KR20200028510A - 화학요법 표적에 대한 srm 검정 - Google Patents

Abstract

ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 변형된 형태의 개시된 특정 단백질을 측정하여, 선택된 반응 모니터링(SRM)/다중 반응 모니터링(MRM) 질량 분광법에 의해 화학요법의 표적인 단백질의 정량적 분석. 이들 펩타이드는, 그것의 변형된 형태가 아미노산 서열 내 인산화된 티로신, 트레오닌, 세린 및/또는 다른 아미노산 잔기를 포함하면, 정량화될 수 있다. 포르말린에서 고정되었던 생물학적 샘플이 분석을 위해 사용된다.

Description

화학요법 표적에 대한 SRM 검정{SRM ASSAYS TO CHEMOTHERAPY TARGETS}

본 출원은 2014년 7월 1일자로 출원된 가출원 제62/019,830호에 대한 우선권을 주장하고 상기 우선권은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.

서론

암은 성장하고 분열하는 세포를 사멸시키고 다양한 방식으로 기능하는 치료학적 제제의 수거물로 치료한다. 통상의 치료학적 제제의 수거물은 개별적으로 또는 조합하여 수십년 동안 사용되어 왔고, 상기 통상의 제제의 수거물은 임상 종양학 수행에서 통상적이고 일상적인 암 치료가 되었다. 이들 통상의 화학치료학적 제제는 대부분의 암 세포의 주요 성질 중 하나인 신속하게 분열하는 모든 세포를 사멸시킴에 의해 작용한다. 상기 제제는 직접적으로 DNA를 손상시키는 알킬화제; 미소관 형성을 차단하는 탁산; DNA 및 RNA 복제를 방해하는 항대사물; DNA 복제에 관여하는 효소를 방해하는 안트라사이클린 (항-종양 항생제); DNA 복제를 차단하는 토포이소머라제 억제제; 효소가 세포 생식을 위해 요구되는 단백질을 제조하지 못하도록 하는 천연 생성물로부터 유래된 알칼로이드 및 다른 화합물; DNA 복구 및/또는 DNA 합성을 억제하도록 DNA의 가교결합을 유발하는 백금계 약물을 포함한다. 화학요법 제제의 이들 그룹은 본래에 이들의 표적화 작용 방식이 거의 알려져 있지 않은 암 세포의 성장을 억제하기 위해 이들의 기본 기능을 기반으로 개발되었다. 이들은 공지된 단백질을 특이적으로 표적화하여 이를 직접 억제하기 위해 개발되지 않았기 때문에 이들 제제는 역사적으로, "표적화된" 암 치료학적 제제로 고려되지 않았다. 그러나, 이들 제제 그룹의 각각의 개발 및 생화학적 기능이 널리 이해되고 있기 때문에 각각은 특이적 단백질, 효소 또는 핵산에 대해 "표적화된" 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 화학요법 제제의 "표적"은 또한 널리 이해되고 있고 따라서 소정의 암에 대해 가장 효과적인 화학요법 제제는 상기 암에서 이들 특이적 "표적"의 존재 또는 부재를 기반으로 선택될 수 있다. 이들 제제가 이들의 표적에 대해 효과를 갖는지를 예측할 수 있는 특이적 바이오마커가 존재한다. 이러한 구현예는 환자-유래된 생물학적 샘플에서 직접적으로 화학요법의 이들 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 검정하기 위한 특이적 방식을 기재한다.

암 치료요법에 대해 표적화된 방법은, 하나 이상의 특이적 표적 단백질이 어느 치료학적 제제 또는 제제들이 암의 성장을 억제하여 암을 치료하기 위해 사용되어야만 하는지에 관한 지시를 제공하는 경우 가장 유리하다. 상기 구현예는, 암 치료요법에 대해 개선된 치료 결정을 위해 암 환자 기원의 환자-유래 생물학적 샘플에서 화학요법의 어느 단백질 지시가 발현되거나, 과발현되거나, 직접적으로 발현되지 않는지를 정량적으로 결정하기 위해 유용한 하나 이상의 SRM/MRM 검정에 사용하기 위한 펩타이드들 및 펩타이드 서열을 제공한다.

