺菌プロセス、発酵プロセスに組み込
み、微生物を計測、制御することはできなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の短時間微生物計測法であるＡＴＰ法、ウンベリフ
ェロン法の最大の問題の一つは、微生物濃度の高い試料
しか適用できないことである。この原因はＡＴＰ法の場
合、細胞に含まれるＡＴＰを熱処理又は界面活性剤など
により溶液中に放出させてからルシフェリンルシフェラ
ーゼを作用させ、液の発光量を測定することにより間接
的に細胞数を把握する方法であるため個々の細胞の発光
計測ができないこと、また測定装置も個々の細胞の発光
計数ができるシステム構成になっていないことなどがあ
げられ、これはウンベリフェロン銹導体を用いる方法で
も共通の課題である。

本発明は上記技術水準に鑑み、短時間のうちに微生物生
細胞を計数できる方法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、先ず個々の細胞の発光計数を可
能とするため、種々化学物質について実験・検討した結
果、フルオレセイン誘導体が生細胞中に含まれる酵素と
反応し細胞内に蛍光物質であるフルオレセインを生成・
蓄積するのでウンベリフェロンのように細胞外へほとん
どの色素が流出してしまうことがなく、励起光を照射し
た場合、個々の細胞が蛍光を発し、光の点として計測で
きることを知った。

本発明は上記知見に基いて、フルオレセン誘導体のよう
な生細胞中の酵素と反応することにより細胞中に蛍光物
質を生成蓄積する性質をもつ物質を用い、細胞に励起光
を照射し、細胞内の蛍光物質を励起させ、蛍光を発する
個々の細胞を計数することにより、短時間でかつ低濃度
の細胞でも測定を可能とすることができることを確認し
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は （１）微生物生細胞を計数する方法において、細胞内に
蓄積した傾向物質を励起するに必要な波長を有する光源
、細胞試料を連続的に通過、測定するためのセル、生細
胞の発する蛍光を受光するための受光素子、受光素子の
出力をカウントするカウンターを設け、該セルは測定部
において該測定部の流れ方向と直交する断面形状が横方
向に長く縦方向に短い長方形であり、励起光を照射し横
方向に長い正面部から細胞の発する蛍光を受光素子によ
り受光させる微生物生細胞の計数方法。

（２）細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の受光素
子により受光させることを特徴とする上記（１）記載の
微生物生細胞の計数方法。

（３）励起光がセルの側面部から照射されることを特徴
とする上記（１）又は（２）記載の微生物生細胞の計数
方法。

（４）細胞内に蛍光物質を蓄積させる物質としてフルオ
レセン誘導体を使用することを特徴とする上記（１）〜
（３）いずれかに記載の微生物生細胞の計数方法。

（５）　　フルオレセン誘導体がフルオレセン・ジアセ
テートであることを特徴とする上記（４）記載の微生物
生細胞の計数方法。

（６）　　フルオレセン誘導体が５−カルボキシフルオ
レセンジアセテート及び／又は６−カルボキシフルオレ
センジアセテートであることを特徴とする上記（４）記
載の微生物生細胞の計数方法。

（７）　　フルオレセン誘導体が５−カルボキシ−２′
７′−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／又は６
′−カルボキシ−２，７′−ジクロロフルオレセンジア
セテートであることを特徴とする上記（４）記載の微生
物生細胞の計数方法。

である。

〔作用〕

フルオレセイン誘導体を試料に所定温度、所定時間作用
させると、生細胞に含まれる酵素とフルオレセン誘導体
が反応し、生細胞中にフルオレセインが生成する。この
試料にフルオレセインを励起するに必要な波長を有する
光を照射すると、フルオレセインは蛍光を発し生細胞は
個々の光の点として計測できるようになる。

低濃度の試料でも精度よく計数するためには、例えば、
数個／ｉａｌ！の試料の場合、最低でも１−１信頼性の
あるデータを得ようとすればｌＯｍｊ！の試料を計測す
る必要があり、さらに微生物濃度が低い場合には測定試
料もさらに多くする必要がある。

