BR112012028926B1 - método e aparelho para rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra e computador - Google Patents

Abstract

IDENTIFICAÇÃO E/OU CARACTERIZAÇÃO DE UM AGENTE MICROBIANO USANDO CLASSIFICAÇÃO HIERÁRQUICA TAXONÔMICA Trata-se de um método para a identificação e/ou a caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra que inclui uma etapa de dados de teste analítico (por exemplo, obter valores de fluorescência intrínsecos ao longo de uma faixa de comprimentos de onda de emissão) do agente microbiano. Os dados de teste analítico são transformados, minimizando, assim as variações cepa a cepa dentro de um grupo de organismos. Com o auxílio de um computador programado, um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento opera nos dados de teste analítico transformados. Os múltiplos níveis correspondem a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

Description

Referência cruzada a pedidos relacionados

Este pedido refere-se aos seguintes pedidos de patente US, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência:

Pedido US No. 12/589.929, intitulado “Methods for the isolation and identification of microorganisms”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Pedido US No. 12/589.969, intitulado “Separation device for use in the separation, identification and/or characterization of microorganisms”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Pedido US No. 12/589.952, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Pedido US No. 12/589.936, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Patente US. No. 12/589.985, intitulado “Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Patente US No. 12/589.968, intitulado “Method for detection, identification and/or characterization of microorganisms in a sealed container”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Patente US No. 12/589.976, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”, depositado em 30 de outubro de 2009.

Este pedido refere-se também ao seguinte pedido depositado na mesma data deste pedido, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência:

Registro de agente No. 09-271-B, intitulado “System for rapid identification and/or characterization of a microbial agente in a sample”, US No. depositadoem 14 de maio de 2010.

Registro de agente No. 09-271-A, intitulado “Methods for rapid identification and/or characterization of a microbial agente in a sample”, US No. depositado em 14 de maio de 2010.

Declaração de pesquisa patrocinada pelo governo Não aplicável. Campo da Invenção

Esta invenção refere-se ao campo de métodos para caracterizar e/ou identificar au- tomaticamente um agente microbiano presente em uma amostra, tal como sangue ou outra amostra biológica, armazenada em um recipiente de espécime. Como um exemplo, os métodos desta descrição fornecem informação tal como tipo de Gram (positivo ou negativo), morfologia, espécie ou outra informação clínica relevante do agente microbiano rápida e automaticamente.

Fundamentos da Invenção

Os instrumentos que existem atualmente no mercado nos Estados Unidos detectam o crescimento e então a presença de um micro-organismo em uma amostra de sangue. Tal instrumento é o instrumento BacT/ALERT 3D do presente cessionário bioMérieux, Inc. O instrumento recebe um frasco de cultura de sangue contendo uma amostra de sangue, por exemplo, de um paciente humano. O instrumento incuba o frasco. Periodicamente durante a incubação, uma unidade de detecção óptica na incubadora analisa um sensor colorimétrico incorporado no frasco para detectar se o crescimento microbiano ocorreu dentro do frasco. A unidade de detecção óptica, os recipientes de espécimes e sensores são descritos na literatura de patente, ver Patentes US. Nos. 4.945.060, 5.094.955, 5.162.229, 5.164.796, 5.217.876, 5.795.773 e 5.856.175, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Outra técnica anterior de interesse com relação geralmente à detecção de micro-organismos em uma amostra biológica inclui as seguintes patentes: US Nos. 5.770.394, 5.518.923, 5.498.543, 5.432.061, 5.371.016, 5.397.709, 5.344.417, 5.374.264, 6.709.857 e 7.211.430.

Em instrumentos de detecção tal como o BacT/ALERT 3D e instrumentos similares, uma vez que o frasco de cultura de sangue tenha sido testado positivo quanto à presença de micro-organismos, é difícil obter um alto nível de caracterização do agente microbiano, ou identificação da espécie do agente microbiano, devido à interferência de componentes sanguíneos e aparelhos do sistema descartável (por exemplo, frasco) contendo a amostra. Então, os métodos atuais usam um frasco ou outro recipiente descartável adequado e um instrumento relacionado para o crescimento natural e a detecção de um micro-organismo na amostra, como descrito acima. Uma vez que o instrumento indica que o frasco é positivo quanto à presença de um agente microbiano, de acordo com os métodos atuais, o frasco “positivo” é manualmente restaurado a partir do instrumento e uma parte da amostra é manualmente removida do frasco e cultivada em uma placa de ágar. Há instrumentos na técnica que automatizam o esfregaço de um meio de amostra em uma placa de cultura e incubam a placa. Um tal instrumento é descrito na Patente US No. 6.617.146. Após o esfregaço, a placa é manualmente colocada em uma incubadora e periodicamente inspecionada quanto ao crescimento de uma subcultura do micro-organismo. Após a subcultura ter crescido suficientemente, uma amostra da cultura é tirada da placa e colocada em um tubo de teste. O tubo de teste é então introduzido em ainda outro instrumento para o teste de identificação via um cartão de amostra de teste descartável tendo várias cavidades individuais. Os car- tões de teste descartáveis são conhecidos na literatura de patente, ver, por exemplo, Patentes US. Nos. 4.118.280, 3.963.355, 4.018.65, 4.116.775, 4.038.151, 5.609.828, 5.746.980, 5.766.553, 5.843.380, 5.869.005, 5.916.812, 5.932.177, 5.951.952 e 6.045.758, cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência.

O cartão de amostra de teste é então processado em um instrumento analítico conhecido na técnica como o instrumento VITEK 2 do cessionário. O instrumento VITEK 2 incuba e lê periodicamente as cavidades do cartão de amostra de teste com uma unidade leitora. O crescimento da amostra em uma ou mais das cavidades dos cartões resulta na identificação do agente microbiano. O instrumento VITEK 2 é descrito na literatura de patente, ver, por exemplo, Patentes US. Nos. 5.762.873 e 6.086.824, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

Esse processo inteiro, a partir do momento de introduzir a amostra no frasco de coleta de sangue para cultura, detecção da presença de micro-organismos e então identificação do micro-organismo pelo instrumento VITEK 2, leva tipicamente de 2 a 5 dias. A etapa de identificação sozinha, ocorrendo após a detecção do frasco positivo, ocupa tipicamente de 1 a 3 desses dias.

Os benefícios clínicos para substancial e potencialmente salvar a vida de um paciente são possíveis se o tempo que ele leva para a detecção e a identificação de um agente microbiano em uma amostra de sangue e para relatar os resultados a um médico pudesse ser reduzido de 2 a 5 dias para menos de um dia. Esse documento descreve um método para a rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano em uma amostra biológica tal como uma amostra de sangue usando um método de classificação hierárquica taxonômica.

Sumário da Invenção

Em um primeiro aspecto, é descrito um método para a identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra. O método inclui as etapas de obter os valores de fluorescência intrínsecos ao longo de uma faixa de comprimentos de onda de emissão a partir do agente microbiano. Os valores de fluorescência são obtidos em uma pluralidade de comprimentos de onda de excitação. As medições de fluorescência intrínsecas são submetidas a uma operação de transformação, minimizando desse modo as variações cepa a cepa em medições de fluorescência intrínsecas dentro de um grupo de organismos. Os exemplos das operações de transformação incluem uma transformação logarítmica natural e uma primeira operação derivada. Com o auxílio de um computador programado, o método inclui uma etapa de executar um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nas medições de fluorescência intrínseca transformadas. Os múltiplos níveis correspondem a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

Em uma modalidade, o algoritmo de classificação multinível prossegue de forma monótona em uma ordem de um nível mais alto na hierarquia taxonômica para um nível mais baixo na hierarquia taxonômica. Por exemplo, o algoritmo de classificação multinível primeiro classifica o agente microbiano pela classe Gram, então família, e então espécie.

