CN102272602A - 微生物的分离和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离、表征和/或鉴定测试样品中的微生物的方法。本发明的方法包括用于溶解可能存在于测试样品中的非微生物细胞的可选的溶胞步骤,接着是后续的分离步骤。该方法可以用于从复杂样品诸如含血液的培养基中分离、表征和/或鉴定微生物。本发明进一步提供了在单个系统内原位分离、表征和/或鉴定微生物的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求享有于2008年10月31日提交的标题为“Method and Systemfor Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample”的美国临时专利申请第61/110,187号的权益,将其结合于本文中。
技术领域
本发明涉及用于检测、离析和/或鉴定样品中的微生物的方法和系统。
背景技术
检测生物学流体中的病原微生物,应该在尽可能最短的时间内进行,尤其是在败血症的情况下,对于该病症尽管医生可利用的抗生素的范围广泛,但是其死亡率仍然保持较高。生物学活性剂(诸如微生物)在患者体液尤其是血液中的存在,一般采用血培养瓶进行检测。血流感染与高的发病率和死亡率有关,然而当前的诊断方法即培养之后进行生物化学鉴定和抗生素敏感性测试,可能要耗费几天时间来进行。通常,基于临床症状开始经验疗法,而只有当初始疗法失效时测试结果才会影响临床决策。在阳性血液培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内表征血液感染的能力,将会显著地加强所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出了分子扩增方法来填补这方面的需要,但是对于这种方法仍然存在严重的挑战。阳性血液培养液自身代表具有用于各种快速、鉴定(ID)试验的潜能的天然扩增的微生物种群。
为了提供稳健的结果,传统的自动表型ID测试(诸如Vitek、PhoenixTM和Microscan系统)或手动表型测试(诸如API)要求微生物处于适当的生长阶段并且无干涉培养基和血液产物。这些系统利用在平板培养基上从阳性培养液中生长18~24小时的菌落。然而,为了获得更快的结果,一些实验室已经报道了采用这些系统及从阳性血培养瓶中分离的微生物。这些直接获自培养瓶的试验并不是对于所有的微生物(例如,革兰氏阳性球菌)都是适当的,未经测试厂商验证,并且一般要花费3~8小时才能提供结果。迫切需要更快且更广泛的特异性试验,以便在阳性培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内为医师提供临床上相关的结果。
光学光谱学方法诸如内荧光(IF)、红外光谱法(FTIR)或拉曼光谱法,以及质谱方法诸如MALDI-TOF,都具有实现非常快速地鉴定微生物的潜能,但是可能会遇到在液体微生物培养基中和临床样品诸如血液或其组合中存在的许多高度荧光和吸收性化合物的干扰。直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两步差速离心和在血清分离器管中的离心。
已经描述了用于分离、表征和/或鉴定微生物的其它方法,包括:
美国专利第4,847,198号公开了一种利用UV激发拉曼光谱法鉴定微生物的方法。根据′198专利,通过紫外光谱范围内的单波长接触细菌悬浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被发射。发射的光能,共振增强拉曼散射,作为反向散射能量进行测定。对该能量进行处理以产生细菌的特征性光谱。
Vo-Dinh的美国专利第5,938,617号涉及一种系统,该系统通过用几个波长的光激发样品并同步采集发射强度来鉴定样品中生物病原体。系统包括用于将样品暴露于激发辐射并由此产生发射辐射的机制。生物病原体可能是病毒和细菌。
美国专利第6,177,266号公开了一种采用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株的特异性生物标记对细菌进行化学分类学分类的方法。
在美国专利第7,070,739号中,显示了一种通过二维超离心直接从体液或均质化组织中提取、分离和纯化微生物(包括病毒)的方法。在第一步离心步骤中,将沉降速度高于待鉴定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超离心步骤中,采用专用锯齿离心管,于填充的流体中应用等密度分带以形成宽范围的密度梯度。根据该专利,分离技术能够用于通过利用核酸特异性染料的光散射或荧光检测分带的粒子,以及用于以非常小的体积回收分带的粒子,从而通过质谱分析病毒蛋白亚单位和完整的病毒粒子以及通过荧光流量细胞计数测定核酸的质量和由限制酶产生的片段的质量进行表征。
美国专利申请出版物第2007/0037135号公开了一种用于鉴定和定量悬浮于液体中的生物样品的系统。该系统包括具有至少一个激发光源的荧光激发模块;样品界面模块,其可选地耦合到荧光激发模块用于定位生物样品以接受来自至少一个激发光源的激发光;荧光发射模块,其可选地耦合到样品界面模块并包含至少一个用于检测生物样品的荧光激发-发射矩阵的检测仪;和计算机模块,其经过操作耦合到荧光发射模块。计算机模块对生物样品的荧光激发-发射矩阵进行多变量分析以鉴定和定量生物样品。然而,′135申请并未讨论从复杂生物学样品诸如血液中鉴定和定量微生物。
美国专利申请出版物第2007/0175278号描述了采用液体培养基培养所关注的样品,包括例如血液、尿液、粪便、脉管导管等,工业生产线,水系统,食物产品,化妆品,药物制剂和法医样品。随后,通过本领域内已知的方法,例如通过离心可以从液体培养基中收集微生物。然后可以将浓缩的微生物转移到载体物质中,可选地在干燥之后,用于获取振动光谱。该专利申请讨论了用于鉴定和分类微生物的各种方法,包括振动光谱法,诸如拉曼光谱法。
然而,这些方法在试图从复杂样品(诸如含血液的培养基)中分离和表征微生物时具有一些缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血细胞、血小板、脂质微粒、血浆酶和细胞碎片,这些都可以导致结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的并且由于其步骤能够使潜在危险的病原体在空气中暴露于使用者从而是不安全的。仍需要从临床样品(例如,血液培养液)和其它无这些干扰物质并与快速鉴定技术相容的复杂样品中分离微生物的安全且可靠的方法。
发明内容
本发明提供用于分离、表征和/或鉴定样品中微生物的方法。方法实现了比现有技术更快速地表征和/或鉴定微生物,从而更快地诊断(例如,在患有或疑似患有败血症的受试者中)并鉴定受污染物质(例如,食品和药物)。在本发明的方法中所包括的步骤,从获得样品到表征和/或鉴定微生物,都可以在非常短的时间框架内实施以产生临床相关的可采取行动的信息,例如在不到约120分钟内。另外,可以使本发明的方法完全自动化,由此降低处理传染性物质和/或污染样品的风险。
本发明的一个方面涉及离析和/或鉴定微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的样品;
(b)可选地溶解所述样品中的细胞以产生溶胞样品;和
(c)使微生物与所述样品的其它组分分离以形成所述微生物的离析的样品。
在一个实施方式中,分离通过将样品铺层在容器中的密度缓冲垫层上方并将容器离心以粒化微生物,同时样品培养基仍保持在密度缓冲垫层的顶部来实施。在另一个实施方式中,容器在底部和/或侧面上具有光学窗口以便可以对微生物颗粒进行探询以产生鉴定该微生物的测定结果(例如,所以可以采用光谱法和/或质谱法对颗粒进行探询)。通过将颗粒的测定结果(例如,光谱)与取自已知微生物的类似测定结果(例如,一个或多个光谱)比较或通过微生物的基因组知识预测化合物的存在可以表征和/或鉴定微生物。这种无需进一步处理而直接在颗粒中鉴定微生物的能力,增强了微生物鉴定的安全性。
在一个实施方式中,光谱探询是基于微生物的固有特征(例如,内荧光)或组成分子的振动结构(例如,拉曼光谱法)。在另一个实施方式中,探询可以基于质谱法进行。在其它实施方式中,光谱探询是部分地基于从在本发明方法期间加入的且与特异性微生物或微生物组相互作用的其它试剂获得的信号。
在另一个实施方式中,该方法进一步包括回收微生物颗粒,再悬浮微生物并进行进一步的鉴定或表征测试(例如,耐药性、毒力因子、抗药型)的步骤。
在另一个方面中,本发明涉及离析、表征和/或鉴定微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的样品;
(b)可选地溶解所述样品中的细胞以产生溶胞样品;
(c)将样品铺层在容器中的密度缓冲垫层上方;
(d)将容器离心以使微生物与所述样品的其它组分分离并形成微生物颗粒;
(e)对颗粒进行探询以产生鉴定微生物的测定结果;和
(f)基于所产生的测定结果鉴定颗粒中的微生物。
在又一个方面中,本发明涉及离析微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的样品;
(b)将样品铺层在容器中的密度缓冲垫层的上方;
(c)将容器离心以使微生物与所述样品的其它组分分离并形成微生物颗粒。
在另外的一个方面中,本发明涉及从血液培养物中离析微生物的方法,包括:
(a)从已知包含或可能包含微生物的血液培养物中获得样品;
(b)可选地选择性地溶解所述样品中的血液细胞以产生溶胞样品;和
(c)通过离心使微生物与所述样品的其它组分分离以形成微生物颗粒;
可选地,可以对微生物颗粒进行探询(例如,采用光谱法和/或质谱法)以产生表征和/或鉴定微生物的测定结果。通过将颗粒的测定结果(例如,波谱)与取自已知微生物的类似测定结果(例如,波谱或光谱)比较可以表征和/或鉴定微生物。
在另一个方面,本发明涉及用于检测、表征和/或鉴定微生物的系统,包括:
(a)包含可能含有微生物的样品的容器;
(b)密度缓冲垫层;和
(c)提供测定结果的光谱仪;
其中所述测定结果检测、表征和/或鉴定所述微生物,所述微生物通过在所述系统内原位分离而浓缩在所述容器中。在一个实施方式中,系统可选地包含溶胞溶液。在另一个实施方式中,分离包括将容器离心。
在本文的附图中和下面阐述的描述中对本发明进行更详细的解释。
附图说明
图1显示了在对肺炎链球菌(S.pneumoniae)培养物和阴性培养液实施本发明的溶胞、分离步骤之后的分离容器的照片。
图2A~2C显示了在探询之前的溶胞步骤中采用溶胞缓冲液A、B和C的示例性激发/发射光谱。
图3显示了采用5种不同的溶胞缓冲液和两种不同密度缓冲垫层实施本发明的溶胞和分离步骤之后的分离容器的照片。
图4是显示溶胞的含微生物的血液培养液离心后的分离装置的照片。在照片中清楚可见的是溶胞血液培养物、密度缓冲垫层和微生物颗粒。
图5~8显示了密闭分离容器中读取的各种微生物的激发/发射光谱的实例。
图9是显示从10种缓症链球菌(S.mitis)(圆圈)和10种肺炎链球菌(三角形)培养物获得的颗粒的平均内荧光信号的图形。
图10是显示从10种缓症链球菌(圆圈)和10种肺炎链球菌(三角形)培养物获得的颗粒的平均粒径的的图形。
图11显示了从血液培养物中加工和回收的各种微生物的质谱图。
图12显示了从血液培养液中加工和回收的5种金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离物的质谱图。
图13显示了直接来自琼脂平板的大肠杆菌(E.coli)和根据本发明从血液培养液加工的大肠杆菌的质谱图的对比。
图14显示了来自血液培养物的各种微生物的拉曼光谱。
图15显示了直接从血液培养液中回收的13种金黄色葡萄球菌分离物的拉曼光谱。
具体实施方式
本发明可以以不同的形式体现,并且不应该解释为仅限于本文中所阐述的实施方式。相反,提供这些实施方式以便使本公开是全面和完整的,并将向本领域的技术人员充分表达本发明的范围。例如,可以将有关一个实施方式举例说明的特征结合至其它实施方式中,以及可以将有关具体实施方式举例说明的特征从该实施方式中删除。另外,依据本公开,在本文中提出的对实施方式的各种变通和添加对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的,所述的各种变通和添加没有偏离本发明。
除非另外规定,本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文中在本发明的说明书中所用的术语仅仅是为了达到描述具体实施方式的目的而不是用来限制本发明。
定义
如本文中所用的“一个(一种)”(“a”,“an”)或“该(the)”可以意指一个(一种)或多于一个(一种)。例如,“一个”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。
而且,如本文中所用的“和/或”是指并包含一个或多个相关所列项的任何和所有的可能的组合,以及在另一种情况(“或”)下解释为不组合。
另外,如本文中所用的术语“约”,当是指可测量的值诸如本发明的化合物或物质的量、剂量、时间、温度等时,意味着包含指定量的±20%、+10%、±5%、±1%、±0.5%,或甚至±0.1%的变化。