そこで多量の試料を処理・計測するための手段として、
透明セル内を連続的に試料を通過させ、このセルにフル
オレセインを励起させるための光を照射し、個々の細胞
から発する蛍光を光の点として計測する方法がある。こ
の時重要なのはセルの形状であり、細胞の発する蛍光を
受光器に受光させるためにはなるべくセルの厚みを薄く
する必要がある。これは、セル厚みが大きいとセルを通
過する試料の液厚みも厚くなるため細胞に焦点をあてに
くくなり、細胞の蛍光を受光器に受光させる際感度が低
下するためである。そこでセル厚みが薄く、かつ多量の
試料の処理を可能とするため、横方向に長く、縦方向に
短い長方体のセルを採用し、縦方向に短いセルの側面部
から励起光を照射する。細胞の発する蛍光は横方向に長
いセルの正面部から受光、即ちセルの厚みの薄い方向か
ら受光することになる。

横方向に長いセル部からの蛍光を受光するために、−殻
内にはフォトマルチプライヤ−を使用することが考えら
れるが、横幅のセルでは集光が難しく、セル面を走査す
るなど面倒な光学機構が必要となる。

そこで、本発明では受光素子は１個でもよいが、なるべ
く複数個の受光素子をセル横方向に並べておき、レンズ
光学系を介して受光素子に受光させるようにすることが
好ましい。本発明方法によりセル内を通過する全試料の
計測が可能となりまたセルの幅を必要に応じて長くでき
るので多量の試料の処理が可能となる。

本発明者らは、多くのフルオレセン誘導体につき実験研
究の結果、先ず、フルオレセンジアセテート（以下、Ｆ
ＤＡと略称する）が上記目的を遠戚する好ましい物質で
あることを確認した。ＦＤＡと酵素の反応は下記の通り
である。

ＦＤＡ 上述したように、ＦＤＡは十分それなりに効果を奏する
−が、連続的に長時間計測を行っていると、セルの壁面
に未溶解のＦＤＡが付着して計測が困難となったり、ま
た試料ラインに付着したＦＤＡが剥離してセルを通過し
誤計測の原因となることが判り、長時間の連続計測を行
う場合、試料ラインやセル壁面を時々洗浄してやる必要
のあることが判った。この問題点のないフルオレセン誘
導体のないものを更に探索した結果、５−カルボキシフ
ルオレセンジアセテート及ヒ／又は６−カルボキシフル
オレセンジアセテート（以下、Ｃ−ＦＤＡと略称する）
又は５−カルボキシ−２’、？’　−ジクロロフルオレ
センジアセテート及び／又は６−カルボキシ−２’、７
’−ジクロロフルオレセンジアセテート（以下、ＣＤＣ
−ＦＤＡと略称する）が極めて好ましい物質であること
が判った。

Ｃ−ＦＤＡ、ＣＤＣ−ＦＤＡはそれ自体に蛍光がないが
、生細胞内に存在する酵素、特にエステラーゼと反応し
て、蛍光物質がある５−力ルボキシフルオレセイン及び
／又は６−カルボキシフルオレセインあるいは５−カル
ボキシ＝２７．７／　−ジクロロフルオレセイン及び／
又は６−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセ
インを細胞内に蓄積する。Ｃ−ＦＤＡ。

ＣＤＣ−ＦＤＡと酵素の反応は下記の通りである。

（ＣＤＣ−ＦＤＡ） （Ｃ−ＦＤＡ） Ｃ−ＦＤＡ、ＣＤＣ−ＦＤＡの水に対する溶解度は両者
共１００μｇ１ｍ１以上ある。細胞試料への添加量は５
０〜１００μｇ／−で行うので十分溶解することができ
、セル壁面や試料うインへの付着といった問題は起こら
ない。

ちなみに、ＦＤＡの溶解度は１μｇ／−以下と水に対し
非常に難溶性であるため、未溶解のＦＤＡがセル壁面、
試料ラインに徐々に付着し、洗浄操作が不可欠になると
いう問題を生ずる。

細胞内に蓄積した蛍光物質を特定波長の光で励起させて
やるとこれらが蛍光を発し、生きている細胞のみが光る
ので、これを計数すれば生菌数を求めることができる。

なお、死んだ細胞には酵素が失活しているため蛍光物質
を生ずる反応は起こらず従って励起光を照射しても蛍光
は発しない。

〔実施例１〕 本発明の一実施例を第１図によって説明する。

第１図において、（ａ）は本発明を実施する装置の全体
図、（ｂ）は第１図（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（Ｃ）は第
１図（ａ）の■−■断面図である。

ラインＰ、より測定対象試料が反応器ｖ１に流入し、ラ
インＰ、よりアセトンで溶解されたＦＤＡが注入される
。反応器Ｖｌで試料とＦＤＡは一定時間、一定温度に保
たれた後、セルＶ、に流入する。

