CN107003239A - 自触发流式细胞计数仪 - Google Patents

Abstract

光谱分析仪(100)具有激发光源(103)以及由流路(102)携带的照明生物样品(114)。光谱色散元件213分散由生物样品(114)产生的荧光。

Description

自触发流式细胞计数仪

相关申请的交叉引用

本申请是于2014年12月10日提交的美国临时专利申请No.62/089864的非临时专利申请。本申请将通过引用合并这样的申请的全部内容。然而，在本公开内容与所引用的申请相冲突的情况下，本发公开内容将被优先考虑。

技术领域

本发明总体涉及血细胞计数仪；更具体地说，涉及流式细胞计数仪以及用于制造、设计、使用和整合这些细胞计数仪到系统中的方法。

背景技术

通常，流式细胞计数术是用于对微观颗粒、生物颗粒、生物细胞及其衍生物的各个方面进行计数、检查、分类、测量和表征以经由光学和/或电子检测装置确定其物理和/或化学特性的方法。流式细胞计数系统的早期开发基于阻抗，并且由Wallace H.Coulter于1953年开发。多年来，由Mack Fulwyler、Wolfgang Gohde等人做出的几项开发，提高了市场对该系统的令人满意的可接受性。在今天的常规流式细胞计数术中，流式细胞计数术通常基于可见光谱的光的使用。

典型地，流式细胞计数仪是一种分析仪器，其发射被导向一个样品或多个样品的某种频率或多种频率的光。从光源发射的光激发样品从样品的样品表面(并且在某些情况下从样品内部)发射某种频率或多种频率的光。收集并分析从样品表面(并且在某些情况下从样品内部)发射的光的频率。

然而，诸如某些部分未整合到单一整体或单一设计中之类的某些问题已经使得常规流式细胞计数机进入市场的速度变得很缓慢。此外，由于这种低劣的设计，常规流式细胞计数仪不能精确地计数和表征细胞、生物细胞和/或生物材料，从而限制了常规流式细胞计数仪器的使用和潜在的效能。此外，由于这种低劣设计引起诸如制造、可靠性之类的其它问题，这恶化了在市场上的常规流式细胞计数仪的效能。此外，常规流式细胞计数仪的低劣设计限制了制造能力和成本因素，导致成本增加。因此，其限制了制造能力并且使得常规流式细胞计数仪十分昂贵。

可以容易地看到，常规流式细胞计数仪有几个问题和缺点。尽管流式细胞计数仪具有许多潜在优势，但市场接受度受限，特别是在便携式和非便携式应用中尤其如此。此外，由于流式细胞计数术的一些应用是大容量应用，所以这些问题和缺点不允许使用常规流式细胞计数技术来降低流式细胞计数术的成本并且在大容量应用中更有用。因此，具有大容量可制造性的更高效率的低成本流式细胞计数系统或仪器将是非常期望的。

发明内容

在各种代表性方面，本发明提供一种具有照射生物样品的激发光源的光谱分析仪。生物样品随着该生物样品由激发光源激发而发荧光。该荧光被导向色散元件，其中该荧光被扩散并数字化，并在数字信号处理单元中存储和分析。数字信号处理单元与荧光数据的初始获取直接且密切地通信，这允许将流式细胞计数仪用作计数仪。

附图说明

像下文将参考形成其一部分的附图更全面地图示、描述和要求那样，本发明的代表性元件、操作特征、应用和/或优点特别在于结构和操作的细节，在整个附图中，相同的附图标记指的是相同的部分。根据在具体实施方式中所描述的某些示例性实施例，其它元件、操作特征、应用和/或优点对于本领域技术人员将变得显而易见，在附图中：

图1是常规简化流式细胞计数仪的示意图，示出了激发光源、流路、多个光电检测器、多个滤波器、多个光栅、数字信号处理器和触发器；

图2是根据本发明的流式细胞计数仪的实施例的简化示意图，示出了激发光源、流路、多个光电检测器、数字信号处理器和触发器；和

图3是根据本发明的简化流式细胞计数仪的另一实施例的简化示意图，示出了激发光源、流路、多个光电检测器、数字信号处理器和触发器。

本领域技术人员将理解，附图中的元件为了简单和清楚而被示出，并且不一定按比例绘制。例如，附图中的一些元件的尺寸可能相对于其它元件被夸大，以帮助提升对本发明的各种实施例的理解。此外，这里的术语“第一”、“第二”等(如果有的话)特别用于区分相似元件，而不一定用于描述顺序或时间顺序。此外，在本说明书和/或权利要求书(如果有的话)中，术语前面、后面、顶部、底部、上面、下面等(如果有的话)通常用于描述目的，而不一定用于全面地描述排他的相对位置。因此，本领域技术人员将理解，如此使用的任何前述术语可以在适当的环境下互换，使得本文所述的本发明的各种实施例例如能够在除了明确示出或描述的方位之外的其它方位上操作。