如本文中所用的术语“微生物”意图包括通常是单细胞的生物体,其能够在实验室中进行繁殖和处理,包括但不限于革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌、寄生虫和柔膜细菌。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性的实例包括以下属的细菌:假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希式杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、青枯菌属(Ralstonia)、无色杆菌属(Achromobacter)、梭菌属(Fusobacterium)、普氏菌属(Prevotella)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗维登斯菌属(Providencia)、和军团菌属(Legionella)。本发明的革兰氏阳性细菌的非限制性的实例包括以下属的细菌:肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、梭菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、加德纳菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)和棒状杆菌属(Corynebacteria)。本发明的酵母菌和霉菌的非限制性的实例包括以下属的那些:念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、青霉菌属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、酵母属(Saccharomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)。本发明的寄生虫的非限制性的实例包括以下属的那些:锥体虫属(Trypanosoma)、巴贝西虫属(Babesia)、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Plasmodium)、Wucheria、布鲁格氏丝虫属(Brugia)、盘尾丝虫属(Onchocerca)和纳氏虫属(Naegleria)。本发明的柔膜细菌的非限制性的实例包括以下属的那些:支原体属(Mycoplasma)和脲原体属(Ureaplasma)。
在如本文中更详细地描述的一个实施方式中,可以对来自样品或生长培养基的微生物进行分离和探询以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“分离(separate)”意图包括已经从其原始状态或从生长培养基或培养基中除去、浓缩或另外分开的任何的微生物样品。例如,根据本发明,可以使微生物与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分分离开(例如,作为分离的样品(separated sample))。该术语可以包括夹在两个其它层之间的微生物层(例如,离心后在高密度缓冲垫层顶部收集的微生物),或在固体表面(例如,过滤膜)上收集的微生物层。该术语也可以包括已经部分地通过层(例如,密度缓冲垫层)的微生物的收集。同样,分离的微生物样品可以包括微生物和/或其组分的任何收集或层,这比原始样品更浓,或另外从原始样品中分离出来,并且其可以是从微生物的紧密堆积的稠密块到微生物的扩散层。在分离形式或样品中可以包含的微生物组分包括但不限于以任何组合形式存在的菌毛、鞭毛、伞毛和荚膜。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。
在如本文中更详细地描述的又一个实施方式中,可以对来自样品或生长培养基的微生物进行分离和探询以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“离析的”意图包括已经从其原始状态或从其生长培养基或培养基中至少部分地纯化的任何微生物样品,以及其中所含的任何非微生物或非微生物组分。例如,根据本发明,微生物可以与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分离析分开(例如,作为离析的样品(isolated sample))。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。
在如本文中更详细地描述的又一个实施方案中,可以对来自样品或生长培养基的微生物进行粒化和探询以表征和鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“颗粒”意图包括已经被压缩或沉积成微生物团块的任何微生物样品。例如,通过离心或本领域内的其它已知方法可以将样品中的微生物在试管底部压缩或沉积成团块。该术语包括离心后在容器的底部和/或侧面上的微生物(和/或其组分)的收集。在颗粒中可以包含的微生物组分包括但不限于以任何组合形式存在的菌毛、鞭毛、伞毛和荚膜。根据本发明,微生物可以与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分粒化分开(例如作为基本上纯化的微生物颗粒)。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞(例如,血液细胞和/或其它组织细胞)和/或其任何组分。
如本文中所用的术语“密度缓冲垫层”是指整个具有均匀密度的溶液。
本发明提供了用于分离、表征和/或鉴定样品中微生物的方法。而且,该方法可以特别用于从复杂样品诸如含血液的培养基中分离、表征和/或鉴定微生物。快速方法也实现了比现有技术更快地表征和/或鉴定微生物,从而更快速地诊断(例如,在患有或疑似患有败血症的受试者中)并表征/鉴定受污染物质(例如,食品和药物)。本发明的方法中所包含的步骤,从获得样品到表征和/或鉴定微生物,都可以在非常短的时间框架内实施以得到临床上相关的可采取行动的信息。在某些实施方式中,本发明的方法可以在不到约120分钟内,例如在不到约110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2或1分钟内进行实施。本发明的方法的极度快速性代表优于现有方法的改进。可以使用本发明方法来表征和/或鉴定本文中所述的任何微生物。在一个实施方式中,微生物是细菌。在另一个实施方式中,微生物是酵母菌。在另一个实施方式中,微生物是霉菌。在另外的实施方式中,微生物是寄生虫。在另一个实施方式中,微生物是柔膜细菌。另外,可以使本发明的方法完全自动化,从而降低了处理传染性物质和/或污染样品的风险。
本发明的一个方面涉及离析微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品;
(b)可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品;和
(c)使微生物与所述测试样品的其它组分分离以形成所述微生物的离析的样品。
在另一个方面中,本发明涉及离析、表征和/或鉴定微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品;
(b)可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品;
(c)将溶胞样品铺层在容器中的密度缓冲垫层的上方;
(d)将容器离心以使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离并形成微生物颗粒;
(e)对颗粒进行探询以产生鉴定微生物的测定结果;和
(f)基于所产生的测定结果来鉴定颗粒中的微生物。
在又一个方面中,本发明涉及离析微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品;
(b)将测试样品铺层在容器中的密度缓冲垫层的上方;
(c)将容器离心以使微生物与所述测试样品的其它组分分离并形成微生物颗粒。
在另外的一个方面中,本发明涉及从血液培养物中离析微生物的方法,包括:
(a)从已知包含或可能包含微生物的血液培养物中获得样品;
(b)可选地选择性地溶解所述样品中的血液细胞以产生溶胞样品;和
(c)通过离心使微生物与所述样品的其它组分分离以形成微生物颗粒;
在不同的方面,本发明涉及检测样品中微生物存在的方法,包括:
(a)获得测试样品;
(b)可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品;和
(c)使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离以形成微生物颗粒;
其中颗粒的存在表明在测试样品中存在微生物。在一个实施方式中,采用裸眼检测颗粒。在其它实施方式中,颗粒通过探询,例如在光谱学上进行检测。
在又一个方面中,本发明涉及用于检测、表征和/或鉴定微生物的系统,包括:
(a)包含可能包含微生物的测试样品的容器;
(b)密度缓冲垫层;和
(c)用于提供测定结果的光谱仪;
其中所述测定结果检测,表征和/或鉴定所述微生物,所述微生物通过所述系统内的原位分离浓缩在所述容器中。在一个实施方式中,系统可选地包含溶胞溶液。在另一个实施方式中,分离包括将容器离心。
在本发明的另一个实施方式中,方法包括在探询微生物之前从分离容器中回收分离步骤期间形成的微生物颗粒或其的一部分。例如,在形成颗粒之后,可以将流体从颗粒中吸出并将颗粒再悬浮于合适的培养基(例如,其中微生物能存活的培养基)中。可以将再悬浮的微生物从分离容器中移出。然后,可以例如在悬浮液中或在已将它们再粒化之后对微生物探询从而进行表征和/或鉴定。在其它实施方式中,可以在分离容器中对再悬浮的微生物进行探询,例如在悬浮液中或已将它们再粒化之后。在另外的实施方式中,从颗粒中回收的微生物可以直接用于进一步的探询(例如,拉曼光谱法,质谱法)而无需再悬浮。
样品
可以通过本发明的方法进行测试的样品(即,测试样品)包括其中微生物存在和/或生长或可能疑似存在和/或生长的临床和非临床样品,以及对微生物的存在进行常规或不定期检测的物质的样品。所利用的样品的量由于方法的通用性和/或灵敏度可能大大不同。样品制备可以通过本领域内技术人员已知的任何技术来实施,尽管本发明的一个优点在于可以利用系统对复杂的样品类型(诸如例如血液、体液、和/或其它不透明的物质)直接进行测试,而仅需极少的或无需大量的预处理。在一个实施方式中,样品取自培养物。在另一个实施方式中,样品取自微生物培养物(例如,血液培养物)。在另一个实施方式中,在样品中疑似或已知包含微生物。
可以检测的临床样品包括通常在临床或研究实验室中测试的任何类型的样品,包括但不限于血液、血清、血浆、血液部分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽取液、骨匀浆、痰、抽吸物、拭子和拭子渣液(rinsates)、其它体液等。在另一个实施方式中,可以对临床样品进行培养并使用培养样品。
本发明发现了在研究以及兽用和医药应用中的用途。可以获取临床样品的合适受试者一般是哺乳动物受试者,但是可以是任何动物。如本文中所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔子、啮齿类动物(例如,大鼠或小鼠)等。人类受试者包括新生儿、婴幼儿、青少年、成年人和老年受试者。可以获取样品的受试者包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。
可以进行测试的非临床样品包括物质,所述物质包含但不限于食品、饮料、药物、化妆品、水(例如,饮用水、非饮用水、和废水)、海水压载物、空气、土壤、污水、植物材料(种子、叶子、茎、根、花、果实)、血液制品(例如血小板、血清、血浆、白血细胞部分等)、捐赠器官或组织样品、生物战样品等等。方法也尤其十分适合实时测试以监控工业环境中的污染水平、过程控制、质量控制等。在另一个实施方式中,可以对非临床样品进行培养,并使用培养样品。
在本发明的一个实施方式中,样品获自患有或疑似患有微生物感染的受试者(例如,患者)。在一个实施方式中,受试者患有或疑似患有败血症,例如,菌血症或真菌血症。样品可以是直接获自受试者的血液样品。样品可以来自由患者的血液样品生长的血液培养物,例如BacT/ALERT血液培养物。血液培养样品可以来自阳性血液培养物,例如,表明微生物存在的血液培养物。在某些实施方式中,样品在其转为阳性之后短时间内,例如约6h之内,例如约5、4、3、或2h内,或在约60min,例如约55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1min内取自阳性血液培养物。在一个实施方式中,样品取自其中微生物处于对数生长期的培养物。在另一个实施方式中,样品取自其中微生物处于静止期的培养物。
本发明提供了用于检测、表征和/或鉴定微生物的高灵敏度。这能够使检测、表征和/或鉴定无需首先必须经过下列步骤:通过使它们在固体或半固体培养基上生长来分离微生物,以及对生长的菌落采样。因此,在本发明一个实施方式中,样品不是来自在固体或半固体表面上生长的微生物(例如,细菌、酵母菌或霉菌)菌落。因此在本发明一个实施方式中,样品不是来自在固体或半固体表面上生长的微生物(例如,细菌、酵母菌或霉菌)菌落。
样品的体积应该足够大以产生实施本发明方法的分离/离析步骤后可以进行探询的微生物的分离样品或微生物颗粒。适当的体积将取决于样品的来源和样品中微生物的预期水平。例如,阳性血液培养物将含有比待检测污染的饮用水样品更高的每体积微生物水平,因此可能需要相对于饮用水样品体积更小的血液培养基。一般而言,样品大小可以是低于约50ml,例如,低于约40、30、20、15、10、5、4、3、或2ml。在某些实施方式中,样品大小可以是约1ml,例如约0.75、0.5或0.25ml。在某些实施方式中,其中分离以微量规模进行,则样品大小可以是低于约200μl,例如,低于约150、100、50、25、20、15、10或5μl。在一些实施方式中(例如,当期望样品含有少量微生物时),样品大小可以是约100ml或更大,例如,约250、500、750或1000ml或更大。
