CN107408152B - 使用快速固有荧光法的含有抗性基因的细菌的免试剂鉴定 - Google Patents
使用快速固有荧光法的含有抗性基因的细菌的免试剂鉴定 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种允许鉴别含有特异性抗生素抗性基因的常见细菌的分离物和不含该基因的相似分离物的方法。更具体地,本发明涉及一种使用自动化快速平台系统来分析细菌菌株的多维光学特性的方法,该自动化快速平台系统采用固有荧光、光学数据分析和人工智能方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月6日提交的名称为“使用快速固有荧光法的含有抗性基因的细菌的免试剂鉴定”的美国临时专利申请序列号62/129,530的优先权,其全部内容通过引用并入本申请。
背景技术
技术领域
本发明涉及一种允许鉴别含有特异性抗生素抗性基因的常见细菌分离物和不含有抗生素抗性基因的相似分离物的方法。此外,本发明涉及允许在含有不同抗生素抗性基因的细菌菌株之间进行鉴别的方法。更具体地,本发明涉及一种鉴定和鉴别细菌菌株的方法,包括:1)获得生物样品,例如血液、尿液和/或任何其他体液;2)处理生物样品以浓缩生物样品中的细菌;和3)通过光学分析仪运行浓缩的细菌样品,以获得固有荧光数据,然后其不仅可以用于确定细菌菌株,而且可以用于确定细菌菌株是否含有抗生素抗性基因。此外,本申请提供的方法还允许使用数据来鉴别可能含有不同抗生素抗性基因的细菌。总之,本申请提供的方法主要是使用固有荧光以:1)鉴别不同类型的细菌(即鉴别不同细菌物种);2)鉴别含有不同抗生素抗性基因的相同细菌物种;和3)从不携带抗生素抗性基因的那些细菌物种中鉴别携带抗生素抗性基因的细菌物种。此外,本申请提供的方法允许分析收集的可疑样品的各种类型。
当微生物(即细菌和/或细菌菌株)自发或通过基因转移获得基因突变时,抗微生物(即抗菌)抗性发生,使其对一种或多种抗菌剂即抗生素的作用具有抗性。耐药生物可能获得对一线抗生素的抗性,需要使用微生物敏感的二线试剂。在一些已经获得对多种药物耐受性的细菌菌株的情况下,依次获得对第二和甚至第三线抗生素的抗性。
抗性可能采取自发或诱导遗传突变的形式产生,或通过接合、转导或转化的水平基因转移从其他细菌物种中获得抗性基因。许多抗生素抗性基因存在于便于其转移的可传播的质粒上。抗生素抗性质粒通常含有对几种不同抗生素产生抗性的基因。
在临床实践中所看到的抗生素抗性细菌感染的增加率源于人类和兽医药物中抗生素的使用。抗生素的任何使用可以增加菌群的进化选择压力,使抗性细菌成长,并使非抗性细菌死亡。由于对抗生素的抗性变得更加普遍,所以需要更多的替代治疗方法。抗生素耐药性对公共卫生构成了严重和日益增加的全球性问题。随着对抗生素具有抗性的细菌菌株数量的增加,需要药物帮助的个体无法获得他们所需要的适当治疗。
因此,本发明的目的是提供一种用于鉴定含有抗生素抗性基因的细菌菌株的灵敏、快速的方法。更重要的是,确定细菌菌株所含有的抗生素抗性是什么类型或有哪些类型是必要的。鉴定含有抗生素抗性基因的细菌菌株将非常有助于药物设计和治疗方案的开发。
相关技术说明
一般来说,目前用于鉴定、分离和鉴别具有和不具有抗生素抗性基因的细菌菌株的实践通常包括一个在微生物实验室中复杂且漫长的过程。在目前的过程中,含有细菌的生物样品首先被接受入实验室。在一个过程中,然后使用消毒的环将生物样品在含营养丰富的培养基(例如,LB培养基或任何其它合适的肉汤)的琼脂平板上划线。该琼脂平板含有用抗生素处理过的斑点。一旦将样品在平板上划线,将琼脂平板置于专用培养箱中至少要12小时。然后定期检查琼脂平板以进行细菌菌落生长。如本领域普通技术人员理解的,如果生物样品含有细菌,则预期在不含抗生素的斑点上存在细菌菌落生长。如果细菌没有获得抗生素抗性基因,那么在含有抗生素的斑点上的生长是不可预料的。然而,如果细菌菌株获得抗生素抗性基因,则在用抗生素处理的斑点上将会发生菌落生长。参见例如共有的美国专利申请公开号No.2008/0220465。
