PL186810B1

PL186810B1 - Sposób określania stanu organizmu drogą pomiaru peptydów

Info

Publication number: PL186810B1
Application number: PL97331612A
Authority: PL
Inventors: Wolf G. Forssmann; Peter Schulz-Knappe; Michael Schrader; Hans-Georg Opitz
Original assignee: Biovision Ag
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2004-02-27
Also published as: CZ49199A3; IS4971A; US6875616B1; CN1233326A; EP0922226B2; PT922226E; ATE234469T1; CA2263443C; DK0922226T3; ES2191175T3; WO1998007036A1; CA2263443A1; AU4298897A; DE59709517D1; EA199900196A1; PL331612A1; CZ294729B6; EP0922226B1; JP2001508864A; EP0922226A1

Abstract

1. Sposób okreslania stanu organizmu droga pomiaru peptydów w próbce z organizmu, która zawiera wysoko- i niskoczasteczkowe peptydy, jako wskaznika stanu organizmu, znamienny tym, ze - niskoczasteczkowe peptydy okresla sie i charakteryzuje bezposrednio, i - odnosi do wzorca. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób określania stanu organizmu drogą pomiaru peptydów w próbce z organizmu, która zawiera wysoko- i niskocząsteczkowe peptydy, jako wskaźnika stanu organizmu. W sposobie według wynalazku niskocząsteczkowe peptydy określa się i charakteryzuje bezpośrednio, po czym odnosi do wzorca.

Sposób według wynalazku określania stanu organizmu polega na pobraniu próbki badanego organizmu, przy czym próbką może być także cały organizm. Próbka musi zawierać niskocząsteczkowe peptydy, przy czym nie jest przeszkodą, jeżeli próbka obok peptydów niskocząsteczkowych zawiera także peptydy lub białka wielkocząsteczkowe. Peptydy niskocząsteczkowe określa się przy tym i charakteryzuje według wynalazku bezpośrednio i służą one jako wskaźnik stanu organizmu. Przy tym możliwe jest zarówno oznaczanie poszczególnych peptydów bezpośrednio techniką pomiarową, oznaczania więcej peptydów techniką pomiarową, a nawet oznaczania wszystkich znajdujących się w próbce, dających się oznaczać techniką pomiarową peptydów niskocząsteczkowych. Inaczej niż w zwykłych analitycznych lub diagnostycznych metodach, takich jak elektroforeza żelowa albo elektroforeza dwuwymiarowa i na przykład kliniczne metody diagnostyczne, w sposobie według wynalazku nie bada się struktur wielkocząsteczkowych, takich jak białka. W przeciwieństwie do znanych metod diagnostycznych, takich jak na przykład próba radioimmunologiczna albo inne próby konkurencyjne pomiaru hormonów peptydowych i podobnych, niskocząsteczkowe peptydy oznacza się według wynalazku bezpośrednio techniką pomiarową, a nie pośrednio, jak w znanych metodach. Jako wzorzec służy rozkład niskocząsteczkowych peptydów w reprezentatywnym przekroju określonych kontroli.

W sposobie według wynalazku badana próbka może pochodzić z próbki tkanki lub płynu z organizmu, którego stan ma być określony, albo może być samym organizmem lub jego częściami. W przypadku badania niższych organizmów przeważnie sam organizm służy jako próbka. Jako niższe organizmy bierze się pod uwagę zwłaszcza organizmy jednokomórkowe, takie jak systemy prokariotyczne, albo proste systemy eukariotyczne, takie jak drożdże lub inne drobnoustroje.

Zgodnie z wynalazkiem niskocząsteczkowe peptydy, które wykorzystuje się do pomiaru, mają korzystnie masę cząsteczkową co najwyżej 30000 daltonów. Dolna granica nie jest wartością krytyczną, jednak dwupeptydy stanowią dolną granicę niskocząsteczkowych peptydów, które mają być oznaczane według wynalazku. Szczególnie korzystne masy cząsteczkowe niskocząsteczkowych peptydów wynoszą od 100 do 10000 daltonów.

Jeśli jest konieczne, na przykład na skutek zmienionego układu pomiarowego, może być korzystne usunięcie z próbki wielkocząsteczkowych peptydów lub białek oraz innych biopolimerów, które mogą zakłócać pomiar. Nie jest to konieczne zwłaszcza w tych przypadkach, gdy metoda pomiarowa stosowana według wynalazku nie obejmuje wielkocząsteczkowych związków peptydowych.