可选的溶解步骤
在一些实施方式中,获得样品之后,本发明的方法中的下一个步骤是选择性地溶解样品中可能存在的不想要的细胞,例如血液细胞和/或组织细胞。细胞可以溶解以允许微生物与样品的其它组分分离。微生物与其它组分的分离防止在探询步骤期间产生干扰。如果期望非微生物细胞在样品中不存在或期望其不会干扰探询步骤,则可以不需要实施溶胞步骤。在一个实施方式中,待溶解的细胞是样品中存在的非微生物细胞且可能存在于样品中的微生物细胞不发生溶解。然而,在一些实施方式中,特定种类的微生物的选择性溶胞可能是所期望的并因此可以根据本文中描述的以及本领域内众所周知的方法进行实施。例如,可以选择性地溶解不想要的微生物种类,例如溶解酵母菌,而不溶解细菌或反之亦然。在另一个实施方式中,溶解所需的微生物以便分离微生物的特定亚细胞组分,例如,细胞膜或细胞器。在一个实施方式中,溶解所有的非微生物细胞。在其它实施方式中,溶解一部分的非微生物细胞,例如,溶解防止干扰探询步骤的足够多的细胞。细胞的溶解可以通过本领域内已知的有效地选择性溶解细胞而溶解或不溶解微生物的任何方法进行实施,包括但不限于加入溶胞溶液、超声处理、渗透压冲击、化学处理和/或其组合。
溶胞溶液是一种能够溶解细胞例如非微生物细胞(例如,通过溶解真核细胞膜)和/或微生物细胞的溶液。在一个实施方式中,溶胞溶液可以包含一种或多种清洁剂(detergent)、一种或多种酶、或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合,并且可以进一步包含其它物质。在一个实施方式中,清洁剂可以是非变性溶胞清洁剂,诸如TritonX-100、TritonX-100-R、TritonX-114、NP-40、GenapolC-100、GenapolX-100、IgepalCA 630、ArlasolveTM200、Brij96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷和单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇(polidocenol))。可选地,可以包含变性溶胞清洁剂,诸如十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐类、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14(amidosulfobetaine-14)和C7BzO。可选地,还可以包含增溶剂,诸如Brij98、Brij58、Brij35、Tween80、Tween20、PluronicL64、PluronicP84、非清洁剂磺基甜菜碱(NDSB201)、两亲高分子(amphipols)(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。通常,非-变性清洁剂和增溶剂以超过其临界胶束浓度(CMC)的浓度使用,而变性清洁剂可以以低于其CMC的浓度加入。例如,非-变性溶胞清洁剂可以在约0.010%至约10%,例如约0.015%至约1.0%,例如约0.05%至约0.5%,例如约0.10%至约0.30%(用样品稀释后的最终浓度)的浓度使用。在另一个实施方式中,可以优选使用聚氧乙烯清洁剂。聚氧乙烯清洁剂可以包含C12-18/E9-10结构,其中C12-18表示12~18个碳原子的碳链长度和E9-10表示9~10个氧乙烯亲水性头基团。例如,聚氧乙烯清洁剂可以选自Brij97、Brij96V、GenapolC-100、GenapolX-100、单十二烷基九乙二醇醚(聚多卡醇),或其组合组成的组。
可以用在溶胞溶液中的酶包括但不限于,消化核酸和其它膜污染物质的酶(例如,蛋白酶XXIII、脱氧核糖核酸酶、神经氨糖酸苷酶、多糖酶、Glucanex和Pectinex)。可以使用的其它添加剂包括但不限于还原剂诸如2-巯基乙醇(2-Me)或二硫苏糖醇(DTT)和稳定剂诸如镁、丙酮酸盐和保湿剂。溶胞溶液可以在适合溶解所需细胞的任何pH下进行缓冲,而这将取决于多种因素,包括但不限于,样品的类型、待溶解的细胞和所用的清洁剂。在一些实施方式中,pH可以处于约2至约13,例如约6至约13,例如约8至约13,例如约10至约13的范围中。合适的pH缓冲剂包括能够保持pH处于所需范围中的任何缓冲剂,例如,约0.05M至约1.0M的CAPS。
在一个实施方式中,将样品和溶胞溶液混合然后孵育足以发生细胞膜的溶胞和溶解的一段时间,例如,约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或60秒,或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20分钟或更长的时间,例如,约1秒至约20分钟,约1秒至约5分钟,或约1秒至约2分钟。孵育时间将取决于溶胞溶液的强度,例如清洁剂和/或酶的浓度。一般而言,越弱溶胞缓冲剂越需要更长的时间和更大的样品稀释度来完全溶解非微生物细胞。溶胞溶液的强度可以基于样品中已知存在或疑似存在的微生物进行选择。对于更易于溶胞的微生物,可以使用弱的溶胞溶液。溶胞可以在约2℃至约45℃,例如约15℃至约40℃,例如约30℃至约40℃的温度下发生。在一个实施方式中,可以将溶胞溶液载入到注射器中,然后可以将样品吸入到注射器中从而使混合和孵育在注射器内发生。在一个实施方式中,可以将溶胞溶液载入到注射器中,然后将样品吸入到注射器中从而使混合和孵育在注射器内发生。
在一些实施方式中,溶胞条件(例如,溶液或孵育时间),以及分离和/或探询步骤,能够足以杀死样品中一些或所有的微生物。本发明的方法是高度通用的并且不要求所有微生物对于要发生的分离和鉴定都是活着的。在某些实施方式中,一些或所有的微生物可以是死亡的,死亡可以发生在本发明方法的步骤实施之前、期间和/或之后。
分离步骤
本发明的方法中的下一步骤(例如,如果进行溶胞步骤,则是在样品已经被溶胞之后的步骤)是分离步骤。可以实施分离步骤以使微生物与样品的其它组分(例如,非微生物或其组分)分离,并将微生物浓缩成为实现鉴定和表征目的可以进行探询的颗粒。分离不必是完全的,即,不要求达到100%的分离。需要的是微生物与样品的其它组分的分离足以允许对微生物进行探询且基本上不会受到其它组分干扰。例如,分离能够产生至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%纯度的或更高纯度的微生物颗粒。
在一个实施方式中,分离通过离心步骤实施,其中将样品(例如,溶胞样品)置于分离容器中的密度缓冲垫层的顶部并且将容器在允许微生物被分离的条件下离心(例如,微生物可以在容器的底部和/或侧面上形成颗粒)。根据该实施方式,样品的其它组分(例如,在样品培养基中可能存在的非微生物或其组分)保留在密度缓冲垫层的顶部或在密度缓冲垫层的顶层部分内。一般而言,任何已知的容器都可以用于分离步骤。在一个实施方式中,分离容器是在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms”的序列号为____中的有关美国专利申请中公开的分离装置,将该专利申请结合于本文中作为参考。该分离步骤从样品中的物质,诸如培养基、细胞碎片、和/或其它可能干扰微生物的探询(例如,通过内荧光)的组分中分离出微生物。在一个实施方式中,密度缓冲垫层还用于分离活的微生物和死亡微生物(其不通过密度缓冲垫层)。在另一个实施方式中,密度缓冲垫层不含有密度梯度,无论是在离心之前还是在离心之后。换句话说,对分离容器离心的时间和/或加速度的量不足以使组成密度缓冲垫层的物质形成密度梯度。
选择缓冲垫层的密度以便使样品中的微生物通过缓冲垫层而样品的其它组分(例如,血液培养液、细胞碎片)仍保留在垫层的顶部或没有完全通过密度缓冲垫层。也可以选择密度缓冲垫层用来分离活的微生物(其通过缓冲垫层)和死亡微生物(其不通过缓冲垫层)。合适的密度将取决于密度缓冲垫层中所用的物质以及待分离的样品。在一个实施方式中,缓冲垫层的密度在约1.025至约1.120g/ml,例如约1.030至约1.070g/ml,约1.040至约1.060g/mL的范围中或在约1.025至约1.120g/ml之间的任何范围中。在另一个实施方式中,缓冲垫层的密度为约1.025、1.030、1.035、1.040、1.045、1.050、1.055、1.060、1.065、1.070、1.075、1.080、1.085、1.090、1.095、1.100、1.105、1.110、1.115或1.120g/ml。
用于密度缓冲垫层的物质可以是具有用于本发明方法的适当的密度范围的任何物质。在一个实施方式中,物质是胶体二氧化硅。胶体二氧化硅可以是未涂覆的(例如,Ludox(W.R.Grace,CT))或者是例如用硅烷(例如,PureSperm(Nidacon Int′l,瑞典)或Isolate(Irvine Scientific,Santa Ana,CA))或聚乙烯吡咯烷酮(例如,PercollTM,PercollTM Plus(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))涂覆的。在一个实施方式中,选择了对光谱探询产生最小干扰作用的胶体二氧化硅,例如,具有最低内荧光的物质。胶体二氧化硅可以在任何合适的介质中稀释以形成合适的密度,例如,平衡盐溶液、生理盐水和/或0.25M的蔗糖。合适的密度可以采用浓度为约15%至约80%v/v,例如约20%至约65%v/v的胶体二氧化硅获得。密度缓冲垫层的另一种合适的物质是碘化造影剂,例如碘海醇(OmnipaqueTM NycoPrepTM,或Nycodenz)和碘克沙醇(VisipaqueTM或OptiPrepTM)。对于血液培养样品,合适的密度可以采用浓度为约10%至约25%w/v,例如约14%至约18%w/v的碘海醇或碘克沙醇获得。对于血液培养样品,蔗糖可以以约10%至约30%w/v例如约15%至约20%w/v的浓度用作密度缓冲垫层。可以用于制备密度缓冲垫层的其它合适的物质包括低粘度高密度的油,诸如显微镜浸镜油(例如,Type DF;Cargille Labs,New York);矿物油(例如,Drakeol5,Draketex 50,Peneteck;Penreco Co.,Pennsylvania);硅油(聚二甲基硅氧烷);氟硅油;硅凝胶;甲泛影酸盐-Ficoll(LymphoPrepTM),例如,对于血液培养样品在约75%至约100%浓度下;泛影酸盐-葡聚糖(PolymorphoPrep),例如,对于血液培养样品在约25%至约50%浓度下;羧甲基纤维素;羟丙基甲基纤维素;聚环氧乙烷(高分子量);PluronicF 127;PluronicF68;Pluronic化合物的混合物;聚丙烯酸;交联的聚乙烯醇;交联的聚乙烯吡咯烷;PEG甲醚甲基丙烯酸酯;果胶;琼脂糖;黄原胶;胶凝糖;Phytagel;山梨醇;Ficoll(例如,对于血液培养样品浓度为约10%至约15%的Ficoll400);甘油;葡聚糖(例如,对于血液培养样品在约10%至约15%的浓度下);糖原;氯化铯(例如,对于血液培养样品在约15%至约25%的浓度下);全氟碳流体(例如,全氟正辛烷);氢氟碳流体(例如,Vertrel XF);和本领域内众所周知的类似物质等等。在一个实施方式中,密度缓冲垫层选自以任意组合形式存在的一种或多种胶体二氧化硅、碘克沙醇、碘海醇、氯化铯、甲泛影酸盐-Ficoll、泛影酸盐-葡聚糖、蔗糖、Ficoll400、和/或葡聚糖。密度缓冲垫层也可以由物质的组合构成,例如胶体二氧化硅和油的组合。上述化合物的某些组合对于本发明的分离和读数步骤是有益的。例如,具有不同UV-淬灭性质的化合物的组合,如氯化铯和碘海醇。
密度缓冲垫层的体积/高度应该足以实现微生物与其它样品组分的分离。体积将取决于分离容器的大小和形状。一般而言,可以使用约0.1至约5ml的体积,例如约0.2至约1ml,例如约0.2ml至约0.5ml。如果以微量规模进行分离,则密度缓冲垫层的体积可以是约1μl至约100μl,例如约5μl至约50μl。在密度缓冲垫层的顶部放置或铺层的样品的体积应该足以提供可产生适合探询的颗粒的足够的微生物。一般而言,可以使用适合装入到容器中的任何体积。例如,可以使用约0.1ml至约5ml的体积,例如约0.2ml至约1ml,例如约0.2ml至约0.5ml。如果以微量规模进行分离,则样品的体积可以是约1μl至约100μl,例如约5μl至约50μl。对于样品在容器中的可利用空间将取决于容器的尺寸和形状。在一些实施方式中,在将样品放置或铺层在顶部之前可以将中间层(液体或固体)放置在密度缓冲垫层的顶部以防止密度缓冲垫层和样品之间的任何混合。在一个实施方式中,中间层可以是聚乙烯珠。在另一个实施方式中,可以在密度缓冲垫层和样品之间放置小气泡以防止混合。在另外的实施方式中,可以将密度缓冲垫层铺层在高密度物质(例如,全氟碳流体)的顶部从而使微生物在分离期间通过密度缓冲垫层并在密度缓冲垫层和高密度物质之间的界面处收集。