在另一个过程中,生物样品收集后进行分类、标记,然后使用一个消毒环接种到含有血液琼脂培养基或任何其他合适的营养丰富的生长培养基(如LB培养基)的玻璃、圆底的试管中。然后,将样品插入专用培养箱中12至24小时。然后,观察样品并筛选阳性培养物(即含有细菌)和阴性培养物(即不含细菌)。处理似乎包含阳性培养物的样品,以便在生物化学液体中将细菌分离并悬浮。该过程包括悬浮、稀释、涡旋和浊度测量,从而导致生化废物产物。然后,将培养物进行物种鉴定和抗生素敏感性试验,该过程将细菌悬浮液暴露于多种试剂。在另外6到24小时的潜伏期后,实验室技术人员对这些发现进行了解释和报告。整个过程通常需要至少11个或更多个步骤和至少50小时才能获得样品结果,并且该过程劳动强度很大。
鉴别和鉴定细菌物种和/或菌株的其他方法包括各种类型的核酸测序方法。简单来说,DNA测序是确定DNA分子内核苷酸的精确顺序的过程。它包括用于确定DNA链中四种碱基-腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序的任何方法或技术。在这些方法中,一旦得到生物样品,生物样品中所含的细菌需要首先被扩增。换言之,首先收集生物样品,然后将其用于接种合适的细菌生长培养基(例如,血液生长培养基或LB培养基)。然后,接种的样品在合适的条件下生长12-24小时。生长后,将细菌细胞从培养基中沉淀,裂解并加工,以提取细菌DNA。然后,清洗、纯化细菌DNA,并置于DNA测序仪中。细菌的生长和细菌DNA的分离不仅需要试剂,而且还产生生物废料,另外,是一个费时的过程。另外,核酸测序方法需要使用引物序列。引物是一个短核酸序列(通常约10个碱基对)的链,其用作DNA合成起点。DNA复制是必需的,因为催化该过程的酶,DNA聚合酶,只能将新的核苷酸添加到现有的DNA链中。通过要求引物序列,该方法另外需要对细菌菌株类型的有一些最小限度的认识。正如所指出的,序列是另外耗时且昂贵的。
一般来说,在典型的微生物实验室中,鉴定、分离和鉴别具有和不具有抗生素抗性基因的细菌菌株的当前实践是一个费力且耗时的过程。
发明内容
基于上述原因,具有抗生素药物抗性的细菌菌株数量的增加已被证明是有问题的。
本申请提供了含抗生素药物抗性的细菌菌株的检测方法。此外,本发明涉及允许在含有不同抗生素抗性基因的细菌之间进行鉴别的方法。更具体地,描述了使用光学分析仪来识别和鉴别不同细菌菌株的方法。正如所指出的,可以使用其他合适的光学分析仪系统。系统是一种自动化快速平台,其采用固有荧光、光学数据分析和人工智能(例如通过使用化学计量技术)方法来分析微生物的多维光学特性。如下所述,获得的光学数据允许鉴别具有或不具有抗生素抗性基因的细菌菌株和另外含有不同抗生素抗性基因的细菌菌株。与本申请提供的方法有若干益处。这些方法消除了对试剂(即在生物样品的处理中通常需要的试剂)的需要,同时,消除了生物废料的产生,并且总体上该方法灵敏、快速、有效和准确。
一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别样品中携带一种或多种的抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,所述步骤包括:a)提供具有一种或多种细菌菌株的样品;b)用具有多个波长的光源激发具有一个或多个细菌菌株的样品;c)测量来自步骤b)的光发射数据,并获得样品的激发发射矩阵;和d)分析激发发射矩阵以确定一种或多种抗生素抗性基因存在或不存在。
另外,在一个非限制性的实施方案中,样品是浓缩的细菌样品。
在另一个非限制性的实施方案中,样品是生物样品。
在一个非限制性的实施例中,处理生物样品以产生浓缩的细菌样品。例如,通过离心产生浓缩的细菌样品。在另一个非限制性的实施方案中,进一步将该浓缩的细菌样品在盐溶液中再溶。
在另一个非限制性的实施方案中,通过过滤产生浓缩的细菌样品。进一步,从过滤器洗脱浓缩的细菌样品,从而产生洗脱的浓缩细菌样品。该浓缩的细菌样品可以通过使用气泡溶液从过滤器中洗脱。
本发明的一个非限制性实施例中可包括获得激发发射矩阵的步骤,所述步骤是通过激发具有多个不同波长的样品并收集和检测荧光发射。进一步,该荧光发射可以被引导到分光光度计中以产生激发发射矩阵。另外,使用化学计量技术分析激发发射矩阵。
本发明的光源可以是UV光源。进一步,光源可以具有波长或具有200nm至800nm范围内的波长,例如260nm、270nm、275nm、280nm和285nm。