요약

하기의 단백질의 서브서열로부터 유래된 특이적 펩타이드가 제공된다: ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및 TOPO2A. ENT1은 또한 평형적 뉴클레오사이드 수송체 1 단백질로서 공지되어 있고 본원에서 ENT1로 언급된다. ERCC1은 또한 DNA 절단 복구 단백질 ERCC-1로서 공지되어 있고 본원에서 ERCC 1로서 언급된다. FOLR1은 또한 폴레이트 수용체 알파로서 공지되어 있고 본원에서 FOLR1로 언급된다. RRM1은 또한 리보뉴클레오사이드-디포스페이트 리덕타제 대형 서브유니트로서 공지되어 있고 본원에서 RRM1로 언급된다. TUBB3은 또한 튜불린 베타-3 쇄 단백질로서 공지되어 있고 본원에서 TUBB3으로 언급된다. TOPO1은 또한 DNA 토포이소머라제 1로서 공지되어 있고 본원에서 TOPO1로 언급된다. TOPO2A는 또한 DNA 토포이소머라제 2 알파로서 공지되어 있고 본원에서 TOPO2A로 언급된다.

단백질로부터 유래된 각각의 펩타이드에 대한 펩타이드 서열 및 단편화/전이 이온은 이후 SRM/MRM 검정(들)로 언급되는 다중 반응 모니터링(MRM) 검정(들)으로서도 언급될 수 있는, 질량 분광측정 기반 선택된 반응 모니터링(SRM) 검정(들)에서 특히 유용하다. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및 TOPO2A 단백질 및 이들 단백질의 이소형의 정량적 SRM/MRM 분석을 위한 펩타이드의 용도가 기재된다.

1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 또는 6개의 SRM/MRM 검정(들)을 사용하여 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 특이적 펩타이드 중 하나 이상의 존재를 검출하고 이들의 상대적 또는 절대적 정량 수준을 측정할 수 있고, 따라서 질량 분광측정기에 의해 생물학적 샘플로부터 수득된 소정의 단백질 제제에서 상기 단백질 각각의 총량을 측정하는 수단을 제공할 수 있다. 상기 단백질 기원의 모든 가용한 펩타이드 전부 또는 일부는 또한 단일 SRM/MRM 검정에서 동시에 분석될 수 있거나 개별 SRM/MRM 검정의 임의의 조합으로 분석될 수 있다. 펩타이드 각각은 생물학적 샘플로부터 수득된 소정의 단백질 제제에서 각각의 상응하는 단백질들의 총량을 질량 분광측정기에 의해 측정하는 잠재적인 수단을 제공한다.

보다 구체적으로, 본원에 기재된 SRM/MRM 검정(들)은 포르말린 고정된 암 환자 조직(예를 들어, 절개된 종양 및 생검)과 같은 환자 조직 샘플로부터 어렵게 수득된 세포로부터 제조된 복합 단백질 용해 샘플에서 직접 상기 펩타이드를 측정할 수 있다. 포르말린 고정된 조직으로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법은 미국 특허 번호 제7,473,532호에 기재되어 있고, 이의 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 상기 환자에서 기재된 방법은 제조원 (Expression Pathology Inc. (Rockville, MD))으로부터 가용한 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 간편하게 수행될 수 있다.

암 환자로부터 수술적으로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 병리 수행에서 수용되는 통상적인 것이다. 결과로서, 포름알데하이드/포르말린 고정된 파라핀 매립된 조직은 상기 환자로부터 기원하는 가장 광범위하게 가용한 형태의 조직이다. 포름알데하이드/포르말린 고정은 전형적으로 본원에서 포르말린으로서 언급되는 포름알데하이드의 수용액을 사용한다. "100%" 포르말린은 소량의 안정화제, 일반적으로 산화 및 중합도를 제한하기 위한 메탄올과 함께,물 중에서 포화된 용액의 포름알데하이드(약 40용적%의 포름알데하이드 또는 37질량%)로 이루어진다. 조직이 보존되는 가장 통상적인 방법은 수성 포름알데하이드, 통상적으로 10% 중성 완충된 포르말린으로 호칭되는 수성 포름알데하이드 중에서 연장된 기간 (8시간 내지 48시간) 동안 전체 조직을 적시고 고정된 전체 조직을 실온에서 장기 저장 동안 파라핀 왁스 중에 매립시키는 것이다. 따라서, 포르말린 고정된 암 조직을 분석하기 위한 분자 분석 방법이 암 환자 조직의 분석을위해 대부분 수용되고 과도하게 활용되는 방법이다.