Em uma modalidade, o algoritmo de classificação multinível inclui, para cada nível no algoritmo, etapas de: (a) executar um cálculo de distância em valores de fluorescência transformados e uma inversa de uma matriz covariância para um conjunto predefinido de pares de excitação/emissão; (b) executar uma interpretação da classificação usando os resultados do cálculo de distância e um limite de distância mínimo e um limite de baixa discriminação; e (c) gerar um resultado da classificação. O conjunto predefinido de pares de exci- tação/emissão é obtido a partir de medições de fluorescência intrínseca de agentes microbianos conhecidos através de uma faixa de valores de excitação e emissão, com o conjunto predefinido de pares de excitação/emissão selecionados quanto a sua capacidade para distinguir entre os diferentes agentes microbianos.

Em outro aspecto, é descrito um método para a identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra, compreendendo as etapas de: obter ex-perimentalmente medições de fluorescência intrínseca a partir de agentes microbianos conhecidos através de uma faixa de valores de excitação e emissão e selecionar a partir de tais medições um conjunto de pares de excitação/emissão quanto a sua capacidade de distinguir entre agentes microbianos diferentes; obter medições de fluorescência intrínseca a partir de um agente microbiano desconhecido como o conjunto de pares de excita- ção/emissão; transformar as medições de fluorescência intrínseca a partir de um agente microbiano desconhecido minimizando assim as variações cepa a cepa em medições de fluorescência intrínseca dentro de um grupo de organismos; e identificar e/ou caracterizar o agente microbiano desconhecido usando as medições de fluorescência intrínseca e as medições de fluorescência intrínseca experimentalmente obtidas a partir de agentes microbianos conhecidos com o auxílio de um computador programado executando um algoritmo de classificação.

Em uma modalidade preferencial, o algoritmo de classificação compreende um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nas medições de fluorescência intrínseca transformadas, os múltiplos níveis correspondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

Os métodos são aplicáveis a agentes microbianos e amostras em geral. Em uma implementação possível, as amostras são amostras de sangue humano ou animal e os agentes microbianos são agentes (por exemplo, bactérias) presentes no sangue.

O método de classificação hierárquica taxonômica pode ser usado com diferentes dados analíticos além dos dados de fluorescência intrínseca. Generalizando-se a descrição, um método para a rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra é descrito, compreendendo as etapas de: obter os dados do teste analítico do agente microbiano (por exemplo, espectrometria de massas ou dados de espalhamento Raman); transformar os dados do teste analítico, minimizando assim as variações cepa a cepa nos dados do teste analítico dentro de um grupo de organismos; e com o auxílio de um computador programado, executar um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nos dados do teste analítico transformados, os múltiplos níveis correspondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

Em ainda outro aspecto, um método para a identificação e/ou classificação de um agente microbiano presente em uma amostra é descrito, compreendendo as etapas de: obter experimentalmente os dados do teste analítico a partir de agentes microbianos conhecidos e selecionar a partir de tais dados de teste um subconjunto dos dados de teste quanto a sua capacidade de distinguir entre os diferentes agentes microbianos; obter os dados do teste analítico a partir de um agente microbiano desconhecido associado com o subconjunto de dados do teste analítico; transformar os dados do teste analítico do agente microbiano desconhecido minimizando assim as variações cepa a cepa em medições de fluorescência intrínseca dentro de um grupo de organismos; e identificar e/ou caracterizar o agente microbiano desconhecido usando os dados do teste analítico transformados e os dados do teste analítico obtidos experimentalmente a partir de agentes microbianos conhecidos com o auxílio de um computador programado executando um algoritmo de classificação.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIG. 1 é uma ilustração esquemática de um aparelho de medição no qual os métodos dessa descrição podem ser usados.

As FIGs. 2A a 2C são um fluxograma que mostra uma sequência de instruções de processamento que executam a identificação e/ou a caracterização do agente microbiano concentrado usando medições de fluorescência intrínseca.

As FIGs. 3 a 8 são gráficos de medições de fluorescência intrínseca (IF), e as trans-formadas dessas que ilustram o benefício das instruções pré-processamento da FIG. 2A, em termos de minimizar as variações cepa a cepa dentro de um grupo de organismos.

As FIGs. 9 e 10 são gráficos da primeira derivada de transformadas logarítmicas naturais de medições de IF mostrando o potencial de discriminação entre um subconjunto de espécies para comprimentos de onda de excitação de 315 a 415 nm.

Descrição Detalhada da Invenção

Descrevem-se, neste documento, métodos para a identificação e/ou caracterização de um agente microbiano. Em modalidades preferenciais, a identificação e/ou caracteriza-ção é executada em um agente microbiano concentrado que foi isolado de outros componentes em uma amostra. O método pode ser executado enquanto o agente microbiano concentrado é armazenado em um dispositivo descartável usado para a separação e concentração do agente microbiano; alternativamente ele pode ser executado após o agente microbiano ter sido removido do dispositivo descartável. Exemplos de métodos, instrumentos, e dispositivos para a separação e concentração de um agente microbiano em uma amostra, por exemplo, sangue, são descritos no pedido copendente no. de série , intitulado “System for rapid identification and/or characterization of a microbial agente in a sample”, registro de agente no. 09-271-B, que é incorporado aqui por referência. Tais métodos, instrumentos e dispositivos não são particularmente importantes para os métodos desta descrição e então uma descrição detalhada não é fornecida de modo a não ofuscar a presente descrição.

Um exemplo representativo de um arranjo de detecção e dispositivo descartável será descrito agora em conjunto com a FIG. 1. A FIG. 1 é uma ilustração esquemática de um aparelho de medição no qual os métodos desta descrição podem ser usados. O aparelho inclui um dispositivo de separação e concentração descartável 10 no qual uma amostra 14 contendo um agente microbiano desconhecido é colocada. O agente microbiano é concentrado em uma massa tipo pelete 12 usando lise seletiva opcional de componentes de agente não microbiano na amostra (por exemplo, células de sangue), um colchão de densidade presente no dispositivo 10 e centrifugação. O gradiente de densidade e a centrifugação concentram o agente microbiano no fundo de um tubo capilar 15 presente no dispositivo 10.

O aparelho de medição inclui uma fonte de luz 16 que emite luz 18 em um comprimento de onda de excitação para estimular a produção de fluorescência intrínseca a partir do agente microbiano 12. A radiação de emissão 20 é direcionada para um arranjo de sensores 22 que é opcionalmente acoplado a um espectrômetro 24. Os dados de emissão de fluorescência em uma banda de comprimentos de onda são enviados para um computador 26. O computador é acoplado a uma memória 30 que armazena código de programa (incluindo código executando a sequência de instruções de processamento mostradas nas FIGs. 2A a 2C), constantes usadas nos módulos, e modelos compreendendo uma lista de agentes microbianos esperados e dados de fluorescência experimentalmente obtidos em pares de excitação e emissão particulares que são discriminatórios entre micro-organismos da maneira descrita abaixo. O computador 26 processa os dados com o auxílio da informação e código armazenado na memória 30 e gera um resultado de classificação que é exibido em uma tela da estação de trabalho acoplada 28 ou outro dispositivo de saída adequado, cujos detalhes não são importantes.

Os métodos de separação, concentração e interrogação são descritos em mais detalhes nas seguintes aplicações, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência, No. série US 12/589.929, intitulado “Methods for the isolation and identification of microorganisms”, depositado em 30 de outubro de 2009, US No. série 12/589.969, intitulado “Separation device for use in the separation, identification and/or characterization of microorganisms”, depositado em 30 de outubro de 2009, US No. série 12/589.952, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”, depositado em 30 de outubro de 2009, US No. série 12/589.936, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”, depositado em 30 de outubro de 2009, US. No. série 12/589.985, intitulado “Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents”, depositado em 30 de outubro de 2009, US No. série 12/589.968, intitulado “Method for detection, identification and/or characterization of microorganisms in a sealed container”, depositado em 30 de outubro de 2009, US No. série 12/589.976, intitulado “Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”, depositado em 30 de outubro de 2009. Os presentes métodos inventivos não estão limitados a essas técnicas.