进一步,发射的光是荧光。此外,发射的光可以具有以200nm至800nm的波长为中心的电磁辐射发射,例如230nm、260nm和280nm,还可以在300nm-420nm。
共同拥有的美国专利申请公开号2007/0037135和2012/0196271中详细讨论了合适的和示例性的激发参数和发射参数,两者都通过引用并入本申请中。
另外,本发明提供了一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别样品中携带一种或多种的抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,所述步骤包括:a)提供具有一种或多种细菌菌株的样品;b)用波长范围为200nm至800nm的光源激发具有一个或多个细菌菌株的样品;c)测量来自步骤b)的波长范围为200nm至800nm的光发射数据,并获得样品的激发发射矩阵;和d)分析激发发射矩阵以确定一种或多种抗生素抗性基因存在或不存在。
另外,本发明提供了一种用于处理样品的方法,所述样品含有一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,所述步骤包括:a)提供具有一种或多种细菌菌株的样品;b)用具有五种不同波长的UV光激发具有一个或多个细菌菌株的样品;c)测量来自步骤b)的光发射数据,并获得样品的激发发射矩阵;和d)分析激发发射矩阵以确定一种或多种抗生素抗性基因存在或不存在。另外,该方法提供了其激发发射矩阵是通过化学计量技术分析的,并且进一步,发射的光是荧光。
本申请另外提供了用于鉴定类型的相关方法,即鉴别生物样品中的细菌菌株并对细菌菌株进行定量。
本申请描述的光学分析仪系统是一种自动快速系统,其需要采用固有荧光、光学数据分析和人工智能方法来分析微生物的多维光学特性。该光学分析仪系统捕获从光子和生物分子之间的相互作用发出的光,以检测病原体的特有的光学特性。然后通过化学计量技术分析从该系统获得的光学数据,允许确定和了解病原体的类型以及病原体的额外特征。
附图说明
图1是本申请提供的方法的示例性说明。简单地说,浓缩样品在各种波长下被激发,收集发射光,分光光度计测量发射光,分析发射光以产生激发发射矩阵,然后通过化学计量技术,相对已知样品,利用激发发射矩阵学来分析未知样品。
详细说明
除非另有明确说明,否则在本申请中指定的各种范围内使用数值被表示为近似值,就好像所述范围内的最小值和最大值都在前面加上“约”。以这种方式,可以使用高于和低于所述范围的轻微变化来获得与所述范围内的值基本相同的结果。此外,除非另有说明,否则这些范围的公开内容旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。对于本申请提供的定义,这些定义是指这些单词或短语的单词形式、同义词和语法变体。
如本申请所使用的,术语“包括”,或“包含”及其变体意指开放式的。术语“一个”是指一个或多个。
如本申请所使用的,术语“患者”或“受试者”是指动物界的成员,包括但不限于人类,“哺乳动物”是指所有哺乳动物,包括但不限于人类。
如本申请所使用的,术语“样品”或“生物样品/样品”是指提交用于测试具有抗生素抗性基因的细菌菌株存在的任何材料。例如,“样品”或“生物样品/样品”包括但不限于血液、尿液和/或牙周/口腔液体。“样品”还可以指已经是半成品的样品,换句话说,细菌培养物,例如在合适的生长培养基中生长的细菌培养物(例如来自血液琼脂平板的细菌菌落分离物或LB培养基中的细菌菌落生长物)。
如本申请所使用的,术语:“细菌”和“微生物”是指相同的事物。也就是说,它们是指单细胞、原核生物、微生物,它们是小的,通常为棒状,并可能是疾病引起的。由细菌引起的疾病通常使用抗生素治疗。另外,“细菌菌株”或“细菌分离物”是指相同的事物。也就是说,菌株/分离株是细菌的遗传变体或亚型。换句话说,一种类型的细菌物种可能含有几种不同的菌株。菌株因遗传突变而不同,例如通过获得另外的基因,例如抗生素抗性基因等。这些术语将被本领域普通技术人员所理解。