在本发明的一个实施方式中,分离容器在甩平式转头中进行离心从而使微生物直接在容器底部上形成颗粒。在足够的加速度下将容器离心足够长的时间从而使微生物与其它样品组分分离(例如形成的颗粒)。离心加速度可以是约1,000xg至约20,000xg,例如约2,500xg至约15,000xg,例如约7,500xg至约12,500xg,等。离心时间可以是约30s至约30min,例如约1min至约15min,例如,约1min至约5min。离心可以在约2℃至约45℃,例如约15℃至约40℃,例如约20℃至约30℃的温度下进行实施。在一个实施方式中,分离容器包含封套,并在离心之前将封套应用于容器以形成气密式密封。封套的存在降低了处理具有或可能具有传染性和/或危险性的微生物的风险,以及污染样品的风险。本发明方法的一个优点是能够采用密封容器(例如,气密式密封容器)内的微生物实施方法的任意一个或多个步骤(例如,溶胞、分离、探询、和/或鉴定)。本发明方法,涉及自动化系统的应用,避免与处理高毒性微生物相关的健康和安全性风险,诸如从样品中回收微生物用于直接测试发生的。在一个实施方式中,对容器离心的时间和/或力不足以在密度缓冲垫层内形成密度梯度。本发明不涉及样品的超离心,例如,在超过约100,000xg的力下离心。而且,本发明也不涉及等密度(平衡)沉降或分带。
分离容器可以是任何具有足以容纳密度缓冲垫层和样品的容量的容器。如本文中所指出的,在本发明的实践中可以使用在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/orIdentification of Microorganisms”序列号为____的有关美国专利申请中公开的分离装置,将该专利申请结合于本文中作为参考。在一个实施方式中,容器刚好放入或能够被刚好放入到离心机转子中。容器的容量可以是约0.1ml至约25ml,例如约1ml至约10ml,例如约2ml至约8ml。如果分离以微量规模进行,容器的容量可以是约2μl至约100μl,例如,约5μl至约50μl。在一个实施方式中,容器在其上层部具有宽的内径以容纳样品和大部分的密度缓冲垫层,而在收集微生物颗粒的下层部分具有较窄的内径。窄部分具有的内径可以是约0.04至约0.12英寸,例如约0.06至约0.10英寸,例如约0.08英寸。宽部分具有的内径可以是约0.32至约0.40英寸,例如约0.34至约0.38英寸,例如约0.36英寸。对于微量分离,内径可以甚至更小。例如,窄部分的内径可以是约0.001至约0.04英寸,例如,约0.002至约0.01英寸。锥形内径部分可以连接上下层部分。锥形部分具有的角度可以是约20至约70度,例如约30至约60度。在一个实施方式中,下层窄部分低于容器的总高度的一半,例如,低于容器的总高度的约40%、30%、20%或10%。容器可以具有连接的封套装置或可以通过螺纹接受封套装置(例如,封盖)从而使容器在离心期间可以是密封式封闭的。在某些实施方式中,容器经过设计以便使微生物样品或颗粒可以在分离之后很容易地回收、或另外获得或从容器中移出,不论是以手动还是自动的方式(从而使技术人员不会暴露于容器的内容物)。例如,容器可以包含含有颗粒并能够与容器其余部分分开的可卸下部分或脱离部分。在另一个实施方式中,容器包含用于分离之后接近颗粒的工具,诸如一个或多个用于插入注射器或其它采样装置或用于吸出颗粒的孔道或可穿透的表面。在一个实施方式中,容器可以是管,例如离心管。在另一个实施方式中,容器可以是小片或卡片。在一个实施方式中,容器是独立容器,即分离单个样品的装置。在其它实施方式中,容器是包含两个或更多个分离容器从而能够同时分离多个样品的装置的部分。在一个实施方式中,装置包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、36、42、48、60、72、84、96或更多个分离容器。
容器可以包含光学窗口,通过该光学窗口探询能够进行。光学窗口可以是在容器的底部、顶部和/或侧面。窗口可以由任何对光(例如,至少部分的近红外光(NIR;700nm-1400nm)、紫外光(UV;190nm-400nm)和/或可见光(VIS;400nm-700nm)光谱)透明的材料构成。合适的材料的实例包括但不限于,丙烯酸树脂、甲基丙烯酸酯、石英、熔融硅石、蓝宝石和/或环状烯烃共聚物(COC)。在一个实施方式中,整个容器都由光学窗口材料制成。在另一实施方式中,容器可以由两个或更多个独立部件,诸如用于光学窗口的光学UV-VIS-NIR透明组件和构成容器其余部分的另一种材料(例如,低成本标准模铸塑料)制成(例如,模塑)。在一个实施方式中,光学窗口足够薄而容许光谱探询,这将取决于窗口的材质。在另一个实施方式中,光学窗口尽可能薄而降低光谱探询的干涉。例如窗口能够具有低于约0.20英寸,例如,低于约0.15,0.10,或0.05英寸的厚度。
在另一个实施方式中,通过过滤步骤实施分离,在所述的过滤步骤中,将样品(例如溶胞样品)放置于装有具有阻留微生物的孔径的选择性过滤器或过滤装置。所阻留的微生物可以通过使合适的缓冲液缓缓地通过过滤器来进行洗涤。然后洗涤的微生物可以直接在过滤器上进行探询和/或通过直接在过滤器表面上采样或通过用合适的水性缓冲溶液反冲洗过滤器回收进行探询。
探询步骤
一旦已将微生物分离、离析和/或粒化,可以对分离的样品、离析的样品或颗粒进行探询以鉴定和/或表征样品或颗粒中的微生物。在一个实施方式中,探询以非侵入方式进行,即,对颗粒进行探询同时其保留在分离容器中。在另一个实施方式中,分离容器在整个探询期间保持密封。以非侵入方式鉴定微生物的能力,可选地加上在整个分离和鉴定/表征过程期间保持容器密封并使一些或所有的步骤自动化,从而避免不断处理受污染的和/或感染性的样品并大大地提高了整个工艺的安全性。另外,通过直接探询而不进一步处理样品或颗粒(例如,再悬浮、平板培养和菌落生长)进行表征和/或鉴定微生物的能力,大大地提高了能够进行鉴定/表征的速度。在一个实施方式中,在探询之前将样品或颗粒从分离容器中回收和/或再悬浮和可选地移出。在另一个实施方式中,在原位探询之后将样品或颗粒回收和/或再悬浮,然后实施进一步的探询。例如,能够应用于分离的微生物而不是微生物颗粒的技术诸如胶乳凝集测试或自动表型鉴定测试能够在回收的和/或再悬浮的微生物上实施。
在一些实施方式中,可以对分离的样品或颗粒进行光谱探询。在一个实施方式中,光学光谱学方法能够用于分析微生物的一种或多种固有性质,例如,在不存在其它物质,诸如染色剂、染料、结合剂等的情况下微生物内存在的性质。在其它实施方式中,光学光谱方法可以用于分析微生物的一种或多种非固有性质,例如,只有在其它物质的辅助下才能检测到的性质。探询可以采用,例如,荧光光谱法、漫反射光谱法、红外光谱法、太赫兹光谱法、透射和吸收光谱法、拉曼光谱法(包括表面增强拉曼光谱法(SERS)、空间偏转拉曼光谱法(SORS)、透射拉曼光谱法、透射拉曼光谱法、和/或共振拉曼光谱法)进行实施。为了增强拉曼(SERS)和荧光信号,微生物可以在离心之前用金和/或银纳米粒子涂层,和/或内部光学表面可以用特定尺寸和形状的金属胶体预先涂层(参考文献:对于荧光,Lakowicz,Anal.Biochem.337:171(2005);对于SERS,Efrima等,J.Phys.Chem.B.(Letter)102:5947(1998))。在另一个实施方式中,纳米粒子在离心之前存在于密度缓冲垫层中并且当微生物通过密度缓冲垫层时与微生物缔合。在其它实施方式中,采用质谱技术,诸如MALDI-TOF质谱法、解吸电喷雾离子化(DESI)质谱法、GC质谱法、LC质谱法、电喷雾离子化(ESI)质谱法和选择性离子流量管(SIFT)光谱法,对颗粒中的微生物进行探询。在一个实施方式中,对分离的样品或颗粒进行光谱探询同时其仍保留在分离容器中。可以通过容器上的光学窗口对容器进行探询。光学窗口可以在容器的底部和/或任何一个侧面或多个侧面和/或顶部上。在一个实施方式中,分离容器在适合探询的位置上放入或能够被放入到分光光度计的支架中。光谱探询可以通过本领域内的技术人员已知的用于有效地检测和/鉴定微生物的一种或多种固有或非固有性质的任何技术进行实施。例如,正面荧光(其中激发光和发射光进入和离开相同的光学表面,并且如果样品是一般光学厚时,则激发光穿透到样品中的距离非常短(参见,例如,Eisinger,J.,和J.Flores,“Front-face fluorometry of liquid samples,”Anal.Biochem.94:15(1983))可以用于鉴定颗粒中的微生物。其它形式的测定,诸如落射荧光、反射比、吸收度和/或散射测定,也可以应用于本发明中。在另一个实施方式中,如本文中所述的,可以将分离的样品或颗粒移出用于探询(例如,可以将分离的样品或颗粒移出并制备用于通过质谱进行探询,如本领域内众所周知的)。在又一个实施方式中,可以采用一种以上的方式对分离的样品或颗粒进行探询。例如,可以采用荧光光谱法和拉曼光谱法对分离的样品或颗粒进行探询。根据该实施方式,可以连续地或同时地实施这些探询步骤。
样品照明源,或激发源,可以选自本领域内技术人员已知的许多合适的光源。可以使用产生可用数据的电磁波谱的任何部分。能够在紫外、可见和/或近红外光谱中发射的光源,以及电磁波谱的其它部分,都可以利用并且对于本领域内的技术人员都是已知的。例如,光源可以是连续光谱灯诸如用于产生紫外光的氘灯或氙弧灯,和/或用于产生可见/近红外激发的卤钨灯。这些光源提供了宽的发射范围并且具体激发波长的光谱带宽可以采用光干涉滤光片、棱镜和/或光学光栅来降低,如在本领域众所周知的。
另外,多个窄带光源,诸如发光二极管和/或激光,可以在空间和/或时间上进行多路复用以提供多波长激发源。例如,发光二极管从240nm至超过900nm是可利用的并且该源具有20~40nm(半极大处全宽度)的光谱带宽。激光在从紫外至近红外的离散波长中是可利用的并可以采用本领域技术人员众所周知的多路复用方法进行应用。
任何光源的光谱选择性可以通过采用光谱区分装置诸如扫描单色器来改进。可以利用其它区分方法,如本领域技术人员已知的,诸如声光可调滤波器、液晶可调滤波器、光学干涉滤光片阵列、棱镜光谱仪等,及其任意组合。在选择光谱鉴别器时需要考虑可调性的范围以及选择性的水平。通过举例说明的方式,例如,鉴别器可能利用300-800nm的波长范围而选择性为10nm。这些参数一般决定达到可调谐性范围以及选择性必需的最佳技术。
通常,光源导致样品的激发,接着在预定时间点或连续地测定样品荧光的发射。类似地,可以测定来自激发源与样品的相互作用的反射光以提供检测和/或表征的相关资料。
样品的发射可以通过任何合适的光谱区分装置进行测定,最优选采用光谱仪。光谱仪可以是检测特定发射波长的扫描单色器,由此从单色器产生的输出通过光电倍增管进行检测,和/或分光光度计可以被设置为成像光谱仪,由此输出通过成像检测器阵列诸如电荷耦合器件(CCD)检测器阵列检测。在一个实施方式中,鉴别器允许通过光电检测装置(诸如,光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)检测器阵列)观察荧光和/或散射信号。
使用光谱技术来获得测定结果,该测定结果优选作为激发-发射矩阵(EEM)测定结果提供的。如本文中所用的EEM定义为作为激发和发射波长的函数的荧光物质的发光光谱发射强度,并包括全谱或其子集,其中子集可以包含单对或多对激发/发射对。另外,采用固定激发波长的EEM的横截面可以用于显示具体激发波长的发射光谱,而采用固定发射波长的EEM的横截面可以用于显示样品的激发光谱。在一个实施方式中,在多个特定激发-发射波长对下,例如,至少在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个特定激发-发射波长对下测定多重EEM。
根据本发明的一个具体实施方式,已经发现,正面荧光光谱法在测定高度散射和高度淬灭样品的荧光和/或反射性质方面提供了优势。在一个实施方式中,正面方法可能尤其适用。例如,正面荧光可能尤其适用于高度吸收性样品,因为激发和发射束不需要经过大多数样品,因此可能较少地受其中可能含有的干扰组分(例如,血液细胞和微生物培养基)的影响。容器的光学表面可以以提供本领域技术人员已知的可接受的结果的角度进行照射,(例如,Eisinger,J.,和J.Flores,“Front-face fluorometry of liquid samples,”Anal.Biochem.94:15-21(1983))。在一个实施方式中,系统经过设计以便使光学系统除了在最少一个固定角度下测定发射的荧光之外,还在最少一个固定角度下测定漫反射光。
根据本发明,对于已知微生物进行了对照测量,由此实现采用本领域技术人员已知的各种数学方法使所测量的试验数据与所关注的微生物的表征相关。例如,使用本领域技术人员已知的软件系统可以将样品的数据与基线或对照测量结果进行对比。更具体而言,这些数据可以通过许多多元分析方法,诸如例如一般判别分析法(General Discriminant Analysis)(GDA)、偏最小二乘判别分析法(Partial Least Squares Discriminant Analysis)(PLSDA)、偏最小二乘回归(Partial Least Squares regression)、主成分分析(Principal Component Analysis)(PCA)、平行因素分析(Parallel Factor Analysis)(PARAFAC)、神经网络分析(Neural Network Analysis)(NNA)和/或支持向量机(Support Vector Machine)(SVM)进行分析。这些方法可以用于将所关注的未知微生物基于已存在的命名分类到相关组,和/或基于在如以前所述的设计用于监控、检测和/或表征生物体的系统中的生物体的代谢、病原性和/或毒力分类到天然存在组。
在又一个实施方式中,可以使用根据检测系统的非-光谱测量结果诸如检测时间和生长速率来辅助表征和/或鉴定离析的样品或颗粒中的微生物。另外,取自分离装置下部区域的照片图像的测量结果可以提供关于鉴别分离物的有价值的信息,诸如颗粒大小、形状、颜色和密度。
