CN1233326A - 通过测量肽检测有机体的状况的方法 - Google Patents

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Abstract

通过测量来自含有作为所述有机体状况的指示的高和低分子量肽的所述有机体的样品的肽检测有机体的状况的方法,其中直接检测和鉴定低分子量肽;和与参考相比。

Description

通过测量肽检测有机体的状况的方法
本发明涉及通过检测来自所述有机体的样品的肽，检测有机体的状况的方法。
各种分析方法可用于检测有机体的状况。所以，例如，在高等有机体的诊断中，当得到病理结果时，为了进行根源性治疗，在症状的基础上尝试进行推测病理变化的原因。另外，为了能够通过相应的基因分析发现可以指示可能的病原发展的个体偏差，进行了尝试通过测序有机体的基因组和确立“野生型基因组”，建立一个平均的“健康”有机体的参考。第一个途径的缺点是没有各种假说(无原理)不能进行诊断，因为其中的诊断已经是在各种设想的基础上的。第二个方法的缺点是诊断归因于遗传功能失调的重要的或甚至是所有疾病在很长时间内将是不可能的。后面的方法的另一个缺点也可能是基因的突变不必要地导致了相关的表现型的表达。
所以提供广泛的可应用的诊断方法是符合需要的，通过这些方法可能避免上面提到的缺点，特别是，可以进行无假说的诊断。另外，诊断方法可以广泛应用，不限制于高等的发展系统，而且可以用于检测低等有机体的状况。另外，利用已知的技术应该容易建立和能够进行的。
所以，本发明的目的是提供这样的方法。
令人吃惊的是，通过具有权利要求1的特征的方法，可以简单的方式达到本发明的目的。后面的权利要求涉及本发明的方法的优选实施方案。
用于检测有机体的状况的本发明的方法是从待检测的有机体取样开始的。这一样品也可以是整个有机体。样品必须含有低分子量的肽，但除了低分子量肽，样品中同时含有高分子量肽或蛋白质是没有干扰的。根据本发明，可以直接检测和鉴定低分子量的肽，并作为有机体状况的指征。通过测量技术检测单个肽，通过测量技术检测几个肽，或甚至通过测量技术检测样品中的所有低分子量肽是可能的。与常规分析或诊断方法如凝胶电泳或二维电泳和例如临床诊断方法不一样，本发明的方法不检测高分子量结构如蛋白质。与已知诊断方法如放射性免疫测试或其它用于测量肽激素和诸如此类的竞争测试相反，通过一些测量技术，根据本发明可以直接检测的低分子量肽而不是上面提到的方法中的间接检测。将低分子量肽类定义的对照的代表性横切切片中的分布用作参考。
在本发明的方法中，待检测的样品可以起源于来自有机体的组织或液体样品，该有机体的状况待检测，该样品也可以是有机体本身或其部分。当检测低等有机体时，优选地，利用有机体本身作为样品。特定地，这样的低等有机体包括单细胞有机体，如原核系统或简单的真核系统，如酵母或其它微生物。
根据本发明，用于测量的低分子量肽将优选地具有不高于30,000道尔顿的分子量。下限实际上不是关键，但二肽代表了本发明检测的低分子量肽的下限。特别优选的低分子量肽的分子量是100到10,000道尔顿之间。
如果需要，例如由于测量方案的变化，从样品中除去高分子量肽或蛋白质和其它可能干扰测量的生物多聚体可以是有利的。特定地，在高分子量肽化合物不处于本发明的测量方法包含的范围内的情况下，上面的过程是不需要的。
根据本发明，优选地应用质谱检测低分子量肽。特别优选的是所谓的MALDI方法(基质辅助的激光吸收离子化质谱)。如果将质谱用作方法，建议应用所述的质谱得到的数据如它们的分子量，表征低分子量肽。在特定的情况下，分析其它参数如肽的电荷，或在层析柱上的特征性滞留时间，或低分子量肽的片断谱图(Fragmentmuster)，或低分子量肽的质量和电荷的联合也是可能的。