Uma vez que o micro-organismo ou outro agente microbiano presente na amostra foi isolado e/ou peletizado no dispositivo de separação 10, a amostra ou pelete isolado é interrogada (por exemplo, espectroscopicamente, usando medições de fluorescência intrínseca) como descrito abaixo para caracterizar e/ou identificar os micro-organismos na amostra ou pelete. A interrogação pode acontecer de uma maneira não invasiva, isto é, o pelete pode ser interrogado enquanto permanece no dispositivo 10 usado para separar e concentrar o agente microbiano. A capacidade de identificar os micro-organismos de uma maneira não invasiva, opcionalmente junto com a manutenção do dispositivo 10 vedado por todo o processo de separação e caracterização/identificação e com a automatização do procedimento evita o constante manuseio de amostras contaminadas e/ou infecciosas e aumenta muito a segurança do processo inteiro. Ademais, a capacidade de caracterizar e/ou identificar micro-organismos por interrogação direta sem mais processamento da amostra ou pele- te 12 (por exemplo, ressuspensão, plaqueamento, e crescimento de colônias), aumenta muito a velocidade com a qual a identificação/caracterização pode ser feita.

Em uma modalidade, os métodos espectroscópicos ópticos podem ser usados para analisar uma ou mais propriedades intrínsecas dos micro-organismos, por exemplo, uma propriedade presente dentro do micro-organismo na ausência de agentes adicionais, tal como colorações, corantes, agentes de ligação, etc. Em outras modalidades, os métodos es- pectroscópicos ópticos podem ser usados para analisar uma ou mais propriedades extrínsecas dos micro-organismos, por exemplo, uma propriedade que pode somente ser detectada com o auxílio de agentes adicionais. A interrogação em formas preferenciais é executada usando espectroscopia de fluorescência. Por exemplo, a fluorescência em face frontal (onde a luz de excitação e a luz emitida entram e deixam a mesma superfície óptica, e se a amos-tra é geralmente opticamente espessa, a luz de excitação penetra na amostra uma distância muito curta (ver, por exemplo, Eisinger, J., e J. Flores, “Front-face fluorometry of liquid samples”, Anal. Biochem. 94: 15 (1983)) pode ser usada para a identificação de microorganismos em peletes.

Tipicamente, a fonte de luz 16, ou fonte de excitação, resulta na excitação da amostra, seguida por medição da emissão da fluorescência 20 da amostra em pontos no tempo pré-determinados ou continuamente. Similarmente, a luz refletida a partir da interação da fonte de excitação com a amostra pode ser medida para fornecer dados pertinentes para a identificação e/ou caracterização. A emissão a partir da amostra pode ser medida por qualquer meio adequado de discriminação espectral, mais preferencialmente empregando um espectrômetro 24.

Em uma modalidade presentemente preferencial, as medições de controle (por exemplo, espectro de fluorescência) são obtidas por micro-organismos conhecidos e dados armazenados na memória 30, permitindo assim a correlação de dados de teste medidos com a caracterização dos micro-organismos de interesse usando vários métodos matemáticos conhecidos pelos versados na técnica. Os dados de teste medidos a partir de microorganismos conhecidos são armazenados na memória legível por máquina 30, por exemplo, dentro de um instrumento implementando o método ou dentro de um dispositivo de processamento de dados associado, tal como a estação de trabalho conectada. Esses métodos podem ser usados para classificar micro-organismos desconhecidos de interesse na amostra que está sendo testada em grupos relevantes (por exemplo, espécie) com base na nomenclatura existente, e/ou em grupos que ocorrem naturalmente com base no metabolismo do organismo, patogenicidade e/ou virulência em projetar o sistema para monitorar, detectar e/ou caracterizar o organismo como descrito anteriormente.

A fonte de iluminação da amostra (ver FIG. 1), ou a fonte de excitação 16, pode ser selecionada a partir de qualquer número de fontes de luz adequadas como conhecidos pelos versados na técnica. Qualquer parte do espectro eletromagnético que produz dados utilizáveis pode ser usada. As fontes de luz capazes de emissão no espectro ultravioleta, visível e/ou infravermelho próximo, bem como outras partes do espectro eletromagnético, podem ser utilizadas e são conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, as fontes de luz podem ser lâmpadas contínuas tal como lâmpadas de deutério ou de xenon para a geração de luz ultravioleta e/ou lâmpadas alógenas de tungstênio para a geração de excitação infravermelha próxima/visível. Essas fontes de luz fornecem uma ampla faixa de emissão e a largura de banda espectral para os comprimentos de onda de excitação específicos podem ser reduzidas usando filtros de interferência óptica, prismas e/ou redes ópticas, como são bem conhecidos na técnica.

Alternativamente, uma pluralidade de fontes de luz de banda estreita, tal como diodos emissores de luz e/ou lasers, pode ser espacial e/ou temporariamente multiplexada para fornecer uma fonte de excitação de múltiplos comprimentos de onda. Por exemplo, os diodos emissores de luz estão disponíveis de 240 nm a em excesso de 900 nm e as fontes têm uma largura de banda espectral de 20 a 40 nm (largura total à metade da intensidade máxima). Os lasers estão disponíveis em comprimentos de onda discretos do ultravioleta ao infravermelho próximo e podem ser empregados usando métodos de multiplexação bem conhecidos pelos versados na técnica.

A seletividade espectral de qualquer uma das fontes de luz pode ser aprimorada usando-se dispositivos de discriminação espectral tal como um monocromador de varredura. Outros métodos de discriminação podem ser utilizados, como conhecido pelos versados na técnica, tal como um filtro sintonizável acústico-óptico, filtro sintonizável de cristal líquido, um arranjo de filtros de interferência óptica, espectrógrafo de prisma, etc., e em qualquer combinação. Uma consideração em selecionar o discriminador espectral leva em conta a faixa de sintonabilidade bem como o nível de seletividade. A título de ilustração, por exemplo, um discriminador precisa utilizar a faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm com uma seletividade de 10 nm. Esses parâmetros determinam geralmente a tecnologia ideal necessária para alcançar a faixa de sintonabilidade bem como a seletividade.

A iluminação a partir da fonte de luz 16 resulta na excitação da amostra, seguida por medição da emissão da fluorescência da amostra em pontos no tempo pré- determinados ou continuamente. Similarmente, a luz refletida a partir da interação da fonte de excitação com a amostra pode ser medida para fornecer dados pertinentes para a detecção e/ou caracterização.

A emissão a partir da amostra pode ser medida por qualquer dispositivo adequado de discriminação espectral, mais preferencialmente empregando um espectrômetro 24. O espectrômetro pode ser um monocromador de varredura que detecta os comprimentos de onda de emissão específicos onde a saída do monocromador é detectada por um tubo fo- tomultiplicador e/ou o espectrômetro pode ser configurado como um espectrógrafo de ima- giologia onde a saída é detectada por um arranjo detector de imagiologia tal como um arranjo detector de dispositivo de carga acoplada (CCD). Em uma modalidade, um discriminador permite a observação do sinal de fluorescência e/ou espalhamento por um dispositivo de fotodetecção (tal como um tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avalanche, arranjo detector CCD, e/ou arranjo detector de dispositivo de carga acoplada com multiplicação de elétrons (EMCCD)).

A técnica espectroscópica é usada para obter as medições que são preferencialmente fornecidas como medições de Matriz de Excitação-Emissão (EEM). Como usado aqui, EEM é definido como a intensidade de emissão espectral luminescente de substâncias fluorescentes como uma função tanto de comprimento de onda de excitação quanto de comprimento de onda de emissão, e inclui um espectro total ou um subconjunto desse, onde um subconjunto pode conter um único par de excitação/emissão ou múltiplos pares de exci- tação/emissão. Adicionalmente, uma seção transversal do EEM com um comprimento de onda de excitação fixo pode ser usada para mostrar o espectro de emissão para um comprimento de onda de excitação específico, e uma seção transversal do EEM com um comprimento de onda de emissão fixa pode ser usada para mostrar o espectro de excitação para uma amostra. Em uma modalidade, múltiplos EEMs são medidos em mais de um par de comprimentos de onda de excitação-emissão específicos, por exemplo, ao menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais pares de comprimentos de onda excitação-emissão específicos.