在本发明的一些实施方式中,离析的样品或颗粒中的微生物的表征和/或鉴定不需要涉及精确物种的鉴定。表征涵盖了生物微粒的广泛分类或分级以及单一物种的实际鉴定。离析的样品或颗粒中的微生物的分类可以包含对微生物的表型和/或形态学特征的测定。例如,生物微粒的表征可以基于可观察的差异,诸如组成、形状、大小、聚簇和/或代谢实现。在一些实施方式中,所关注的生物微粒的分类可能不需要给定的生物微粒的特征的先验知识而只需要与经验测量结果一致的相关性,从而使这种方法比基于特异性结合事件或代谢反应的方法更加通用和更易适应。如本文中所用的“鉴定”意指确定以前未知的微生物所属的科、属、种和/或菌株。例如,将以前未知的微生物鉴定到科、属、种和/或菌株水平。
在一些情况下,表征包含提供足够用于采取行动的有用信息的分类模型。如本文中所用的优选的分类模型包含分组到以下一组或多组:(1)革兰氏组;(2)临床革兰氏组;(3)治疗组;和(4)功能组;和(5)天然内荧光组。
(1)革兰氏组:在革兰氏组分类中,基于其革兰氏染色反应和总尺寸,可以将微生物归类成三大分类类别之一,所述组选自以下一组或多组:(a)采用革兰氏染色法染成深蓝色的革兰氏阳性微生物;(b)采用革兰氏染色法染成红色的革兰氏阴性微生物;和(c)采用革兰氏染色法染成蓝黑色但是通过形态学特征和尺寸与细菌进行区分的非常大的圆形细胞的酵母细胞。
(2)临床革兰氏组:可以将革兰氏组进一步分成几组代表有区别的形态学特征的子类。这些子类包括由有经验的实验室技师报道的所有相关临床信息,并由此提供比阳性或阴性革兰氏反应更高水平的鉴定。这种具体的分类是非常有用的,因为其通过采用自动化系统提供相当的临床相关信息消除了关于依赖革兰氏染色质量和/或技师读取涂片的技能水平的问题。更具体而言,基于这种分类模型的微生物子类可以选自以下一种或多种:(a)球菌,其是小而圆的细胞;(b)双球菌,其是结合在一起的两个小而圆的细胞;(c)棒状菌,其是矩形形状;和(d)杆菌,其具有杆状形状。这些能够通过其它形态学信息确证的子类的实例包括:(i)革兰氏阳性球菌;(ii)链状革兰氏阳性球菌;(iii)簇状革兰氏阳性球菌(即,“葡萄样”簇);(iv)革兰氏阳性双球菌;(v)革兰氏阳性杆菌;(vi)具有内芽孢的革兰氏阳性杆菌;(vii)革兰氏阴性杆菌;(viii)革兰氏阴性球杆菌;(ix)革兰氏阴性双球菌;(x)酵母菌;和(xi)丝状真菌。
(3)治疗组:治疗组包括多种微生物物种,所述的微生物物种当从具体试样类型中分离出来时,用同类抗生素或抗生素的混合物进行处理(例如,如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”中所述的)。在许多情况下,对于能够从初始的经验疗法改变至更靶向的疗法的临床医师,不需要鉴定到种水平,因为一个以上的物种可以采用相同的抗生素选择处理。这种分类水平正确地将这些“相同处理”的微生物归类到单个治疗类别。这种表征水平的实例包括区分高度耐药的肠杆菌(Enterobacteriacae)(EB)种与敏感EB种(肠杆菌属某些种(Enterobacter spp.)与大肠杆菌(E.coli))、或耐氟康唑的念珠菌种(光滑念珠菌(C.glabrata)和克柔念珠菌(C.kruzei))与敏感念珠菌种(白色念珠菌(C.albicans)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis))等等的能力。
(4)功能组:根据本发明,基于代谢、毒力和/或表型特性的混合,也可以将微生物归类到几个组中。非发酵性生物体可以明确地与发酵性生物体区分开。而且,产生溶血素的微生物物种可以与非溶血性物种分别进行分组。在一些情况下,这些组表示比属水平(例如,大肠杆菌类,革兰氏阴性非发酵性杆菌)更宽泛的类别,一些在属水平(例如,肠球菌属(Enterococcus),念珠菌属(Candida)),和一些具有更近于种水平的区分(例如,凝固酶阴性葡萄球菌,α-溶血性链球菌,β-溶血性链球菌,凝固酶阳性葡萄球菌,即金黄色葡萄球菌(S.aureus))。
(5)天然内荧光(“IF”)组:也可以将微生物归类为基于它们的自然趋势的类别中以按照其先天的和/或固有的荧光特征一起分组。这些组中的一些可能是治疗和功能组类型共有的。这些分组可以包括个体物种,诸如具有特征性IF信号的粪肠球菌(E.faecalis)、化脓链球菌(S.pyogenes)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),和/或可以包含小的具有相对保守的IF信号的生物体组,诸如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)-产酸克雷伯菌(K.oxytoca)组或产气肠杆菌(E.aerogenes)-阴沟肠杆菌(E.cloacae)组。
除了测量微生物的固有性质(诸如内荧光)用于鉴定目的外,本发明的方法可以进一步包含使用其它鉴定剂来辅助分离和/或鉴定方法。与特异性微生物结合的物质,如亲和配体,可以用于分离微生物,鉴定微生物的分类或物种(例如,通过与独特的表面蛋白或受体结合)和/或鉴别微生物的特征(例如,抗生素耐药性)。所用的鉴定剂包括但不限于单克隆和多克隆抗体及其片段(例如,用于金黄色葡萄球菌鉴定的抗-Eap)、核酸探针、抗生素(例如,青霉素、万古霉素、多粘菌素B)、适体、肽模拟物、噬菌体衍生的结合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物标记物(急性期蛋白、LPS结合蛋白、CD14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体),宿主防御肽(例如,防御素、cathelicidins、proteogrins、爪蟾抗菌肽)、细菌素(bacterocins)(例如,羊毛硫抗生素(诸如乳酸链球菌肽、mersacidin、表皮素、鸡葡萄球菌素(gallidermin)和plantaricin C),和II类肽)、细菌噬菌体和选择性用于核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/黏液或蛋白质的染料、或其任意组合。如果该物质自身没有给出可检测信号,则可以对物质进行标记,诸如通过将该物质与标记物(例如,可见的或荧光的)结合以提供可检测信号。标记物包括但不限于,荧光化合物、发光化合物、发磷光化合物、放射性化合物、拉曼活性化合物和/或比色化合物。可以在本发明方法的任何步骤中,例如当获得样品时、溶胞期间、和/或分离期间将作用剂加入微生物中。在一些实施方式中,在颗粒的探询期间可以测定该作用剂在颗粒中的存在。其它可用的鉴定剂包括微生物酶的底物、螯合剂、光增敏剂、淬灭剂、还原剂、氧化剂、缓冲剂、酸、碱、溶剂、固定剂、清洁剂、表面活性剂、消毒剂(例如,醇、漂白剂、过氧化氢)和有毒化合物(例如,叠氮化钠、氰化钾)和代谢抑制剂如环己酰胺等。类似地,许多用于测定微生物细胞存活力、代谢和/或膜电位的荧光化合物在本发明中可以用作鉴定剂。
在本发明的一个方面中,方法可以进一步包含回收微生物颗粒和实施另外测试的步骤。在一个实施方式中,可以通过从样品培养基和密度缓冲垫层中吸出来回收颗粒。在另一个实施方式中,可以通过将注射器插入容器并将颗粒吸出来回收颗粒,同时样品培养基和密度缓冲垫层仍保持完整。然后可以将回收的颗粒再悬浮于合适介质例如盐水中。一旦再悬浮,可以对微生物进行任何进一步所需的测试,如本领域内的技术人员公知的以及如以上所述的。具体而言,用再悬浮的微生物可以实施需要清洁微生物样品的任何测试。在一些实施方式中,可以进行另外的鉴定测试。鉴定测试的实例包括Vitek2、扩增和非扩增核酸测试(NAT)、显色和乳胶凝集分析、免疫分析(例如,采用标记的抗体和/或其它配体)、质谱法(例如,MALDI-TOF质谱法)和/或其它光学技术诸如红外光谱法(FTIR)或拉曼光谱法。也可以进行其它表征测试,诸如抗生素和/或其它药物的耐药性。其它表征可以是在本方法的初始分离和鉴定步骤期间开始的测试的一部分。例如,耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的检测可以通过在分离微生物之前将荧光标记的青霉素加入样品中开始。一旦已将颗粒回收并且再悬浮,可以测定结合的青霉素水平。
在本发明的一个方面,可以使一些或所有的方法步骤自动化。使方法步骤自动化允许更有效地检测大量的样品并降低了在处理可能包含有害和/或传染性的微生物的样品中的人为误差的风险。然而,更重要的是,自动化能够在白天或夜晚的任何时间递送关键性的结果而无延误。一些研究已表明,更快速地鉴定导致败血症的生物与改善患者护理,缩短住院时间和降低整个成本相关。
在本发明的某些实施方式中,方法也可以用于检测样品中微生物的存在。在这些实施方式中,方法包括以下步骤:
(a)获得样品;
(b)可选地溶解所述样品中的细胞以产生溶胞样品;和
(c)使微生物与所述样品的其它组分分离以形成微生物颗粒;
其中颗粒的存在表明在样品中存在微生物。在一个实施方式中,采用裸眼检测颗粒。在其它实施方式中,颗粒通过探询,例如,在光谱学上进行检测。
在一些实施方式中,检测方法能够用于监控被微生物污染的样品,例如食品、药物、饮用水等。在一个实施方式中,所述方法可以以重复模式实施用于定期监控污染,例如,每月一次,每周一次,每天一次,每小时一次或任何其它时间模式。在另一个实施方式中,可以根据需要对样品进行检测,例如,当怀疑受到污染时。在另外的实施方式中,检测方法可以用于在临床样品例如血液培养物中寻找微生物的存在。例如,在某些时间点可以将样品从血液培养基中移出并对样品实施检测方法以测定血液培养物是否是阳性的。在一个实施方式中,可以在培养物接种后的设定时间点取样,例如,接种后24h取样,以测定血液培养基是否是阳性的。在另一个实施方式中,可以定期例如,每12、6、4或2h或每60、50、40、30、20、15、10或5min从血液培养物中取样,以在可检测为阳性的短时间内鉴定阳性血液培养物。在检测方法的某些实施方式中,检测步骤可以可选地在如本文中描述的鉴定方法之后进行。在其它实施方式中,使检测方法部分或完全自动化,尤其是对于涉及重复监控样品的实施方式。
在以下实施例中进一步详细说明本发明,所述实施例通过举例说明的方式提供而不是预期以任何方式限制本发明。利用本领域内众所周知的标准技术或下面具体描述的技术。
实施例
实施例1.快速微生物离析和鉴定方法
A.溶胞-离心分离程序
胶体二氧化硅悬浮液(0.2~0.5mL;密度为1.040~1.050gm/mL)加入到几个尖底微量离心管中。将溶胞的阳性BacT/ALERTSA血液培养液样品(0.5~1.0mL)覆盖在胶体二氧化硅悬浮液上。另外,采用针或套管可以将胶体二氧化硅溶液加入到溶胞血液培养液下面。
对来自含以下微生物的培养物的阳性培养液进行测试:
将管封盖,然后在微量离心机中在室温(20~25℃)下以约10,000g旋转2min。将上清液吸出,然后将纯化的微生物颗粒再悬浮在0.45%w/v NaCl中以至660nm的光学密度为0.40。
将第二部分载入到Vitek2ID/AST卡(bioMerieux Inc.,Missouri)上。将“直接的”Vitek2结果与来自由阳性培养液继代培养的过夜生长的菌落(传统方法)的悬浮液进行比较。对于直接获自血液培养法和标准Vitek法所有4个物种都给出了优异的鉴定置信度水平,证明基于密度的分离方法提供基本上不含有血液和/或来源于培养液的粒子和蛋白质的微生物。
B.通过本征荧光原位鉴定的快速程序
在标记阳性的1h内,优选标记阳性的10min内将阳性血培养瓶从BacT/ALERT微生物检测系统(bioMérieux Inc.,Missouri)中移出。将2.0mL阳性血液培养液样品加入到无菌、螺旋盖的管中的0.5mL溶胞溶液(0.75%TritonX-100-Reduced(Rohm and Haas,Pennsylvania)+0.375%蛋白酶XXIII)中。在室温下将管子短暂地涡旋混合并孵育5min。将溶胞培养液样品(0.5mL)加入到含密度为1.045mg/mL的分离溶液(Isolate胶体二氧化硅30%v/v在0.15M NaCl中)的定制微量离心管(在基部具有0.5mm厚的石英光学窗口)中。在室温(20~25℃)下使管在配备A-8-11甩开转子(Eppendorf,New York)的Eppendorf5417R微量离心机中以约10,000rmp旋转2min。将管从离心机中移出并转移至Fluorolog3(HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey)荧光分光光度计的定制的正面适配器。从下面可以立即读取管底部的粒化的微生物的荧光。将数据输出到Excel和Statistica软件中进行多变量分析。
实施例2.快速微生物纯化和鉴定方法的评价
为了评价实施例1中所描述的快速鉴定概念的可能性,在本方法中对从阳性血液培养物中回收的24种分离物(包括白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的4个种中的6种菌株)进行测试。
从三个捐献者采集SPS-抗凝血液并汇集。将10mL新鲜人血液加入BacT/ALERT(BTA)SA血培养瓶(bioMérieux Inc.,Missouri)中。在胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中制备每一种分离物的悬浮液。将每个瓶子用0.4mL的103/mL悬浮液孵育并将瓶子置于BTA橱柜中在36℃下进行孵育。4个含10mL血液但不含生物的BacT/ALERTSA瓶作为阴性对照进行孵育。