具体实施方式

在讲解下面描述的实施例的细节之前，定义或澄清一些术语。

术语“滤波器”指的是能够过滤、阻止或防止某些频率的光通过滤波器的任何材料或器件。

术语“辐射检测器”指的是能够检测和/或感测来自样品材料的辐射的任何器件或材料。典型地，辐射检测器可以感测或检测各种频率。然而，应当理解，可以使辐射检测器感测或检测单个频率的光或一小组频率的光。另外，辐射检测器由各种辐射检测器制成。

术语“样品”指的是能够发射光或从正在由光源激发的样品中发荧光的任何一种材料或多种材料、任何生物或非生物材料。

术语“生物样品”指的是能够发射光或从正在由光源激发的样品中发荧光的任何一种生物材料或多种生物材料。

术语“生物细胞”指的是可以是活的和/或死的基本生物学单位。

术语“细胞”指的是可以是活的或者死的基本单位。仅作为例子但不限于，病毒、支原体等，有时难以定义。

术语“荧光光谱”指的是亮线、光带或连续辐射特性的光谱，并且由经受特定类型的激发的特定发射物质确定。

术语“荧光信号捕获”指的是对来自光源对生物样品的照射的输出信号的捕获和记录，该种照射引起具有某些频率的生物样品亮度，而所述某些频率允许标识和记录某些特征。

术语“激发光源”指的是能够照射样品并发射荧光的任何合适的光源。

术语“流路”指的是能够将样品悬浮并携带到其中样品可被激发光源照射的区域的任何合适的液体。

术语“数字信号处理器”(DSP)(也称为数字信号器件)指的是专门的微处理器(或SIP块)，其架构针对数字信号处理的操作需求而优化。通常，DSP的目标通常是测量、过滤和/或压缩连续的实际模拟信号。

如本文所使用那样，术语“包括”、“包含”或其任何变体指的是参考非排他性包含，使得包括元件列表的过程、方法、制品、组合物或装置不仅仅包括所列举的这些元件，但也可以包括未明确列出或这些过程、方法、制品、组合物或装置固有的其它元件。除了未具体叙述的那些之外，在本发明的实践中使用的上述结构、布置、应用、比例、元件、材料或组件的其它组合和/或修改可以由那些本领域技术人员在具体环境、制造规范、设计参数或其它操作要求的情况下改变或以其它特别方式采用，而不脱离本发明的一般原则。

此外，除非有明确的相反说明，否则“或”是指包容性的“或”，而不是专属的“或”。例如，条件A或B满足以下任一条件：A为真(或存在)，B为假(或不存在)；A为假(或不存在)，而B为真(或存在)；以及A和B都为真(或存在)。另外，使用“一个”来描述本发明的元件和组件。这只是为了方便起见，并且给出本发明的一般意义。本说明书应该被阅读为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非其明显表示其他含义。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是合适的方法和材料是在下面所描述的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体合并本文。在发生冲突的情况下，本说明书(包括定义)将受到控制。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

在本文未描述的情况下，关于具体材料、加工动作和电路的许多细节是常规的，并且可以在燃料电池和化学领域的教科书和其它来源中找到。

现在参考图1，图1是合并了光谱分析仪的常规流式细胞计数仪100，用于分析由箭头109和111指示的被激发成发荧光的生物分子。这样的荧光可以通过从细胞本身或附着到一个生物细胞或多个生物细胞的色标或标记物的自发光产生。可以通过光谱分析获得关于该一个生物细胞或多个生物细胞的信息，其包括其波长分布和强度不同的光谱分布，指示在生物细胞上不同的生物细胞和/或标记物的存在。此外，其相应的强度指示生物细胞上这种不同生物细胞或不同标记物的浓度。