Zgodnie z wynalazkiem do oznaczania niskocząsteczkowych peptydów stosuje się korzystnie spektroskopię masową. Zwłaszcza sprawdziła się przy tym tak zwana metoda MALDI (jonizacyjna spektroskopia masowa z desorpcją laserową, wspomagana przez matrycę). Jeżeli jako metodę stosuje się spektroskopię masową, to zaleca się wykorzystanie danych ustalonych na podstawie spektroskopii masowej do charakteryzowania niskocząsteczkowych peptydów, takich jak na przykład ich masy cząsteczkowe. Możliwe jest również analizowanie w określonych okolicznościach innych parametrów, takich jak na przykład ładunek peptydów

186 810 albo charakterystyczny czas retencji w kolumnach chromatograficznych albo wzorzec fragmentu niskocząsteczkowych peptydów albo połączenia masy niskocząsteczkowych peptydów i ich ładunków.

W zależności od zagadnienia, jakie ma być rozwiązane w związku z ustaleniem stanu organizmu, może być korzystne podzielenie próbki na kilka frakcji i analizowanie próbek w różnych aspektach albo układach pomiarowych i ustalenie w ten sposób stanu organizmu.

Jako organizmy służą zwłaszcza prokarionty, eukarionty, organizmy wielokomórkowe, komórki z kultur tkankowych, komórki zwierząt i ludzi. Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest badanie stanu genetycznie modyfikowanych łub przekształcanych i ewentualnie kondycjonowanych organizmów. Może być to zwłaszcza korzystne przy sprawdzaniu przekształconych systemów celem rozpoznania, w jakim stopniu przekształcone organizmy rozwinęły możliwie nieoczekiwane lub niepożądane właściwości, na przykład przez utworzenie peptydów wykazujących niepożądane lub nieoczekiwane właściwości, takie jak właściwości toksyczne.

Każda świadomie lub nieświadomie podjęta manipulacja (kondycjonowanie) organizmem może wpłynąć ma jego stan, niezależnie od tego, czy ma to miejsce w ramach podawania leków, terapii genowej, przy infekcjach, w miejscu pracy, przez kontakt z substancjami chemicznymi, przy zwierzętach doświadczalnych, a zwłaszcza przy zwierzętach transgenicznych i mutantach typu „knock-out”. Zwłaszcza w przypadku takich metod można sprawdzić drogą wewnętrznego lub zewnętrznego indywidualnego porównania, na przykład przez chronologiczne pobieranie próbek z organizmu przed i w czasie jednego z wyżej wymienionych kroków albo przez porównanie z nietraktowanymi organizmami kontrolnymi, czy przewidywane, pożądane zmiany stanu faktycznie wystąpiły i czy poza tym albo zamiast tego wystąpiły nie przewidywane, niepożądane albo także zmiany pożądane, które określa się sposobem według wynalazku bez potrzeby odwoływania się do hipotezy.

Stąd sposób według wynalazku jest także odpowiedni na przykład do towarzyszenia badaniom klinicznym, badaniom toksykologicznym przy sprawdzaniu leków wszelkiego rodzaju, do analizy/oznaczania produktów rozkładu i do identyfikacji produktów genowych.

W weterynarii i medycynie ludzkiej sposób według wynalazku zyskał bardzo na znaczeniu dzięki temu, że możliwe jest ustalenie stanu odnośnego organizmu bez potrzeby odwoływania się do hipotezy. Zamiast przeprowadzania próby potwierdzającej w oparciu o z góry założoną hipotezę staje się raczej możliwe określenie prawdziwego ogólnego obrazu stanu badanego organizmu. Sposób według wynalazku, który można określić jako różnicową wizualizację peptydów (Differential Peptide Display), wychodzi przy tym z założenia, że w zdrowym organizmie istnieje określony wzorzec peptydowy i dlatego może on służyć jako wzorzec odnośnikowy. Jeżeli przyjmie się stan peptydowy jakiegoś osobnika i porówna go z wzorcem, to można z jednej strony ustalić odchylenia, które już dają pierwszą wskazówkę, co do możliwego stanu chorobowego. Jeżeli z odpowiednich próbek chorego ustala się raczej odchylenia, które ustalono przez porównanie z podobnymi stanami patologicznymi, to już przez porównanie odchyleń wzorca peptydowego próbki osobnika i uzgodnienie odchylenia z przyporządkowanym obrazem choroby można zidentyfikować odnośną chorobę bezpośrednio na podstawie analizy danych.