根据与有机体的状况的检测相关的其它问题，将样品分成几个部分，和在不同方面或不同的测量方案下分析样品，从而检测有机体的状况可能是有利的。
特定地，有机体包括原核生物，真核生物，多细胞有机体，来自组织培养的细胞，来自动物和人的细胞。所以，根据本发明检测遗传工程或转化和/或控制的有机体的状况成为可能。特定地，这对于检查转化系统识别任何转化有机体可能已经发展的不希望或不需要的特性可能是有利的，例如通过形成指示不需要或不希望的特性如毒性特性的肽。
特定地，任何故意地或不故意地对有机体进行的操作(调节)可能影响它的状况，不管是在给予药剂，基因治疗，感染的过程中，在来自接触化学物质的工作场所，在测试动物中，特别是转基因动物和剔除突变体中。特别是在这样的方法的情况中，个体内部和个体之间的比较，例如在上面提到的一个测量过程之前或过程中通过年代性地从有机体取样，或与未处理的对照有机体比较可以用于检查在状况中是否发生了预测和需要的变化，和是否另外，或相反，预测不到的，不需要或需要的变化已经发生，这些可以根据本发明的方法检测，不需要借助于假说。
所以，本发明的方法也可用于例如在所有种类的药剂的测试中的附属临床研究，毒性检测，分析/检测分解产物，鉴定基因产物。
在兽医和人医学中，本发明的方法因为这样的事实，即它能够检测有关的有机体的状况而不需要借助于假说而获得它杰出的重要性。所以，不是基于预想的观点进行证明测验，就可以产生检测的有机体的状况的真正全貌。可以称为不同肽展示的本发明的方法是基于这样的事实，即健康的有机体中存在特定的肽图谱，所以该图谱能够作为参考标准。现在，如果记录个体的肽状况并与参考比较，能够检测到的偏差提供了可能的病原状况的第一个证据。通过与来自相应的疾病的样品的相同的病原状况比较检测偏差，然后可能直接从唯一地比较所述的个体的样品的肽图谱中的偏差和将偏差与指定的临床图谱相比的分析鉴定相关的疾病。
根据本发明，人们可以特定地如下操作。首先可以利用来自体液和组织提取物的超滤物制备参考样品。进行回收滤液肽和将它们分成几部分，例如通过回收低分子量肽部分。例如由色谱层析或质谱可以确定的滞留行为和分子量可以进行肽部分的鉴定。例如，如果使用来自患有已知疾病的病人的超滤物并与前面确立的健康参考受试者的图谱比较，偏差的图谱能够将特异的疾病指定到相关的肽混合物的状况。所以，这一方法也可以常规的方式使用，例如，通过即时审查预示病原变化的适当的肽图谱。在一些情况中，这甚至可以是代表相关疾病的一个肽。例如，如果分析来自病人的样品，对于该样品，可以识别出特定的临床图谱，并且存在这样的疾病的原因的假说，那么在本发明的分析中也可以审查这一特定的肽，并且如果结果是阳性，可以确立适当的治疗方案。所以，首先从病人取样，通过本发明的方法记录状况，并且然后，如果确立存在预示病原状况的偏差，则借助于有用的临床测试的已知的证明测试进行控制测量，或通过特定地筛选病原状况的指征进行这样的控制测量都是可能的。
通过本领域技术人员已知的方法如超滤相关的起始物质，可以回收肽。当这样做的时候，所用的过滤器具有的分子量排除大小在本发明的要求范围内，即在二肽和最大值30,000道尔顿之间。通过适当选择相关的膜，也可能获得特定的分子量部分。优选地，从过滤可以获得0.2毫升到50升的滤液，在过滤结束后可以用稀释的盐酸马上酸化调节滤液的pH值到2到4。提到的量特定地用于检测合并的样品，用于发展来自健康受试者的参考样品，或用于确定特异于疾病的肽标记用于建立肽数据库。
通过色谱层析材料的吸收，特定地阳离子交换物，如Fracto凝胶，阴离子交换物Fracto凝胶TMAE和反相(RP)材料，接着利用线性梯度或步骤梯度洗脱，回收超滤后存在于滤液中的肽。有选择地可以特定地通过反相材料进行进一步纯化，其它色谱层析分离。