SRM/MRM 검정(들)로부터의 결과는 환자, 또는 조직(생물학적 샘플)이 수거되고 보존되는 대상체의 특정 조직 샘플 (예를 들어, 암 조직 샘플) 내에서 상기 단백질의 잠재적인 이소형의 정확하고 정밀한 정량적 수준 뿐만 아니라 임의의 또는 모든 상기 단백질의 정확하고 정밀한 정량적 수준을 서로 관련시키기 위해 사용될 수 있다. 이것은 암에 대한 진단학적 정보를 제공할 뿐만 아니라 담당의 또는 다른 의학적 전문의가 환자 또는 대상체에 대해 적당한 치료요법을 결정할 수 있도록 해준다. 환부 조직에서 또는 또 다른 환자/대상체 샘플에서 단백질 발현 수준에 대하여 진단학적으로 그리고 치료학적으로 중요한 정보를 제공하는 상기 검정은 동반 진단학적 검정으로 호칭된다. 예를 들어, 상기 검정은 암의 단계, 정도 또는 조직학을 진단하고 어느 치료학적 제제가 환자 또는 대상체에게 가장 가능하게 응답할지의 결정을 유도하는, 암 세포의 성장을 중단시키는데 가장 효과적인 치료학적 제제를 결정하도록 디자인될 수 있다. 보다 구체적으로, 환자 기원의 암 세포에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 검출 및/또는 정량은 어느 치료 용법 또는 용법들이 수행되어야만 하는지를 지시할 수 있는 단백질을 제공할 수 있다.

상세한 설명

본원에 기재된 검정은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질을 포함하는 단백질 기원의 특정 변형되지 않은 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 정량하거나 측정하고 또한 상기 단백질 기원의 특정 변형된 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정할 수 있다. 변형의 예는 펩타이드 상에 존재하는 인산화된 아미노산 잔기들 및 당화된 아미노산 잔기들을 포함한다. 단백질들 및 단백질 이소형의 상대적 정량적 수준은 SRM/MRM 방법에 의해, 예를 들어, SRM/MRM 시그니처 피크 면적(예를 들어, 시그니처 피크 면적 또는 통합된 단편 이온 강도)을 비교함에 의해 결정될 수 있다. 개별 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드의 상대적 수준은 상이한 샘플 (예를 들어, 대조군 샘플 및 환자의 또는 대상체의 조직으로부터 제조된 샘플)에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 각각의 펩타이드가 이들 자체의 특이적 SRM/MRM 시그니처 피크를 갖는 경우 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 시그니처 펩타이드 중 하나 이상에 대한 다중 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 비교할 수 있다. 피크 면적을 비교함에 의해 하나의 생물학적 샘플에서 또는 하나 이상의 추가의 또는 상이한 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 및 잠재적인 단백질 이소형 함량의 상대적 수준을 결정할 수 있다. 상기 방식으로, 상기 단백질로부터 기원하는 특정 펩타이드 또는 펩타이드들의 상대적 양 및 따라서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질, 및 이들의 잠재적인 이소형의 상대적 양은 동일한 실험적 조건하에서 다수의 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상) 생물학적 샘플에 걸쳐 결정될 수 있다. 추가로, 상대적 정량은 단일 샘플 내에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 소정의 펩타이드 또는 펩타이드들에 대해 결정될 수 있고, 이는 SRM/MRM 방법에 의해, 상기 펩타이드에 대한 시그니처 피크 면적을, 상기 생물학적 샘플로부터 기원하는 동일한 단백질 제제 내에 상이한 단백질 또는 단백질들로부터 기원하는 또 다른 상이한 펩타이드 또는 펩타이드들에 대한 시그니처 피크 면적과 비교함에 의해 결정될 수 있다. 상기 방법을 사용하여, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 특정 펩타이드의 양 및 따라서 상응하는 단백질 및 이들의 잠재적인 이소형 각각의 양은 동일한 샘플 내 또는 상이한 샘플에서 서로 상대적으로 결정될 수 있다. 개별 펩타이드 또는 펩타이드들의 상대적 정량은 샘플 내 또는 샘플 간의 또 다른 펩타이드 또는 펩타이드들의 양에 상대적으로 수행될 수 있기 때문에 생물학적 샘플에서 단백질의 절대적 중량 대 용적 또는 중량 대 중량과는 상관 없이 존재하는 펩타이드의 상대적 양을 결정할 수 있다 (예를 들어, 피크 면적을 결정하는 것은 서로 상대적인 것이다). 따라서, 생물학적 샘플로부터 기원하는 단백질 제제에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드의 양을 사용하여 다양한 샘플에서 및 이들 중에서의 이들 단백질의 양을 결정할 수 있다. 상이한 샘플 간의 개별 시그니처 피크 면적에 대한 상대적 정량 데이터는 일반적으로 샘플당 분석되는 단백질의 양으로 표준화된다 (예를 들어, 분석되는 샘플의 총 단백질 농도 및 용적은 샘플을 표준화하기 위해 사용된다). 상대적 정량은 단일 샘플 내에서 다수의 단백질 및 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질(들)로부터 기원하는 많은 펩타이드에 걸쳐 동시에 수행되고/되거나 다른 펩타이드/단백질과 관련된 상대적 단백질 양, 하나의 펩타이드/단백질로의 추가의 통찰력을 수득할 수 있다.

ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 절대적 정량 수준은 예를 들어, SRM/MRM 방법에 의해 결정하고 하나의 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 개별 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 공지된 양으로 샘플에서 "스파이크된" 하나 이상의 내부 표준(예를 들어, 동위원소 표지된 표준)의 공지된 양의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교한다. 하나의 구현예에서, 내부 표준은 하나 이상의 중동위원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를함유하는 동일하게 정확한 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드의 합성 버젼이다. 상기 동위원소 표지된 내부 표준은 질량 분광측정기로 분석되는 경우, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드 시그니처 피크와는 상이하고 독특하며 비교인자 피크로서 사용될 수 있는 예측가능하고 일관된 SRM/MRM 시그니처 피크가 생성되도록 합성된다. 따라서, 내부 표준이 공지된 양으로, 공지된 양의 생물학적 샘플 기원의 단백질 또는 펩타이드 제제로 스파이크되고 질량 분광측정기에 의해 분석되는 경우, 본래의 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교될 수 있다. 상기 수치적 비교는 상응하는 단백질의 농도 또는 중량이 결정될 수 있는 생물학적 샘플 기원의본래의 단백질 제제에 존재하는 본래의 펩타이드의 절대 몰농도 및/또는 절대 중량의 계산을 가능하게 한다. 단편 펩타이드에 대한 절대적 정량 데이터는 전형적으로 샘플당 분석되는 단백질의 양에 따라 나타낸다. 절대적 정량은 많은 펩타이드에 걸쳐 수행될 수 있고, 이는 개별 생물학적 샘플 및/또는 개별 샘플들의 전체 코호트에서 절대 단백질 양으로의 통찰을 수득하기 위해 단일 샘플에서 및/또는 다중 샘플에 걸쳐 동시에 다수의 단백질(예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개 등)의 정량적 결정을 가능하게 한다. 하나의 구현예에서, 단백질의 정량은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 펩타이드 표준을 사용하여 수행될 수 있다[문헌참조: Gygi et al in U.S. Patent 7,501,286].