在标示为阳性的3h内将阳性瓶从BTA橱柜中移出。将阴性对照瓶与每组阳性瓶(按种)一起移出。按照瓶子变成阳性的顺序从BTA橱柜中一次移出一个瓶子。采用3mL注射器和18G针将2.0mL的阳性血液培养液样品移出,并立即加入到无菌螺旋盖玻璃管中的0.5mL溶胞缓冲液(0.75%w/v TritonX-100-Reduced(Fluka))中。将该管短暂地涡旋混合并在室温下孵育5min。向预先载入55μL分离溶液(30%v/v Isolate在0.15M NaCl中)的定制毛细管微量离心管(在毛细管部分的基部含有0.5mm石英光学窗口)中加入一份0.5mL的溶胞培养液样品。在22℃下使微量离心管在配备A-8-11甩开转子(Eppendorf,New York)的Eppendorf5417R微量离心机中以10,000rpm离心2min。将管从离心机中移出并转移至Fluorolog3(HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey)分光光度计的定制30-度正面适配器。使用5-分钟定制程序立即读取在管底部粒化的纯化微生物的荧光。将数据输出到Excel和Statistica软件用于分离物的化学计量学分析和分类。
采用和不采用标准化(normalization)以及采用留一交叉验证法对数据实施分类模型的优化。结果在表1显示。在表中,“#步骤”是指采用“留一法”交叉验证方法产生最高灵敏度的判别分析步骤的数量。在无数据标准化的情况下,正确鉴定的菌株的百分数为82.6%。虽然通过标准化到NADH、色氨酸和黄素峰仍可获得改进的结果,但当将数据标准化到瑞利散射点、胶原区域或吡哆胺峰时获得最佳结果(正确鉴定率约96%)。
表1
数据标准化 | 原理/荧光团 | 在X-Val上的正确率% | #步骤 |
未 | n/a | 82.6 | 2 |
320_320 | 散射 | 95.7 | 2 |
320_405 | 胶原 | 95.7 | 6 |
300_400 | 吡哆胺 | 95.7 | 8 |
345_460 | NADH | 91.0 | 10 |
285_350 | 色氨酸 | 87.0 | 1 |
465_515 | 黄素 | 87.0 | 3 |
实施例3.溶胞缓冲液的评价
实施实验以评价用强和弱的溶胞缓冲液处理的新鲜阳性肺炎链球菌WM-43血液培养液的分离效率和微生物内荧光(MIF)曲线图。对以下溶胞缓冲液制剂进行了测试:(A)2.0%TX100-R在0.5M CAPS中,pH 11.7(强=LB-A);(B)0.75%TX100-R在0.5M CAPS中,pH 11.7(弱=LB-B);和(C)0.45%TX100-R在0.3M CAPS中,pH 11.7(弱=LB-C)。将1.0mL溶胞缓冲液A和B与2.0mL溶胞缓冲液C置于螺旋盖管中并将管放置在37℃水浴中的支架上。在BTA系统中在标记阳性5min内采用5mL注射器和18G针将培养液样品(4.0mL)从肺炎链球菌WM43-阳性BacT/ALERTSA培养瓶中取出。将培养液快速分散到每个含溶胞缓冲液的管中,并将管封盖并涡旋约5秒。也对来自满溢的(15mL血液)阴性对照BacT/ALERTSA瓶的测试培养液进行采样以测定溶胞和分离步骤的效率。使管回到37℃水浴中1min。将管从水浴中取出并将0.5mL溶胞产物覆盖到预装载的分离管中,该分离管含有200μL的14%w/v碘海醇密度缓冲垫层。将管在配备A-8-11甩开转子(Eppendorf,New York)的Eppendorf5417R微量离心机中在25℃下以10,000rpm(约10,000×g)离心2min。采用LB-B的分离管下部区域的照片在图1中显示。注意当对满溢的(15mL血液)阴性对照培养液进行处理时不存在任何颗粒。在完成离心之后即刻采用双重30度管适配器,pMTorr检测器和“全EEM”扫描文件(20.8min扫描)在Fluorolog3(HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey)荧光分光光度计中读取管。来自单个样品的EEM光谱的实例显示在图2A~2C中。
图2A~2C中所示的肺炎链球菌颗粒的内荧光EEM曲线与细胞存活力结果充分相关。与用两种含0.15%的TX100(最终浓度)的弱缓冲液处理相比,用0.40%的含TX100(最终浓度)的溶胞缓冲液(LB-A;强缓冲液)处理阳性培养液,导致肺炎链球菌存活力下降30倍以及峰NADH荧光下降5倍,尽管在所有的三种颗粒中出现类似的色氨酸信号。与降低微生物存活力相关的另一变化是峰黄素荧光的增加(表2)。降低的NADH和增加的黄素荧光在图2A中是显而易见的。
表2肺炎链球菌颗粒内荧光信号
实施例4.用于原位鉴定纯化的微生物颗粒的改进的装置和方法
为了进一步探索实施例2中描述的快速原位分离和鉴定的方法的可能性,设计并用UV透明的塑料模塑制成几种专利装置。这些装置公开在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/or Identificaion of Microorganisms”,序列号为____的相关美国专利申请中,将该专利申请结合于本文中作为参考。这些装置包含几个共同特征,包括封盖、样品储液池和能够从下面和/或侧面对沉降的微生物颗粒进行光谱探询的渐缩光学质量下部区域,以及有助于装置耦合到荧光分光光度计的特征。装置还必须在分离步骤器件能够经受相对高的g-力。设计这种管的几个反复以改进微生物的回收、荧光再现性并减少了由杂散散射光引起的污染。在一些实施方式中,也可以将管设计成气密式密封。
沉降的微生物球粒的光学探询通过将分离装置插入放置在荧光分光光度计样品室的定制适配器中或通过将分离装置直接耦合到连接至荧光分光光度计(Fluorolog3,(HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey))的双叉分六环一300~400微米的光纤电缆(Ocean Optics,Florida)来实现。构建三反射镜光纤适配器使其能够使用这两种系统检测器(PMT和CCD)。在每种微生物颗粒上收集激发-发射矩阵(EEM)全光谱(扫描范围:激发260-800nm;发射260-1100nm;增量5nm)。
量具重现性和可靠性研究在一次性装置-光纤电缆设计结构上采用纯化的色氨酸和核黄素溶液进行实施。对于这两种荧光团均获得小于2.5%的目标CV,从而证实该一次性装置和研究平台的质量。
实施例5.与微生物悬浮液相比,采用微生物颗粒的测定结果鉴定微生物
几个研究人员之前已经描述了采用直角荧光测定稀微生物悬浮液以便鉴定微生物。我们比较了这种传统方法与我们的新方法的效率,所述新方法为正面测定在专利的UV-透明的分离装置或光学管基部内的沉降微生物颗粒。而且,我们比较了用于正面测定的两种检测器的效率;这两种检测器为连接至双光栅光谱仪的光电倍增管(PMT)检测器,和连接至单光栅光谱仪的电荷耦合器件(CCD)检测器。这些实验采用两块分离设备和在琼脂板上生长的微生物菌落进行实施。在以下三种光学构造中的每一个中对代表7个物种(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、白色念珠菌、热带念珠菌和粪肠球菌)的42种菌株的板进行测试:
1.在0.45%NaCl中对每种微生物制备在660nm下OD为0.40的悬浮液,加入到UV透明的比色皿中并采用PMT检测器以直角收集全EEM光谱(传统方法)
2.在定制的分离装置中通过离心悬浮液来制备2~3mm厚的微生物颗粒。采用PMT检测器以正面模式收集所得颗粒的全EEM光谱。
3.在定制的分离设备中通过离心悬浮液来制备2~3mm厚的微生物颗粒。采用CCD检测器以正面模式收集所得颗粒的全EEM光谱。
采用商购获得的多变量分析软件(一般判别分析;Statistica)对EEM中的内荧光数据进行分析。分析结果描述于表3中。
表3
光学配置 | 检测器类型 | 到种水平的正确率% |
1.比色皿中的悬浮液 | PMT | 83.3(35/42菌株正确) |
2.定制光学管中的颗粒 | PMT | 97.6(41/42菌株正确) |
3.定制光学管中的颗粒 | CCD | 97.6(41/42菌株正确) |
令人惊讶的是,以正面模式扫描微生物颗粒显著地改进了采用已知的多变量分析方法鉴定它们的能力。荧光EEM数据的进一步分析表明,对于传统的悬浮液在比色皿中的构造来说主要的判别区域是在光谱的色氨酸区域内。相比而言,微生物颗粒的正面测定导致EEM光谱的一些其它区域提供强有力的判别能力,尤其是在360~440nm的激发波长内。该实验也证明了PMT和CCD检测器的功能等效性。通过正面探询微生物颗粒提供的其它内荧光光谱信息是意外并且有利的结果。
实施例6.选择性溶胞缓冲液的开发
我们开始设计能够在数秒内溶解人血组分但是保持大多数致败血症的微生物完整和代谢活性的选择性溶胞缓冲液。用于这些研究的最常见的样品是含人血液的BacT/ALERTSA培养基。在存在或不存在少量测试微生物接种物的情况下,将瓶子用10~15mL人血接种,随后装载到BacT/ALERT微生物检测系统中。将阳性的或目前为阴性的瓶取出并按照以下描述处理培养液样品。
在本发明中所用的最早溶胞溶液是无缓冲的(实施例1~2)并且主要结合胶体二氧化硅密度缓冲垫层使用。胶体二氧化硅的一个令人感兴趣的性质是其能够使不完全溶解的血液细胞组分(其在密度缓冲垫层的顶部收集)与完整微生物(其通过密度缓冲垫层并形成颗粒)分离的能力。在寻找更为广泛适用的密度缓冲垫层时(参见实施例7),许多不能防止这种非微生物碎片的沉降,因此仍需要改进的溶胞缓冲液制剂。我们确定了非微生物碎片迅速地被氢氧化钾而不是被酸溶解,因此在各种清洁剂的存在下对许多碱性pH缓冲液进行测试。在这些研究期间,我们发现,TritonX100-R清洁剂和pH 11.7的CAPS缓冲液的混合物导致来自无菌血液培养液样品的血液细胞组分完全溶解。
在实施例3中描述了Triton X100-R清洁剂浓度和高pH溶胞条件对肺炎链球菌菌株WM-43的影响的初步评价。导致较低的微生物存活力的条件导致了NADH荧光显著下降以及伴随着黄素荧光的增加(参见表2;LB-A)。
为了选择性溶胞缓冲液中的包含物,对一系列阴离子、中性和两性离子清洁剂进行筛选。发现阴离子和两性离子清洁剂对血液蛋白的变性作用太强,因此我们集中研究非变性的中性清洁剂,如在表4中给出的选择。在测试的碱性pH下具有最强血液细胞溶解活性的清洁剂作为#1~6列出。这些清洁剂在20秒内完全溶解阴性对照血液培养液中的血液细胞,如通过660nm下的透光率%的增加所评价的。第二组清洁剂(#7~10)表明更缓慢、更可控制的血液细胞溶解,在30~40秒内给出最大溶解。第三组(#11~12)在相当的清洁剂浓度下达到完全溶解花费了8~10min。
制备在0.3M CAPS,pH 11.7的碱性缓冲液制剂中含有不同结构和溶胞活性的清洁剂的溶胞缓冲液。清洁剂浓度在表4中给出。采用包含已知对清洁剂和碱性pH条件敏感的临床微生物菌株肺炎链球菌菌株WM-43的阳性血液培养液在功能上对这些溶胞缓冲液进行评价。评价的参数是微生物内荧光水平(激发-发射矩阵光谱)、分离效率、分离的微生物颗粒的外观和革兰氏染色特征和从密度缓冲垫层下方的颗粒中回收的微生物的存活力。
如下实施程序:
将2份阳性培养液与1份测试溶胞缓冲液混合,在37℃水浴中孵育1min以溶解血液细胞,然后将0.5mL溶胞产物铺层在分散在2-段光学分离管中的0.2mL密度缓冲垫层(14%w/v碘海醇+1.93%w/v NaCl+10mM Hepes,pH7.4)上,然后将所述光学分离管用螺旋盖进行气密式密封。在将管在配备A-8-11甩开转子的Eppendorf 5417R微量离心机中以约10,000rmp离心2min后,将管放置到定制适配器中,该定制适配器将管的基部直接耦合到连接至荧光分光光度计(Fluorolog3,来自Horiba Jobin-Yvon Inc.,New Jersey)的400微米光纤探针上,并进行全程EEM扫描(Ex 260-850nm;Em 260-1100nm;每隔5nm)。在扫描之后,除去上清液并将微生物颗粒再悬浮在0.5mL胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中。制备悬浮液的涂片用于革兰氏染色,并将20微升的1∶100稀释液涂板于羊血琼脂平板上,用于按NG(无生长)至4+(最大生长)的等级评估存活力。
该实验的结果表明,在以上所述的所需溶胞条件下,将测试清洁剂划分到广泛对应于其溶胞性质的三个类别中:
1.快速溶胞清洁剂(#1~6),其对这种肺炎链球菌分离物的革兰氏反应具有一些影响。在该组中最后两种清洁剂(GenapolX-080(Hoechst AG,Frankfurt,德国)和聚多卡醇(polidocenol))具有相对较小的影响,而头三种清洁剂完全改变了革兰氏反应性并降低了存活力。
2.较弱的溶胞清洁剂组(#7~10),其在60s溶胞周期内有效溶解血液细胞并且不改变肺炎链球菌分离物的革兰氏反应性或存活力。
3.清洁剂组(#11~12),其也未改变肺炎链球菌分离物的革兰氏反应性或存活力,但是具有更缓慢的溶胞活性。
表4:清洁剂类型对肺炎链球菌的革兰氏反应性和存活力的影响
a对于全部溶解血液细胞需要5min溶胞步骤。
测试清洁剂对肺炎链球菌细胞颗粒中存在的内荧光团水平的影响在表5中显示。如由实施例3中所示的结果所教导的,黄素与NADH荧光的比率是这种敏感微生物的健康状况的优良指标。比率低与微生物存活力降低相关,诸如采用正辛基糖苷和CHAPS清洁剂观察到的。将表5中所示的4组划归到与从颗粒中回收的肺炎链球菌细胞的革兰氏反应性中观察到的变化(表4)直接相关的类别中。数据证明,清洁剂7、8、9、10和12在用于存活力的黄素/NADH替代标记物中显示出显著的改进。
