CN206089692U - 基于培养和核酸定量检测的细菌药敏检测系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种基于培养和核酸定量检测的细菌药敏检测系统，属于医学检测领域。包括浊度测试模块、孵育模块、核酸定量测定模块、以及分析模块。所述的浊度测试模块能对细菌溶液浓度进行测试；所述的孵育模块，具有时间编程的变温功能，能提供细菌培养所需的温度以及热裂解方式灭活细菌提取细菌内核酸的温度；所述核酸定量测定模块能对经孵育模块处理后溶液中的细菌核酸浓度进行定量测试。本细菌药敏检测系统模块化设计、使用方便、所需培养时间短、与目前基于基因检测的细菌耐药性检测系统相比具有不需要复杂的核酸提取、能对一种细菌的所有药敏进行检测等优点。

Description

基于培养和核酸定量检测的细菌药敏检测系统

技术领域

本实用新型涉及一种基于培养和核酸定量检测的细菌药敏检测系统，属于医学检测领域。

背景技术

细菌耐药性检测(又称药敏试验)，对于指导临床精确用药和及时治疗感染患者具有重要意义。目前一般采用培养的方法进行细菌的药敏检测，主要是利用细菌在含有不同抗生素的固态或液态培养基下的生长是否受到抑制来进行。经典的手工药敏试验，如纸片扩散法和抗生素稀释法（MIC法）等，存在的主要问题是手工操作较繁琐，培养时间长，对于及时指导临床治疗不利。因此，目前的细菌耐药性检测发展趋势为发展操作简便、自动化、更快速的检测系统。相关的细菌药敏仪器检测系统，目前主要分为两大类。一类为根据细菌对生化物质的代谢等特点来进行细菌鉴定和药敏实验，如VITEK微生物自动分析系统等，在培养时间上较手工药敏有所减少，但是需要的时间还是比较长，也需要先从样本中进行细菌的分离培养后才能进行药敏测试。另一大类为基于基因的分子检测系统，主要是基于PCR仪器检测细菌基因组上耐药基因的存在或者一些与耐药性相关的基因突变。分子检测的主要优点是不需要细菌培养、检测速度快。但由于细菌的耐药基因发生重组和突变导致序列发生变化非常频繁，加之某些抗生素的分子耐药机制仍未完全阐明，这些问题导致基于基因的分子药敏检测系统的使用受到很大的局限，目前只能针对一些有明确的耐药基因或耐药突变热点的特定细菌进行药敏检测。因此，有必要发展新的细菌药敏检测仪器。

实用新型内容

本实用新型所要解决的技术问题是提供一种速度快同时适用面广的基于培养和核酸定量的细菌药敏检测系统。

所述的基于培养和核酸定量的细菌药敏检测系统，由彼此独立的浊度测试模块、孵育模块、核酸定量测定模块、以及分析模块组成；

所述的浊度测试模块对待测细菌溶液的浓度进行测试；

所述的孵育模块，具有时间编程的变温功能，用于培养细菌和通过热裂解方式灭活细菌，提取细菌内核酸；

所述的核酸定量测定模块对经孵育模块处理后的细菌核酸浓度进行定量测试；

所述的分析模块，具有对药敏结果进行分析和报告的功能。

优选的配置为:

所述的浊度测试模块可以采用测定溶液光吸收或者光散射的原理来对细菌的浓度进行检测。

所述的孵育模块可以采用带有时间编程控温功能的干式金属浴。

所述的核酸定量测定模块可以采用定量PCR仪、数字PCR仪或核酸荧光定量仪。

所述的分析模块采用计算机。

本实用新型还公开了使用所述的基于培养和核酸定量的细菌药敏检测系统的工作流程和检测原理:

1. 首先通过浊度模块测试和调整细菌浓度。一般需将从样本中分离得到的待测细菌（如培养板上的菌落，或者是体液样本中经过离心沉淀后收集的细菌）溶于药敏测试培养基中，混匀后根据浊度测试的结果，加入更多的菌或者是培养基溶液，配制成药敏测试所需的浓度。

2.将菌液等量移入已含有一定量但不同种类抗生素的多个培养管（含不加任何抗生素的对照管）中，混匀后放入孵育模块。

3.在孵育模块上分别设定细菌培养温度（如25 - 45 ℃）和时间（如 1-8h等），以及之后进行细菌热裂解的温度（如90-100℃）和时间（如5-20 min）等后进行培养和细菌灭活及核酸的提取；