优选地通过质谱分析，特定地利用MALDIMS(基质辅助的激光吸收离子化质谱)或ESI MS(电子离子化MS)进行肽部分的测量。这些是可以用于分析肽的方法。优选地这包括Microbore反相分离和质谱的在线偶联(LC-MS偶联)。从得到的数据，基于滞留行为分子量和信号确定作为优选的指导参数建立多维表。但是，也可以记录提到的方法中确定的其它量。
将从上面提到的步骤中获得的有关患有已知基础疾病的病人的数据与从健康的参考人群同样获得的数据比较。检测质的变化(例如，产生新肽或缺乏肽)和量的变化(个体的肽的出现增加或减少)。如果需要，可以通过本领域技术人员已知的肽化学方法可以进一步纯化和鉴定通过比较分析定义的靶。然后将获得的序列资料与蛋白质和核酸数据库比较，随后与文献的数据比较。通过功能研究和通过筛选适当的病人组检查代表的肽与检测的疾病的相关性。
实施例1
体液的利用：血液滤液(血滤液，HF)
1．HF的回收
通过本领域技术人员已知的技术对选定的病人或受试者进行动脉-静脉或静脉-静脉血过滤回收HF。基本上如常规的同样方法对患有慢性肾脏疾病的病人进行HF的回收。通过动脉排出和静脉导入(arterielle Ableitung und vense Zuleitung)(动脉-静脉血过滤)或静脉排出和静脉导入(vense Ableitung und venseZuleitung)(静脉-静脉血过滤)，在血过滤装置(例如，hemoprozessor,Sartorius,Gottingen,AK  10HFM,Gambro,Hechingen)的辅助下使病人的血液通过血过滤器(例如，Hemoflow F 60或Hemoflow HF 80 S,Fresenius,BadHomburg；Hmoflow fH 77和Hemoflow HF 88H,Gambro)，该过滤器具有分子量排出大小高达30千道尔顿。用电解液(例如，SH01,SH05,SH22,SH29,Schiwa,Glandorf)替代从病人排出的滤液体积。
根据本发明的方法，为了在一次血过滤过程中从病人获得1到30升HF，进行诊断性血过滤。为了避免蛋白质水解，立即将血滤液用稀释的酸(例如，1摩尔HCl)调节到pH值2和4之间，并冷却到4℃。
2．回收HF肽并分离成几部分
2.1利用逐步洗脱提取肽
10升血滤液利用去离子水稀释调节到6ms/厘米电导率，利用盐酸调节它的pH值到2.7。然后，将HF上样于层析柱。在HF肽结合后，利用pH值增加的7缓冲液的pH步骤洗脱液洗脱结合的肽。层析条件：
加样流速：100毫升/分钟
洗脱流速：30毫升/分钟
检测：214,280纳米
柱：Vantage(Amicon,Witten)，6厘米直径×7厘米填充高度
柱材料：Frak凝胶TSK SP 650M(Merck,Darmstadt)
仪器：BioCAD 250,Perseptive生物系统，Wiesbaden-Norden-Stadt
    缓冲液     pH值     缓冲物质 摩尔体积浓度
洗脱缓冲液1     3.6     柠檬酸     0.1
洗脱缓冲液2     4.5     乙酸     0.1
洗脱缓冲液3     5.0     马来酸     0.1
洗脱缓冲液4     5.6     琥珀酸     0.1
洗脱缓冲液5     6.6     二氢磷酸钠     0.1
洗脱缓冲液6     7.4     磷酸氢二钠     0.1
洗脱缓冲液7     9.0     乙酸胺     0.1
分别收集洗脱液1-7。
2.2二次层析分离
将洗脱液1-7通过反相柱层析。
层析条件：
加样流速：10毫升/分钟
洗脱流速：4毫升/分钟
检测：214纳米
柱：HPLC钢柱，1厘米直径，12.5填充高度
柱材料：Source RPC 15微米(Pharmacia,Freiburg)
