JP2003210193A - 微生物の存在の検出及びその生理学的状態の決定のための方法及び装置 - Google Patents
微生物の存在の検出及びその生理学的状態の決定のための方法及び装置Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】試薬を使用せず、試料との物理的な接触もな
く、微生物の存在を検出するのみならず、各種生菌、非
生菌、胞子を分別できる方法を提供する。 【解決手段】 各種代謝産物、コファクター、細胞成
分、胞子成分を励起することができる特定のエネルギー
レベルの電磁放射に各種試料を暴露し、該試料に含まれ
る各種微生物細胞（より具体的には、そこに含まれる励
起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細胞成
分）をして測定可能な蛍光を発せしめることにより、液
体中、空気中、非生体表面中の微生物を検出する方法及
び装置。バックグラウンドからの信号や散乱励起信号を
微生物成分の蛍光信号から除去し、内因性微生物成分の
相対蛍光信号が生理学的範囲に収まる条件下で、バック
グラウンド補正後の蛍光信号の振幅(amplitude)によっ
て試料中の微生物内容物(microbe content)を計数す
る。
く、微生物の存在を検出するのみならず、各種生菌、非
生菌、胞子を分別できる方法を提供する。 【解決手段】 各種代謝産物、コファクター、細胞成
分、胞子成分を励起することができる特定のエネルギー
レベルの電磁放射に各種試料を暴露し、該試料に含まれ
る各種微生物細胞（より具体的には、そこに含まれる励
起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細胞成
分）をして測定可能な蛍光を発せしめることにより、液
体中、空気中、非生体表面中の微生物を検出する方法及
び装置。バックグラウンドからの信号や散乱励起信号を
微生物成分の蛍光信号から除去し、内因性微生物成分の
相対蛍光信号が生理学的範囲に収まる条件下で、バック
グラウンド補正後の蛍光信号の振幅(amplitude)によっ
て試料中の微生物内容物(microbe content)を計数す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、非生体表面上、空
気中、液体中の各種微生物（細菌、真菌、原生動物、リ
ケッチア及び／又はその他の微生物）や各種芽胞（以
下、胞子とも記載する）の存在を検知するための方法及
び装置に関する。
気中、液体中の各種微生物（細菌、真菌、原生動物、リ
ケッチア及び／又はその他の微生物）や各種芽胞（以
下、胞子とも記載する）の存在を検知するための方法及
び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】初歩的事項ではあるが、微生物細胞は全
て呼吸により細胞活動のためのエネルギーを産生する。
細胞の呼吸が生きた細胞で起こると、ピリジンヌクレオ
チド類が還元され、フラビン類が酸化され、他の各種補
酵素や各種代謝産物が産生される。また、胞子はジピコ
リン酸カルシウム複合体（胞子以外では自然では稀な蛍
光化合物）に富むことが判明している。ピリジンヌクレ
オチド類、フラビン類、その他のコファクター類の酸化
状態及び／又はジピコリン酸カルシウムの存在は、各化
合物を適切な電磁放射 (electromagnetic radiation)
で同時に励起し、蛍光団それぞれが発する特性放射 (ch
aracteristic radiation) を検出することにより、同時
に明らかにすることができる。蛍光を発する細胞成分や
胞子成分に対する特性励起エネルギーを複数種用いて試
料を同時励起し、発光のエネルギーと反射／散乱光のエ
ネルギー（前者は蛍光団に関連し、後者は蛍光団とは独
立している）を集めて検出することが、本明細書に記載
する方法による試料中や非生体表面の微生物の検出原理
である。
て呼吸により細胞活動のためのエネルギーを産生する。
細胞の呼吸が生きた細胞で起こると、ピリジンヌクレオ
チド類が還元され、フラビン類が酸化され、他の各種補
酵素や各種代謝産物が産生される。また、胞子はジピコ
リン酸カルシウム複合体（胞子以外では自然では稀な蛍
光化合物）に富むことが判明している。ピリジンヌクレ
オチド類、フラビン類、その他のコファクター類の酸化
状態及び／又はジピコリン酸カルシウムの存在は、各化
合物を適切な電磁放射 (electromagnetic radiation)
で同時に励起し、蛍光団それぞれが発する特性放射 (ch
aracteristic radiation) を検出することにより、同時
に明らかにすることができる。蛍光を発する細胞成分や
胞子成分に対する特性励起エネルギーを複数種用いて試
料を同時励起し、発光のエネルギーと反射／散乱光のエ
ネルギー（前者は蛍光団に関連し、後者は蛍光団とは独
立している）を集めて検出することが、本明細書に記載
する方法による試料中や非生体表面の微生物の検出原理
である。
【０００３】現実の試料中の呼吸している各種細胞の検
出において前記方法を用いると、次の２つの理由により
信頼性が向上する。第一の理由は、複数の励起エネルギ
ーを用いて微生物を同時に励起し、続いて多数の各種蛍
光信号を同時に検出するので、干渉源が数々の蛍光団の
特性を重ねる可能性が非常に小さくなるため、干渉の機
会が減少することである。第二の理由は、各固有代謝産
物同士の相対量ひいてはそれらの蛍光信号が一定の生理
学的範囲に収まることがわかっているためである。次の
（１）と（２）を可能とする方法によって各種信号の分
析が達成される。（１）存在する各種微生物に由来する
各検出蛍光信号を、干渉、バックグラウンド信号及び／
又は散乱励起信号から区別すること。（２）微生物の代
謝産物、微生物成分、胞子成分からの各種信号強度を生
理学的な範囲に収まるように要求すること。即ち、試料
中の微生物の検出は基本的には次のステップからなる。
第一に、細胞の代謝産物、微生物成分、胞子成分それぞ
れの特性励起エネルギーを用いて試料を同時に励起す
る。第二に、続いて（これらの励起された代謝産物の最
大発光及び最小発光に関連する）多数の各蛍光信号を集
める。最後に集めた信号を、バックグラウンド蛍光を除
去し各種代謝産物の相対信号強度を既知の生理学的範囲
と比較することができる方法で分析する。
出において前記方法を用いると、次の２つの理由により
信頼性が向上する。第一の理由は、複数の励起エネルギ
ーを用いて微生物を同時に励起し、続いて多数の各種蛍
光信号を同時に検出するので、干渉源が数々の蛍光団の
特性を重ねる可能性が非常に小さくなるため、干渉の機
会が減少することである。第二の理由は、各固有代謝産
物同士の相対量ひいてはそれらの蛍光信号が一定の生理
学的範囲に収まることがわかっているためである。次の
（１）と（２）を可能とする方法によって各種信号の分
析が達成される。（１）存在する各種微生物に由来する
各検出蛍光信号を、干渉、バックグラウンド信号及び／
又は散乱励起信号から区別すること。（２）微生物の代
謝産物、微生物成分、胞子成分からの各種信号強度を生
理学的な範囲に収まるように要求すること。即ち、試料
中の微生物の検出は基本的には次のステップからなる。
第一に、細胞の代謝産物、微生物成分、胞子成分それぞ
れの特性励起エネルギーを用いて試料を同時に励起す
る。第二に、続いて（これらの励起された代謝産物の最
大発光及び最小発光に関連する）多数の各蛍光信号を集
める。最後に集めた信号を、バックグラウンド蛍光を除
去し各種代謝産物の相対信号強度を既知の生理学的範囲
と比較することができる方法で分析する。
【０００４】これまでの長い間で確立されてきた各種微
生物検出技術や方法は、代謝反応産物、免疫学的捕捉産
物、所望の塩基配列の増殖産物の検出を利用するもので
ある。本発明は、各種微生物から得られる複数の内因性
蛍光団の検出と共にこれらの蛍光団による各信号の相対
量を検出するものであるので、微生物の存在を検出でき
るだけでなく、各種生菌、非生菌、胞子を分別すること
ができる。本発明の方法及び装置は、試薬を使用せず、
試料との物理的な接触もなく、リアルタイムの結果を提
供するものである。
生物検出技術や方法は、代謝反応産物、免疫学的捕捉産
物、所望の塩基配列の増殖産物の検出を利用するもので
ある。本発明は、各種微生物から得られる複数の内因性
蛍光団の検出と共にこれらの蛍光団による各信号の相対
量を検出するものであるので、微生物の存在を検出でき
るだけでなく、各種生菌、非生菌、胞子を分別すること
ができる。本発明の方法及び装置は、試薬を使用せず、
試料との物理的な接触もなく、リアルタイムの結果を提
供するものである。
【０００５】蛍光を利用する微生物検出方法は他にも存
在する。フローサイトメトリーの各種方法の多くは、所
望の分析対象物を標的とする免疫学的タンパク質にコン
ジュゲートした染料分子の蛍光によるものである。この
例が米国特許第４７４５２８５号（Ｒｅｃｋｔｅｎｗａ
ｌｄらに付与）に記載されている。また、蛍光を使用す
る他の方法では、蛍光性各種代謝染料や染料コンジュゲ
ートを添加して使用している（米国特許第４９００９３
４号（Ｐｅｅｔｅｒｓらに付与）に記載）。
在する。フローサイトメトリーの各種方法の多くは、所
望の分析対象物を標的とする免疫学的タンパク質にコン
ジュゲートした染料分子の蛍光によるものである。この
例が米国特許第４７４５２８５号（Ｒｅｃｋｔｅｎｗａ
ｌｄらに付与）に記載されている。また、蛍光を使用す
る他の方法では、蛍光性各種代謝染料や染料コンジュゲ
ートを添加して使用している（米国特許第４９００９３
４号（Ｐｅｅｔｅｒｓらに付与）に記載）。