Concluiu-se que uma espectroscopia de fluorescência em face frontal fornece uma vantagem em medir as propriedades de fluorescência e/ou refletância de amostras altamente espalhadas e altamente resfriadas. Em uma modalidade, o método de face frontal pode ser particularmente útil. Por exemplo, a fluorescência em face frontal pode ser particularmente útil em amostras altamente absorventes porque o feixe de excitação e emissão não precisa viajar através do resto da amostra, e assim, pode ser menos afetado pelos componentes interferentes que podem estar contidos nesta (por exemplo, células sanguíneas e meio de cultura microbiológico). A superfície óptica do dispositivo de separação 1904 pode ser iluminada em tal ângulo a fornecer resultados aceitáveis como conhecido pelos versados na técnica (por exemplo, Eisinger, J. e J. Flores, “Front-face fluorometry of liquid samples”, Anal. Biochem. 94: 15 a 21 (1983)). Em uma modalidade, o sistema é projetado de modo que o sistema espectroscópico mede a luz refletida difusa em um mínimo de um ângulo fixo em adição a medir a fluorescência emitida em um mínimo de um ângulo fixo.

Em algumas modalidades, a caracterização e/ou identificação dos microorganismos na amostra ou pelete isolado não precisa envolver a identificação de uma espécie exata. A caracterização abrange a ampla categorização ou classificação de partículas biológicas bem como a identificação real de uma única espécie. A classificação do microorganismo a partir de uma amostra ou pelete isolado pode compreender a determinação de características fenotípicas e/ou morfológicas para o micro-organismo. Por exemplo, a caracterização das partículas biológicas pode ser executada com base em diferenças observáveis, tal como composição, forma, tamanho, agrupamento e/ou metabolismo. Em algumas modalidades, a classificação das partículas biológicas de interesse pode não exigir conhecimento anterior das características de uma dada partícula biológica, mas somente exige correlações consistentes com as medições empíricas, tornando assim esse método mais geral e prontamente adaptável do que os métodos com base em eventos de ligação específicos ou reações metabólicas. Como usado aqui, “identificação” significa determinar a qual família, gênero, espécie, e/ou cepa um micro-organismo anteriormente desconhecido pertence. Por exemplo, identificar um micro-organismo anteriormente desconhecido ao nível defamília, gênero, espécie, e/ou cepa.

Em alguns casos, a caracterização abrange modelos de classificação que fornecem informação útil suficiente para que a ação aconteça. Como usado aqui, os modelos de clas-sificação preferenciais compreendem o agrupamento em um ou mais dos seguintes: (1) Grupos de Gram, (2) Grupos de Gram Clínicos, (3) Grupos Terapêuticos, (4) Grupos Funcionais, e (5) Grupos de Fluorescência Intrínseca Natural. (1) Grupos de Gram: Dentro da classificação de Grupos de Gram, os microorganismos podem ser colocados em uma de três amplas categorias de classificação com base em sua reação de coloração de Gram e tamanho total, os ditos grupos selecionados a partir de um ou mais dos seguintes: (a) micro-organismos Gram positivos que têm a coloração azul escuro com a coloração de Gram; (b) micro-organismos Gram negativos que têm a coloração vermelha com a coloração de Gram; e (c) células de levedura que têm a coloração azul escuro com a coloração de Gram, mas são células arredondadas muito grandes que são distinguidas de bactérias por suas características morfológicas e seu tamanho. (2) Grupos de Gram Clinico: Os Grupos de Gram podem ser ainda divididos em várias subcategorias representando diferentes características morfológicas. Essas subcategorias compreendem toda a informação clínica relevante relatada por um técnico de laboratório com experiência, e assim fornecem um nível mais alto de identificação do que a reação Gram positiva ou negativa. Essa classificação particular é muito útil porque ela elimina considerações sobre a qualidade de uma coloração de Gram e/ou o nível do técnico que lê a mancha fornecendo a informação clinicamente relevante equivalente com o sistema automatizado. Mais especificamente, as subcategorias de micro-organismos com base nesse modelo de classificação podem ser selecionadas a partir de um ou mais dos seguintes: (a) cocos, que são pequenas células arredondadas, (b) diplococos, que são duas pequenas células arredondadas unidas, (c) hastes, que têm forma retangular, e (d) bacilos, que têm forma de haste. Exemplos dessas subcategorias que podem ser verificadas por informação morfológica adicional incluem: (i) cocos Gram positivos, (ii) cocos Gram positivos em cadeias, (iii) cocos Gram positivos em agrupamentos (isto é, agrupamentos “tipo uva”), (iv) diplococos Gram positivos, (v) hastes Gram positivas, (vi) hastes Gram positivas com endósporos, (vii) hastes Gram negativas, (viii) bacilococos Gram negativos, (ix) diplococos Gram negativos, (x) leveduras, e (xi) fungos filamentosos. (3) Grupos Terapêuticos: Os grupos terapêuticos compreendem múltiplas espécies microbianas que, quando isoladas a partir de tipos de espécimes particulares, são tratadas com a mesma classe de antibióticos ou mistura de antibióticos (por exemplo, como descrito em “Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”). Em muitos casos, a identidade para o nível espécie não é exigida pelo médico para possibilitar uma mudança da terapia empírica inicial para uma terapia mais direcionada, porque mais de uma espécie pode ser tratada com a mesma escolha de antibiótico(s). Esse nível de classificação coloca corretamente esses micro-organismos do “mesmo tratamento” em únicas categorias terapêuticas. Exemplos desse nível de caracterização incluem a capacidade de distinguir espécies de Entero- bacteriacae (EB) altamente resistentes de espécies EB sensíveis (Enterobacter spp. de E. coli) ou espécie Candida resistente a fluconazol (C. glabrata e C. kruzei) da espécie Candida sensível (C. albicans e C. parapsilosis) e assim por diante. (4) Grupos Funcionais: De acordo com a invenção, os micro-organismos podem também ser colocados em vários grupos com base em uma mistura de características metabólicas, de virulência e/ou fenotípicas. Os organismos não fermentativos podem ser claramente distinguidos dos fermentativos. Ademais, as espécies de micro-organismos que produzem hemolisinas podem ser agrupadas separadamente de espécies não hemolíticas. Em alguns casos, esses grupos representam categorias mais amplas do que o nível de gênero (por exemplo, coliformes, hastes não fermentativas Gram negativas), alguns no nível de gênero (por exemplo, Enterococos, Candida), e alguns com discriminação mais próxima ou de nível de espécie (por exemplo, estafilococo coagulase negativo, estreptococo alfa- hemolítico, estreptococo beta-hemolítico, estafilococo coagulase-positivo, isto é, S. aureus). (5) Grupos de Fluorescência Intrínseca (“IF”) Natural: Os micro-organismos podem também ser colocados em categorias com base em sua tendência natural de se agruparem por suas características de fluorescência intrínseca e/ou inata. Alguns desses grupos podem ser comuns a categorias de Grupo Terapêutico e Funcional. Esses agrupamentos podem compreender espécies individuais, tal como E. faecalis, S. pyrogenes, ou P. aeruginosa que têm assinaturas IF características e/ou podem conter pequenos grupos de organismos com assinaturas IF relativamente conservadas tal como os grupos K. pneumoniae-K. oxytoca ou E. aerogenes-E. cloacae.