仪器：BioCAD,Perseptive生物系统，Wiesbaden-Nordenstadt
以4毫升收集洗脱液。
3．肽部分的图谱绘制
3.1
将2.2中获得的部分的等分试样加载在Microbore反相柱并梯度洗脱。利用UV检测器和电子质量分光计在线进行检测。
层析条件：
加样的流速：20微升/分钟
洗脱的流速：20微升/分钟
检测：220纳米
柱：C18 AQS,3微米，120A,1毫米直径，10厘米长度(YMC,Schermbeck)
仪器：ABI 140B双重溶剂传导系统
缓冲液A：0.06％水中的三氟乙酸
缓冲液B：80％A中的乙腈
梯度：0％B到100％的B,90分钟
在线质谱仪：
APIⅢ，含有电子电喷射界面(Perkin-Elmer,Weiterstadt)阳性离子方式
测量范围：m/z，从300到2390
扫描时间：7秒
扫描窗口：0.25m/z
利用MacSpec或MultiView软件(Perkin-Elmer)进行数据探测。
3.2个体部分的MALDI MS测量
利用不同的基质物质例如在MALDI MS中加入L-(-)-岩藻糖测量2.2中获得的部分的等分试样。
从原始数据，考虑扫描数目，信号强度和，从多重带电离子扫描计算质量后，建立多维表。
4．比较分析
4.1鉴定新的或缺乏的或量明显偏差的肽
通过比较3.3获得的数据系列，这些数据也可以称为肽图谱，确立质的和/或量的差异。考虑对照和样品，将个体的数据系列或数据系列的系列用于比较。
4.2鉴定的靶的肽化学特征
从获得的原始物质(例如，血滤液的大量制剂)，利用通常用于分离肽混合物的本领域技术人员已知的不同层析分离技术(反相，离子交换，大小排除，疏水反应，等等)，在允许鉴定的量中纯化鉴定的靶物。在每个层析分离部分后，通过ESI MS,MALDI MS或LC MS在各部分中再次鉴定靶物。重复这一过程，改变色谱层析参数，直到得到需要的说明书的纯产物，即滞留时间和分子量。接着确定部分的或完全的氨基酸序列或片断图谱。随后，利用已知的数据库(Swiss-Prot和EMBL-Peptid-und Nucleinsaure-Datenbank)进行数据库比较，目的是鉴定部分或完全的序列或片断图谱。如果没有数据库入口，阐明一级结构。实施例2
利用体液：腹水
1．回收腹水
在各种疾病中(恶性肿瘤，肝紊乱等等)腹水是作为血管外渗出物形成的。根据本发明的方法，通过穿刺得到10毫升到10升腹水，然后马上利用稀释的酸(例如，1摩尔的HCl)调节pH值到2.0和4.0之间，目的是避免蛋白质水解，并冷却到4℃。在排出大小为30千道尔顿的三醋酸纤维素膜(Sartocon小型仪器，Sartorius)上超滤后，进一步将滤液用作肽的来源。
2．腹水肽的回收和分离成几部分
2.1利用梯度洗脱萃取肽
将5升腹水滤液的pH调节到2.0并通过制备反相柱分离。
色谱层析条件：
加样的流速：40毫升/分钟
洗脱的流速：40毫升/分钟
检测：214纳米，280纳米
柱：Waters cartridge系统，4.7厘米直径，30厘米填充高度
柱物质：Vydac RP-C18,15-20微米
仪器：BioCAD Perseptive生物系统，Wiesbaden-Nordenstadt
缓冲液A：0.1％水中的三氟乙酸
缓冲液B：80％A中的乙腈
梯度：3000毫升0％B到100％B
以50毫升部分收集洗脱液
鉴定的其它过程对应于实施例1。实施例3
利用体液：尿
1．回收尿
从病人直接回收导管尿或自发的尿，量为0.5到50升，利用稀释的酸(例如1摩尔HCl)马上调节pH值到2.0和4.0之间，目的是避免蛋白质水解，并冷却到4℃。在排出大小为30千道尔顿的三醋酸纤维素膜(Sartocon小型仪器，Sartorius)上超滤，进一步将滤液用作肽的来源。