【０００６】蛍光に基づく微生物検出方法のあるもの
は、各種内因性細胞蛍光団を使用するものである。米国
特許第５４２４９５９号（Ｒｅｙｅｓらに付与）の方法
は、試料の蛍光スペクトルとスペクトルのライブラリー
とを単に比較するものである。また、米国特許第５４７
４９１０号（Ａｌｆａｎｏに付与）に記載の方法では、
試料表面の蛍光とクリーンな表面の蛍光を比較する。各
種微生物検出方法でよく使用される内因性蛍光団は還元
型ピリジンヌクレオチドＮＡＤＨである。米国特許第５
７０１０１２号（Ｈｏに付与）では、試料を含有する強
制空気流中のＮＡＤＨ蛍光を検出しブランクと比較す
る。また、ＮＡＤＨ蛍光と散乱励起信号との比、又はＮ
ＡＤＨ蛍光と他の蛍光放射との比がＰｏｗｅｒｓに付与
された米国特許（第５７６０４０６号及び第５９６８７
６６号）において使用されている。
は、各種内因性細胞蛍光団を使用するものである。米国
特許第５４２４９５９号（Ｒｅｙｅｓらに付与）の方法
は、試料の蛍光スペクトルとスペクトルのライブラリー
とを単に比較するものである。また、米国特許第５４７
４９１０号（Ａｌｆａｎｏに付与）に記載の方法では、
試料表面の蛍光とクリーンな表面の蛍光を比較する。各
種微生物検出方法でよく使用される内因性蛍光団は還元
型ピリジンヌクレオチドＮＡＤＨである。米国特許第５
７０１０１２号（Ｈｏに付与）では、試料を含有する強
制空気流中のＮＡＤＨ蛍光を検出しブランクと比較す
る。また、ＮＡＤＨ蛍光と散乱励起信号との比、又はＮ
ＡＤＨ蛍光と他の蛍光放射との比がＰｏｗｅｒｓに付与
された米国特許（第５７６０４０６号及び第５９６８７
６６号）において使用されている。
【０００７】本明細書の一部を構成するものとしてここ
に援用する米国特許第５７６０４０６号及び第５９６８
７６６号（それぞれ１９９８年６月２日、１９９９年１
０月１９日発行）は、非生体表面や非生体試料上の各種
微生物を検出する方法及び装置を開示している。測定試
料は、（１）微生物細胞中の各種ピリジンヌクレオチド
を励起する３５０ｎｍを超える波長と（２）測定環境の
他の特性に対応する３４０ｎｍ未満の波長、の両方を有
する電磁放射で励起される。微生物のピリジンヌクレオ
チドが（異なる波長で励起された結果）発する蛍光発光
の、反射励起信号に対する比を、試料上に存在する微生
物の検出及び定量のベースとして計測、比較する。この
発明によれば、肉類等の非生体表面上の微生物を確定し
定量することができる。
に援用する米国特許第５７６０４０６号及び第５９６８
７６６号（それぞれ１９９８年６月２日、１９９９年１
０月１９日発行）は、非生体表面や非生体試料上の各種
微生物を検出する方法及び装置を開示している。測定試
料は、（１）微生物細胞中の各種ピリジンヌクレオチド
を励起する３５０ｎｍを超える波長と（２）測定環境の
他の特性に対応する３４０ｎｍ未満の波長、の両方を有
する電磁放射で励起される。微生物のピリジンヌクレオ
チドが（異なる波長で励起された結果）発する蛍光発光
の、反射励起信号に対する比を、試料上に存在する微生
物の検出及び定量のベースとして計測、比較する。この
発明によれば、肉類等の非生体表面上の微生物を確定し
定量することができる。
【０００８】Ｐｏｗｅｒｓに付与された上記各特許は、
１種類の代謝産物を蛍光比によって検出するものである
が、本発明では一以上の蛍光団の励起と、散乱／反射励
起エネルギーによる検出信号を差し引くアルゴリズムと
を組み合わせて用いる。設計及び方法にこのような差異
があるため、蛍光を用いる他の各種方法に比べ、本発明
は各種非生体表面上、各種液体中、空気中の各種微生物
をよりよく検出、定量することができる。複数の内因性
蛍光団を検出することによりバックグラウンド干渉によ
る擬陽性の結果が出る可能性が低くなるため、本発明は
各種微生物の検出において優れている。上記の方法及び
装置による各種微生物の検出としては、生物兵器用剤の
検出、細胞のソーティング、医学的診断、滅菌の確認、
水質検査、食品の製造や調理における安全管理、非常時
対応チームによる公共施設における微生物の検出、浄
化、防御の用途が挙げられる。
１種類の代謝産物を蛍光比によって検出するものである
が、本発明では一以上の蛍光団の励起と、散乱／反射励
起エネルギーによる検出信号を差し引くアルゴリズムと
を組み合わせて用いる。設計及び方法にこのような差異
があるため、蛍光を用いる他の各種方法に比べ、本発明
は各種非生体表面上、各種液体中、空気中の各種微生物
をよりよく検出、定量することができる。複数の内因性
蛍光団を検出することによりバックグラウンド干渉によ
る擬陽性の結果が出る可能性が低くなるため、本発明は
各種微生物の検出において優れている。上記の方法及び
装置による各種微生物の検出としては、生物兵器用剤の
検出、細胞のソーティング、医学的診断、滅菌の確認、
水質検査、食品の製造や調理における安全管理、非常時
対応チームによる公共施設における微生物の検出、浄
化、防御の用途が挙げられる。
【０００９】近年、食品（獣肉、鶏肉、海産物、ジュー
ス、果物、野菜）の細菌汚染が報じられており、食品
内、食品表面、調理器具表面の微生物汚染を検出するの
に使用できる方法や装置へのニーズがある。このような
ニーズを満たす方法及び装置の提供は、本発明の一目的
であるが、例えば獣肉生産施設や鶏肉生産施設などで低
廉且つ迅速に使用しうるものである必要がある。
ス、果物、野菜）の細菌汚染が報じられており、食品
内、食品表面、調理器具表面の微生物汚染を検出するの
に使用できる方法や装置へのニーズがある。このような
ニーズを満たす方法及び装置の提供は、本発明の一目的
であるが、例えば獣肉生産施設や鶏肉生産施設などで低
廉且つ迅速に使用しうるものである必要がある。
【００１０】本発明の他の目的は、食品の微生物汚染の
検出に使用するための方法及び装置を提供することであ
って、具体的には、各種ピリジンヌクレオチド、フラビ
ン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光
を電磁放射によって励起し、各種微生物の様々な代謝反
応や胞子成分と食品組織を区別することにより、食品と
接触することなく食品の微生物汚染を確認できる方法及
び装置を提供することである。
検出に使用するための方法及び装置を提供することであ
って、具体的には、各種ピリジンヌクレオチド、フラビ
ン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光
を電磁放射によって励起し、各種微生物の様々な代謝反
応や胞子成分と食品組織を区別することにより、食品と
接触することなく食品の微生物汚染を確認できる方法及
び装置を提供することである。
【００１１】従って、本発明の一目的は、各種非生体表
面上、各種液体中、空気中の微生物汚染を検出するのに
使用できる方法及び装置を提供することである。本発明
の具体的な目的として、本方法及び装置は、例えば、各
種ヘルスケア施設、研究所、水処理施設及び水質検査施
設、公共建築物、戦場等で低廉且つ迅速に各種微生物や
微生物汚染を見い出すために使用することができる。
面上、各種液体中、空気中の微生物汚染を検出するのに
使用できる方法及び装置を提供することである。本発明
の具体的な目的として、本方法及び装置は、例えば、各
種ヘルスケア施設、研究所、水処理施設及び水質検査施
設、公共建築物、戦場等で低廉且つ迅速に各種微生物や
微生物汚染を見い出すために使用することができる。
【００１２】本発明の他の目的は、各種非生体表面上、
各種液体試料中、空気試料中の微生物汚染を検出するの
に使用する方法及び装置であって、各種微生物の様々な
代謝反応及び／又は胞子の存在を媒体のバックグラウン
ドや散乱光から区別するために、各種ピリジンヌクレオ
チド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分
の蛍光を電磁放射によって励起し、試料と接触すること
なく試料の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供
することである。
各種液体試料中、空気試料中の微生物汚染を検出するの
に使用する方法及び装置であって、各種微生物の様々な
代謝反応及び／又は胞子の存在を媒体のバックグラウン
ドや散乱光から区別するために、各種ピリジンヌクレオ
チド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分
の蛍光を電磁放射によって励起し、試料と接触すること
なく試料の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供
することである。
【００１３】また、本発明の更に他の目的は、生存可能
な各種細胞（viable cells; 以下、生菌とも称する）、
生存不能な各種細胞（non-viable cells; 以下、非生菌
とも称する）、各種胞子、汚染されていない各種試料の
分別化に使用される方法及び装置を提供することであっ
て、本方法及び装置においては各種ピリジンヌクレオチ
ド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が
発する蛍光を、電磁放射によって励起するにあたり、そ
れぞれの内因性蛍光団の相対量の差をもって微生物の存
在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別する方法
及び装置を提供することである。
な各種細胞（viable cells; 以下、生菌とも称する）、
生存不能な各種細胞（non-viable cells; 以下、非生菌
とも称する）、各種胞子、汚染されていない各種試料の