4.孵育结束后，在这些管中分别加入核酸染料后放入核酸荧光定量仪进行直接测试，或者以这些管中的溶液为核酸模板通过定量PCR仪或数字PCR仪等进行溶液中核酸的定量。

5.获得以上细菌核酸定量结果后，采用所述的分析模块通过比较在不同抗生素作用下生长的细菌核酸量与不加任何抗生素对照管中细菌核酸量的差别，判断给出细菌药敏结果。其判断原理为：细菌在培养的生长过程中，其核酸也会随着细菌的数目增加而增多。对于某种抗生素耐药的细菌，由于在该抗生素的作用下，细菌生长不受影响，其经过培养后的细菌核酸量与不加任何抗生素的对照管中的细菌核酸量相当；相反，对于某种抗生素敏感的细菌由于在该抗生素的作用下，细菌生长受到抑制，其经过培养后的细菌核酸量将会少于不加任何抗生素的对照管中的细菌核酸量。因此，通过比较在不同抗生素作用下生长的细菌核酸量与不加任何抗生素对照管中细菌核酸量的差别，可以得出细菌药敏结果。同时，由以上描述也可知，如果核酸定量测试模块，能对更小差别的细菌核酸量进行区别检测，则所需的细菌培养时间越短，从而能加快药敏检测速度。

本发明的细菌药敏检测系统相比于现有技术的细菌药敏检测仪有以下的技术优点：

1.与目前基于基因检测的细菌耐药性检测仪相比不需要复杂的核酸提取、能够分析细菌对不同抗生素的耐药性，包括分子耐药机制目前不明的抗生素、适应性更广等优点。

2.与目前根据细菌对生化物质的代谢等特点的微生物药敏检测系统相比，具有与不同的核酸定量检测仪联用的可能性，所需的培养时间更短。目前有多种技术可以用于核酸的高灵敏和精确定量，如定量PCR和数字PCR技术等。特别是数字PCR技术，有可能对差别只有20-40%的核酸进行绝对定量，这就意味着有可能在细菌分裂生长的一代时间内（对于普通的大肠杆菌只需20min）区分出细菌是否在抗生素作用下是否生长，从而实现更快的药敏测试。

3.该检测系统操作简单，细菌在培养后经高温热裂解失活，对于操作人员和相关实验室的生物安全性更高。

4.该检测系统综合了培养与核酸定量检测的优点，在通过使用菌特异性PCR引物的数字PCR或者定量PCR对靶细菌核酸进行的定量时，能实现不需要菌分离步骤就可以对临床样本中的靶细菌进行药敏测试，大大缩短目前基于培养的细菌药敏检测法所需的时间。

附图说明

图1为本实用新型的细菌药敏检测系统的结构原理框图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型作进一步详细的描述。

如图1所示，本实用新型的细菌药敏检测系统主要由浊度测试模块、孵育模块、核酸定量测定模块、以及分析模块组成。

各个组成模块的功能和优选的配置为：

所述的浊度测试模块能对待测细菌在培养基溶液中的浓度进行测试。一般进行细菌药敏测试时，需要对细菌的浓度进行控制，由于细菌的浓度与菌液浊度有正比例的关系，可以采用浊度来对待测细菌的浓度进行控制。优选地，该模块可以使用目前比较成熟的商品化麦氏浊度计（如类似上海悦丰产的SGZ-2AXJ细菌浊度计）。

所述的孵育模块，具有时间编程的变温功能，能提供细菌培养所需的温度以及热裂解灭活细菌提取细菌内核酸的温度。一般细菌进行药敏测试培养时，需要在37℃的恒温下进行培养。为了释放细菌胞内的核酸用于后续的核酸定量检测，可以采用细菌在高温（如95℃ -100℃）下煮沸一段时间来进行。因此，所述的孵育模块，具有时间编程的变温功能，理想的变温范围可以为-20℃-100℃，能自动控制培养及热裂解过程中所需的温度和时间。优选地使用带有编程功能与半导体加热与制冷技术相结合的干式恒温器，譬如类似杭州瑞诚仪器有限公司生产的DC10型干式恒温器。

所述的能对核酸进行精确定量的核酸定量测定模块能对经孵育模块处理后溶液中的细菌核酸浓度进行定量测试。目前有各种核酸染料，能对溶液中的核酸进行定量检测。如SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关。优选地所述的能对核酸进行精确定量的测定模块可以采用常规的荧光检测仪或者其它光学检测仪，譬如类似Thermofisher的Qubit 3.0荧光计。与此同时，各种商业化的荧光定量PCR仪，如ABI 7500荧光定量PCR仪，和数字PCR仪，譬如BioRad QX200数字PCR仪，也可以作为核酸定量模块对细菌核酸进行精确的定量检测。