본원에 사용된 바와 같은 용어 정량한다, 정량하는, 측정한다 또는 측정하는은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 표준(예를 들어, 내부 표준)과 같은 분석물의 상대적 또는 절대적 수준을 측정함을 의미한다. 본원에 기재된 검정 방법은 예를 들어, 환자 유래되거나 대상체 유래된 조직, 예를 들어, 포르말린 고정된 조직을 사용하는 경우 암의 단계를 결정하기 위한 보조 수단으로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 SRM/MRM 검정은 또한 어느 치료학적 제제가 상기 환자 또는 대상체를 치료하는데 사용하기 위해 가장 유리할 것인지를 결정하는데 있어서 보조 수단으로서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 암과 관련된 단백질의 수준을 조사하기 위해, 암 조직 또는 전부 또는 일부 종양의수술적 제거 또는 의심되는 질환의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 수행되는 생검 과정을 통해 환자 또는 대상체로부터 제거된 암 조직 또는 암인 것으로 의심되는 조직에 대해서 분석이 수행될 수 있다. 조직의 샘플은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질(들) 중 하나 이상 및 상기 단백질 중 어느 형태가 환자 또는 대상체의 조직에 존재하는지를 결정하기 위해 분석된다. 더욱이, 상기 단백질 중 하나 이상의 발현 수준이 결정될 수 있고 건강한 조직에서 발견되는 "정상" 또는 참조 수준과 비교될 수 있다. 건강한 조직에서 발견되는 단백질의 정상 또는 참조 수준은 예를 들어, 암을 갖지 않는 하나 이상의 개체의 관련 조직으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 정상 또는 표준 수준은 암에 의해 영향받지 않는 관련 조직 (예를 들어, 동일 기관의 일부)의 분석에 의해 암을 갖는 개체에 대해 수득될 수 있다.

단백질 또는 펩타이드의 수준 또는 양은 SRM/MRM 검정에 의해 결정되는 단백질 또는 펩타이드의 몰, 질량 또는 중량으로 표현되는 양으로서 정의될 수 있다. 상기 수준 또는 양은 분석된 용해물 중에 단백질 또는 또 다른 성분의 총 수준 또는 양 (예를 들어, 단백질의 마이크로몰/마이크로그램 또는 단백질의 마이크로그램/마이크로그램으로 표현됨)으로 표준화될 수 있거나 심지어 중량 기준 당 DNA의 양 (예를 들어, DNA의 마이크로몰 또는 마이크로그램스/마이크로그램)으로 표준화될 수 있다. 추가로, 단백질 또는 펩타이드의 수준 또는 양은 예를 들어, 마이크로몰 또는 나노그램/마이크로리터로 표현되는 용적 기준으로 결정될 수 있다. SRM/MRM 검정에 의해 결정된 바와 같은 단백질 또는 펩타이드의 수준 또는 양은 또한 분석된세포의 수로 표준화될 수 있다. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질, 및 이들 단백질의 이소형에 관한 정보를 사용하여 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 및 이의 이소형 또는 단편 펩타이드의 수준을 정상 조직에서 관찰되는 수준과 상호 관련시키거나 비교함에 의해 암의 조직학적 단계 또는 등급을 결정하는 것을 보조할 수 있다. 일단 암의 조직학적 단계 및/또는 등급 및/또는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질-발현 특성이 결정되면, 상기 정보는 예를 들어, 하기 분석된 단백질 또는 단백질(들)의 비정상적 발현을 특징으로 하는 암 조직을 특이적으로 치료하기 위해 개발된 치료학적(화학적 및 생물학적) 제제의 목록과 일치시킬 수 있다 (예를 들어, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A). 특정 개체 기원의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 검정으로부터의 정보를 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질(들)을 발현하는 세포들/조직을 특이적으로 표적화하는 치료학적 제제의 목록과 일치시키는 것은 암을 치료하기 위한 개인화된 의약 방법을 나타낸다. 본원에 기재된 검정 방법은 진단학적 및 치료 결정을 위한 공급원으로서 환자 또는 대상체 자체조직 기원의 단백질의 분석을 사용함에 의해 개인화된 의약 방법의 기초를 형성한다.