分別化に使用される方法及び装置を提供することであっ
て、本方法及び装置においては各種ピリジンヌクレオチ
ド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が
発する蛍光を、電磁放射によって励起するにあたり、そ
れぞれの内因性蛍光団の相対量の差をもって微生物の存
在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別する方法
及び装置を提供することである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の思想は、各種
代謝産物、コファクター、細胞成分、胞子成分からの蛍
光を励起することができる複数の特定のエネルギーレベ
ルの電磁放射に各種試料を暴露する、微生物の検出のた
めの方法及び装置にある。これにより、試料に含まれる
各種微生物細胞や胞子（より具体的には、そこに含まれ
る励起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細
胞成分、ウィルス成分、及び／又は胞子成分）は、測定
可能な蛍光を発する。集めた蛍光信号（細胞／ウィルス
／胞子成分から発せられる信号の最大値及び／又は最小
値に関連する）は（１）バックグラウンドや反射／散乱
励起信号の除去、及び（２）代謝産物、コファクター、
胞子成分の相対蛍光信号値と既知の生理学的範囲との比
較、が可能な方法で分析される。
代謝産物、コファクター、細胞成分、胞子成分からの蛍
光を励起することができる複数の特定のエネルギーレベ
ルの電磁放射に各種試料を暴露する、微生物の検出のた
めの方法及び装置にある。これにより、試料に含まれる
各種微生物細胞や胞子（より具体的には、そこに含まれ
る励起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細
胞成分、ウィルス成分、及び／又は胞子成分）は、測定
可能な蛍光を発する。集めた蛍光信号（細胞／ウィルス
／胞子成分から発せられる信号の最大値及び／又は最小
値に関連する）は（１）バックグラウンドや反射／散乱
励起信号の除去、及び（２）代謝産物、コファクター、
胞子成分の相対蛍光信号値と既知の生理学的範囲との比
較、が可能な方法で分析される。
【００１５】即ち、本発明の方法及び装置は、試料をス
キャンすることにより、該試料と接触せずに微生物汚染
の存在を検出・定量する、低廉且つ迅速な方法を提供す
るものである。非接触下で試料中の微生物汚染を評価で
きるので、汚染を広げる危険性が低くなる。
キャンすることにより、該試料と接触せずに微生物汚染
の存在を検出・定量する、低廉且つ迅速な方法を提供す
るものである。非接触下で試料中の微生物汚染を評価で
きるので、汚染を広げる危険性が低くなる。
【００１６】上の目的を達成するために、本発明の一形
態においては、多くの場合、２００ｎｍを超える波長の
電磁放射を発する一又は複数の光源を使用することが好
ましい。本発明のこのような形態においては、光源から
の光は、ピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフ
ォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カ
ルシウムを特異的に励起するものであるか、あるいは、
フィルタに通すことによってピリジンヌクレオチド類、
フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／
又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するエネル
ギーを有する電磁放射としうるものである。
態においては、多くの場合、２００ｎｍを超える波長の
電磁放射を発する一又は複数の光源を使用することが好
ましい。本発明のこのような形態においては、光源から
の光は、ピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフ
ォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カ
ルシウムを特異的に励起するものであるか、あるいは、
フィルタに通すことによってピリジンヌクレオチド類、
フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／
又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するエネル
ギーを有する電磁放射としうるものである。
【００１７】本発明の他の形態においては、異なる紫外
エネルギー（波長：２００〜３００ｎｍの間）を有する
電磁放射を試料に照射することができ、また、場合によ
ってはそのようにすることが好ましい。紫外光は芳香族
アミノ酸や核酸を励起する。その結果の発光の一部は試
料に再吸収され、ジピコリン酸カルシウムやピリジンヌ
クレオチド類を順に励起していく。また、それらの発光
の一部は試料に再吸収され、今度はコファクター類（フ
ラビン等）を励起する。発光の一部はポルフォリン類や
他のフラビン類を励起するのに使用される。試料が発す
る各種蛍光を上述の通りに集め分析する。紫外光を使用
する場合は、比較的浅い試料サンプリング深度となる。
エネルギー（波長：２００〜３００ｎｍの間）を有する
電磁放射を試料に照射することができ、また、場合によ
ってはそのようにすることが好ましい。紫外光は芳香族
アミノ酸や核酸を励起する。その結果の発光の一部は試
料に再吸収され、ジピコリン酸カルシウムやピリジンヌ
クレオチド類を順に励起していく。また、それらの発光
の一部は試料に再吸収され、今度はコファクター類（フ
ラビン等）を励起する。発光の一部はポルフォリン類や
他のフラビン類を励起するのに使用される。試料が発す
る各種蛍光を上述の通りに集め分析する。紫外光を使用
する場合は、比較的浅い試料サンプリング深度となる。
【００１８】本発明の他の形態においては、各種代謝産
物、各種コファクター、各種細胞／胞子成分を特異的に
励起できる各種エネルギーレベル及び微生物と相互作用
しないエネルギーレベルを有する電磁放射を照射するこ
とができ、また、場合によってはそのようにすることが
好ましい。即ち、本発明のこのような形態においては、
試料が発する蛍光信号（各種微生物成分が発したもの及
び試料で単に反射／散乱したもの両方）を測定すること
ができ、微生物が発した信号間の比と試料からの反射／
散乱信号間の比を比較することによって微生物の存在を
決定することができる。
物、各種コファクター、各種細胞／胞子成分を特異的に
励起できる各種エネルギーレベル及び微生物と相互作用
しないエネルギーレベルを有する電磁放射を照射するこ
とができ、また、場合によってはそのようにすることが
好ましい。即ち、本発明のこのような形態においては、
試料が発する蛍光信号（各種微生物成分が発したもの及
び試料で単に反射／散乱したもの両方）を測定すること
ができ、微生物が発した信号間の比と試料からの反射／
散乱信号間の比を比較することによって微生物の存在を
決定することができる。
【００１９】本発明の実施にあたっては、センサを用い
て内因性蛍光団による蛍光だけでなく、反射あるいは散
乱した電磁放射も検出する。これにより、信号を標準化
し、スキャンされる試料とプローブの距離の変動により
生じる変動や、試料や表面が異なることによって生じる
変動を補償する。
て内因性蛍光団による蛍光だけでなく、反射あるいは散
乱した電磁放射も検出する。これにより、信号を標準化
し、スキャンされる試料とプローブの距離の変動により
生じる変動や、試料や表面が異なることによって生じる
変動を補償する。
【００２０】試料に照射する電磁放射を、６０ヘルツと
異なる (different than 60 Herz)周波数で急速に変化
させることにより、周囲の光（特に蛍光）の影響を実質
的に最小化することができることが判明した。また、励
起エネルギーの調整により、微生物内容物 (microbial
content) の測定精度に実質的影響を与えることなく、
センサを動かして電磁放射を試料の種々の部分に照射す
ることができる。
異なる (different than 60 Herz)周波数で急速に変化
させることにより、周囲の光（特に蛍光）の影響を実質
的に最小化することができることが判明した。また、励
起エネルギーの調整により、微生物内容物 (microbial
content) の測定精度に実質的影響を与えることなく、
センサを動かして電磁放射を試料の種々の部分に照射す
ることができる。
【００２１】市販されている微生物検出器の多くは、微
生物培養によって試料サイズを十分に大きなもの（増殖
物）とした上で、種（属)の同定のための各種代謝テス
トに付すものである。しかしながら、細菌の増殖を必要
とする技法では、生存可能ではあっても培養できない細
胞については検出できないであろう。逆に言えば、使用
した生育培地は、細菌を特定の表現型で成長させるのに
は好都合であるかもしれない。
生物培養によって試料サイズを十分に大きなもの（増殖
物）とした上で、種（属)の同定のための各種代謝テス
トに付すものである。しかしながら、細菌の増殖を必要
とする技法では、生存可能ではあっても培養できない細
胞については検出できないであろう。逆に言えば、使用
した生育培地は、細菌を特定の表現型で成長させるのに
は好都合であるかもしれない。
【００２２】微生物検出に関する他のアプローチは、微
生物そのものの免疫学的捕捉、又は微生物成分の免疫学
的捕捉に依存している。最もよく使われるイムノアッセ