Zgodnie z wynalazkiem można przy tym postępować następująco. Do wytwarzania próbki wzorcowej można początkowo wykorzystać ultrafiltraty z płynów ustrojowych i wyciągów z tkanek. Uzyskanie peptydów z przesączów i ich rozdzielenie na frakcje odbywa się w ten sposób, że uzyskuje się na przykład niskocząsteczkowe frakcje peptydów. Charakterystyka frakcji peptydowych może mieć miejsce na przykład z wykorzystaniem właściwości retencyjnych i masy cząsteczkowej, ustalonych drogą chromatografii albo spektroskopii masowej. Jeżeli stosuje się na przykład ultrafiltrat od pacjentów, którzy cierpią na znaną chorobę i porównuje go z wcześniej ustalonym widmem zdrowych pacjentów stanowiących odnośnik, to dzięki określeniu wzoru odchylenia, możliwe jest przypisanie specyficznej choroby stanowi odpowiedniej mieszaniny peptydów. Zatem sposób może być zatem zastosowany w tradycyjny, znany sposób, na przykład przez natychmiastowe sprawdzenie odpowiedniego wzorca peptydowego, wskazującego na zmiany patologiczne. W szczególnym przypadku może to być nawet peptyd charakterystyczny dla odpowiedniej choroby. Jeżeli analizuje się na przykład

186 810 próbkę od pacjenta, u którego można rozpoznać określony wzorzec chorobowy i istnieje hipoteza, co do przyczyn tej choroby, to można na przykład ten specyficzny peptyd w analizie według wynalazku również uwzględnić i jeżeli wynik jest pozytywny, to można przygotować odpowiedni plan leczenia. Jest możliwe rozpoczęcie od pobrania od pacjenta próbki, ustalenia stanu sposobem według wynalazku, a następnie przy stwierdzeniu występowania odchylenia wskazującego na stany chorobowe, przeprowadzenie pomiaru kontrolnego drogą znanych prób potwierdzających, odwołując się do zwykłych prób klinicznych, albo przeprowadzenie pomiaru kontrolnego drogą specyficznego przeszukiwania według wskaźnika stanu chorobowego.

Peptydy można przy tym otrzymać w sposób znany specjalistom, na przykład drogą ultrafiltracji odpowiedniego materiału wyjściowego, przy czym wykorzystuje się filtry wykluczające cząsteczki o wielkości w zakresie według wynalazku, czyli od dwupeptydu do maksymalnej wielkości 30000 daltonów. Przez odpowiedni dobór odpowiednich błon można także uzyskać frakcje o określonych masach cząsteczkowych. W wyniku filtracji uzyskuje się korzystnie od 0,2 do 50 l przesączu, który po zakończeniu filtracji doprowadza się na przykład do wartości pH od 2 do 4, przez zakwaszenie rozcieńczonym kwasem solnym. Wymienione ilości służą zwłaszcza do badania zebranych próbek, przede wszystkim do opracowania próbek wzorcowych zdrowych osobników względnie do określania markerów specyficznych dla choroby do sporządzenia peptydowej bazy danych.

Peptydy występujące w filtracie po ultrafiltracji uzyskuje się drogą adsorpcji na materiałach chromatograficznych, zwłaszcza wymieniaczach jonowych, takich jak na przykład Fractogel, anionowymienny Fractogel TMAE i materiały z odwróconą fazą (RP), a następnie elucji gradientami liniowymi lub gradientami stopniowymi. Celem dalszego oczyszczenia można ewentualnie wykorzystać inne techniki rozdzielania chromatograficznego, zwłaszcza materiały z odwróconą, fazą.

Pomiar frakcji peptydowych prowadzi się się korzystnie drogą analizy spektrometrii mas, a zwłaszcza techniką MALDI-MS (jonizacyjna spektrometria masowa wspomagana przez desorpcję laserową) albo techniką ESI-MS (jonizacyjna spektrometria masowa z elektrorozpylaniem). Są to metody, które można wykorzystać do analizy peptydów. Metody te obejmują korzystnie sprzężenie bezpośrednie rozdzielania z odwróconą fazą Microbore ze spektrometrią masową (sprzężenie LC-MS). Z uzyskanych danych sporządza się wielowymiarowe tabele w oparciu o właściwości retencyjne, masę cząsteczkową i intensywność sygnału, jako korzystne parametry prowadzące. Stosować można jednak także i inne wielkości określone opisanymi metodami.