通过将细菌平铺到琼脂平板(培养皿中包含的琼脂)的表面上,培养细菌即培养。这种琼脂是凝胶状的,包含细菌需要生长的所有食物和营养物质。随着细菌消耗营养,它们开始生长和繁殖。这产生数千到数百万到数十亿的开始堆积的细胞,并变得肉眼可见。这一堆细胞来自一个细胞,并且称为细菌菌落。细菌细胞的培养(生长)也可以通过接种营养丰富的生长培养基的液体而发生。该营养丰富的生长培养基包含细菌需要生长的所有食物和营养物质。如果检测到细菌的存在,已经接种未知样品的琼脂平板或液体生长培养基称为阳性培养物,如果未检测细菌,则被称为阴性培养物。
正如所指出的,细菌可以通过选择性压力获得抗生素抗性,例如通过用抗生素治疗。也就是说,由于这种抗性,用特定的抗生素治疗不会导致杀死细菌。这种抗生素耐药性可能是由于细菌获得了抗生素抗性基因导致的。抗生素抗性基因是一种使有效治疗或预防由细菌引起的感染的抗生素变得无效的基因。
抗性可能以多种方式发生。例如,抗性可以通过自发或诱导的遗传突变的形式产生,或者通过接合、转导或转化的水平基因转移从其他细菌物种获得抗性基因。抗性可以自发发生,这是由于随着时间的推移抵抗的积累,或者滥用抗生素或抗菌药物产生了随机突变。水平基因转移是指传统繁殖以外的两种或多种细菌之间的基因转移。转导是当病毒感染细菌时,一些细菌DNA被截留在病毒壳体中;该病毒感染另一种细菌,其导致先前细菌DNA转移。转化是指从其环境中获取DNA的细菌,可能是由于选择性(进化)压力。此外,许多抗生素抗性基因存在于便于其转移的传播质粒上,从而容易获得。这些机制,以及获得抗生素抗性的任何其他机制在本领域中是众所周知的。
本申请提供了一种用于处理生物样品的方法,用于:鉴定细菌微生物的类型并在生物样品中进行定量;识别;并鉴别含有或不含有抗生素抗性基因的细菌菌株;最后,在生物样品中鉴定和鉴别含有不同抗性基因的细菌。步骤包括:获取生物样品;在生物样品中浓缩细菌;或者在盐水溶液中重新溶解浓缩的细菌样品重或过滤生物样品以获得浓缩的细菌样品,并用合适的溶液(例如气泡溶液)从过滤器中洗脱细菌样品;将上一步骤的浓缩细菌转移到光学杯或比色杯中用于分析;对所述光学杯或比色杯进行光学分析,其中所述光学分析包括具有光学元件的光学分析仪,并且其中所述光学分析包括用多种不同波长激发所述流体样品,收集和检测所述荧光发射;将荧光发射导入分光光度计;并获得细菌样品的激发发射矩阵,并使用一种或多种化学计量技术分析样品的激发发射矩阵,以确定抗生素抗性基因的存在或不存在。
图1是本申请提供的方法的示例性说明。图1是如本申请所述的整个样品处理器的描述。更具体地,本发明的样品处理器允许以下方法:1)处理生物样品以产生浓缩细菌样品;2)具有通过各种波长激发细菌样品的能力的光学分析仪(经由光学分析仪的激发单元);3)允许发射被引导并反射回回收单元的机制;4)可以接收和测量所产生的发射的分光光度计;5)能够获得发射数据然后分析数据以产生激发发射矩阵(或矩阵)的分析系统;和6)使用化学计量技术得出关于未知样品的结论的分析系统。
本申请描述的方法利用细菌菌株的固有荧光特性不仅可鉴定和鉴别具有或不具有抗生素抗性基因的细菌物种,而且可鉴定和鉴别具有或不具有抗生素抗性基因的特定细菌物种。此外,本发明涉及允许鉴别具有不同抗生素抗性基因的细菌的方法。
本申请所述的方法可以通过P-1000系统提供的自动化平台容易、快速地执行。检测方法,即测量样品的固有荧光,可以另外任何其它合适的方式进行。更具体地,以下共同拥有的美国专利和专利申请出版物描述了本申请描述的系统:美国专利号8,309,897、8,519,358、8,804,114和8,808,649,另外,美国专利申请公开号2011/0093207、2012/0196271、2014/0246389和2015/0152467,其中每件专利各自通过引用并入本申请中。
本申请提供的方法简化了目前用于获取、处理和分析样品结果的方法。提供的方法是环保的,能够快速判断,结果一致,不需要试剂,并且可进行多功能判断。
首先,通过本领域所公知的标准方法收集生物样品,包括但不限于细菌培养物、细菌血琼脂平板或来自患者的生物样品。然后处理这些生物样品,以获得浓缩的细菌样品。用于获得浓缩细菌样品的合适系统在上述列出的共同拥有的美国专利和专利申请出版物中已经进行了讨论。