典型的生物样品114可能包括各种生物细胞分子，其各自通过自发光生成或标记的色标对应于唯一光谱分布。如图1所示，常规流式细胞计数仪100合并多个诸如光电倍增管(PMT)之类的光电检测器128、130、132、134和126与可以被定制来接收对应的荧光光谱109和多个频谱111及其强度并排除其余部分的滤波器138、140、142和144。因此，诸如光电检测器132之类的一个光电检测器对应于生物细胞上的一种类型的生物细胞分子或标记物。常规流式细胞计数仪100包括含有生物细胞样品114的液体流路102。使用诸如半导体激光器或LED之类的激发光源103来激发流路102上的区域107中的生物样品114。区域107处的生物细胞发射荧光111，其被多个光电检测器131-134和126收集，而光电检测器128、130、132和134具有对应的滤波器138、140、142和144以只允许感兴趣的荧光光谱内容由光电检测器128、130、132和134中的任何个体光电检测器检测到。光电检测器128、130、132和134的输出模拟信号由包括多个A/D转换器的数字信号处理(DSP)电路141数字化。来自生物样品区域107的散射光109由光电检测器126捕获，而该光电检测器126产生触发信号143来触发DSP 141以使荧光信号捕获同步。除了在光激发下记录其发射的荧光，这还允许计数生物细胞上的生物细胞或标记物。另外，不同标记物之间的串扰通过复杂的校准程序来补偿。

不同生物细胞分子由于其独特的自发光或附着的色标而发射不同的特征荧光。如果它们在波长上彼此太靠近，则荧光光谱可能彼此重叠。这种串扰限制了对生物细胞上的多种类型的生物细胞或标记物的检测灵敏度和同时检测。

现在参考图2，图2是流式细胞计数仪200的简化示意图，该流式细胞计数仪200已经被简化以便更好地说明本发明。图2示出了激发光源203、流路201、多个光电检测器215(具有分别标识的个体光电检测器205、221、222、223、224、225、226、227、228和229)、数字信号处理器241和触发器243。此外，如图2所示，流式细胞计数仪200包括具有多个生物样本214的液体流路201，所述多个生物样本214由个体生物样品216、218和220图示。多个生物样品214通常悬浮在能够将多个生物样品214携带到区域207的任何合适的液体、悬浮液或液体培养基中。

通常，可以使用任何合适的液体悬浮液或液体培养基，诸如但不限于盐水、5％葡萄糖溶液、缓冲溶液等。如图2所示，流路201由多条流线204表示，分别地和部分地由流动线106、108和110标识。

如图2所示，激发光源203用于照射区域207，其中当生物样品通过区域207时，个体生物样品114被照射。激发光源203可以由诸如发光二极管、发光光电二极管、激光器、半导体激光器之类的任何合适的器件制成。此外，激发光源203可以被配置成产生期望的任何合适的一种波长或多种波长的光。作为示例，在多个生物样品215被激发光源203照射之后，所述多个生物样品发荧光(以通常为较低波长的不同波长发光)。

通常，从生物样品的荧光所发射的光由任何合适的光电检测器或一组光电检测器收集。如图2所示，取决于特定的应用和/或需要，个体光电检测器205、221、223、225、227、228、230、231和232可以被配置成分别捕获光，也可以被配置成作为多个光电检测器215来捕获光。

可以使用任何合适的光电检测器，诸如但不限于半导体光电检测器、有源像素传感器(APS)、电荷耦合器件(CCD)等。

如图2所示，可以使用光电检测器阵列215来记录由诸如光栅或棱镜之类的色散元件213在空间上分散的完整生物分子光谱211，如图2所示。色标或自发光的荧光光谱通常遵循可以预先校准的其自己的特征分布。当包括多种类型的生物细胞的生物样品通过激发光源203在区域207被激发时，特征荧光分布将重叠，并且多个光电检测器215或光电检测器阵列215将通过个体光电检测器221、222、223、224、225、226、227、228和229记录组合式荧光光谱211。此外，应当理解，取决于具体应用，可以使用任何合适尺寸的阵列。每个光电检测器组件接收频谱分布的特定频谱内容。由于任何特定色标和自发光的特征荧光光谱已经被预先校准，所以在接收到的模拟信号被DSP241转换成数字数据之后，可以通过数字数据处理从组合式光谱中去除每个生物细胞的分布强度。这将允许在峰值波长处使用彼此紧密间隔的更多色标，从而增加待同时检测的生物细胞的类型，而不牺牲检测灵敏度。在该检测方法中，因为完整频谱强度将被外推，所以不需要常规硬件滤波器，因而可以在数据处理中实现软件滤波器以获得与来自常规流式细胞计数仪中的硬件滤波器的数据等效的任何数据。软件实现灵活并且可以自动化，从而简化了整个系统，并且降低了制造和服务成本。