Em adição a medir as propriedades intrínsecas de micro-organismos (tal como fluo-rescência intrínseca) para propósitos de identificação, os métodos podem usar agentes identificadores adicionais no processo de separação e/ou identificação. Os agentes que se ligam a micro-organismos específicos, tal como ligandos de afinidade, podem ser usados para separar micro-organismos, para identificar uma classe ou espécie de micro-organismos (por exemplo, através da ligação a uma proteína de superfície ou receptor exclusivo) e/ou para identificar uma característica do micro-organismo (por exemplo, resistência a antibióticos). Os agentes identificadores úteis incluem, sem limitação, anticorpos monoclonais e po- liclonais e fragmentos desses (por exemplo, anti-Eap para a identificação de S. aureus), sondas de ácido nucleico, antibióticos (por exemplo, penicilina, vancomicina, polimixina B), aptâmeros, miméticos de peptídeo, proteínas de ligação derivadas de fagos, lectinas, bio- marcadores de imunidade inata do hospedeiro (proteínas de fase aguda, proteína de ligação a LPS, CD14, lectina de ligação à manose, receptores tipo Toll), peptídeos de defesa de hospedeiro (por exemplo, defensinas, catelicidinas, proteogrinas, magaininas), bacterocinas (por exemplo, lantibióticos, tal como nisina, mersacidina, epidermina, galidermina e plantari- cina C, e peptídeos classe II), bacteriófagos, e corantes seletivos quanto a ácidos nucleicos, lipídeos, carboidratos, polissacarídeos, cápsulas ou proteínas, ou qualquer combinação desses. Se o agente não emitir um sinal detectável, o agente pode ser marcado para fornecer um sinal detectável, tal como conjugando o agente a um marcador (por exemplo, visível ou fluorescente). Os marcadores incluem, sem limitação, compostos de limitação, fluorescentes, luminescentes, fosforescentes, radioativos, e/ou colorimétricos. O agente pode ser adicionado aos micro-organismos em qualquer etapa nos métodos da invenção, por exemplo, quando a amostra é obtida, durante a lise, e/ou durante a separação. Em algumas modalidades, a presença do agente no pelete pode ser determinada durante a interrogação do pelete. Outros agentes identificadores úteis incluem substratos para enzimas microbianas, agentes quelantes, agente de fotossensibilizantes, agentes de arrefecimento, agentes de redução, agentes oxidantes, tampão, ácido, base, solvente, fixadores, detergentes, tensoati- vos, desinfetantes (por exemplo, álcoois, alvejantes, peróxido de hidrogênio) e compostos tóxicos (por exemplo, azida de sódio, cianeto de potássio) e inibidores metabólicos tal como ciclohexamida, etc. Similarmente, muitos compostos fluorescentes para medir a viabilidade, metabolismo e/ou potencial de membrana de células microbianas podem ser usados como um agente identificador na presente invenção. Como seria prontamente apreciado pelos versados na técnica, a sensibilidade de um micro-organismo particular a qualquer composto que afeta seu estado físico ou metabolismo, tal como um antibiótico, poderia ser prontamente verificada adicionando-se o composto à amostra, tampão de lise, colchão de densidade ou qualquer mistura desses.

Uma modalidade de um método para executar a identificação e/ou caracterização de agentes microbianos em amostras usando fluorescência intrínseca e um processo de classificação taxonômica hierárquica será descrita agora em conjunto com as FIGs. 2 a 10. Basicamente, o método pode ser incorporado como uma sequência de instruções de processamento armazenadas na memória e executadas usando um processador de dados convencional ou computador 26. As instruções de processamento executam um algoritmo mostrado nas FIGs. 2A a 2C, que é projetado para fornecer a identificação de um isolado de cultura sanguínea (pelete concentrado) dada uma varredura de fluorescência intrínseca (IF) do isolado a partir de um conjunto predefinido de comprimentos de onda de emissão. O algoritmo pode ser adaptado para outros tipos de dados do teste analítico (por exemplo, espalhamento Raman ou espectrometria de massas).

Em modalidades preferenciais, o método é codificado como instruções de software implementando um algoritmo de identificação multinível. Os algoritmos de classificação tra-dicionais que usam dados de entrada e determinam a identificação de um micro-organismo usam um único modelo de classificação. Fornecidos os dados a partir de uma varredura de fluorescência intrínseca em um conjunto predefinido de comprimentos de onda de um organismo desconhecido, o algoritmo de identificação multinível classifica o organismo seguindo as ramificações de uma hierarquia taxonômica - classe de Gram, família, e espécie. A única característica é o uso de modelos de classificação separados em cada etapa de identificação da mais alta, classe de Gram, para a mais baixa, espécie. Adicionalmente, a abordagem incorpora o uso de modelos de classificação paralelos para avaliar a consistência entre os resultados. Assim, a probabilidade de identificação e/ou caracterização precisa é maximizada, e a geração de resultados de identificação ou caracterização incorretos é minimizada.

O método de identificação inclui um conjunto de etapas de pré-processamento de dados (mostrado como os blocos 5102, 5104 e 5106 da FIG. 2A), e um conjunto de etapas de análise (os blocos restantes 5108, 5110, etc. nas FIGs. 2B, 2C). O método determina a identificação do organismo em múltiplos níveis da hierarquia taxonômica. As etapas de pré- processamento são projetadas para adquirir os dados de varredura IF e executam as transformações de dados que minimizam a variação entre diferentes cepas de um agente microbiano dentro de um dado grupo ou espécie de organismos. As etapas de análise de dados implementam uma identificação multinível usando modelos de classificação paralelos, como será entendido a partir da seguinte discussão.

Como notado acima, as modalidades preferenciais fornecem uma identificação de organismo nos níveis de Gram, família, e espécie. Os organismos geralmente encontrados em culturas sanguíneas que podem ser identificadas pelo algoritmo incluem, mas não estão necessariamente limitados aos listados na Tabela 1. Obviamente, para diferentes aplicações (por exemplo, sangue, água, amostras ambientais, etc.), os organismos podem diferir dos listados na Tabela 1, entretanto, a metodologia é a mesma.(a) Tabela 1: Lista de organismos de identificação de algoritmo de fluorescência in-trínseca

As etapas de processamento ou módulos mostrados nas FIGs. 2A a 2C serão agora descritas em detalhes.

Pré-processamento

Etapa 5102: Obter um valor de fluorescência, nij, para cada valor de excitação, i = 1, 2, ..., x, e cada combinação de emissão, j = 1, 2, ..., y. A relação valor de emissão/valor de excitação deve estar dentro do intervalo (1,05, 1,95).

Etapa 5104: Para cada valor de fluorescência, nij, calcular o valor logarítmico natural, ln(nij).

Etapa 5106: Calcular a 1a derivada do valor de transformada log natural (da etapa 5104) para cada valor de emissão, j = 2, 3, ..., y-1, através de um dado comprimento de on-da de excitação, i.

É vantajoso transformar os dados de fluorescência brutos para minimizar a variação cepa a cepa dentro de cada grupo de organismos, usando ambas as etapas 5104 e 5106. Adicionalmente, o processo de transformação tende a criar variância similar através de grupos de organismos. As FIGs. 3, 4, e 5 ilustram, a título de exemplo, os efeitos de executar o pré-processamento descrito para múltiplas cepas de Staphylococcus aureus avaliado através da faixa de emissão na excitação de 315 nm. Na FIG. 3, cada linha representa o sinal de fluorescência a partir de uma única cepa. A linha 5202 indica o sinal de fluorescência médio em cada valor de emissão. A FIG. 4 mostra a variação cepa a cepa no sinal de fluorescência após a aplicação da transformação logarítmica natural (etapa 5104), nota-se que as curvas para todas as cepas estão próximas. A FIG. 5 mostra a variação cepa a cepa na excitação de 315 nm após o cálculo da primeira derivada da transformação logarítmica natural (etapa 5106). Novamente, nota-se que as curvas para todas as cepas estão muito próximas, particularmente na faixa de emissão 400 a 610 nm.

Como outro exemplo, a FIG. 6 mostra a variação cepa a cepa no sinal de fluorescência na excitação de 415 nm para Candida parapsilosis, antes de executar as etapas de transformação. Nota-se a ampla variação na emissão na faixa de 400 a 650 nm. A variação cepa a cepa para esse organismo na excitação de 415 nm após executar a transformação logarítmica natural é mostrada na FIG. 7. A variação cepa a cepa após executar a transformação da primeira derivada é mostrada na FIG. 8. Nota-se que na FIG. 8, a variação cepa a cepa é muito reduzida.