イ法であるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent
assay）の細胞検出限界は数百細胞である。（これは、
フレクスナー赤痢菌 (Shigella flexneri) 等非常に感
染力の強い細菌の５０％感染量ＩＤ50よりも十分少ない
菌体数である。）また、これらの技法は、使用する各種
抗体がｐＨ、イオン強度、温度の変動に非常に影響され
やすいという大きな問題点をかかえている。微生物成分
に対する各種抗体は開発や製造にかかるコストが比較的
高いというだけでなく、「汚れた」試料中ではタンパク
質分解酵素によって分解されやすい。更に、各種表面
（マイクロウェルプレート、磁気ビーズ等）上に支持さ
れている抗体分子の密度は、通常必要とされるレベルに
達していない。
生物そのものの免疫学的捕捉、又は微生物成分の免疫学
的捕捉に依存している。最もよく使われるイムノアッセ
イ法であるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent
assay）の細胞検出限界は数百細胞である。（これは、
フレクスナー赤痢菌 (Shigella flexneri) 等非常に感
染力の強い細菌の５０％感染量ＩＤ50よりも十分少ない
菌体数である。）また、これらの技法は、使用する各種
抗体がｐＨ、イオン強度、温度の変動に非常に影響され
やすいという大きな問題点をかかえている。微生物成分
に対する各種抗体は開発や製造にかかるコストが比較的
高いというだけでなく、「汚れた」試料中ではタンパク
質分解酵素によって分解されやすい。更に、各種表面
（マイクロウェルプレート、磁気ビーズ等）上に支持さ
れている抗体分子の密度は、通常必要とされるレベルに
達していない。
【００２３】感度はより高いが迅速ではないタイプの方
法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細
菌のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定
して特定の細菌種の存在を検出する。そのような増幅及
び配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化
された実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣ
Ｒに基づく各種技法は微生物が存在しているという推測
を利用するものである。何故ならばこれらの技法は、必
ずしも微生物を目的とした分析ではなく完全な標的核酸
配列を目的とした分析であるからである。更に、標的Ｄ
ＮＡの効果的な増幅を阻む物質が「汚れた」、現実の試
料中に存在すると、特定の微生物を環境試料から検出す
ることが困難になってしまう。
法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細
菌のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定
して特定の細菌種の存在を検出する。そのような増幅及
び配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化
された実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣ
Ｒに基づく各種技法は微生物が存在しているという推測
を利用するものである。何故ならばこれらの技法は、必
ずしも微生物を目的とした分析ではなく完全な標的核酸
配列を目的とした分析であるからである。更に、標的Ｄ
ＮＡの効果的な増幅を阻む物質が「汚れた」、現実の試
料中に存在すると、特定の微生物を環境試料から検出す
ることが困難になってしまう。
【００２４】細菌やウィルスの検出は、試料を溶菌や熱
分解に付した後で揮発性細胞成分（例えば脂肪酸）をマ
ススペクトル分析することで行われてきた。残念なが
ら、微生物の揮発性成分の組成は成長環境条件によって
異なるので、分析対象物の同定結果は信頼性を欠く。
分解に付した後で揮発性細胞成分（例えば脂肪酸）をマ
ススペクトル分析することで行われてきた。残念なが
ら、微生物の揮発性成分の組成は成長環境条件によって
異なるので、分析対象物の同定結果は信頼性を欠く。
【００２５】免疫学的な方法、マススペクトルによる方
法、ＰＣＲによる方法はいずれも、微生物が試料中で生
存可能であったかどうかについては確定できない。ま
た、免疫学的方法やＰＣＲによる方法では、専門的な取
扱いを必要とする比較的高価な試薬を使用する。本明細
書に記載の方法及び装置を用いると、検出された細菌、
真菌、原生動物、リケッチアの生存可能性を決定するこ
とができる。本方法及び装置は試薬を要さず、試料と接
触せず、低コストで実施でき、リアルタイムの結果を得
ることができる。本発明のこれらの及び他の目的、特
徴、利点は、以下に記載する実施形態の詳細な説明や添
付の請求項によって明確になるであろう。
法、ＰＣＲによる方法はいずれも、微生物が試料中で生
存可能であったかどうかについては確定できない。ま
た、免疫学的方法やＰＣＲによる方法では、専門的な取
扱いを必要とする比較的高価な試薬を使用する。本明細
書に記載の方法及び装置を用いると、検出された細菌、
真菌、原生動物、リケッチアの生存可能性を決定するこ
とができる。本方法及び装置は試薬を要さず、試料と接
触せず、低コストで実施でき、リアルタイムの結果を得
ることができる。本発明のこれらの及び他の目的、特
徴、利点は、以下に記載する実施形態の詳細な説明や添
付の請求項によって明確になるであろう。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明の装置における基本構成要
素を図１のブロックダイアグラムで示す。この装置は、
光源、励起フィルタ、フォーカス光学部、集光光学部、
エミッション・フィルタ及び検出器から構成される。電
磁放射は光源から試料に向かい、必要に応じ励起フィル
タやフォーカス光学部を通って試料中の内因性蛍光団を
励起させる。散乱、反射された励起光は蛍光発光と共
に、集光光学部で集められ、検出器に向かう。エミッシ
ョン・フィルタは、所望のエネルギーだけを測定するこ
とができる。
素を図１のブロックダイアグラムで示す。この装置は、
光源、励起フィルタ、フォーカス光学部、集光光学部、
エミッション・フィルタ及び検出器から構成される。電
磁放射は光源から試料に向かい、必要に応じ励起フィル
タやフォーカス光学部を通って試料中の内因性蛍光団を
励起させる。散乱、反射された励起光は蛍光発光と共
に、集光光学部で集められ、検出器に向かう。エミッシ
ョン・フィルタは、所望のエネルギーだけを測定するこ
とができる。
【００２７】本発明の実施形態としては、様々な形状や
様々な構成要素の利用が可能である。本微生物検出法の
基本的な構成要素は、複数の内因性微生物蛍光団を励起
すること、発光して反射／散乱された光のエネルギーを
集めて検出すること、及びバックグラウンド干渉を補正
できると共に、既知の生理学的パラメータと相対信号強
度を比較することができる方法で検出した信号を分析す
ること、を許容するものである。本法を利用する装置の
形状や構成要素は、応用上の様々な要求及び予想される
干渉に対応したものでなければならない。
様々な構成要素の利用が可能である。本微生物検出法の
基本的な構成要素は、複数の内因性微生物蛍光団を励起
すること、発光して反射／散乱された光のエネルギーを
集めて検出すること、及びバックグラウンド干渉を補正
できると共に、既知の生理学的パラメータと相対信号強
度を比較することができる方法で検出した信号を分析す
ること、を許容するものである。本法を利用する装置の
形状や構成要素は、応用上の様々な要求及び予想される
干渉に対応したものでなければならない。
【００２８】広域イルミネーションを提供する光源を用
いることができ、また、そのような光源の使用が時には
好ましい。用いられる光源の種類は、所望の内因性微生
物成分を励起させるのに必要な波長の電磁放射を生成す
る能力によって決まる。オフサイクルの間に、環境バッ
クグラウンドを測定することのできるパルス光源の利用
が望まれることもある。用いられる光源としては、各種
電球（水銀、タングステン、重水素、キセノン等）を有
するランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、及び要求され
る励起エネルギーに特異的なダイオードレーザが挙げら
れる。用いる光源の種類は、必要とされる励起光の強度
や要求検出限界に依存する。
いることができ、また、そのような光源の使用が時には
好ましい。用いられる光源の種類は、所望の内因性微生
物成分を励起させるのに必要な波長の電磁放射を生成す
る能力によって決まる。オフサイクルの間に、環境バッ
クグラウンドを測定することのできるパルス光源の利用
が望まれることもある。用いられる光源としては、各種
電球（水銀、タングステン、重水素、キセノン等）を有
するランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、及び要求され
る励起エネルギーに特異的なダイオードレーザが挙げら
れる。用いる光源の種類は、必要とされる励起光の強度
や要求検出限界に依存する。
【００２９】本発明の各実施形態に用いられる励起及び
エミッション・フィルタ類としては、各種干渉フィル
タ、含浸ガラス、一連のカットオフフィルタ、ゼラチン
フィルタ、モノクロメータ、回折格子等が挙げられる。
用いられる各種エミッション・フィルタの光カットオフ
特性は、散乱・反射された励起光の信号がどれだけその
分析方法で許容されるか、或いは、要求検出限界がどれ