所述的分析模块能给出不同细菌药敏测试所需的各模块工作参数，以及对药敏结果进行分析和报告。优选地采用带有细菌药敏数据分析软件的计算机，所述的细菌药敏数据分析软件具有数据库和结果分析功能。所述数据库含有针对不同细菌的药敏测试所需的抗生素种类和折点浓度、细菌浊度、培养基组成、培养温度和时间、裂解温度和时间，以及核酸定量模式等信息，以指导用户更好地使用本实用新型的细菌药敏检测系统。具体抗生素种类的选择,使用的抗生素折点浓度以及培养基可以参考目前公认的药敏测试手册，如美国临床和实验室标准协会的CLSI手册。所述结果分析功能， 能根据获得的细菌在不同抗生素作用下生长的细菌核酸量与对照的细菌核酸量的比较，自动给出敏感（Sensitive）、耐药（Resistant）、中介（Intermediate）等结果，并能生成结果报告供打印或查阅。具体用于判断药敏结果的核酸量差别大小标准，可以根据不同种类细菌的耐药和敏感菌株预先测试后的结果，植入分析软件中作为判断标准。

本实用新型的细菌药敏检测系统的工作过程如下：

1.打开分析模块，查阅待测细菌的数据库以及仪器各模块需设定的参数等，准备好所需抗生素和培养基等试剂和材料。

2.取一定的从样本中分离或提取的待测细菌，如培养板上的菌落，或者是体液样本中经过离心沉淀后收集的细菌(在通过使用菌特异性PCR引物的定量PCR或数字PCR仪进行靶细菌核酸定量时)，放入装有一定量药敏测试液体培养基的透明瓶中，混匀后，放入所述的浊度模块测试进行测试。如果浊度低于所需的浊度，取更多的菌溶于培养基中；如浊度高于所需的浊度，则在瓶中加入更多的培养基。如此调整，配制完成药敏测试所需的浓度。

3.将菌液等量移入已含有一定量但不同种类抗生素的多个培养管（含不加任何抗生素的对照管）中，混匀后放入孵育模块。

4.在孵育模块上分别设定细菌培养温度（如 25 - 45 ℃）和时间（如 1-8h等），以及之后进行细菌热裂解的温度（如90-100 ℃）和时间（如5-20 min）等后进行培养和细菌灭活及核酸的提取。具体的培养温度时间以及热裂解温度和时间，可以根据不同种类的菌预先测试优化后选定。

5.孵育结束后，在这些管中分别加入核酸染料后放入核酸定量测定模块进行直接测试；或者取少量这些管中的溶液（如2-5微升）作为核酸模板，通过独立的定量PCR仪或数字PCR仪等进行溶液中核酸的定量。

6.获得以上细菌核酸定量结果后，采用所述的分析模块通过比较在不同抗生素作用下生长的细菌核酸量与不加任何抗生素对照管中细菌核酸量的差别，分析判断给出细菌药敏结果。其判断原理为：细菌在培养的生长过程中，其核酸也会随着细菌的数目增加而增多。对于某种抗生素耐药的细菌，由于在该抗生素的作用下，细菌生长不受影响，其经过培养后的细菌核酸量与不加任何抗生素的对照管中的细菌核酸量相当；相反，对于某种抗生素敏感的细菌由于在该抗生素的作用下，细菌生长受到抑制，其经过培养后的细菌核酸量将会少于不加任何抗生素的对照管中的细菌核酸量。因此，通过比较在不同抗生素作用下生长的细菌核酸量与不加任何抗生素对照管中细菌核酸量的差别大小，可以得出细菌药敏结果(耐药，敏感，或中介)。

以上所述，仅为本发明较佳的实施例，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于培养和核酸定量的细菌药敏检测系统，由彼此独立的浊度测试模块、孵育模块、核酸定量测定模块、以及分析模块组成；

所述的浊度测试模块对待测细菌溶液的浓度进行测试；

所述的孵育模块，具有时间编程的变温功能，用于培养细菌和通过热裂解方式灭活细菌，提取细菌内核酸；

所述的核酸定量测定模块对经孵育模块处理后的细菌核酸浓度进行定量测试；

所述的分析模块，具有对药敏结果进行分析和报告的功能。

2.根据权利要求1所述的细菌药敏检测系统，其特征在于，所述的浊度测试模块采用分光光度计或者麦氏浊度仪。

3.根据权利要求1所述的细菌药敏检测系统，其特征在于，所述的孵育模块采用带有时间编程控温功能的干式恒温器。

4.根据权利要求1所述的细菌药敏检测系统，其特征在于，所述的核酸定量测定模块采用荧光光谱仪、数字PCR仪或定量PCR仪。

5.根据权利要求1所述的细菌药敏检测系统，其特征在于，所述的分析模块采用计算机。