Dane o pacjentach cierpiących na znaną chorobę uzyskane w wyżej wymienionych etapach porównuje się z podobnie uzyskanymi danymi od zdrowej populacji wzorcowej, przy czym ustala się zarówno zmiany jakościowe (na przykład występowanie nowych peptydów lub brak peptydów), jak i zmiany ilościowe (zwiększone względnie zmniejszone występowanie poszczególnych peptydów). Jeżeli jest to konieczne, to obiekty docelowe określone drogą analizy porównawczej oczyszcza się i identyfikuje sposobami znanymi specjalistom w chemii peptydów. Otrzymane informacje o sekwencjach można następnie porównać z bazami danych białek i kwasów nukleinowych, a następnie z danymi z literatury. Związek przedstawionych peptydów z badaną choroba sprawdza się drogą badań funkcyjnych oraz drogą eliminacji na odpowiednich grupach pacjentów.

Przykład 1

Stosowanie płynów ustrojowych: filtrat krwi (hemofiltrat, HF)

1. Otrzymywanie HF

HF otrzymuje się drogą hemofiltracji tętniczo-żylnej lub żylno-żylnej sposobami znanymi specjalistom od wybranych pacjentów lub osobników. Otrzymywanie prowadzi się zasadniczo w taki sam sposób, jak prowadzi się rutynowo u pacjentów z chroniczną chorobą nerek. Poprzez odprowadzenie tętnicze i doprowadzenie żylne (hemofiltracja tętniczo-żylna) albo odprowadzenie żylne z doprowadzeniem żylnym (hemofiltracja żylno-żylna) krew pacjentów przechodzi za pomocą aparatury hemofiltracyjnej (na przykład hemoprocesora, Sartorius, Góttingen; AK 10 HFM, Gambro, Hechingen) przez hemofiltr (na przykład Hemoflow

186 810

F 60 lub Hemoflow HF 80 S, Fresenius, Bad Homburg; Hemof Iow FH 77 H i Hemoflow HF 88 H, Gambro), który ma molekularną wielkość wykluczenia do 30 kDa. Ilość filtratu pobraną od pacjenta zastępuje się roztworem elektrolitu (na przykład SH 01, SH 05, SH 22, SH 29, Schiwa, Glandorf).

Zgodnie z niniejszym sposobem diagnostyczną hemofiltrację prowadzi się w celu uzyskania od 1 do 30 l HF od jednego pacjenta w czasie jednej hemofiltracji. Celem uniknięcia proteolizy hemofiltrat doprowadza się natychmiast za pomocą rozcieńczonego kwasu (na przykład 1M HCl) do wartości pH od 2 do 4 i ochładza do temperatury 4°C.

2. Otrzzyn)yvanie peptydów z hemofiitraaów i rozcdżellaueich na frrkcje

2.1 Ekstrakcja pesptydów drogą stopniowej ełucji l hemofiltratu rozcieńcza się odmineralizowaną wodą do przewodności 6 mS/cm i doprowadza się wartość pH za pomocą kwasu chlorowodorowego do 2,7. Następnie hemofiltrat wprowadza się na kolumnę chromatograficzną. Po związaniu peptydów z HF, związane peptydy wymywa się z hemzfilrratu drogą elucji buforem o stopniowo zmiennionym pH, stosuje się 7 buforów ze wzrastającym pH.

Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzaniu: 100 ml/min

Przepływ przy wymywaniu: 30 ml/min

Detekcja: 214 nm, 280 nm

Kolumna: Yantage (Amicon, Witten) o średnicy 6 cm i wysokości wypełnienia 7 cm

Materiał kolumny: Fractogel TSK sP 650 M (Merck, Darmstadt)

Sprzęt: BioCad 250, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt

Bufor	Wartość pH	Substancje buforowe	Molowość
Bufor elucyjny 1	3,6	Kwas cytrynowy	0,1
Bufor elucyjny 2	4,5	Kwas octowy	0,1
Bufor elucyjny 3	5,0	Kwas jabłkowy	0,1
Bufor elucyjny 4	5,6	Kwas bursztynowy	0,1
Bufor elucyjny 5	6,6	Dtwodorofosforan sodowy	0,1
Bufor elucyjny 6	7,4	Wodorofosforan dwusodowy	0,1
Bufor elucyjny 7	9,0	Węglan amonowy	0,1

Eluaty 1-7 zbiera się oddzielnie.