有趣的是,这些5种清洁剂全部都是聚氧乙烯类型。令人惊讶的是,4种易于溶解血液细胞的较弱清洁剂(#7~10),具有提示未改变的存活力的最佳内荧光团水平并具有预期的革兰氏反应性,全部都享有共同的化学性质。每一个都具有平均链长度为10(E)且平均烃链长度的范围为12-18(C)的聚氧乙烯亲水性头基团。
我们提出,该特殊清洁剂组代表了用于溶胞缓冲液中的包含物的优良的候选物,所述溶胞缓冲液被设计用于选择性地溶解哺乳动物血液细胞并同时维持附近微生物的活力。
表5:清洁剂类型对肺炎链球菌内荧光团水平的影响
开发筛选模型以能够测试较大量的微生物分离物对一些清洁剂的敏感性。简而言之,将测试苛求菌的悬浮液加入到含人血液的BacT/ALERTSA培养基中达到103-105CFU/mL。将样品用测试溶胞缓冲液在37℃下处理1~5分钟,然后如果需要,在TSB中稀释为1∶100并铺板用于活菌计数。
在表6中给出的菌落计数的总结表明,Brij97证明毒性最低,然而,单用CAPS缓冲液的碱性条件迅速杀死脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)和伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)。GenapolC-100具有与Brij97类似的活性,但是在该模型中对于副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae)和隐孢子虫(C.hominis)的毒性略微更强。在随访实验中,在与Brij97和GenapolC-100接触5分钟后,肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌(S.agalactiae)、缓症链球菌(S.mitis)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)和大肠杆菌的存活力保持不受影响(数据未显示)。
表6:在溶胞缓冲液处理后苛求生物的活菌计数
许多溶胞缓冲液,尤其是用于分子方法的那些,含有螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)以辅助溶解步骤。我们采用革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物面板评价了向TX100-CAPS溶胞缓冲基础液中加入EDTA的影响。表7显示了EDTA对铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌(A.baumanii)的快速毒性效应,但是对于两种其它的革兰氏阴性杆菌洋葱假单胞菌(B.cepacia)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae),或革兰氏阳性金黄色葡萄球菌没有快速毒性作用。注意到,尽管EDTA对铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌两种都有抑制作用,但是这两个菌种之间主要内荧光团的变化非常不同。铜绿假单胞菌是仅有的在EDTA处理之后NADH和色氨酸荧光都显著下降的测试生物。
这些实验代表了一个良好的实例,其中如何能够将某些添加剂或鉴定剂加入到溶胞缓冲液中以快速改变特定微生物的基础微生物内荧光曲线并提供强化鉴定和进一步表征该分离物的机会。正如本领域技术人员易于理解的那样,特定的微生物对影响其物理状态或代谢的任何化合物的敏感性可以通过将该化合物加入样品、溶胞缓冲液、密度缓冲垫层或其任何混合物中来快速地确定。类似地,改变溶胞条件或选择性溶胞缓冲液的组成(例如,缓冲液pH、清洁剂类型和其浓度)都可以产生微生物内荧光的特征性变化,如在图2A和2B中示例性说明的那样。(参见,例如,于2009年10月30日提交的标题为“Method for the Separation and Characterization of Microorganisms UsingIdentifier Agents”,序列号为____的共同受让的美国专利申请,并将其结合于本文中作为参考)。
表7:EDTA在溶胞缓冲液作为铜绿假单胞菌的“鉴定剂”
实施例7.基于密度的分离缓冲液的开发
分离缓冲液(也被称为密度缓冲垫层)的目的是在几分钟内可靠地使代谢活性微生物与溶胞血液组分和培养基分离和分开。选择缓冲垫层材料使之具有在完整微生物和溶胞的阳性血液培养液样品的密度之间的密度。分离通过离心力完成。
我们首先确定(实施例1~2),胶体二氧化硅具有从在阳性血液培养液中发现的高度荧光血液和培养基组分快速离析微生物的令人满意的性能。然而,一些微生物物种诸如肺炎链球菌通过胶体二氧化硅没有发生令人满意的沉降,该胶体二氧化硅具有在沉降的微生物与污染性血液和培养基组分之间形成有效的相间屏障所需的密度。因此,对于其它更广泛有效的密度缓冲垫层进行了探索。
为了分离缓冲液中的包含物对一系列化合物进行筛选。用于密度缓冲垫层的优选化合物具有以下特征:
1.能够使微生物通过缓冲垫层快速沉降的低粘度
2.对微生物来源的内荧光干扰最小的低荧光
3.在整个进行探询的光波长范围内优选是光学透明的
4.对微生物无毒性
5.廉价且易于获得
6.广泛适用于宽范围内的细菌和样品
表8:为密度缓冲垫层测试的化合物的列表
采用含肺炎链球菌(低密度囊封微生物)、大肠杆菌(中等密度微生物)和金黄色葡萄球菌(高密度微生物)的阳性血液培养液筛选潜在的密度化合物。将培养液样品在实施例6描述的条件下通过将1份溶胞缓冲液(0.45%TritonX100-R+0.3M CAPS,pH 11.7)与2份样品混合并在37℃水浴中孵育1分钟进行溶胞。然后小心地将0.7mL溶胞产物覆盖在标准1.5mL微量离心管中的0.5mL测试密度缓冲垫层上。以约10,000g将管旋转2分钟,并记录分离结果。当在两个不同的液体层基部具有沉降的固体微生物颗粒而在下层不存在可见的血红蛋白污染时注意到产生了良好的分离。采用胶体二氧化硅、碘海醇、氯化铯、LymphoPrep和PolymorphoPrep作为密度缓冲垫层都获得了良好的分离结果。采用葡萄糖T70、Ficoll 400、蔗糖和聚乙烯醇获得了满意的结果。期望碘克沙醇具有与碘海醇类似的性质。我们还发现,例如通过加入氯化钠使密度缓冲垫层具有高渗性,改进了低密度微生物诸如肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌的沉降。
利用含敏感肺炎链球菌菌株WM43的阳性培养液,并采用14%w/v碘海醇、18%w/v氯化铯和30%PolymorphoPrep储备液结合用TritonX100-R、聚多卡醇、Brij97、GenapolC-100和GenapolX-100制备的溶胞缓冲液进行进一步的测试。5种溶胞缓冲液和4种密度缓冲垫层的组合提供了预期的良好分离。碘海醇和氯化铯密度缓冲垫层的结果在图3中显示。如在实施例6中更详细讨论的,不考虑密度缓冲垫层的组成,回收的肺炎葡萄球菌细胞的存活力都不如用含TritonX100-R和聚多卡醇的缓冲液高。
实施例8.几种溶胞缓冲液和密度缓冲垫层的评价
为了测定本发明的概念的广泛适用性,我们采用接种血液培养物研究比较了两种选择性溶胞缓冲液和两种密度缓冲垫层制剂的效力以开发微型分类模型。在模型中所用的微生物是肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌(K.oxytoca)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、热带念珠菌和肺炎链球菌(每个6种菌株)。对溶胞缓冲液和密度缓冲垫层的以下组合进行测试:
在以上所述的4种条件的每一种下,如下所示对阳性培养液样品进行处理:
1.2.0mL阳性培养液样品与1.0mL选择性溶胞缓冲液混合,然后在37℃水浴中放置1分钟。
2.将1.0mL溶胞产物样品覆盖在定制光学分离管中包含的0.5mL密度缓冲垫层上。在密度缓冲垫层的表面上存在聚丙烯球以有助于装载而不会扰乱两个水相。
4.然后将密封的管转移至定制适配器,所述定制适配器将该管的基部直接耦合至连接荧光分光光度计(Fluorolog3,来自HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey)的300微米光纤探针上。
5.采用CCD检测器构造进行全程EEM扫描(Ex 260-850nm,每隔5nm;Em 260-1100nm)
6.将EEM数据输出到Excel,并采用一般判别分析法(Statistica)对每种试剂组构建微型分离模型。
对于所有四组试剂,除了一组外,分离结果都相当。组D,其在密度缓冲垫层中不含弱表面活性剂Pluronic F-108,由于将这些生物强粘附在分离管的侧壁上而显著降低了几种热带念珠菌菌株的生物量。这种现象也在使用碘海醇缓冲垫层时出现(数据未显示)。随后的数据分析表明,虽然优选在密度缓冲垫层中存在弱表面活性剂,但是这不是基本的。实际上,所有四个试剂组合的GDA结果均揭示了令人满意的分类性能(表9)。四个试剂组之间的任何差异都是相对较小的。最常见的误分类出现在平板上两个紧密相关的物种肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌之间。
表9
含碘海醇的密度缓冲垫层相比于含氯化铯的垫层的潜在缺点之一是碘海醇(一种医用造影剂)的强吸收性,这会导致在低于约380nm的激发波长下荧光显著淬灭。然而,在令人惊讶的发现中,当使用碘海醇缓冲垫层时,改进了肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的分析差别,这表明更显著的荧光团诸如NADH和色氨酸的部分淬灭可以揭示具有不同淬灭性质的较低水平的细胞荧光团中的差异。
对于这种有限的微生物调查对象,含Brij97和GenapolC-100的溶胞缓冲液提供了类似的分类结果。类似地,也对氯化铯和碘海醇密度缓冲垫层进行。在有趣的发现中,使用碘海醇可以选择性地辅助一些微生物物种的区分。
实施例9.通过内荧光快速鉴定血液培养分离物的改进方法
在设计和验证光学分离管和相关光学平台方面所作出的最高进展,改进的正面探询微生物颗粒的分类能力以及快速选择性溶胞缓冲液和基于密度的分离步骤的优化,已经导致了新方法,该新方法具有在数分钟内从复杂样品诸如血液培养液中鉴定微生物的潜力。
方法由于在密封装置中进行分离和读取步骤因而具有简单性和安全性的优点。为了进一步建立该方法的实用性,我们建立了代表已知导致败血症的最流行的29个物种的373种微生物菌株的数据库。在低接种物下将这些生物“接种”于含10mL人血的BacT/ALERTSA瓶中。在通过BacT/ALERT3D微生物检测系统标记阳性的几分钟内将血液培养液样品从瓶中取出。如下所示对样品进行处理:
2.将1.0mL溶胞产物样品覆盖在定制光学分离管中包含的0.5mL密度缓冲垫层(24%w/v氯化铯在10mM Hepes pH 7.4中+0.005%Pluronic F-108)上。在密度缓冲垫层的表面上存在聚丙烯球以有助于装载而不会扰乱两个水相。
4.然后将密封的管转移至定制适配器中,所述定制适配器将该管的基部直接耦合至连接荧光分光光度计(Fluorolog3,来自HORIBA Jobin Yvon Inc.,New Jersey)的300微米光纤探针上。
5.采用CCD检测器构造进行纯化的微生物颗粒的全程EEM扫描(Ex260-850nm,每隔5nm;Em 260-1100nm)
6.将EEM数据输出到Excel中。
7.整个过程从瓶子标记事件开始花费不到20分钟,采甩在2~8℃下已经储存4~5小时的阳性培养液重复该过程。在处理之前将储存的培养液加温5分钟。
从阳性血液培养液中分离出来的微生物颗粒的EEM光谱的一些代表性实例在图5~8中给出。在存在的各种细胞荧光团的数量和形状方面所描述的物种之间的差异是显而易见的。
通过各种多变量分析方法进行数据分析以达到构建微生物分类数据库的目的。每份扫描文件包含超过9,000个个体荧光读数,因此在分析之前使用各种方法来最小化和标准化这些数据。作为一个实例,表10显示了采用一般判别分析工具(Statistica)的一些初步结果。可以使用其它输入变量,诸如从BacT/ALERT微生物检测系统获得的检测时间和生长速率,以及细胞颗粒中存在的生物质的量,来辅助致败血病分离物的鉴定和/或表征(参见,例如实施例10)。
虽然表10中的数据显示了到种水平的鉴定结果,但是为主治医师提供临床上相关的可采取行动的信息的任何分组水平是可以传递的。这种的实例可以是“治疗”组,其中根据用于处理它们的抗生素对微生物物种进行分组。
本发明中所描述的方法满足了对于以安全和可靠方式从阳性血培养瓶中快速鉴定微生物的迫切需要。表10中举例说明的结果堪比依赖于微生物的生长或分子特征的其它鉴定方法的结果,但是却无时间延误或成本问题。另外,可以使该方法全自动化以便可以在白天或夜晚的任何时间将ID结果经由电子装置直接发送给医师。
本发明的方法由于定制一次性装置的内嵌分离和读数部分与多种诊断技术也相容,采用完整微生物代表“固相”(图4)。利用本发明的概念正在开发的补充测试的实例包括但不限于,微生物酶的测定、细胞表面标记物、核酸探针和微生物代谢抑制剂。该方法适合于自动化和微型化。这种潜能详细描述在于2009年10月30日提交的标题为“Method for the Separation andCharacterization of Microorganisms Using Identifier Agents”,序列号为____的尚待批准的美国专利申请中,将该专利申请结合于本文中作为参考。