在阵列检测方案中，经由DSP 241转换的数据通过常规方式(即由单独的光电检测器205接收的已散射激发光或荧光209)进行同步，以产生触发信号243。生物样品214通常很复杂，并且包括将散射光的各种生物细胞和颗粒。这些事件中的一些事件是感兴趣的，而其它一些事件则不是感兴趣的。当使用散射光作为阵列信号捕获同步的触发器时，会对所有这些事件进行计数，从而增加数据存储空间尺寸并减慢数据分析速度。当两个感兴趣的事件在分析期间在时间上间隔太近时，这些事件将被丢弃，因为系统无法将它们区分为两个单独的有效事件。作为替代，来自单独的光电检测器的荧光信号已经被用作触发器，并且仅仅捕获感兴趣的事件，从而提高数据分析吞吐量。然而，这种方法有两个缺点：

a)当两个感兴趣的事件在时间上彼此间隔太近时，系统将错过一个有效事件。

b)用于荧光电检测的额外光电检测器增加了系统制造成本。

本发明的目的是通过使用来自光电检测器阵列的已接收荧光来触发数据获取和分析，以校正现有流式细胞计数仪的缺陷。这种自触发是可能的，因为光电检测器阵列被设计成在不用任何光学滤波器的情况下接收全部荧光信号。当有效生物细胞或颗粒被光源激发时，除了来自所附着的色标的荧光之外，它还将发射自发光作为背景。常规流式细胞计数仪使用光学滤波器去除某些不需要的荧光，因此使得自触发不实用。利用捕获完整光谱的光电检测器阵列，自触发变得可行。

现在参考图3，图3示出了本发明的另一实施例的简化示意图，该图图示了简化的流式细胞计数仪300，其示出了激发光源303、流路301、多个光电检测器315、数字信号处理器341和触发器343。

如图3所示，流式细胞计数仪300示出了激发光源303，该激发光源303激发在流路301上的区域307中发射荧光的生物样品314。诸如光栅或棱镜之类的色散元件313将荧光谱311扩散到光电检测器阵列315(具有阵列组件321、322、323、324、325、326、327、328和329)上。光电检测器阵列315可以由雪崩光电二极管(APD)或正常PMT制成。在光电检测器阵列集成了从阵列元件接收到的所有信号之后，将DSP 341中的加法逻辑的输出信号ΣDn用作触发器343以使DSP341的数据捕获同步。因为感兴趣的生物细胞会发射自发光或来自附着的色标的荧光，所以只要它在流路中遇到感兴趣的生物细胞或生物细胞上的标志物，就应该将来自加法逻辑的输出ΣDn与已激发的激光源同步，从而使得能够在记录相关联的荧光光谱以便进行原位或测试后数据处理的同时，对所感兴趣的事件进行细胞计数。可以通过来自所选阵列接收器组件的信号的逻辑加法来采用更复杂的触发，从而允许对准用于分析的所选细胞，在分析这些细胞时提高系统效率并降低检测误差。例如，如果在分析期间仅感兴趣某些生物细胞并且已知这些细胞的色标，则在操作期间仅将来自相应光电接收器阵列组件的信号进行逻辑相加以作为信号触发器。

因此，我们提供了一种简单有效的低成本自触发的流式细胞计数仪来捕获完整的光谱信息并提高细胞计数的吞吐量，同时还允许在存在大量不想要的分子的情况下进行操作，而无需生物样品进行洗涤和裂解，从而简化样品准备过程。

以下描述针对本发明的示例性实施例和发明人对最佳模式的构思，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围、适用性或构造。相反，以下描述旨在为实现本发明的各种实施例提供方便的说明。显而易见，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对在所公开的示例性实施例中所描述的任何元件的功能和/或布置中进行改变。