Transformações de dados adicionais podem ser usadas. Uma é normalizar o valor de fluorescência em cada ponto de emissão para a média para todos os pares de emissão para um comprimento de onda de excitação particular.

Em outra abordagem de pré-processamento, uma normalização do valor de fluo-rescência para o sinal máximo ao longo de cada linha de comprimento de onda de emissão e/ou excitação pode identificar regiões do espectro sem pico próximas que fornecem benefício de classificação considerável não possível com os dados não normalizados. Em alguns casos, pode ser mais preciso primeiro normalizar o valor de fluorescência para um fluoróforo celular menos variável, tal como triptofano antes de aplicar outras estratégias de normalização e/ou análise. Ademais, os dados de espalhamento Rayleigh (refletância difusa) podem ser usados potencialmente para compensar variações de superfície no dispositivo de separação e/ou variações dentro do pelete de células microbianas e/ou sistema óptico.

Análise

Etapa 5108: O primeiro nível de classificação na análise após executar as etapas de pré-processamento é a classificação de Gram 5108. Nessa etapa, o processamento inclui duas ramificações, uma representada pelas etapas 5110 e 5112 e outra representada pelas etapas 5114 e 5116. A FIG. 2A não implica em que as ramificações não poderiam ser executadas sequencialmente, as ramificações poderiam ser executadas ou sequencialmente ou em paralelo.

Etapa 5110: Cálculo da distância de classificação de Gram. Usando as transformadas da 1a derivada para um conjunto predefinido de pares de excitação/emissão, calcular a distância,

para cada classe de Gram definida no modelo onde - = 1,2, 3, representa as classes de Gram definidas no modelo - ”• representa o vetor de valores calculados na ia derivada, •••••-■;, da transformada log natural para cada par de excitação/emissão i, j - ■"representa o vetor de valores médios í.) a partir de uma distribuição para cada classe no par de excitação/emissão i, j - t representa a transposta do vetor - C - J representa o vetor de diferenças “ í.) para cada par de excita-ção/emissão i, j

- representa a inversa da matriz covariância para o conjunto predefinido de par de excitação/emissão. Os conjuntos de pares de excitação e emissão são experimentalmente determinados a partir de medições de fluorescência (com pré-processamento executado) de micro-organismos conhecidos (ver FIGs. 9 e 10 e a discussão abaixo).

O termo “modelo” é usado para se referir a um conjunto de agentes microbianos conhecidos para os quais as medições IF (incluindo transformadas) nos comprimentos de onda de excitação pré-determinados foram anteriormente obtidas e para os quais um espécime é um candidato para a classificação, por exemplo, os agentes listados na Tabela 1.

Etapa 5112: Interpretação da Classificação de Gram - ug representa o limite de distância máximo - Se todas as distâncias d1, d2 e d3 são maiores do que ug, o resultado da classificação é desconhecido. - Se não, determinar o valor de dmin, o valor mínimo de d1, d2, e d3 - wg representa o fator de limite de baixa discriminação - Se mais de uma distância, d1, d2 e d3, é menor do que (dmin * Wq), o resultado da classificação é Baixa Discriminação entre as classes de Gram tendo distâncias menores do que (dmin * Wq) - Se somente uma distância, d1, d2 e d3, é menor do que (dmin * Wq), o resultado da classificação é a classe de Gram correspondente.

Etapa 5114: Cálculo de distância de classificação de todas as famílias

Usando as transformadas de 1a derivada para um conjunto predefinido de pares de excitação/emissão, calcular a distância,

para cada família de organismos definida no modelo onde - = 1,2, ..., k, representa todas as famílias de organismos definidas no modelo

- representa a inversa da matriz covariância para o conjunto predefinido de par de excitação/emissão (mesmo comentário acima, os conjuntos de pares de excitação e emissão são experimentalmente determinados) - representa o vetor de valores calculados da ia derivada, , da transformada log natural para cada par de excitação/emissão i, j - representa o vetor de valores médios (.) a partir de uma distribuição para cada classe no par de excitação/emissão i, j - t representa a transposta do vetor - C - ) representa o vetor de diferenças . _ •••(.) para cada par de excita- ção/emissão i, j

Etapa 5116: Interpretação da classificação de todas as famílias - uf representa o limite de distância máximo - Se todas as distâncias d1, d2, ..., da são maiores do que uf, o resultado da classifi-cação é desconhecido. - Se não, determinar o valor de dmin, o valor mínimo de d1, d2, ..., da - wf representa o fator de limite de baixa discriminação - Se mais de uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Wf), o resultado da classificação é Baixa Discriminação entre as famílias de organismos tendo distâncias meno-res do que (dmin * Wf) - Se somente uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Wq), o resultado da classificação é a família correspondente.

Etapa 5118: Agrupar as interpretações de classificação de Gram e de todas as famílias para o resultado de classificação de Gram final.

Se a classificação de Gram é uma única escolha e a classificação de todas as famílias é uma única escolha, o resultado da classificação agrupada é a classe de Gram indica- da se a classificação de família estiver sob a hierarquia taxonômica da classe de Gram.

Se a classificação de Gram é uma única escolha e a classificação de todas as famílias é uma única escolha, o resultado da classificação agrupada é desconhecido se a classificação de família não está sob a hierarquia taxonômica da classe de Gram.

Se a classificação de Gram é uma única escolha e a classificação de todas as famílias é uma baixa discriminação, a classificação agrupada é a classe de Gram indicada se a família associada com a menor distância está sob a hierarquia taxonômica da classe de Gram.

Se a classificação de Gram é uma única escolha e a classificação de todas as famílias é uma baixa discriminação, a classificação agrupada é desconhecida se a família associada com a menor distância não está sob a hierarquia taxonômica da classe de Gram.

Se a classificação de Gram é uma baixa discriminação e a classificação de todas as famílias é uma única escolha, o resultado da classificação agrupada é a classe de Gram que corresponde à classe de Gram sob a qual a família reside na hierarquia taxonômica.

Se a classificação de Gram é uma baixa discriminação e a classificação de todas as famílias é uma única escolha, o resultado da classificação agrupada é desconhecido se ne-nhuma das classes de Gram corresponde à classe de Gram sob a qual a família reside na hierarquia taxonômica.

Se a classificação de Gram e a classificação de todas as famílias são ambas des-conhecidas, o resultado da classificação agrupada é desconhecido.

O processamento então prossegue para a etapa 5120, a Classificação de Gram- família, um segundo nível de classificação inferior em uma hierarquia taxonômica. Essa etapa consiste de subetapas 5122, 5124 e 5126.

Etapa 5122: Cálculo da distância de classificação de Gram-família

Usando as estimativas de 1a derivada para um conjunto predefinido de par de exci- tação/emissão que são específicas para o resultado da classificação de Gram, calcular a distância,

para cada família de organismos definida no modelo onde - = 1, 2, ..., k, representa o número de famílias de organismos definidas no modelo

- representa a inversa da matriz covariância para o conjunto predefinido de par de excitação/emissão (mesmo comentário acima considerando os pares) - ”• representa o vetor de valores calculados da 1a derivada, : ;, da transformada log natural para cada par de excitação/emissão i, j - representa o vetor de valores médios (.) a partir de uma distribuição para cada classe no par de excitação/emissão i, j - t representa a transposta do vetor - C - ) representa o vetor de diferenças . _ •••(.) para cada par de excita- ção/emissão i, j

Etapa 5124: Interpretação da classificação de Gram-família - ut representa o limite de distância máximo - Se todas as distâncias d1, d2, ..., da são maiores do que ut, o resultado da classificação é desconhecido. - Se não, determinar o valor de dmin, o valor mínimo de d1, d2, ..., da - wt representa o fator de limite de baixa discriminação - Se mais de uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Wt), o resultado da classificação é Baixa Discriminação entre as famílias de organismos tendo distâncias meno-res do que (dmin * Wt) - Se somente uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Wt), o resultado da classificação é a família correspondente.