表10快速微生物ID法
数据库采用新鲜和储存样品的合并数据进行构建(746次扫描;373种菌株;29个物种)
仅对于新鲜样品的留一法交叉验证结果
a=在前两种选择之内且后验概率>0.10
实施例10.辅助表征和/或鉴定微生物的非-光谱测定结果
非-光谱测定结果诸如从检测系统算法获得的检测时间和微生物生长速率,以及分离的微生物颗粒的大小、形状、颜色和密度,可以用作表征和/或鉴定微生物的其他变量
在图9和10中给出的实例证实了颗粒大小、检测时间和平均内荧光的测定结果能够用于辅助判别两种紧密相关物种肺炎链球菌和缓症链球菌,或用于确证对这两种紧密相关物种进行的鉴定。每个符号表示通过本发明方法从阳性血液培养液中回收的独立的临床分离物。在图9和10中画圈的肺炎链球菌分离物是在表10中给出的初步结果中误鉴定为缓症链球菌的一种分离物(实施例9)。
实施例11.从阳性无菌培养液样品中快速鉴定微生物
作为这些申请的实施例,将少量的大肠杆菌ATCC 8739(一种用于工业微生物学的对照微生物)置于BacT/ALERTSA瓶中在胰蛋白酶大豆培养液中孵育。当瓶子标记阳性时,将1.0mL培养基样品取出并直接铺层在0.5mL分散在单段光学分离管内的密度缓冲垫层(24%w/v CsCl+0.005%w/v PluronicF-108在10mM Hepes中,pH 7.4)上(图4)。将管密封后,以10,000g离心2分钟,然后直接转移到Fluorolog 3的定制适配器中。收集纯化的微生物颗粒的激发-发射矩阵(EEM)并将该生物的内荧光曲线与已知微生物的数据库进行比较。该菌株的EEM类似于图6中所示的临床大肠杆菌菌株。
实施例12.通过MALDI-TOF质谱法或拉曼光谱法鉴定从血液培养物中离析的微生物的溶胞-离心方法
如下所示对来自接种的血液培养物中的培养液样品进行处理以使微生物与可能干扰后续分析的血液和培养基组分分离:
将来自新鲜的阳性血液培养物的4.0mL培养液(在实施例1中描述的)与2.0mL溶胞缓冲液(0.45%Brij97在0.3M CAPS中,pH 11.7)合并,涡旋混合5s并随后在37℃的水浴中孵育90s。孵育后,在4个1.5mL尖底离心管的每一个中将0.95mL溶胞产物铺层于0.5mL密度缓冲垫层(14%w/v碘海醇,0.005%Pluronic F-108在10mM Hepes中,pH 7.4)的顶部。然后将所有四个管以10000g在25℃下离心2min以通过密度缓冲垫层沉降(粒化)微生物。溶胞血液和培养基仍保留在缓冲垫层的上方。
当完成离心周期时,除去上清液并将每一个管中的沉降(粒化)的微生物用10微升纯水再悬浮。将所有四个管的再悬浮微生物汇集到干净的管中并轻轻地混合。然后调节每一个处理的试样的体积以使最终悬浮液在660nm的光密度(A660)等于20/cm。将处理的试样在2~8℃下储存用于当天测试,或者将其等分并冷冻于-70℃下用于在以后日期中测试。
实施例13.通过MALDI-TOF MS分析采用溶胞-离心法从阳性血液培养物中处理的微生物试样
将根据实施例1的步骤处理的试样在37℃下迅速解冻(如果先前实施了冷冻),轻轻地混合,然后在纯水中稀释至使用强度(1∶4、1∶8和1∶16)。以二重复制将每种稀释试样各1.0μL施用于MALDI-TOF靶板上。向每种二重复制中的一份中加入1.0μL 50%甲酸。允许所有施用的样品在环境温度下干燥,然后施用1.0μL的基质溶液。基质由Alpha-Cyano(α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液,AnagnosTec GmbH,德国)和DHB(2,5-二羟基苯甲酸,AnagnosTecGmbH,德国)的50∶50混合物组成。
为了进行比较,使对应的微生物分离物生长在适合于该物种的琼脂培养基上,并以二重复制直接涂抹于MALDI-TOF靶板上。将在二重复制的涂覆点之一上的微生物用1.0μL纯水,接着用1.0μL 50%甲酸在原位再悬浮。允许来自给定的分离物的两个涂覆点干燥,然后向每一个涂覆点加入1.0μL的基质混合物。
在所有微生物试样都完全干燥之后,在Axima Assurance MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu Biotech North America,Maryland)上对每个试样在2,000-34,000的质/荷范围内获得MALDI-TOF质谱图。
从阳性血液培养物中回收的所选微生物的代表性质谱图在图11~13中示出。图中的质/荷比范围为了清楚起见而减少,但是对于所有质量范围都保持这些图中举例说明的相同发现。
图11显示了对于四个物种的每一种,由为清楚例证而平均化的5种临床分离物的接种血液培养物中处理的微生物的谱图。在给定质/荷比处有峰或无峰的显著差异是显而易见的并且对这些生物体是特征性的。对于所有谱图没有共同的质/荷峰,这表明在根据本发明处理之后由于血液或培养基的遗留,使潜在掩蔽的质量如果存在,也只会存在极少。
图12显示了图11中平均化所示的金黄色葡萄球菌分离物的5个单独的质谱图。这5个谱图显示了,甚至在生长于具有不同血液供体的不同血液培养物中时,这种微生物在不同临床分离物之间的质谱图也具有一致性。
图13显示了与从在琼脂培养基(具有5%绵羊血液的胰酶大豆琼脂,bioMérieux Inc.)上生长的菌落直接采样的相同5种分离物的谱图相比,图1中所示的5种大肠杆菌分离物的平均。质谱图的相似性表明,血液培养物的处理有效地除去了不是微生物来源的物质,同时保留了微生物特异性的那些质量。
实施例14.通过拉曼光谱法分析采用溶胞-离心法从阳性血液培养基物中处理的微生物试样
根据实施例11中的程序处理的样品在37℃水浴中迅速解冻(如果先前实施了冷冻),轻轻地混合。使样品的一部分保持未稀释而将其余部分按照1∶2稀释于纯水中。将每一种稀释的和未稀释的样品各1微升施用于镀金的显微镜载波片的第一表面上并在环境条件下静置干燥。
干燥后,采用拉曼显微镜(Kaiser Optical Systems,密歇根)在785nm的照明波长下对每一种干燥试样按照5×5栅格图案获得25个谱图。显微镜配备40×物镜,将激光功率设定为400mW,25个谱图中的每一个都采用5秒累积时间来获得。
获得之后,对谱图进行预处理以进行噪声消除(dark subtraction)、宇宙射线赝像去除(cosmic ray artifact removal)、光谱截断(spectral truncation)、基线扣除(baseline subtraction),归一化和在准备多变量统计分析时的离群值的消除。图14显示了对于来自处理的血液培养物的各种物种获得的拉曼光谱图。图15显示了对于从血液培养物中处理的13种金色葡萄球菌分离物获得的拉曼光谱图。
前述实施例举例说明了本发明,而不能解释为限制本发明。本发明通过以下权利要求以及包含在本文中的权利要求的等价体进行限定。所有出版物、专利申请、专利、专利出版物以及本文中引证的任何其它文献都以其全文结合于本文中用于与出现该文献的句子和/或段落相关的教导。
Claims (35)
1.一种从测试样品中分离微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品;
(b)选择性地溶解所述测试样品中的非微生物细胞以产生溶胞样品;
(c)将溶胞样品铺层在容器中的密度缓冲垫层的上方;
(d)将容器离心以使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离并形成微生物颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法,其中对所述离析的微生物样品进行探询从而产生用于表征和/或鉴定所述微生物的测定结果。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述探询通过光谱法或通过质谱法进行。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述光谱法选自由荧光光谱法、漫反射光谱法、吸收和透射光谱法、红外光谱法、太赫兹光谱法、拉曼光谱法、表面增强拉曼光谱法、空间偏转拉曼光谱法、共振拉曼光谱法、及其任意组合组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法,其中荧光光谱法以正面模式进行测定。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述质谱法选自由MALDI-TOF质谱法、解吸电喷雾电离(DESI)质谱法、GC质谱法、LC质谱法、电喷雾电离(ESI)质谱法和选择离子流动管(SIFT)质谱法组成的组。
7.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(c)和(d)在密封容器中实施。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述探询步骤是非侵入式。
9.根据权利要求2所述的方法,其中基于一种或多种表型特征和/或形态学特征对所述微生物进行表征。
10.根据权利要求1所述的方法,其中基于检测时间、生长速率和微生物颗粒大小、形状、颜色和/或密度中的一种或多种测定结果对所述微生物进行表征。
11.根据权利要求2所述的方法,其中将所述微生物表征到一种或多种分类模型中,所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组和天然内荧光组组成的组。
12.根据权利要求2所述的方法,其中将所述微生物鉴定至属水平、种水平、或菌株水平。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是临床样品或非临床样品。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品取自血液培养物。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述选择性溶胞步骤(b)通过声波降解法、渗压震扰法、化学处理,或其组合进行实施。
16.根据权利要求1所述的方法,其中使用包含一种或多种清洁剂的溶胞溶液实施所述选择性溶胞步骤(b)。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述一种或多种清洁剂选自由TritonX-100、TritonX-100-R、TritonX-114、NP-40、GenapolC-100、GenapolX-100、IgepalCA 630、ArlasolveTM200、Brij96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚(C12E9,聚多卡醇)、十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐类、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14、C7BzO、Brij98、Brij58、Brij35、Tween80、Tween20、PluronicL64、PluronicP84、非清洁剂磺基甜菜碱(NDSB 201)、两亲高分子(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精组成的组。
19.根据权利要求16所述的方法,其中所述清洁剂是变性溶胞清洁剂,所述变性溶胞清洁剂选自由十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐类、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14、C7BzO组成的组。
20.根据权利要求16所述的方法,其中所述清洁剂是包含结构C12-18/E9-10的聚氧乙烯清洁剂。
22.根据权利要求16所述的方法,其中所述溶胞溶液还包含一种或多种蛋白酶和一种或多种核酸酶。
23.根据权利要求16所述的方法,其中所述溶胞溶液包含一种或多种缓冲剂。
26.一种分离微生物的方法,包括:
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品;
(b)将测试样品铺层在容器中的密度缓冲垫层的上方;和
(c)将容器离心以使微生物与所述测试样品的其它组分分离并形成微生物颗粒。
27.一种表征和/或鉴定权利要求26所述的粒化的微生物的方法,所述方法是通过探询颗粒以产生鉴定微生物的测定结果,并基于所产生的测定结果表征和/或鉴定颗粒中的微生物。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述探询是通过光谱法或质谱法。
31.根据权利要求28所述的方法,其中所述密度缓冲垫层具有约1.025至约1.120g/mL的密度。
32.根据权利要求27所述的方法,其中基于一种或多种表型特征和/或形态学特征对所述微生物进行表征。
33.根据权利要求27所述的方法,其中基于检测时间、生长速率和微生物颗粒大小、形状、颜色和/或密度中的一种或多种测定结果对所述微生物进行表征。
34.根据权利要求27所述的方法,其中将所述微生物表征到一种或多种分类模型中,所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组和天然内荧光组组成的组。
35.根据权利要求27所述的方法,其中将所述微生物鉴定至属水平、种水平或菌株水平。
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