一般而言,生物样品可以通过离心来浓缩,例如在美国专利号8,804,114中所描述的,或通过使样品通过过滤系统运行进行浓缩,例如在美国专利申请公开号2014/0246389中所描述的。简单地说,可以将样品离心,获得细菌细胞沉淀。然后,可以在光学透明的溶液中再溶该沉淀,例如合适的盐溶液,如缓冲盐水溶液,例如但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
另外,可以使用过滤器或具有小孔径的膜捕获细菌细胞。然后,细菌细胞可以从过滤器或膜上洗脱下来。美国专利申请公开号2204/0246389中描述了这种装置。通常,过滤元件优选聚碳酸酯型过滤器,或任何合适的等效物,其为一个表面过滤器,并且可具有0.1至10微米宽的孔径。过滤器装置例如如下:顶部元件和底部元件以及其之间的过滤元件,该过滤器元件捕获过滤元件的上表面上的过大颗粒,并且使用洗脱液切向冲洗这些颗粒,提供相对低体积流体中的颗粒浓度,用于进一步分析。在中间步骤中,由过滤器捕获的颗粒可以用诸如水的冲洗流体冲洗,以使另外的过小颗粒通过过滤器,从而提供更纯的样品。此外,为了提高效率,过滤系统可以包括止回阀,其可以用于具有单向流动的通道。此外,也可以在过滤器系统中使用三通旋塞阀的构造。最后,过滤系统的夹层结构是可能有的,其中单个底部元件夹在两个相对的顶部元件之间。
正如现有技术中已知的那样,洗脱液可以优选为气泡溶液,并且可以含有发泡剂,例如但不限于吐温或任何其它合适的等同物。进一步,洗脱液可以是盐溶液,例如缓冲盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)。
这些浓度意味着需要最少使用试剂,更重要的是,如本申请所述的方法不会导致生产生物废物。
浓缩的细菌的合适悬浮液具有至少107CFU/ml或108CFU/ml细菌(0.5麦克法兰)的浓度。
然后,将准备好的浓缩细菌样品转移到光学杯或比色杯中,随后将其插入分析样品的光学分析仪中。在上述参考的美国专利和专利申请出版物中描述了合适的比色皿和/或光学杯。
在此,光学分析仪是指能够激发具有多个不同波长(经由激发模块单元)的流体样品的系统,捕获从通过流体样品的光子和分子之间的相互作用发射的光(经由光学收集单元),以产生激发发射矩阵,并使用化学计量分析技术处理和分析激发发射矩阵,以基于流体样品的光学特性确定具体特征(例如抗生素抗性基因的存在)。
如上述提及的美国专利和专利申请出版物(参见例如美国专利申请公开号2002/0196271)中所讨论的,一个合适的光学分析仪包括:光学系统;热控制器;以及具旋转台的抽屉,其用于接收、支撑和旋转包含多个一次性盒的盒匣,所述盒具有含有待分析样品的光学杯或比色杯。光学分析仪还包含用于盘点样品的条形码读取器和一个液位传感器,用于验证每个光学杯或比色杯中含有准确体积的经处理样品。当带盒匣的抽屉插入到光学分析仪中时,用于旋转台的驱动机构支撑盒匣转动,并相对于条形码阅读器记录盒匣的情况,然后相对于光学系统旋转并记录盒匣的情况。该光学系统包括:激发模块单元(激光单元)或不同波长的LED;光学收集单元(传感器单元);和分光光度计。每个杯子或比色皿的温度降低到使样品中的细菌代谢减慢的温度,同时增加荧光信号。热控制器冷却大量热质量,该散热物质位于带有样品杯或比色皿的包含一次性盒的盒匣下的可旋转台上。一个红外温度传感器检测并监测每个样品的温度。
更具体地,光学系统可以包含三个或更多个分离单元,即光学系统至少包括:激发单元;光学收集单元;和分光光度计。激发将由紫外(UV)光源(也称光或光源)提供,优选为LED(发光二极管)。优选地,一系列五个(或更多个)LED模块提供激发单元,并且将以五个(或更多个)不同的激发波长按顺序向每个样品杯或反应杯提供激发信号,其将以相同的顺序施加到每个样品杯或比色皿上。荧光发射反射回光学收集单元的向上方向。光学元件用于收集和引导荧光发射进入分光光度计以进行测量。分析分光光度计测量数据,并且产生激发发射矩阵。
基于固有荧光和化学计量分析,光学分析仪分析并产生完整的结果,为操作者提供有关细菌菌株存在的类型以及这些细菌是否含有抗生素抗性基因的信息。该系统不需要有经验的操作员并可获得快速的结果。该系统提高了效率,改善了工作量,节省了时间和金钱,并且易于操作。该样品制备可以与样品分析过程并行进行,可以对1~50个样品同时分析。