在前面的说明书中，已经参考具体示例性实施例描述了本发明；然而，应当理解，在不脱离如以下权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种改进和变更。说明书和附图将以示例性的方式而不是限制性的方式来看待，并且所有这些改进都打算被包括在本发明的范围内。因此，本发明的范围应该由所附权利要求及其合法等同物来确定，而不是仅仅由上述示例来确定。例如，在任何方法或过程权利要求中叙述的步骤可以以任何顺序执行，并且不限于在权利要求中呈现的特定顺序。另外，在任何装置权利要求中叙述的组件和/或元件可以以各种排列方式组装或可操作地配置来产生与本发明基本相同的结果，因此不限于权利要求中所叙述的具体构造。

以上已经针对特定实施例描述了益处、其它优点和问题解决方案；然而，任何益处、优点、问题解决方案或可能导致任何特定利益、优点或解决方案发生或变得更显著的任何元件，不应被解释为任何或所有权利要求的关键的、必需的或基本的特征或组成部分。

Claims (21)

1.一种光谱分析仪，包括：

激发光源；

由流路携带的被照明的生物样品，所述生物样品发荧光；

光谱色散元件，其中所述荧光的至少一部分被导向到所述光谱色散元件，其中所述荧光被分散；

光电检测装置，其具有至少一个光电检测输入信号和至少一个光电检测输出端，其中被分散的荧光的至少一部分被输入到所述光电检测装置中；

数字信号处理器，存储空间具有数字存储空间输入端和数字存储空间输出端；

分析空间；以及

数字触发器，其耦合到光电检测输出端并且当感测到信号时所述数字存储器和所述数字处理单元存储和分析来自光电检测装置的数据。

2.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中所述激发光源是激光二极管。

3.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中所述光电检测器单元(器件)是雪崩光电二极管阵列(APD)。

4.如权利要求3所述的光谱分析仪，其中所述雪崩光电二极管阵列(ADP)包括范围从六(6)至三十四(34)个的光接收元件。

5.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中所述数字处理单元在由从所述阵列光电检测单元接收到的数据触发时开始存储数据。

6.如权利要求5所述的光谱分析仪，其中所述光电检测阵列中的所有数据或选定数量的元件被逻辑相加。

7.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中所述生物样品发射自发光。

8.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中所述生物样品从生物细胞上的标记物发射荧光。

9.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中，所述光谱色散单元是光栅。

10.如权利要求1所述的光谱分析仪，其中，所述光谱色散元件是棱镜。

11.一种生物计数装置，包括：

激发光源；

由流路携带的被照明的生物样品；

光谱色散元件；

光电检测装置，其具有至少一个光电检测输入信号和至少一个光电检测输出端；

一个光电检测输出信号；

数字存储空间，其具有数字存储空间输入端和数字存储空间输出端；

分析空间；以及

数字触发器，其耦合到所述光电检测输出端并且当感测到信号时所述数字存储空间和所述数字处理单元存储和分析来自所述光电检测装置的数据。

12.如权利要求11所述的生物计数装置，其中所述激发光源是激光二极管。

13.如权利要求11所述的生物计数装置，其中所述光电检测器是雪崩光电二极管阵列(APD)。

14.如权利要求13所述的生物计数装置，其中所述雪崩光电二极管阵列(APD)包括范围从六(6)个光电二极管到三十四(34)个光电二极管的光电二极管元件。

15.如权利要求11或14所述的生物计数装置，其中所述数字处理单元在由从所述阵列光电检测单元接收到的数据触发时开始存储数据。

16.如权利要求15所述的生物计数装置，其中所述光电检测阵列中的所有数据或选定数量的元件被逻辑相加。

17.如权利要求15所述的生物计数装置，其中所述生物样品发射自发光。

18.如权利要求11所述的生物计数装置，其中所述生物样品从生物细胞上的标记物发射荧光。

19.如权利要求11所述的生物计数装置，其中所述光谱色散元件是光栅。

20.一种选择性自触发流式细胞计数仪，包括：

激发激光二极管；

照明生物样品，其由流路携带并由激光二极管激发；

光谱色散元件，其分散来自照明生物样品的荧光；以及

雪崩光电二极管阵列，其检测亮度谱，以及

当被所述光电二极管阵列的相应数量的元件的逻辑相加触发时，使用来自所述雪崩光电二极管阵列的数据分析生物细胞。

21.如权利要求20所述的选择性自触发流式细胞计数仪，其中所述雪崩光电二极管阵列部分地由八(6)至三十(34)个光接收元件制成。