Etapa 5126: Resultado da classificação de Gram-família

Se o resultado da classificação de Gram-família é desconhecido, a classificação do organismo de teste é finalizada no nível de Gram.

Se o resultado da classificação de Gram-família é Baixa Discriminação, a classificação do organismo de teste é finalizada com o Gram e as famílias incluídas na baixa discriminação.

Se o resultado da classificação de Gram-família é uma única família, os dados IF do organismo de teste são ainda analisados para determinar se uma identificação de nível de espécie pode ser determinada.

Etapa 5128: Classificação de Gram-família-espécie

As instruções de processamento prosseguem para um nível de classificação de Gram-família-espécie, um terceiro e ainda menor nível de classificação em uma hierarquia taxonômica, consistindo de subetapas 5130, 5132 e 5134.

Etapa 5130: Cálculo da distância de classificação de Gram-família-espécie.

Usando as estimativas de 1a derivada para um conjunto predefinido de par de exci- tação/emissão que são específicas para o resultado da classificação de Gram-família, calcular a distância,

para cada espécie de organismos definida no modelo onde - = 1, 2, ..., k, representa o número de espécies de organismos definidas no modelo

- representa a inversa da matriz covariância para o conjunto predefinido de pares de excitação/emissão (mesmo comentário acima) - representa o vetor de valores calculados da 1a derivada, •••••- ■;, da transformada log natural para cada par de excitação/emissão i, j - representa o vetor de valores médios (.) a partir de uma distribuição para cada classe ' no par de excitação/emissão i, j - t representa a transposta do vetor - C" — ) representa o vetor de diferenças “ "••■(.) para cada par de excita- ção/emissão i, j

Etapa 5132: Interpretação da classificação de Gram-família-espécie - us representa o limite de distância máximo - Se todas as distâncias d1, d2, ..., da são maiores do que us, o resultado da classificação é desconhecido. - Se não, determinar o valor de dmin, o valor mínimo de d1, d2, ..., da - ws representa o fator de limite de baixa discriminação - Se mais de uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Ws), o resultado da classificação é Baixa Discriminação entre as espécies de organismos tendo distâncias me-nores do que (dmin * Ws) - Se somente uma distância, d1, d2, ..., da, é menor do que (dmin * Wt), o resultado da classificação é a espécie correspondente.

Etapa 5134: Resultado da classificação de Gram-família-espécie.

Se o resultado da classificação de Gram-família-espécie é desconhecido, a classifi-cação do organismo de teste é finalizada no nível de Gram e de família.

Se o resultado da classificação de Gram-família-espécie é Baixa Discriminação, a classificação do organismo de teste é finalizada como o Gram, família, e espécie incluídos na baixa discriminação.

Se o resultado da classificação de Gram-família-espécie é uma única espécie, a classificação do organismo de teste é finalizada no nível de Gram, família e espécie.

Na etapa 5136, os resultados determinados nas etapas 5134, 5118 e 5126 são re- tornados e relatados ao usuário, por exemplo, em uma interface de usuário para o instrumento de identificação, transmitidos para uma estação de trabalho acoplada, retornados para outro módulo de software, ou de outra forma, gerados para o usuário.

Com relação à identificação do organismo (etapa 5134), a discriminação entre as espécies é possível somente se os valores da primeira derivada (da transformação logarítmica natural do valor de emissão) são exclusivos para cada espécie no modelo na mesma parte da faixa de emissão para ao menos um comprimento de onda de excitação. As FIGs. 9 e 10 ilustram o potencial de discriminação entre um subconjunto de espécies para comprimentos de onda de excitação de 315 nm (FIG. 9) e 415 nm (FIG. 10). Com relação à FIG. 9, está claro que várias das espécies podem ser discriminadas das outras com base na primeira derivada no comprimento de onda de excitação de 315 nm. O modelo matemático usa os valores da primeira derivada (da transformada log natural) para emissões onde existem diferenças visuais como entradas para discriminar entre as espécies. Usando seções selecionadas de valores através da faixa de emissão, a seguinte espécie pode ser claramente discriminada das outras: E. coli, H. influenza, P. aeruginosa, e S. pneumoniae. Em adição, S. aureus e S. epidermidis podem ser discriminados de outras espécies, mas não entre si. As seções de valores através da faixa de emissão em um dado comprimento de onda de excitação são os pares predefinidos nas matrizes inversas nos cálculos de distância nas etapas de processamento descritas acima. Esses pares podem, por exemplo, ser excitação em 315 nm e a faixa de valores de emissão indicados pelos círculos mostrados na FIG. 9, isto é, (315/300-450), (315, 485-500), (315/570-580).

Com relação à FIG. 10, está claro que as emissões no comprimento de onda de ex-citação de 415 nm têm a capacidade de discriminar entre as espécies. Usando as seções selecionadas de valores através da faixa de emissão, C. parasilopsis e P. aurginosa podem ser claramente discriminados de outras espécies. É também de interesse notar a diferença entre os valores da primeira derivada para S. aureus e S. epidermidis que ocorre em torno da emissão de 450 nm. Quando a informação a partir das seções selecionadas de valores através da faixa de emissão para os comprimentos de onda de 315 nm e 415 nm (FIGs. 9 e 10) é combinada, todas as espécies no modelo podem ser discriminadas entre si em uma alta taxa (> 97% de confiabilidade).

Para melhorar os sinais de fluorescência, os micro-organismos poderiam ou ser re-vestidos com nanopartículas de ouro e/ou prata antes da centrifugação/concentração, e/ou a superfície óptica interna poderia ser pré-revestida com coloides de metal de tamanho e forma particulares (refs: Lakowicz, Anal. Biochem. 337: 171 (2005) para fluorescência; Efrima e outros, J. Phys. Chem. B. (Letter) 102: 5947 (1998) para SERS). Em outra modalidade, as nanopartículas estão presentes em um colchão de densidade presente no dispositivo de separação antes da centrifugação e se associam com micro-organismos à medida que eles passam através do colchão de densidade.

O método de classificação hierárquica taxonômica explicado acima no contexto das FIGs. 2 a 10 é aplicável a outros conjuntos de dados obtidos a partir da interrogação de um agente microbiano. Por exemplo, o método de classificação seria igualmente útil no caso desses dados de espalhamento Raman ou dados de espectrometria de massas serem obtidos a partir de um agente microbiano concentrado ao invés de dados de fluorescência intrínseca. No caso de espalhamento Raman, os dados são obtidos a partir de agentes microbianos conhecidos e tais dados são analisados (tipicamente depois que etapas de transformação são executadas) para determinados subconjuntos dos dados que são discriminatórios entre Gram, família, e espécie e os resultados, isto é, os subconjuntos discriminatórios armazenados. Similarmente, os dados de um agente microbiano desconhecido são submetidos a uma etapa de transformação para minimizar a variação cepa a cepa entre as espécies; a transformação pode ser logarítmica natural, primeira derivada ou outra transformação, e a seleção e os detalhes da transformação estarão dentro da capacidade dos versados na técnica com base no exame dos dados quanto a agentes microbianos conhecidos. O processamento das FIGs. 2A-2DC (classificação hierárquica no nível de Gram, Família e Espécie) então prossegue. Alternativas para o cálculo de distância mínima usado para a classificação, tal como o algoritmo de classificação K-Nearest Neighbor, podem ser usadas para a classificação da amostra de teste em cada nível hierárquico. Estará claro também que etapas de pré-processamento adicionais podem ser exigidas, as quais não são mostradas no fluxograma das FIGs. 2A-2C, que são exclusivas para o método de teste analítico, tal como subtração de fundo ou normalização, mas essas etapas são conhecidas na técnica e então uma descrição detalhada não é necessária.