펩타이드 제조

원칙적으로, 공지된 특이성을 갖는 임의의 단백질분해 공정에 의해 제조된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 유래된 임의의 예측된 펩타이드는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 풍부함을 결정하기 위한 대용 리포터로서 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플은 공지된 특이성을 갖는 프로테아제 또는 프로테아제들(예를 들어, 트립신 및/또는 엔도프로테이나제 Lys-C 중 하나 이상)로 분해시킨다. 단백질용해 처리로부터 비롯된 하나 이상의 펩타이드는 질량 분광측정기 기반 SRM/MRM 검정과같은 적합한 검정에서 하나 이상의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 풍부함을 결정하기 위한 대용 리포터로서 사용될 수 있다,. 유사하게, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에서 변형되는 것으로 공지된 부위에서 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 예측된 펩타이드 서열은 또한 샘플 내에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 변형 정도를 검정하기 위해 사용될 수 있다.

ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단편 펩타이드들은 미국 특허 제7,473,532호에 제공된 Liquid Tissue™ 프로토콜의 사용을 포함하는 다양한 수단에 의해 생산될 수 있다. Liquid Tissue™ 프로토콜 및 시약은 조직/생물학적 샘플에서 단백질의 단백질용해 분해에 의해 포르말린 고정된 파라핀 매립된 조직으로부터의 질량 분광측정 분석에 대해 적합한 펩타이드 샘플을 제조할 수 있다. Liquid Tissue™ 프로토콜에서, 조직/생물학적 샘플은 단백질 가교 결합을 역전시키거나 방출하기위해, 연장된 기간 동안 완충제에서 승온(예를 들어, 약 10분 내지 약 4시간의 기간 동안 약 80 ℃ 내지 약 100 ℃)에서 유지시킨다. 사용되는 완충제는 중성 완충제 (예를 들어, 트리스-기반 완충제, 또는 세제를 함유하는 완충제)이고 유리하게는 질량 분광측정 분석을 방해하지 않는 완충제이다. 이어서, 조직/생물학적 샘플은 상기 생물학적 샘플의 조직 및 세포 구조를 파괴시키고 상기 샘플을 액화시키기에 충분한 시간 동안 (예를 들어, 약 37 ℃ 내지 약 65 ℃ 의 온도에서 약 30분 내지 약 24시간 기간) 하나 이상의 프로테아제로 처리하고, 상기 프로테아제는 트립신, 키모트립신, 펩신, 및 엔도프로테이나제 Lys-C를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가열 및 단백질용해 결과는 액체, 가용성, 희석가능한 생분자 용해물이다. 하나의 구현예의 세트에서, 트립신, 키모트립신, 펩신 및 엔도프로테이나제 Lys-C로부터 선택된 2개 이상의 프로테아제는 생물학적 샘플의 단백질용해 처리에 사용된다.

펩타이드 분리 및 검정

일단 용해물이 제조되면, 샘플 중의 펩타이드는 이들의 분석 및 측정(정량)을 촉진시키는 다양한기술에 적용될 수 있다. 분석이 질량 분광측정기에 의해 수행되는 경우, 하나 이상의 크로마토그래프 방법은 상기 분석을촉진시키기 위해 사용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 상기 펩타이드는 질량 분광측정기 장치에 의한 분석 전에 액체 크로마토그래피(LC)에 의해 분리된다. 예를 들어, 펩타이드는 Jupiter Proteo 90Å C12, 4μm 수지 (Phenomenex, Torrance, CA)와 함께 12cm의 베드 길이로 자가 팩킹된 PicoFrit (100μm ID/10μm tip ID, New Objective) 칼럼을 사용하여 nanoAcquityLC 시스템 (Waters, Milford, MA) 또는 EASY-nLC II (Thermo Scientific, San Jose, CA) 상에서 분리될 수 있다. 펩타이드는 0.1% 포름산을 함유하는 1% 내지 50%의 아세토니트릴의 12분 크로마토그래피 농도구배 상에서 그리고 800nL./분의 유속에서 용출시킬 수 있다. 액체 크로마토그래피에 의해 일단 분리되면, 용출된 펩타이드는 분석을 위해 질량 분광측정기로지시된다. 하나의 구현예에서, 질량 분광측정기는 나노분무 공급원을 장착한다.