通过固有荧光意味着活细菌含有具有特定激发波长光谱和发射波长光谱的各种细胞内生物分子。荧光光谱已广泛用于化学和生物化学中分子结构和功能的研究中。然而,其在微生物鉴定和表征中它的有效性是最近的近二十年才得到认可。活细菌拥有与能量产生反应相关的许多细胞内生物分子。这些内源性分子在特定的激发波长和发射波长下的荧光特性使其成为生物检测和表征的非常有吸引力的探针。这些内源荧光基团包括蛋白色氨酸、其他氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)、核酸和辅酶。它们的激发最大值处于250-450nm(跨越UV/VIS光谱范围)的范围内,如260nm、270nm、275nm、280nm和285nm,而它们的发射最大值在280nm-540nm的范围内,优选300-420nm(跨越UV/VIS光谱范围)。
正如所指出的,本申请的方法涉及在宽范围的不同激发波长和发射波长下同时收集荧光数据。所得到的激发发射矩阵(EEM)在扫描的激发和发射波长的范围内提供样品的总强度分布。
根据本发明,可以生成各种数据集。该数据集是基于各种细菌菌株的激发发射矩阵产生的。具体地,针对各种“正常”细菌菌株产生数据集,即该细菌菌株是没有抗生素抗性基因的细菌菌株。另外,为具有一个或多个抗生素抗性基因的细菌菌株产生数据集。正如如下所述的,数据集对于化学计量分析技术是必需的。具体地,如上述数据集所述,化学计量分析技术将未知样品的激发发射矩阵与已知的激发发射矩阵进行比较,以确定未知样品是什么。
化学计量分析是多变量分析,包括使用数学方法和统计学方法来设计或选择最佳步骤和实验,并通过分析化学数据提供最多的化学信息。吸收数据或发射数据的分析确定了个体的性能指标,并用于计算其浓度和/或在水溶液中存在的浓度估计值。化学计量技术是本领域公知的,并且可以使用任何合适的化学计量分析。合适的技术包括但不限于以下:偏最小二乘法(PLS);偏最小二乘判别分析(PLS-DA);扩展偏最小二乘法分析(EPLS);正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA);和线性判别分析(LDA)。
PLS分析通过将预测变量和可观察变量投影到新空间以确定线性回归模型。PLS-DA是一个数据集分类时使用的变量。EPLS是另一种形式的PLS。
OPLS-DA是一个监督的多元回归分析方法,用于识别不同数据集之间的区别。在OPLS中,连续变量数据被分为预测的信息和不相关的信息。这导致改进的鉴别,以及更容易解释的可视化。当使用离散变量时可以应用OPLS-DA,如在分类和生物标志物研究中。
LDA是统计学中使用的一种方法,是模式识别和机器学习的一种方法,可以找到表征或分离两类或多类对象或事件的特征的线性组合。所得到的组合可以用作线性分类器,或者更常见地用于在之后分类前的维数压缩。
正如上所指,上述化学计量分析技术是本领域公知的,本申请仅包括作为示例性化学计量分析技术。因此,可以使用任何合适的化学计量分析技术。
本发明的样品处理器简化了用于处理生物样品以用于分析的当前实践方法。本发明的样品处理器是自动化的、完全紧凑的、独立的,并且不需要任何试剂。样品处理器不需要有经验的操作者,并可快速处理样品或样品。该样品处理器提高了效率,改善了工作量,节省了时间和金钱,并且易于操作。几个样品的处理可以在对于单个样品约20分钟内进行,对于约50个样品可以进行1小时的处理。样品制备后,分析时间只需10分钟。总之,本申请提供的方法是一种用于鉴定和表征细菌的快速且有效的方法。
在如下实施例中对本发明进行更详细的描述,但这些实施例的目的仅是用作说明。
实施例
实施例1
方法:含有抗生素抗性基因的菌株包括:具有blaoxA(n=2)的鲍氏不动杆菌(AB),具有blaNDM(n=3)的大肠杆菌(EC),具有blaNDM(n=5)的肺炎克雷伯杆菌(KP),具有blanpc的EC(n=1),具有blaKPC(n=5)的肺炎克雷伯杆菌,具有vanB(n=2)的粪肠球菌(EF)和具有mecA(n=4)的金黄色葡萄球菌(SA)。没有抗性基因的对照菌株包括:AB、EC、EF、KP和SA中的每一种。所有分离株均获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使用系统分析含有1088CFU/ml(0.5麦克法兰)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的细菌悬浮液,该系统可测量样品的激发发射矩阵(EEM)。具体来说,使用5个激发波长(260nm、270nm、275nm、280nm、285nm)。发射数据波长范围为300nm至420nm。使用化学计量技术(特别是PLS-DA方法)处理EEM,并且对每个分离物测试30次,生成预测。预测的准确度计算为正确预测的总数除以总测量次数。