位かによる。所望のエネルギーのみを照射する光源を用
いる場合は励起フィルタを必要としないであろう。一
方、光源が（レーザ光のように）平行である場合は、フ
ォーカス光学部は不要であろう。（フォーカス光学部を
使用する目的は、励起光を２次元的あるいは３次元的サ
ンプリング領域に向けることである。）マルチフォトン
励起では、所望の蛍光団の励起エネルギーよりも小さい
エネルギーの光源を用いることができるという点が重要
である。
エミッション・フィルタ類としては、各種干渉フィル
タ、含浸ガラス、一連のカットオフフィルタ、ゼラチン
フィルタ、モノクロメータ、回折格子等が挙げられる。
用いられる各種エミッション・フィルタの光カットオフ
特性は、散乱・反射された励起光の信号がどれだけその
分析方法で許容されるか、或いは、要求検出限界がどれ
位かによる。所望のエネルギーのみを照射する光源を用
いる場合は励起フィルタを必要としないであろう。一
方、光源が（レーザ光のように）平行である場合は、フ
ォーカス光学部は不要であろう。（フォーカス光学部を
使用する目的は、励起光を２次元的あるいは３次元的サ
ンプリング領域に向けることである。）マルチフォトン
励起では、所望の蛍光団の励起エネルギーよりも小さい
エネルギーの光源を用いることができるという点が重要
である。
【００３０】集光光学部は、微生物の励起された蛍光団
から生じる光や試料から散乱・反射された光を検出器に
運ぶ。干渉フィルタを用いて異なる発光エネルギーを分
別する場合には、このフィルタが最適に作動するよう、
集めた光を平行にしなければならない。光ファイバ・ケ
ーブルも、試料に励起のための照射を行う際に、また、
発光を集め、検出器に向ける際に用いることができる。
紫外領域や可視領域で蛍光を示す多くの光学的成分とし
ては、研磨金属反射する、サファイア、融合シリカ、石
英、ＭｇＦ2、及び／又はＣａＦ2を用いることができ、
また、時にはそれらの使用が望まれる。
から生じる光や試料から散乱・反射された光を検出器に
運ぶ。干渉フィルタを用いて異なる発光エネルギーを分
別する場合には、このフィルタが最適に作動するよう、
集めた光を平行にしなければならない。光ファイバ・ケ
ーブルも、試料に励起のための照射を行う際に、また、
発光を集め、検出器に向ける際に用いることができる。
紫外領域や可視領域で蛍光を示す多くの光学的成分とし
ては、研磨金属反射する、サファイア、融合シリカ、石
英、ＭｇＦ2、及び／又はＣａＦ2を用いることができ、
また、時にはそれらの使用が望まれる。
【００３１】発せられる電磁放射は、検出器により測定
可能な電気信号に変換することができる。本発明の各種
実施形態においては、光増幅管（ＰＭＴ）、電子なだれ
フォトダイオード（ＡＰＤ）、ピンダイオード、ＣＣＤ
等の、異なる感度を有する多数の検出器を用いることが
できる。検出器の選択は、測定される放射光のエネルギ
ー、発光信号の強度、及び装置の要求検出限界に基づい
てなされる。
可能な電気信号に変換することができる。本発明の各種
実施形態においては、光増幅管（ＰＭＴ）、電子なだれ
フォトダイオード（ＡＰＤ）、ピンダイオード、ＣＣＤ
等の、異なる感度を有する多数の検出器を用いることが
できる。検出器の選択は、測定される放射光のエネルギ
ー、発光信号の強度、及び装置の要求検出限界に基づい
てなされる。
【００３２】集めた発光エネルギー（増幅電気信号に変
換したもの）を、すべてのバックグラウンド蛍光や散乱
励起光の寄与分を除去できる方法で分析する。特定の実
施形態で用いる励起・発光エネルギーは、標的微生物や
予想される生理学的状態により選択する。表１は様々な
微生物（及びタンパク質トキシン）に豊富に見られる内
因性蛍光化合物のいくつかにおける、励起・発光の範囲
を表しており、また、各微生物におけるそれぞれの化合
物の存在の確からしさを示している。（タンパク質微生
物トキシンは、本方法及び装置を、ウィルスの検出に用
いる方法と同様に用いて検出することができる。）
換したもの）を、すべてのバックグラウンド蛍光や散乱
励起光の寄与分を除去できる方法で分析する。特定の実
施形態で用いる励起・発光エネルギーは、標的微生物や
予想される生理学的状態により選択する。表１は様々な
微生物（及びタンパク質トキシン）に豊富に見られる内
因性蛍光化合物のいくつかにおける、励起・発光の範囲
を表しており、また、各微生物におけるそれぞれの化合
物の存在の確からしさを示している。（タンパク質微生
物トキシンは、本方法及び装置を、ウィルスの検出に用
いる方法と同様に用いて検出することができる。）
【００３３】
【表１】
【００３４】３４５ｎｍの光で励起した際に蛍光を殆ど
発しない培地における、細菌（Bacillus thuringiensi
s）含有溶液の、発光スペクトルを図２に示す。実線は
観察された細菌発光スペクトルを、破線はスペクトルへ
のレイリー散乱の寄与を示している。観察されたスペク
トルからレイリーバックグラウンドを差し引いたとこ
ろ、３４５ｎｍの光で励起される代謝産物の真の発光ス
ペクトルとなった（図４（ａ））。波長(におけるレイ
リー散乱によるバックグラウンドの大きさは、Ｉ＝Ａ／
(4＋Ｃで表すことができる。（この式において、Ｉは入
射光の強度、Ａは実験条件により決定される値、定数Ｃ
は一般にデータ収集に用いた器具の特性により決定され
る値である。）細菌含有溶液を３２５ｎｍ、３４５ｎｍ
及び５７０ｎｍで励起した際の発光スペクトルを合わせ
ると、５１５ｎｍ及び８５０ｎｍ付近で最小値を示す。
５１５ｎｍ及び８５０ｎｍで測定した蛍光強度を用い、
前記の式中のＡ及びＣで表される未知の値を算出する。
最後に、検出した信号からバックグラウンド信号を差し
引く。レイリー散乱バックグラウンドを差し引くこと
は、とりわけ液体及び気体の試料に好適である。その他
の試料媒体は、レイリー散乱バックグラウンドとは異な
るバックグラウンドを示すが、適切な方法で処理するこ
とができる（例えば、Mie散乱等）。
発しない培地における、細菌（Bacillus thuringiensi
s）含有溶液の、発光スペクトルを図２に示す。実線は
観察された細菌発光スペクトルを、破線はスペクトルへ
のレイリー散乱の寄与を示している。観察されたスペク
トルからレイリーバックグラウンドを差し引いたとこ
ろ、３４５ｎｍの光で励起される代謝産物の真の発光ス
ペクトルとなった（図４（ａ））。波長(におけるレイ
リー散乱によるバックグラウンドの大きさは、Ｉ＝Ａ／
(4＋Ｃで表すことができる。（この式において、Ｉは入
射光の強度、Ａは実験条件により決定される値、定数Ｃ
は一般にデータ収集に用いた器具の特性により決定され
る値である。）細菌含有溶液を３２５ｎｍ、３４５ｎｍ
及び５７０ｎｍで励起した際の発光スペクトルを合わせ
ると、５１５ｎｍ及び８５０ｎｍ付近で最小値を示す。
５１５ｎｍ及び８５０ｎｍで測定した蛍光強度を用い、
前記の式中のＡ及びＣで表される未知の値を算出する。
最後に、検出した信号からバックグラウンド信号を差し
引く。レイリー散乱バックグラウンドを差し引くこと
は、とりわけ液体及び気体の試料に好適である。その他
の試料媒体は、レイリー散乱バックグラウンドとは異な
るバックグラウンドを示すが、適切な方法で処理するこ
とができる（例えば、Mie散乱等）。
【００３５】図３及び図４は、生菌、非生菌及び胞子の
各溶液（Bacillus thuringiensis）を２８０ｎｍ（図３
（ａ））、３１５ｎｍ（図３（ｂ））、３２５ｎｍ（図
３（ｃ））、３４５ｎｍ（図４（ａ））、５７０ｎｍ
（図４（ｂ））、及び６６０ｎｍ（図４（ｃ））で励起
した際の、溶液中の様々な内因性蛍光団による発光スペ
クトル（バックグラウンドを差し引いた値）を示す。図
５は、前記生菌（ａ）、非生菌（ｂ）、及び胞子（ｃ）
溶液の、蛍光信号（バックグラウンド差し引き後、４４
０ｎｍでの発光に標準化した）がはっきり異なることを
示す。本分析方法は、生菌、非生菌、及び胞子溶液の違
いを用いて、試料中のこれらを区別する。検出しバック
グラウンドを差し引いた信号の大きさにより、試料中の
微生物の数を定量する。
各溶液（Bacillus thuringiensis）を２８０ｎｍ（図３
（ａ））、３１５ｎｍ（図３（ｂ））、３２５ｎｍ（図
３（ｃ））、３４５ｎｍ（図４（ａ））、５７０ｎｍ
（図４（ｂ））、及び６６０ｎｍ（図４（ｃ））で励起
した際の、溶液中の様々な内因性蛍光団による発光スペ
クトル（バックグラウンドを差し引いた値）を示す。図
５は、前記生菌（ａ）、非生菌（ｂ）、及び胞子（ｃ）
溶液の、蛍光信号（バックグラウンド差し引き後、４４
０ｎｍでの発光に標準化した）がはっきり異なることを
示す。本分析方法は、生菌、非生菌、及び胞子溶液の違
いを用いて、試料中のこれらを区別する。検出しバック
グラウンドを差し引いた信号の大きさにより、試料中の
微生物の数を定量する。
【００３６】本発明の一実施形態においては、３２５ｎ
ｍ、３４５ｎｍ、及び５７０ｎｍの励起フィルタを使用
することにより、生きている細胞、死細胞、胞子の検出
及び区別を行うことができる。これらの励起フィルタ
は、還元型ピリジンヌクレオチド、各種フラビン、ジピ
コリン酸カルシウム、ヘモプロテイン類、及びその他の
化合物を励起させることができる。励起した蛍光団から
の発光を検出するフィルタの選択においては、４０５ｎ
ｍ、４４０ｎｍ、４８０ｎｍ及び６５０ｎｍのフィルタ
を含むものとされよう。これらのフィルタは、励起した
各蛍光団の発光スペクトルの最大値に対応している。加
えて、その他のエミッション・フィルタ（５４５ｎｍ及
び８５０ｎｍ）によって、反射／散乱バックグラウンド
の大きさを測定できる。検出限界を低くするために、次
のような形状とした。光源としては、干渉励起フィルタ