2．回收尿肽和分离成几部分
2.1利用逐步洗脱萃取肽
用水稀释10升尿滤液，使其电导率为6ms/厘米，利用HCl调节它的pH值到2.7。然后，将尿滤液加载到色谱柱上。在肽结合后，利用盐梯度洗脱结合的肽。
色谱层析条件：
加样的流速：100毫升/分钟
洗脱的流速：30毫升/分钟
检测：214纳米
柱：Vantage(Amicon,Witten),6厘米直径×7厘米填充高度
柱材料：Merck Frakto凝胶TSK SP 650M
仪器：BioCAD 250,Perseptive生物系统，Wiesbaden-Norden-Stadt
缓冲液A：50毫摩尔NaH2PO4,pH3.0
缓冲液B：1.5摩尔A中的NaCl
梯度：2000毫升中0％B到100％B
以10个各200毫升收集洗脱液。
2.2．第二步色谱分离
分别将各部分通过反相柱进行层析。
层析条件：
加样的流速：10毫升/分钟
洗脱的流速：4毫升/分钟
检测：214纳米
柱：HPLC钢柱，1厘米直径，12.5厘米填充高度
柱材料：Pharmacia Source RPC15微米
仪器：BoiCAD,Perseptive生物系统，Wiesbaden-Nordenstadt
缓冲液A：0.1％水中的三氟乙酸缓冲液B：80％A中的乙腈梯度：200毫升0％B到100％B以4毫升的部分收集洗脱液。鉴定的其它过程对应于实施例1。

Claims (13)

1．通过来自含有作为所述有机体的状况的指征的高分子量和低分子量肽的所述有机体的样品的肽的测量，检测有机体的状况的方法，其中
-直接检测和鉴定低分子量的肽；和
-与参考比较。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品是来自所述的有机体的组织或液体样品，或是有机体本身，或它们的联合。
3．根据权利要求1和/或2所述的方法，其中用于所述测量的低分子量肽具有不超过30,000道尔顿的分子量。
4．根据权利要求3所述的方法，其中用于所述的测量的低分子量肽具有的分子量至少对应于二肽。
5．根据权利要求3和/或4所述的方法，其中用于所述的测量的低分子量肽具有的分子量是在100到10,000道尔顿之间。
6．根据权利要求1到5中至少一个所述的方法，其中在所述低分子量肽的测量之前将高分子量肽分离，或在测量或评估方面不考虑在样品的记录中。
7．根据权利要求1到6中至少一个所述的方法，其中通过质谱进行所述的低分子量肽的检测。
8．根据权利要求1到7中至少一个所述的方法，其中通过测量分子量而表征所述的低分子量肽。
9．根据权利要求1到8中的至少一个所述的方法，其中先将所述的样品分成不同部分，然后进行所述的低分子量肽的测量，在不同条件下测量各部分。
10．根据权利要求1到9中的至少一个所述的方法，其中所述的有机体包括原核生物，真核生物，多细胞有机体，来自组织培养的细胞，来自动物和人的细胞。
11．根据权利要求1到10中的至少一个所述的方法，其中所述的样品起源于基因工程或转化和/或控制的(conditionierten)有机体。
12．根据权利要求1到11中的至少一个所述的方法，其中检测有机体的状况以检测和记录有机体的整体状况，而不需要借助于假说以便发现与参考状况的任何偏差。
13．根据权利要求1到11中的至少一个所述的方法，其中检测转化有机体的状况以检测和记录有机体的整体状况，而不需要借助于假说，以便发现转化有机体的任何变化，以便发现存在引起代谢变化的与转化相关的肽。
CN97198763A 1996-08-13 1997-08-13 通过测量肽检测有机体的状况的方法 Pending CN1233326A (zh)

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