结果:含有特异抗性基因的分离物的检测准确性是:AB、EC、EF、KP和SA分别为98%、96%、95%、97%、95%。在EC和KP中,鉴别含有blaKPC或blaNDM的细菌的准确度分别为99%和98%。
虽然已经根据上述具体实施例和详细描述描述了本发明的内容,但是本领域普通技术人员将理解,在本发明的精神范围内可以进行改变。因此,本发明能够以详细的实施方案进行许多变化,其可以使本领域普通技术人员从本申请所包含的描述中得出。
Claims (17)
1.一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别所述样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,其中所述方法包括通过如下步骤确定所述样品中一种或多种细菌菌株的固有荧光:
a)提供能够检测单个样本中的一种和多于一种细菌菌株的系统;
b)向a)的系统提供包含一种或多种细菌菌株的样品;
c)用光源激发包含一种或多种细菌菌株的所述样品,所述光源具有多个波长;
d)测量来自步骤c)的光发射数据并获得所述样品的激发发射矩阵;以及
e)使用化学计量分析技术将步骤d)的所述激发发射矩阵与针对没有一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵和针对携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵进行比较以确定一种或多种抗生素抗性基因的存在或不存在,
其中,包含在所述样品中的一种或多种细菌菌株是未结合的。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是浓缩的细菌样品。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是生物样品。
4.根据权利要求3所述的方法,其中处理所述生物样品以产生浓缩的细菌样品。
5.根据权利要求4所述的方法,其中通过离心产生所述浓缩的细菌样品。
6.根据权利要求5所述的方法,其中在盐溶液中重构所述浓缩的细菌样品。
7.根据权利要求4所述的方法,其中通过过滤产生所述浓缩的细菌样品。
8.根据权利要求7所述的方法,其中将所述浓缩的细菌样品从过滤器洗脱,从而产生洗脱的浓缩的细菌样品。
9.根据权利要求8所述的方法,其中通过使用气泡溶液洗脱所述浓缩的细菌样品。
10.根据权利要求1所述的方法,其中获得激发发射矩阵的步骤包括:激发具有多个不同波长的样品,并收集和检测荧光发射。
11.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括将所述光发射引导到分光光度计中以产生所述激发发射矩阵。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述光源具有200nm至800nm的波长范围。
13.根据权利要求1所述的方法,其中发射的光具有200nm至800nm的波长范围。
14.一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别所述样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,其中所述方法包括通过如下步骤确定所述样品中一种或多种细菌菌株的固有荧光:
a)提供能够检测单个样本中的一种和多于一种细菌菌株的系统;
b)向a)的系统提供包含一种或多种细菌菌株的所述样品;
c)用光源激发包含一种或多种细菌菌株的所述样品,所述光源的波长范围为200nm至800nm;