と共にパルスキセノンランプを用いた。また、光を平行
にするため、フォーカス光学部を干渉フィルタの前に置
いている。フォーカス及び集光光学部は、バックグラウ
ンド蛍光をすべて除去するように、研磨された反射光学
素子で構成した。放物線状の集光光学部（発生信号の約
９０％を集めることができる）を、干渉エミッション・
フィルタ、コリメート光学部、及びＰＭＴに取り付け
た。計器の各種機能、データの収集、統合、及び分析
は、マイクロコントローラにより制御した。
ｍ、３４５ｎｍ、及び５７０ｎｍの励起フィルタを使用
することにより、生きている細胞、死細胞、胞子の検出
及び区別を行うことができる。これらの励起フィルタ
は、還元型ピリジンヌクレオチド、各種フラビン、ジピ
コリン酸カルシウム、ヘモプロテイン類、及びその他の
化合物を励起させることができる。励起した蛍光団から
の発光を検出するフィルタの選択においては、４０５ｎ
ｍ、４４０ｎｍ、４８０ｎｍ及び６５０ｎｍのフィルタ
を含むものとされよう。これらのフィルタは、励起した
各蛍光団の発光スペクトルの最大値に対応している。加
えて、その他のエミッション・フィルタ（５４５ｎｍ及
び８５０ｎｍ）によって、反射／散乱バックグラウンド
の大きさを測定できる。検出限界を低くするために、次
のような形状とした。光源としては、干渉励起フィルタ
と共にパルスキセノンランプを用いた。また、光を平行
にするため、フォーカス光学部を干渉フィルタの前に置
いている。フォーカス及び集光光学部は、バックグラウ
ンド蛍光をすべて除去するように、研磨された反射光学
素子で構成した。放物線状の集光光学部（発生信号の約
９０％を集めることができる）を、干渉エミッション・
フィルタ、コリメート光学部、及びＰＭＴに取り付け
た。計器の各種機能、データの収集、統合、及び分析
は、マイクロコントローラにより制御した。
【００３７】本発明のこの実施形態における検出方法で
は、検出しバックグラウンド補正した信号間の相対比
を、ある生理学的範囲に入るようにする必要がある。異
なる２０を超える細菌種や胞子種を用いた５００個を超
える試料を分析したところ、多くの比率が統計的に有意
な同定結果をもたらしうることを示した。図６は、２２
種類の細菌のこれら比率の中の一比率に関する分布状態
（バックグラウンド差し引き後の、４４０ｎｍ／４８０
ｎｍの比）を示しており、これによって、本検出方法に
要求される生理学的範囲を規定している。この方法によ
り、無菌の培地やその他の各種生化学的バッファーから
細菌含有溶液を区別することもできる。様々な方法や次
の比率（６５０／４０５、４０５／４４０、４８０／４
４０、６５０／４４０、４０５／４８０及び６５０／４
８０）を用いて、例えば、Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏ
ｎテスト、ファジィ論理、学習ニューラルネットワーク
（多層パーセプトロン利用）により、細菌の存在を９９
％、９５.６％及び１００％の検出確率で検出した。
（この検出アルゴリズムのために取った５００個のデー
タポイントの擬陽性確率 (false alarm probability)
は、次の通りである。Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ
（０.０１％）、ファジィ論理（０％）、ニューラルネ
ットワーク（０％）。）
は、検出しバックグラウンド補正した信号間の相対比
を、ある生理学的範囲に入るようにする必要がある。異
なる２０を超える細菌種や胞子種を用いた５００個を超
える試料を分析したところ、多くの比率が統計的に有意
な同定結果をもたらしうることを示した。図６は、２２
種類の細菌のこれら比率の中の一比率に関する分布状態
（バックグラウンド差し引き後の、４４０ｎｍ／４８０
ｎｍの比）を示しており、これによって、本検出方法に
要求される生理学的範囲を規定している。この方法によ
り、無菌の培地やその他の各種生化学的バッファーから
細菌含有溶液を区別することもできる。様々な方法や次
の比率（６５０／４０５、４０５／４４０、４８０／４
４０、６５０／４４０、４０５／４８０及び６５０／４
８０）を用いて、例えば、Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏ
ｎテスト、ファジィ論理、学習ニューラルネットワーク
（多層パーセプトロン利用）により、細菌の存在を９９
％、９５.６％及び１００％の検出確率で検出した。
（この検出アルゴリズムのために取った５００個のデー
タポイントの擬陽性確率 (false alarm probability)
は、次の通りである。Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ
（０.０１％）、ファジィ論理（０％）、ニューラルネ
ットワーク（０％）。）
【００３８】図７は、スライドガラス上の生菌及び非生
菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ細胞用の測定器を
用いた、ある発光（ＲＰＮ）のデータを示す。生菌と非
生菌の蛍光から得られる信号には、明確な違いがみられ
る。図８は、七面鳥の肉の表面上の大腸菌に対するＲＰ
Ｎ発光応答を示す。この方法は、他の微生物検出方法よ
りも低い検出限界での観察をリアルタイムで行うもので
あり、試薬を必要とせず、肉の表面にも触れずに行うこ
とができる。
菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ細胞用の測定器を
用いた、ある発光（ＲＰＮ）のデータを示す。生菌と非
生菌の蛍光から得られる信号には、明確な違いがみられ
る。図８は、七面鳥の肉の表面上の大腸菌に対するＲＰ
Ｎ発光応答を示す。この方法は、他の微生物検出方法よ
りも低い検出限界での観察をリアルタイムで行うもので
あり、試薬を必要とせず、肉の表面にも触れずに行うこ
とができる。
【００３９】本発明の他の実施形態においては、図４
（ａ）及び図４（ｃ）に示すように、約５７０ｎｍ及び
約６６０ｎｍを中心とするＬＥＤを用いて胞子や死細胞
中の成分を励起する。図９は、６６０ｎｍの光で励起し
た際の、紙片及び各種封筒入り試料の発光スペクトルを
示す。図中の矢印は、胞子や非生菌を６６０ｎｍで励起
する際の、予想される発光位置を示す。紙片及び封筒
は、このスペクトル・ウインドウを有するので、紙の
「後ろ (behind paper) 」や封筒の「内側 (inside env
elopes) 」で細菌芽胞を検出することができる。非生菌
成分からの６１０ｎｍ〜６８０ｎｍの間の発光は、この
スペクトル・ウインドウで蛍光を発する胞子成分を励起
するので、５７０ｎｍの励起を含めることができ、また
時には５７０ｎｍの励起が好ましい。図１０は、封筒の
みの場合と、同じ封筒に封入した凍結乾燥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子試料の間の、７
８０ｎｍのバックグラウンド差し引き蛍光信号の違いを
示す。本発明のこの実施形態では、試薬、試料処理、試
料との接触、封筒の開封を必要とせず、封筒に封入され
た胞子を素早く検出することができる。
（ａ）及び図４（ｃ）に示すように、約５７０ｎｍ及び
約６６０ｎｍを中心とするＬＥＤを用いて胞子や死細胞
中の成分を励起する。図９は、６６０ｎｍの光で励起し
た際の、紙片及び各種封筒入り試料の発光スペクトルを
示す。図中の矢印は、胞子や非生菌を６６０ｎｍで励起
する際の、予想される発光位置を示す。紙片及び封筒
は、このスペクトル・ウインドウを有するので、紙の
「後ろ (behind paper) 」や封筒の「内側 (inside env
elopes) 」で細菌芽胞を検出することができる。非生菌
成分からの６１０ｎｍ〜６８０ｎｍの間の発光は、この
スペクトル・ウインドウで蛍光を発する胞子成分を励起
するので、５７０ｎｍの励起を含めることができ、また
時には５７０ｎｍの励起が好ましい。図１０は、封筒の
みの場合と、同じ封筒に封入した凍結乾燥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子試料の間の、７
８０ｎｍのバックグラウンド差し引き蛍光信号の違いを
示す。本発明のこの実施形態では、試薬、試料処理、試
料との接触、封筒の開封を必要とせず、封筒に封入され
た胞子を素早く検出することができる。
【００４０】上で述べた本発明の実施形態は、単に例示
に過ぎないものであって、当業者であれば前述の基本的
発明思想に基づき、本発明の趣旨を逸脱せずに、他の各
種形状物、変形物及び修正物とすることができる。微生
物を検出するための本方法及び装置は、様々な内因性微
生物蛍光団を同時に励起させ、次いで、検出された発光
を分析するに当たり、バックグラウンド信号を明らかに
することと同時にその信号を生理学的範囲内にするとい
う手法を用いる。すべての変形物、修正物及び形状は、
添付のクレームに記載された本発明の範囲内に入るもの
である。
に過ぎないものであって、当業者であれば前述の基本的
発明思想に基づき、本発明の趣旨を逸脱せずに、他の各
種形状物、変形物及び修正物とすることができる。微生
物を検出するための本方法及び装置は、様々な内因性微
生物蛍光団を同時に励起させ、次いで、検出された発光
を分析するに当たり、バックグラウンド信号を明らかに
することと同時にその信号を生理学的範囲内にするとい
う手法を用いる。すべての変形物、修正物及び形状は、
添付のクレームに記載された本発明の範囲内に入るもの
である。
【図１】本発明の最も基本的な特徴を示したブロックダ
イアグラムである。
イアグラムである。