2.2 Drugie rozizieltmie chromatograficzne

Eluaty 1-7 poddaje się chromatografii oddzielnie przez kolumnę z odwróconą fazą. Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzaniu: 10 ml/min

Przepływ przy wymywaniu: 4 ml/min

Detekcja: 214 nm

Kolumna: Kolumna, stalowa HPLC, średnica 1 cm, wysokość wypełnienia 12,5 cm

Materiał kolumny: Źródło RPC 15 pm (Pharmacia, Freiburg)

Sprzęt: BioCAD, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt.

Eluat zbiera się w 4 ml frakcjach.

3. Odwvoznwćmie p^e^p^y^c^A.^^y^^ 3.1

Odmierzone ilości frakcji uzyskanych w punkcie 2.2 wprowadza się na kolumnę z odwróconą fazą Microbore i wymywa gradientem. Detekcję przeprowadza, się za pomocą detektora UV i bezpośrednio za pomocą spektrometru masowego z elektrorozpylaniem.

Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzaniu na kolumnę: 20 pl/min

Przepływ przy wymywaniu: 20 pl/min

186 810

Detekcja: 220 nm

Kolumna: C18 AQS, 3 pm, 120 A, średnica 1 mm, długość 10 cm (YMC, Schermbeck)

Sprzęt: Podwójny system podawania rozpuszczalnika ABI140 B

Bufor A: 0,06% kwas trójfluorooctowy w wodzie

Bufor B: 80% acetonitryl w A

Gradient: 0% B do 100% B w ciągu 90 minut

Bezpośrednia spektrometria masowa:

API III z interfejsem elektrorozpyłowym (Perkin-Elmer, Weiterstadt)

Tryb z jonem dodatnim

Zakres pomiarowy: m/z od 300 do 2390

Czas skanowania: 7 sekund

Okienko skanujące: 0,25 m/z

Dane uzyskuje się za pomocą oprogramowania MacSpec albo MultiYiew (Perkin-Emer).

3.2 Pomiar poszczególnych frakcji drogą MALDI-MS

Odmierzone ilości frakcji uzyskanych według punktu 2.2 mierzy się z różnymi substancjami matrycowymi, na przykład z dodatkiem w MALDI-MS L-(-)-fukozy.

Z nie poddanych obróbce danych sporządza się wielowymiarową tabelę z uwzględnieniem numeru skanowania, intensywności sygnału i po obliczeniu mas z wielokrotnie naładowanych jonów jednego skanowania.

4. jAializa porównawcza

4.1 Identyfikacja nowych, brakujących lub znacznie różniących się ilością. peptydów

Przez porównanie zestawów danych otrzymanych w punkcie 3.3., które można określić jako mapy peptydów, ustala się jakościowe i ewentualnie ilościowe różnice. Przy tym do porównania wykorzystuje się poszczególne zestawy danych lub także grup zestawów danych uwzględniając kontrole i próbki.

4.2 Charakterystyka peptydowo-chemiczna zidentyfikowanych obiektów docelowych

Z uzyskanego surowego materiału (na przykład dużych preparatów hemofiltratu) zidentyfikowane obiekty docelowe oczyszcza się w takich ilościach, które umożliwiają identyfikację. Przy tym stosuje się różne, znane specjalistom chromatograficzne techniki rozdzielania (odwrócona faza, wymiana jonowa, chromatografia eliminowania ze względu na wielkość, hydrofobowa chromatografia interakcyjna, itp.), które stosuje się na ogół do rozdzielania mieszanin peptydów. Po każdym rozdzielaniu chromatograficznym jednej frakcji identyfikuje się ponownie obiekty docelowe drogą ESI-MS, MALDI-MS albo także LC-MS. To postępowanie powtarza się zmieniając tak często parametry chromatograficzne, aż pojawi się czysty produkt o poszukiwanej charakterystyce, to jest czasie retencji i masie cząsteczkowej. Po tym następuje określenie częściowej albo całkowitej sekwencji aminokwasów albo wzorca fragmentu. Na koniec prowadzi się porównanie baz danych ze znanymi bazami danych (baza danych Swiss-Prot i kwasów nukleinowych i peptydów EMBL) w celu identyfikacji częściowej lub pełnej sekwencji albo wzorca fragmentu. Jeżeli nie istnieje żadna wstępna baza danych, to wykrywa się strukturę pierwotną.