Generalizando o anterior, descreveu-se um método para a rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra, compreendendo as etapas de: obter dados de teste analítico do agente microbiano; transformar os dados do teste analítico, minimizando assim as variações cepa a cepa nos dados do teste analítico dentro de um grupo de organismos; e com o auxílio de um computador programado, executar um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de proces-samento operando nos dados do teste analítico transformados, os múltiplos níveis corres-pondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos sus-peitos de estarem na amostra. Em algumas modalidades, os dados do teste analítico (por exemplo, fluorescência intrínseca, espalhamento Raman) são executados enquanto o agente microbiano é concentrado dentro de um dispositivo de teste no qual o agente foi separado e concentrado, como mostrado na FIG. 1; em outras modalidades, o agente concentrado é removido do dispositivo de teste e submetido à análise em um instrumento separado, por exemplo, espectrômetro de massas. Exemplos adicionais de métodos analíticos que podem ser usados são descritos na Patente US. 6.780.602, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

Enquanto uma modalidade foi descrita na qual a amostra é sangue humano ou animal, obviamente a invenção é aplicável a amostras em geral, que podem ser amostras clínicas ou não clínicas. Os métodos poderiam também ser usados para identificar colônias microbianas removidas de uma placa ou outra forma de dispositivo de cultura microbiana, e nessa situação, novamente, a amostra a partir da qual tais colônias são cultivadas poderiam ser amostras clínicas ou não clínicas, e assim não necessariamente sangue. Por exemplo, a amostra pode ser uma amostra clínica ou não clínica suspeita de conter um ou mais agentes microbianos. As amostras clínicas, tal como fluido corporal, incluem, mas não estão limitadas a sangue, soro, plasma, frações de sangue, líquido sinovial, urina, sêmen, saliva, fezes, fluido cérebro-espinhal, conteúdos gástricos, secreções vaginais, homogenados de tecido, aspirados de medula óssea, homogenados ósseos, esputo, aspirados, swabes e rinsagem com swabe, outros fluidos corporais, e similares. As amostras não clínicas que podem ser testadas incluem, mas não estão limitadas a gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, água (por exemplo, água potável, água não potável, e água residual), lastros de água do mar, ar, solo, esgoto, materiais de plantas (por exemplo, sementes, folhas, caules, raízes, flores, frutos), produtos do sangue (por exemplo, peletes, soro, plasma, frações de glóbulos brancos, etc.), amostras de tecido ou órgão doador, amostras de guerra biológica, e similares.

A variação dos detalhes a partir das modalidades descritas é possível sem abandonar o escopo da invenção. Todas as questões com relação ao escopo são respondidas com relação às reivindicações em anexo.

Claims (14)

1. Método para rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: obter valores de fluorescência ao longo de uma faixa de comprimentos de onda de emissão a partir do agente microbiano, a faixa de comprimentos de onda de emissão obtida em uma pluralidade de comprimentos de onda de excitação; transformar as medições de fluorescência, em que transformar compreende calcular um logaritmo natural dos valores de fluorescência através de um dado comprimento de onda de excitação e calcular uma primeira derivada dos valores de logaritmo natural; e com o auxílio de um computador programado, executar um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nas medições de fluorescência transformadas, os múltiplos níveis correspondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo de classificação multinível prossegue de forma monótona em uma ordem de um nível mais alto na hierarquia taxonômica para um nível mais baixo na hierarquia taxonômica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo de classificação multinível primeiro classifica o agente microbiano por classe de Gram, então por família, e então por espécie.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo de classificação multinível, para cada nível no algoritmo, compreende as etapas de: executar um cálculo de distância em valores de fluorescência transformados e uma inversa de uma matriz de covariância para um conjunto predefinido de pares de excitação/emissão; executar uma interpretação de classificação usando os resultados do cálculo de distância e um limite de distância mínima e um limite de baixa discriminação; egerar um resultado de classificação.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo inclui um conjunto de instruções de processamento em nível de classificação de Gram, e em que o nível de classificação de Gram inclui uma primeira ramificação de instruções de processamento incluindo um cálculo de distância para cada classe de Gram definida em um modelo compreendendo um conjunto de agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra e uma etapa de interpretação da classificação de Gram; em que a classificação de Gram inclui uma segunda ramificação de instruções de processamento incluindo um cálculo de distância para todas famílias de organismos definidas no modelo e em uma etapa de interpretação de classificação de todas as famílias; e em que a etapa de gerar um resultado de classificação inclui uma etapa de agrupar os resultados da interpretação de classificação de Gram e da interpretação de classificação de todas as famílias.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo inclui um nível de classificação de Gram-família incluindo instruções de processamento que executam um cálculo de distância para cada família de organismos definida em um modelo que compreende um conjunto de agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra e uma etapa de interpretação de classificação de Gram-família usando os resultados do cálculo de distância para cada família de organismos definida em um modelo, um limite de distância mínima e um limite de baixa discriminação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o algoritmo inclui um nível de classificação de Gram-família-espécie incluindo instruções de processamento que executam um cálculo de distância para cada es- pécie de organismo definida em um modelo que compreende um conjunto de agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra e uma etapa de interpretação de classificação de Gram-família-espécie usando os resultados do cálculo de distância para cada família de organismos definida em um modelo, um limite de distância mínima e um limite de baixa discriminação.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjunto predefinido de pares de excitação/emissão é obtido a partir de medições de fluorescência intrínseca de agentes microbianos conhecidos através de uma faixa de valores de excitação e emissão, o conjunto predefinido de pares de excita- ção/emissão selecionados quanto a sua capacidade de distinguir entre agentes microbianos diferentes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: obter experimentalmente medições de fluorescência intrínseca a partir de agentes microbianos conhecidos através de uma faixa de valores de excitação e emissão e selecionar a partir de tais medições um conjunto de pares de excita- ção/emissão quanto a sua capacidade de distinguir entre agentes microbianos diferentes; obter medições de fluorescência intrínseca a partir de um agente microbiano desconhecido no conjunto de pares de excitação/emissão; transformar as medições de fluorescência intrínseca a partir de um agente microbiano desconhecido; e identificar e/ou caracterizar o agente microbiano desconhecido usando as medições de fluorescência intrínseca transformadas e as medições de fluorescência intrínseca obtidas experimentalmente a partir de agentes microbianos conhecidos com o auxílio de um computador programado executando um algoritmo de classificação.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra compreende uma amostra de sangue humano ou animal.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente microbiano é concentrado em pelete ou massa tipo pelete e em que as medições intrínsecas são obtidas a partir do pelete ou massa tipo pelete.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelete ou massa tipo pelete está contido dentro de dispositivo descartável vedado.

13. Aparelho de medição para rápida identificação e/ou caracterização de um agente microbiano presente em uma amostra, CARACTERIZADO por compreender: meios para obter valores de fluorescência ao longo de uma faixa de comprimentos de onda de emissão a partir de agentes microbianos, a faixa de comprimentos de onda de emissão obtida em uma pluralidade de comprimentos de onda de excitação; e um computador, programado para transformar medições de fluorescência, em que transformar compreende calcular um logaritmo natural dos valores de fluorescência através de um comprimento de onda de excitação dado e calcular uma primeira derivada dos valores de logaritmo natural; e programado para executar um algoritmo de classificação multinível codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nas medições de fluorescência transformadas, os múltiplos níveis correspondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

14. Computador, CARACTERIZADA pelo fato de que contém um método compreendendo: (i) uma etapa de transformar realizada em medições de fluorescência obtidas ao longo de uma faixa de comprimentos de onda de emissão a partir de um agente microbiano presente em uma amostra, a faixa de comprimentos de onda de emissão obtida em uma pluralidade de comprimentos de onda de excitação, em que transformar compreende calcular um logaritmo natural dos valores de fluorescência através de um dado comprimento de onda de excitação e calcular uma primeira derivada dos valores de logaritmo natural; e (ii) uma etapa de classificação de multinível realizada usando um algoritmo codificado como um conjunto de instruções de processamento operando nas medi-ções de fluorescência transformadas, os multiníveis correspondendo a diferentes níveis em uma hierarquia taxonômica para agentes microbianos suspeitos de estarem na amostra.

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