또 다른 구현예에서, 상기 펩타이드는 예를 들어, 면역학적-기반 정제 (예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피), 이온-선택적 배지 상의 크로마토그래피와 같은 친화성 기술에 의해 분리될 수 있거나, 상기 펩타이드가 변형되는 경우, 탄수화물 변형된 펩타이드의 분리를 위한 렉틴과 같은 적당한 배지를 사용하는 분리에 의해 분리될 수 있다. 여전히 또 다른 구현예에서, 질량 분광측정 분석 전에 펩타이드의 면역학적 분리를 사용하는 SISCAPA 방법이 사용된다. SISCAPA 기술은 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 제7,632,686호. 여전히 다른 구현예에서, 렉틴 친화성 방법 (예를 들어, 친화성 정제 및/또는 크로마토그래피)을 사용하여 질량 분광측정기에 의한 분석 전에 용해물로부터 펩타이드를 분리시킬 수 있다. 렉틴-기반 방법을 포함하는 펩타이드 그룹을 분리하기 위한 방법은 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Geng et al., J. Chromatography B, 752:293-306 (2001). 면역친화성 크로마토그래피 기술, 렉틴 친화성 기술 및 다른 형태의 친화성 분리 및/또는 크로마토그래피(예를 들어, 역상, 크기 기반 분리, 이온 교환)는 질량 분광측정기에 의한 펩타이드의 분석을 촉진시키기 위해 임의의 적합한 조합으로 사용될 수 있다.

놀랍게도, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 많은 잠재적인 펩타이드 서열은 명백하지 않은 이유 때문에 질량 분광측정-기반 SRM/MRM 검정에 사용하기에 적합하지 않거나 비효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 많은 트립신처리 펩타이드는 포르말린 고정된 파라핀 매립된 조직 기원의 Liquid Tissue™ 용해물에서 효율적으로 또는 전혀 검출될 수 없는 것으로 밝혀졌다. MRM/SRM 검정용으로 가장 적합한 펩타이드를 예측할 수 없기 때문에, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에 대한 신임할 수 있고 정확한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 실제 Liquid Tissue™ 용해물에서 변형되고 비변형된 펩타이드를 실험적으로 동정할 필요성이 있었다. 임의의 이론에 구애받지 않으면서, 일부 펩타이드는 예를 들어, 이들이 잘 이온화하지 못하거나 다른 단백질과 구분되는 단편을 생성하지 못하기 때문에 질량 분광측정기에 의해 검출하기 어려울 수 있고 펩타이드는 또한 분리 (예를 들어, 액체 크로마토그래피)시 양호한 분해능을 가질 수 없거나 유리 또는 플라스틱 웨어에 부착될 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 포르말린 고정된 조직 샘플로부터 제조된 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출될 수 있는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 이들 펩타이드들 (예를 들어, 표 1 및 2에서의 펩타이드들)은 SRM/MRM 검정이 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 SRM/MRM 검정에서 사용될 수 있는 펩타이드들이다. 하나의 구현예에서, 단일 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 단편의 동시 제조에 사용되는 프로테아제는 트립신일 것이다.

본원에 기재된 다양한 구현예에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드 (예를 들어, 표 1 및/또는 2)는 포르말린 고정된 암 조직으로부터 어렵게 수득된 세포로부터 제조된 복합 Liquid Tissue™ 용해물 내 모든 단백질의 트립신 분해에 의해 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 유래하였다. 달리 주지되지 않는 경우, 각각의 경우에 프로테아제는 트립신이다. 이어서, Liquid Tissue™ 용해물은 질량 분광측정기로 분석하여, 질량 분광측정기에 의해 검출되고 분석되는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 유래된 상기 펩타이드를 결정하였다. 질량 분광측정기 분석을 위해 바람직한 특정 서브세트의 펩타이드의 동정은 1) 단백질 기원의 펩타이드 또는 펩타이드들이 Liquid Tissue™ 용해물의 질량 분광측정 분석에서 이온화하는 실험적 결정 및 2) Liquid Tissue™ 용해물을 제조하는데 사용되는 프로토콜 및 실험적 조건으로부터 생존하는 펩타이드의 능력을 기반으로 한다. 상기 후자의 성질은 펩타이드의 아미노산 서열 및 펩타이드내 변형된 아미노산 잔기가 샘플 제조 동안에 변형된 형태에서 생존하는 능력에 대한 것이다.