Przykład 2

Wykorzystanie płynów ustrojowych: płyn wodobrzusza

1. Otrzymywanie płynu wodobrzussa

Płyn wodbbrzusya tworzy się jako wysięk pbyanacyynibwy przy różnych schorzeniach (nowotwory złośliwe, zaburzenia funkcjonowania wątroby, itp.). Zgodnie z niniejszym sposobem uzyskuje się drogą nakłucia od 10 ml do 10 l wodorryusya, a następnie doprowadza się natychmiast wartość pH od 2,0 do 4,0 za pomocą rozcieńczonego kwasu (na przykład 1M HCl) celem uniknięcia proteolizy i ochładza do temperatury 4°C. Po ultrafiltracji przez błonę z tzójbctanu celulozy z wykluczeniem wielkości 30 kDa (miniaparatura Sartocon, Satorius) wykorzystuje się filtrat dalej jako źródło peptydów.

186 810

2. Otrzymywanie peptydów wodobrzusza i rozdzielanie na frakcje

2.1 Ekstrakcja peptydów z wymywaniem gradientem l Filtratu doprowadza się na pH 2,0 i rozdziela na preparatywnej kolumnie z fazą odwróconą.

Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzeniu na kolumnę: 4 ml/min

Przepływ przy wymywaniu: 40 ml/min

Detekcja: 214 nm, 280 nm

Kolumna: Układ wkładu Watersa, średnica 4,7 mm, wysokość wypełnienia 30 cm

Materiał kolumny: Yydac RP-C18,15-20 firn

Sprzęt: BioCAD, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt

Bufor A: 0,1% kwas trójfluorooctowy w wodzie

Bufor B: 80% acetonitryl w A

Gradient: 0% B do 100% B w 3000 ml

Eluat zbiera się w 50 ml frakcjach.

Dalszy przebieg charakterystyki jak w przykładzie 1.

Przykład 3

Wykorzystanie płynów ustrojowych: mocz

1. Otrzymywanie moczu

Mocz uzyskuje się bezpośrednio jako mocz z cewnika albo jako mocz samorzutny od pacjentów w ilościach od 0,5 do 50 l i celem uniknięcia proteolizy doprowadza się natychmiast jego wartość pH od 2,0 do 4,0 za pomocą rozcieńczonego kwasu (na przykład 1M HCl) i ochładza do temperatury 4°C. Po ultrafiltracji przez błonę z trójoctanu celulozy z wykluczeniem wielkości 30 kDa (miniaparatura Sartocon, Satorius) wykorzystuje się dalej filtrat jako źródło peptydów.

2. Otrzymywanie peptydów z moczu i ich rozdzielanie na frakcje

2.1 Ekstrakcja peptydów ze stopniową elucją l filtratu moczowego rozcieńcza się wodą do przewodności 6 mS/cm i doprowadza pH na 2,7 za pomocą HCl. Następnie filtrat moczowy nanosi się na kolumnę chromatograficzną. Po związaniu peptydów związane peptydy wymywa się gradientem roztworu soli.

Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzaniu na kolumnę: 100 ml/min

Przepływ przy wymywaniu: 30 ml/min

Detekcja: 214 nm

Kolumna: Yantage (Amicon, Witten), średnica 6 cm, wysokość wypełnienia 7 cm

Materiał kolumny: Merck Fraktogel TSK SP 650 M Sprzęt: BioCAD 250, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt

Bufor A: 50 mM NaH2PO4, pH 3,0

Bufor B: 1,5MNaClwA

Gradient: 0% B do 100% B w 2000 ml

Eluat zbiera się w 10 frakcjach po 200 ml każda.

2.2 Drugie rozdzielanie chromatograficzne

Frakcje poddaje się chromatografii oddzielnie na kolumnie z odwróconą fazą.