対象微生物の種類により、作用させるＦＤＡ濃度、反応
時間は異なるが、酵母の場合ＦＤＡ濃度は５０〜１００
μｇ　／　ｔｄ、反応時間は５〜１０分、大腸菌、枯草
菌ではＦＤＡ濃度は１００〜１５０μｇ／ｄ、反応時間
は１０〜２０分が適当である。なお、反応温度は３０〜
３７℃が適当であり、１０℃以下又は４５℃以上の条件
では生菌とＦＤＡとはほとんど反応せず計測はできなく
なる。

反応器ＶＩにて、試料中の生菌だけがＦＤＡと反応して
細胞内にフルオレセインを蓄積しセルＶ、に流入するが
、ここでフルオレセインを励起させるために光を照射す
る。１はそのための励起光源、２は集光レンズ、３は励
起フィルターであり、ここでは励起光源として水銀ラン
プ、励起フィルターとして４５０〜４９０ｎｍの波長を
通過する特性をもつものを使用している。

フルオレセインを励起させることができる波長（４５０
〜４９０　ｎｍ）を有すれば励起光源は水銀ランプでな
くとも構わない。

励起光をセルＶ２の側面部から照射すると、照射された
部分に存在する生細胞は蛍光を発する。セルＶ、には横
方向に長い正面部にスリット４が設けられており、この
スリット４部を通過する細胞のみを計数するためにスリ
ット４以外の部分は光を通過しないようにしである。

このスリット４０幅は細胞の種類、大きさによっても異
なるが、酵母の場合、５０μｍ１またセルｖ２の大きさ
は励起光照射側の側面部で、１００μｍ、蛍光受光側の
正面部（横方向）は５００μｍのものを使用した。なお
、セル■２の上下は試料の通過、洗浄を行いやすくする
ため大きくしである。

生細胞の発する蛍光スペクトルは５１２ｎｍ付近にピー
クをもつ。５は蛍光フィルターで５１０ｎｍ以上の波長
の光を通過させ、４５０〜４９０ｎｍの励起光をカット
する役割を果す。

スリット４を通過する生細胞の蛍光は蛍光フィルター５
、集光レンズ６を介し、スリット４に対応して直線上に
並んだ複数個の受光素子７に受光させる。受光素子７の
数は細胞の種類、セルＶ７幅によって異なるが、酵母の
場合１０個の受光素子をもつフォトダイオードアレイを
用いた。

８は受光器回路、９は受光器回路からの出力をカウント
するパルスカウンタであり、スリット４を通過する生細
胞数を計数するためのものである。

〔実施例２〕 Ｃ−ＦＤＡを用いて行った本発明の一実施例を第２図に
よって説明する。ラインＰ＋より測定対象試料が反応器
Ｖ、に流入し、ラインＰ２よりアセトンで１　ｍ、ｇ／
−の濃度に調整したＣ−ＦＤＡを注入する。注入量は対
象試料に対し容量比テ１／ｌＯ〜１７２０程度（Ｃ−Ｆ
ＤＡ（Ｄ添加濃度としては５０〜１００μｇ／ｒＲ１）
が適当である。

反応器Ｖ１で試料とＣ−ＦＤＡは一定時間、一定温度に
保たれた後Ｐ、を経由してセルＶ２に流入する。

実験で用いた試料は約１０３個／ｄの濃度に調整した酵
母菌であり、この場合反応器Ｖ１にて３７℃、５分間試
料とＣ−ＦＤＡを作用させた。反応器Ｖ１ではＣ−ＦＤ
Ａと生酵母が有する酵素との反応により酵母の中に蛍光
物質である５−カルボキシフルオレセイン及び／又は６
−カルボキシフルオレセインが蓄積される。

第３図に上記蛍光物質の励起スペクトル、蛍光スペクト
ルを示す。これかられかるように励起スペクトルの最大
値は４９０ｎｍ近辺に、また蛍光スペクトルの最大値は
５１５ｎｍ近辺に有する。

そこで、蛍光物質を励起する光源１としては４９０ｎｍ
に近い波長である４８８ｎｍのアルゴンレーザー（出力
１ｍＷ）を用いた。レーザー光はミラー２迷光除去用の
ピンホールスリット３、ミラー４、集光レンズ５を介し
てセルＶ、を通過する細胞試料に、照射されるが、この
時生細胞は蛍光を発する。

この蛍光を集光レンズ６．８で集光し視野絞り９を介し
て受光素子（こ＼では光電子増倍管）１０で蛍光を増倍
し、パルスカウンタ（こ＼ではフォトンカウンタ）　１
１で蛍光をカウンティングすることにより細胞数を計数
する。