【図２】３４５ｎｍでの照射により励起された細菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）低蛍光
媒体溶液の発光スペクトルである。実線は細菌の発光ス
ペクトルを示し、破線はこのスペクトルに対するレイリ
ー散乱の寄与を示す。
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）低蛍光
媒体溶液の発光スペクトルである。実線は細菌の発光ス
ペクトルを示し、破線はこのスペクトルに対するレイリ
ー散乱の寄与を示す。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各
種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した
発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を
示す。
種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した
発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を
示す。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各
種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した
発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を
示す。
種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した
発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を
示す。
【図５】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓの胞子、生菌、非生菌が溶液状態で発した蛍光信号間
（４４０ｎｍの発光に標準化、バックグラウンドを差し
引いた後）の分布の違いを示す図である。
ｓの胞子、生菌、非生菌が溶液状態で発した蛍光信号間
（４４０ｎｍの発光に標準化、バックグラウンドを差し
引いた後）の分布の違いを示す図である。
【図６】２２の細菌種における４８０ｎｍの蛍光発光に
対する４４０ｎｍの蛍光発光の比の分布を示す図（バッ
クグラウンドを差し引いた後）である。
対する４４０ｎｍの蛍光発光の比の分布を示す図（バッ
クグラウンドを差し引いた後）である。
【図７】本発明の一実施形態として、無菌表面上のＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの生菌及び非生菌に対す
る還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答
を示す図である。
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの生菌及び非生菌に対す
る還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答
を示す図である。
【図８】七面鳥表面上のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉからの還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光
発光応答を示す図である。
ｌｉからの還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光
発光応答を示す図である。
【図９】紙片、各種封筒サンプルの蛍光発光スペクトル
におけるスペクトル・ウインドウを示す図である。
におけるスペクトル・ウインドウを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態として、密封された封筒
内の数ミリグラムのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ胞子に対するバックグラウンド補正後の蛍
光チャンネル（７８０ｎｍ）の応答を示す図である。
内の数ミリグラムのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ胞子に対するバックグラウンド補正後の蛍
光チャンネル（７８０ｎｍ）の応答を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 クリストファー アール． ロイド
アメリカ合衆国 84341 ユタ州 ローガ
ン ノース 2574 イースト 200
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA17 CA03 DA01 EA01
FA06 GA08 GB01 HA01 JA03
KA02 KA05 LA01 LA02 LA03
MA01 NA01
2G045 CB21 FA29 FB12 GC15
4B029 AA07 BB01 FA11
4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ05 QX01
Claims (27)
- 【請求項１】 微生物を検出する方法であって、次のａ
〜ｃ、 ａ．２００ｎｍを超える特定の範囲の電磁放射波長を有
する少なくとも１以上の内因性蛍光団を励起することに
より、前記内因性蛍光団を有する微生物を励起して蛍光
を発せしめ、 ｂ．励起された微生物蛍光団の最大値及び最小値に関連
する蛍光信号を検出し、更に ｃ．前記励起された微生物蛍光の前記検出蛍光信号から
反射／散乱励起エネルギー及びバックグラウンドを引く
ことにより、前記検出蛍光の強度によって微生物の計数
(enumeration)を決定する、を含む方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、検出し
てバックグラウンドを補正した後の複数の信号の相対比
を決定し、それにより、次の条件即ち、バックグラウン
ド補正後の蛍光信号の比が一定の生理学的範囲内にあ
り、且つ相対比が前記予想される範囲内にある前記検出
信号の強度によって微生物の計数を決定する条件に依存
して微生物の生理学的な状態の検出がなされる方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記微
生物蛍光団が核酸ポリマー、トリプトファン含有タンパ
ク質、チロシン含有タンパク質、アデノシン三リン酸、
ジピコリン酸カルシウム、還元型ピリジンヌクレオチ
ド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質及び６１０
〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分からなる
群から選ばれるものである方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、検出さ
れる生存可能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリ
ケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内
因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タン
パク質、トリプトファン含有タンパク質、アデノシン三
リン酸、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポル
フィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長
領域で励起される他の成分を含む方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、検出さ
れる生存不能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリ
ケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内
因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリプトファン含
有タンパク質、チロシン含有タンパク質、還元型ピリジ
ンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク
質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の
成分を含む方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、検出さ
れる前記微生物が細菌芽胞であり、前記芽胞の検出に使
用される前記内因性蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン
含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、ジピ
コリン酸カルシウム又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域
で励起される他の成分を含む方法。 - 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、検出さ
れる前記微生物はウィルスを含み、前記ウィルスの検出
に使用される前記内因性蛍光団は核酸ポリマー、チロシ