Warunki prowadzenia chromatografii:

Przepływ przy wprowadzaniu na kolumnę: 10 ml/min

Przepływ przy wymywaniu: 4 ml/min

Detekcja: 214 nm

Kolumna: Stalowa kolumna HPLC, średnica 1 cm, wysokość wypełnienia 12,5 cm

Materiał kolumny: Pharmacia Source RPC 15 pm

Sprzęt: BioCAD 250, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt

Bufor A: 0,1% kwas trójfluorooctowy w wodzie

Bufor B: 80% acetonitryl w A Gradient: 0% B do 100% B w 200 ml

Eluat zbiera się w 4 ml frakcjach.

Dalszy przebieg charakterystyki jak w przykładzie 1.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób określania stanu organizmu drogą pomiaru peptydów w próbce z organizmu, która zawiera wysoko- i niskocząsteczkowe peptydy, jako wskaźnika stanu organizmu, znamienny tym, że

- niskocząsteczkowe peptydy określa się i charakteryzuje bezpośrednio, i

- odnosi do wzorca.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbka jest próbką tkanki lub płynu z organizmu albo samym organizmem albo ich połączeniami.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że niskocząsteczkowe peptydy, które wykorzystuje się do pomiaru, mają masę cząsteczkową najwyżej 30000.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że niskocząsteczkowe peptydy, które wykorzystuje się do pomiaru, mają masę cząsteczkową, która co najmniej odpowiada masie cząsteczkowej dwupeptydów.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że niskocząsteczkowe peptydy, które wykorzystuje się do pomiaru, mają masę cząsteczkową od 100 do 10000.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przed pomiarem niskocząsteczkowych peptydów, wielkocząsteczkowe peptydy oddziela się albo nie uwzględnia się ich pod względem pomiaru lub oceny przy określaniu próbki.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że określanie niskocząsteczkowych peptydów prowadzi się drogą spektroskopii masowej.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że niskocząsteczkowe peptydy charakteryzuje się drogą pomiaru ich mas cząsteczkowych.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 8, znamienny tym, że próbkę przed pomiarem niskocząsteczkowych peptydów dzieli się na różne frakcje i mierzy je w różnych warunkach.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako organizm stosuje się prokarionty, eukarionty, organizmy wielokomórkowe oraz komórki z kultur tkankowych od zwierząt i ludzi.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że próbka pochodzi z genetycznie modyfikowanych albo przekształconych i ewentualnie kondycjonowanych organizmów.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób określania stanu organizmu drogą pomiaru peptydów w próbce z organizmu.

Do określania stanu organizmu stosuje się różne metody analityczne. Na przykład w diagnostyce wyższych organizmów, w przypadku patologicznych wyników badań, próbuje się na podstawie objawów ustalić przyczynę zmiany patologicznej celem opracowania właściwej terapii. Poza tym czynione są wysiłki, aby przez ustalenie sekwencji genomów organizmów i ustalenie genomu typu dzikiego, opracować wzorzec przeciętnego „zdrowego” organizmu, aby następnie przeprowadzając odpowiednie analizy genowe, wykryć indywidualne odchylenia, które mogłyby wskazywać na możliwy patogenny rozwój. Niedogodność pierwszego metodologicznego podejścia polega na tym, że nie można przeprowadzić żadnej diagnostyki, bez konieczności odwoływania się do hipotezy, ponieważ podejmuje się diagnozę, która już opiera się na przypuszczeniach. Niedogodność drugiego sposobu polega na tym, że w dłuższym okresie czasu nie jest możliwe diagnozowanie ważnych lub nawet wszystkich chorób związanych z genetycznymi zaburzeniami czynności. Dalsza niedogodność ostatniej wymienionej metody może polegać także na tym, że mutacja w jednym genie nie musi bezwarunkowo prowadzić do ekspresji związanego z nią fenotypu.

186 810

Stąd jest pożądane posiadanie do dyspozycji metody diagnostycznej dającej się uniwersalnie stosować, za pomocą której udałoby się uniknąć wymienionych niedogodności, a zwłaszcza możliwe byłoby przeprowadzenie diagnostyki bez konieczności odwoływania się do hipotezy. Powinna być poza tym możliwość uniwersalnego zastosowania metody diagnostycznej, nie powinna być ona ograniczona do wyżej rozwiniętych układów, lecz także do ustalania stanu niższych organizmów. Ponadto powinna być łatwa do ustawienia i do przeprowadzenia znanymi sposobami.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie takiego sposobu.

Niespodziewanie problem techniczny leżący u podstaw niniejszego wynalazku rozwiązano prosto sposobem według wynalazku.