なお、集光レンズ６．８の間では蛍光スペクトルの最大
値である５１５ｎｍ近辺の波長のみを通過するバンドパ
スフィルタ７を設置した。

セルＶ、の大きさは横０．１ｃｍ、縦０．０１ｃｍ。

高さ５ｃＩＩであり、励起光の照射は、縦方向に短いセ
ルの側面部から行い、細胞の発する蛍光は横方向に長い
セルの正面部から受光、すなわち、セルＶ、の厚みの薄
い方向から受光することとし、試料のセルＶ、内の通過
速度は１　ｃｍ　／　ｓｅｃとした。

第４図はこの計測結果であり、１０秒間にセルを通過す
る細胞数をカウントしたものである。

セルの断面積は０．ＩＸｏ、０１＝０．００１ｃｍ”流
速は１ｃｍ／ｓｅｃであるから、流量は０．００１ｃｍ
３／ｓｅｃとなり、１０秒間では０．０１　ｃｒｎ’通
過することになる。第４図から、パルスカウント数は１
１個存在するから、１１個／　０．０１　ｃｍ３＝１．
１Ｘ１０’個／−の濃度の細胞数であったことがわかり
、調整した試料濃度の約１０３個／−とほぼ一致する。

ちなみにＦＤＡを使用した場合（反応条件、通水条件は
Ｃ−ＦＤＡと同じ）通水１０分程度まではうまく測定で
きるが、それ以上通水を続けると壁面に未溶解のＦＤＡ
が付着し測定ができなくなるのに対し、Ｃ−ＦＤＡでは
１０時間以上通水しても安定に計測が可能である。

〔実施例３〕 実施例２のＣ−ＦＤＡに代え、ＣＤＣ−ＦＤＡを用いて
本発明の実施例を行った結果、実施例２と同様゛な結果
が得られた。

〔発明の効果〕

本発明により従来１〜数日と長時間必要であった生細胞
の測定が分単位で行えるようになり、また、セルの形状
、励起光照射方法、蛍光受光方法の新しい配設手段によ
って多量の試料処理が可能となり、低濃度の細胞試料で
も計測ができるようになった。

また、本発明は食品分野等における微生物検査の省力化
、原料・製品の品質管理、殺菌管理に極めて高い効果を
発揮するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施する装置の一態様を示し、（ａ）
はその全体図、ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（Ｃ）は
（ａ）の■−■断面図である。 第２図は本発明の実施する装置の他の態様を示す図、第
３図はＣ−ＦＤＡによって生成された蛍光物質の励起、
蛍光スペクトルを示す図表、第４図は本発明の実施例２
で計数した計測結果を示す図表である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物生細胞を計数する方法において、細胞内に
   蓄積した傾向物質を励起するに必要な波長を有する光源
   、細胞試料を連続的に通過、測定するためのセル、生細
   胞の発する蛍光を受光するための受光素子、受光素子の
   出力をカウントするカウンターを設け、該セルは測定部
   において該測定部の流れ方向と直交する断面形状が横方
   向に長く縦方向に短い長方形であり、励起光を照射し横
   方向に長い正面部から細胞の発する蛍光を受光素子によ
   り受光させることを特徴とする微生物生細胞の計数方法
   。
2. （２）細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の受光素
   子により受光させることを特徴とする請求項（１）記載
   の微生物生細胞の計数方法。
3. （３）励起光がセルの側面部から照射されることを特徴
   とする請求項（１）又は（２）記載の微生物生細胞の計
   数方法。
4. （４）細胞内に蛍光物質を蓄積させる物質としてフルオ
   レセン誘導体を使用することを特徴とする請求項（１）
   〜（３）いずれかに記載の微生物生細胞の計数方法。
5. （５）フルオレセン誘導体がフルオレセン・ジアセテー
   トであることを特徴とする請求項（４）記載の微生物生
   細胞の計数方法。
6. （６）フルオレセン誘導体が５−カルボキシフルオレセ
   ンジアセテート及び／又は６−カルボキシフルオレセン
   ジアセテートであることを特徴とする請求項（４）記載
   の微生物生細胞の計数方法。
7. （７）フルオレセン誘導体が５−カルボキシ−２′，７
   ′−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／又は６′
   −カルボキシ−２，７′−ジクロロフルオレセンジアセ
   テートであることを特徴とする請求項（４）記載の微生
   物生細胞の計数方法。