d)测量来自步骤c)的具有200nm至800nm波长范围的光发射数据并获得所述样品的激发发射矩阵;以及
e)使用化学计量分析技术将步骤d)的所述激发发射矩阵与针对没有一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵和针对携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵进行比较以确定一种或多种抗生素抗性基因的存在或不存在,
其中,包含在所述样品中的所述一种或多种细菌菌株是未结合的。
15.一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别所述样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和不含一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株,其中所述方法包括通过如下步骤确定所述样品中一种或多种细菌菌株的固有荧光:
a)提供能够检测单个样本中的一种和多于一种细菌菌株的系统;
b)向a)的系统提供包含一种或多种细菌菌株的样品;
c)用UV光激发包含一种或多种细菌菌株的样品,所述UV光具有五种不同波长;
d)测量来自步骤c)的光发射数据并获得所述样品的激发发射矩阵;以及
e)使用化学计量分析技术将步骤d)的所述激发发射矩阵与针对没有一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵和针对携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵进行比较以确定一种或多种抗生素抗性基因的存在或不存在,
其中,包含在所述样品中的所述一种或多种细菌菌株是未结合的。
16.一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别所述样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和含有一种或多种不同的抗生素抗性基因的细菌菌株,其中所述方法包括通过如下步骤确定所述样品中一种或多种细菌菌株的固有荧光:
a)提供能够检测单个样本中的一种和多于一种细菌菌株的系统;
b)向a)的系统提供包含一种或多种细菌菌株的样品;
c)用紫外光源激发包含一种或多种细菌菌株的所述样品,所述光源具有多个波长;
d)测量来自步骤c)的光发射数据并获得所述样品的激发发射矩阵;以及
e)使用化学计量分析技术将步骤d)的所述激发发射矩阵与针对没有一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵和针对携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵进行比较来鉴定一种或多种抗生素抗性基因,从而鉴别一种或多种细菌菌株,
其中,包含在所述样品中的所述一种或多种细菌菌株是未结合的。
17.一种用于处理样品的方法,所述样品包含一种或多种细菌菌株,用于鉴定和鉴别所述样品中携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株和含有一种或多种不同的抗生素抗性基因的细菌菌株,其中所述方法包括通过如下步骤确定所述样品中一种或多种细菌菌株的固有荧光:
a)提供能够检测单个样本中的一种和多于一种细菌菌株的系统;
b)向a)的系统提供包含一种或多种细菌菌株的样品;
c)用紫外光源激发包含一种或多种细菌菌株的所述样品,所述光源具有多个波长;
d)测量来自步骤c)的光发射数据并获得所述样品的激发发射矩阵;以及
e)使用化学计量分析技术将步骤d)的所述激发发射矩阵与针对没有一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵和针对携带一种或多种抗生素抗性基因的细菌菌株产生的激发发射矩阵进行比较以确定一种或多种抗生素抗性基因的存在或不存在,
其中,所述方法不包括将一种或多种细菌菌株相互分离的步骤。
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