ン含有タンパク質又はトリプトファン含有タンパク質を
含む方法。 - 【請求項８】 微生物を検出する方法であって、次のａ
〜ｄ、 ａ．２００ｎｍ〜３００ｎｍの種々の波長の紫外電磁放
射を用いて複数の内因性微生物蛍光団を励起することに
より内因性蛍光団を含有して存在するいずれかの微生物
を励起し蛍光を発せしめ、その蛍光の一部を自己吸収し
て他の微生物蛍光団を励起し新たに蛍光を発せしめ、 ｂ．励起された微生物蛍光団の最大値及び最小値に関連
する蛍光信号を検出し、 ｃ．検出蛍光信号から、反射／散乱励起エネルギー及び
バックグラウンドからの蛍光を差し引き、更に ｄ．検出されバックグラウンド補正した後の信号の相対
比が生理学的な範囲にあることを決定し、それにより、
相対比が生理学的範囲にある前記検出信号の強度によっ
て前記微生物を計数する、を含む方法。 - 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、前記微
生物の前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリ
プトファン含有タンパク質、アデノシン三リン酸及びジ
ピコリン酸カルシウム化合物からなる群から選択される
１種以上のものを含む方法。 - 【請求項１０】 請求項８に記載の方法であって、２次
励起された微生物蛍光団が、ジピコリン酸カルシウム、
還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン
含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励
起される細胞成分等からなる群から選択される１種以上
のものを含む方法。 - 【請求項１１】 請求項８に記載の方法であって、検出
される生存可能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又は
リケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記
内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タ
ンパク質、トリプトファン含有タンパク質、アデノシン
三リン酸、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポ
ルフィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波
長領域で励起される細胞成分を含む方法。 - 【請求項１２】 請求項８に記載の方法であって、検出
される生存不能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又は
リケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記
内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリプトファン
含有タンパク質、チロシン含有タンパク質、還元型ピリ
ジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパ
ク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される細
胞成分を含む方法。 - 【請求項１３】 請求項８に記載の方法であって、検出
される前記微生物が細菌芽胞であり、前記芽胞の検出に
使用される前記内因性蛍光団は、核酸ポリマー、チロシ
ン含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、ジ
ピコリン酸カルシウム又は６１０〜６７０ｎｍの波長領
域で励起される芽胞成分を含む方法。 - 【請求項１４】 非生体表面上、空気中又は液体中の微
生物を検出する装置であって、次のａ〜ｃ、 ａ．試料に向けて電磁放射を照射する手段であって、当
該手段は１以上の内因性微生物蛍光団を励起することが
できる放射エネルギーを放射するものである手段と、 ｂ．放射、反射／散乱した前記電磁放射を電気信号に変
換することができる１以上の電磁放射検出器であって、
当該検出器は前記微生物蛍光団の蛍光発光の最大値及び
最小値を検出するための３２０ｎｍより長い波長の電磁
放射を検出するものである検出器と、更に ｃ．前記内因性微生物蛍光団の発する蛍光に対応する電
気信号及び微生物の存在を決定するための反射／散乱励
起エネルギーを分析する手段と、を含む装置。 - 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、電磁
波が時変調されたパルスとして前記微生物に照射される
方法。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載の装置であって、前
記電磁放射を照射する手段が前記電磁放射を時変調させ
る手段を含む装置。 - 【請求項１７】 微生物タンパク質トキシンを検出する
方法であって、次のａ〜ｃ、 ａ．２００ｎｍを超える特定の範囲の電磁放射波長を有
する少なくとも１以上の内因性蛍光団を励起することに
より、前記内因性蛍光団を有する微生物を励起して蛍光
を発せしめ、 ｂ．励起された微生物蛍光団の最大値及び最小値に関連
する蛍光信号を検出し、更に ｃ．前記励起された微生物蛍光の前記検出蛍光信号から
反射／散乱励起エネルギー及びバックグラウンドを引く
ことにより、前記検出されたバックグラウンド補正後の
蛍光の強度によって前記微生物トキシンの計数(enumera
tion)を決定する、を含む方法。 - 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、前
記微生物蛍光団がトリプトファン含有タンパク質及びチ
ロシン含有タンパク質からなる群から選択されるもので
ある方法。 - 【請求項１９】 生存不能な細菌及び芽胞を検出する方
法であって、次のａ〜ｃ、 ａ．５５０ｎｍを超え７００ｎｍ未満の特定の範囲の電
磁放射波長を有する少なくとも１以上の内因性蛍光団を
励起することにより、前記内因性蛍光団を有する微生物
を励起して蛍光を発せしめ、 ｂ．励起された微生物蛍光団の最大値及び最小値に関連
する蛍光信号を検出し、更に ｃ．前記励起された微生物蛍光の前記検出蛍光信号から
反射／散乱励起エネルギー及びバックグラウンドを引く
ことにより、前記検出蛍光の強度によって前記生存不能
な細菌及び芽胞の計数(enumeration)を決定する、を含
む方法。 - 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法であって、検
出してバックグラウンドを補正した後の複数の信号の相
対比を決定し、それにより、次の条件即ち、バックグラ
ウンド補正後の蛍光信号の比が一定の生理学的範囲内に
あり、且つ相対比が前記予想される範囲内にある前記検
出信号の強度によって芽胞の計数を決定する条件に依存
して芽胞と生存不能な細菌との差別化がなされる方法。 - 【請求項２１】 請求項１９に記載の方法であって、前
記生存不能な細菌及び細菌芽胞の検出に使用される前記
内因性微生物蛍光団が、フラビン、ポルフォリン含有タ
ンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起され
る他の成分を含む群から選択されるものである方法。 - 【請求項２２】 請求項１９に記載の方法であって、前
記生存不能な細菌及び細菌芽胞は、表面上、紙製封筒
内、紙を通して、溶液中又はエアロゾル中で検出される
ものである方法。 - 【請求項２３】 細菌芽胞と生存不能な細菌を検出する
方法であって、次のａ〜ｄ、 ａ．５５０ｎｍ〜６４０ｎｍの種々の波長の電磁放射を
用いて複数の内因性微生物蛍光団を励起することにより
内因性蛍光団を含有して存在する芽胞と生存不能な細菌
のいずれかを励起し蛍光を発せしめ、その蛍光の一部を
自己吸収して他の芽胞蛍光団を励起し新たに蛍光を発せ
しめ、 ｂ．励起された微生物蛍光団の最大値及び最小値に関連
する蛍光信号を検出し、 ｃ．検出蛍光信号から、反射／散乱励起エネルギー及び
バックグラウンドからの蛍光を差し引き、更に ｄ．検出されバックグラウンド補正した後の信号の相対
比が生理学的な範囲にあることを決定し、それにより、
相対比が生理学的範囲にある前記検出信号の強度によっ
て前記生存不能な細菌と細菌芽胞とを計数する、を含む
方法。 - 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前
記微生物の前記内因性微生物蛍光団は、フラビン、ポル
フィリン含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長
領域で励起される他の成分からなる群から選択される１
種以上のものを含む方法。 - 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、２
次励起された微生物蛍光団が、６１０〜６８０ｎｍの波
長領域で励起される内因性成分類からなる群から選択さ
れる１種以上のものを含む方法。 - 【請求項２６】 請求項２３に記載の方法であって、前
記生存不能な細菌及び細菌芽胞は、表面上、紙製封筒
内、紙を通して、溶液中又はエアロゾル中で検出される
ものである方法。 - 【請求項２７】 請求項２３に記載の方法であって、前
記芽胞及び生存不能な細菌は紙製封筒内で検出されるも
のであり、前記２次励起される微生物蛍光団は前記励起
された紙製品からの光放射により励起される方法。
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