포르말린 (포름알데하이드) 고정된 조직으로부터 직접 어렵게 수득된 세포로부터의 단백질 용해물은 Liquid Tissue™ 시약 및 조직 미세절개를 통해 샘플 튜브로 세포를 수거함에 이어서 연장된 기간 동안 Liquid Tissue™ 완충제에서 상기 세포를 가열시키는 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 일단, 포르말린-유도된 가교 결합이 음성적으로 영향을 받는 경우, 이어서 조직/세포는 예를 들어, 프로테아제 트립신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 프로테아제를 사용하는 예측가능한 방식으로 완료되도록 분해시킨다. 각각의 단백질 용해물은 상기 프로테아제를 사용하여 온전한 폴리펩타이드를 분해시켜 펩타이드수거물로 전환시킨다. 각각의 Liquid Tissue™ 용해물은 (예를 들어, 이온 포집 질량 분광측정기에 의해) 분석하여 펩타이드의 다중의 범용 프로테오믹 조사를 수행하였고, 여기서, 상기 데이터는 각각의 단백질 용해물에 존재하는 모든 세포 단백질로부터 질량 분광측정기에 의해 동정될 수 있는 많은 펩타이드의 동정에 따라 제공되었다. 단일 복합 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩타이드의 동정을 위해 범용 프로파일링을 수행할 수 있는 이온 포집 질량 분광측정기 또는 또 다른 형태의 질량 분광측정기는 전형적으로 분석을 위해 사용된다. SRM/MRM 검정이 MALDI, 이온 포집 또는 삼중 4중극자를 포함하는, 임의의 유형의 질량 분광측정기 상에서 개발되고 수행될 수 있지만, SRM/MRM 검정을 위해 가장 유리한 장치 플랫폼은 흔히 삼중 4중극자 장치 플랫폼인 것으로 고려된다.

일단 가능한 한 많은 펩타이드들이, 사용되는 조건하에서 단일 용해물의 단일 MS 분석에서 동정되면, 이어서, 펩타이드 목록을 수집하고 이를 사용하여 상기 용해물에서 검출되는 단백질을 결정하였다. 상기 공정은 다중 Liquid Tissue™ 용해물에 대해 반복하였고, 매우 큰 목록의 펩타이드들은 단일데이터세트로 수집하였다. 상기 유형의 데이터세트는 (프로테아제 분해 후) 분석되는 생물학적 샘플 유형 및 상기 생물학적 샘플의 Liquid Tissue™ 용해물에서 특이적으로 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내는 것으로 고려될 수 있고 따라서, 예를 들어, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질과 같은 특이적 단백질에 대한 펩타이드를 포함한다.

하나의 구현예에서, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 트립신처리 펩타이드는 하기 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로서 동정되었다: ENT1 (예를 들어, NCBI 승인 번호: Q99808, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7), ERCC1 (예를 들어, NCBI 승인 번호: P07992, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16,), FOLR1 (예를 들어, NCBI 승인 번호: P15328, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20), RRM1 (예를 들어, NCBI 승인 번호: P23921, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37), TOPO1 (예를 들어, NCBI 승인 번호: P11387, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56. 서열번호 57, 서열번호 58), TOPO2A (예를 들어, NCBI 승인 번호: P11388, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78. 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101) 및/또는 TUBB3 (예를 들어, NCBI 승인 번호: Q13509, 서열번호 102, 서열번호 103), 이의 각각은 표 1에 열거되어 있다. 상기 펩타이드 각각은 포르말린 고정된 파라핀 매립된 조직으로부터 제조된 Liquid Tissue™ 용해물에서 질량 분광측정기에 의해 검출되었다. 따라서, 표 1에서 펩타이드 각각 또는 상기 펩타이드의 임의의 조합 (예를 들어, 표 1에 기재된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 펩타이드들)은 포르말린 고정된 환자 또는 대상체 조직에 직접 포함되는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 검정에 사용하기 위한 후보물이다.

표 1

표 1에 열거된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드는 전립선, 결장 및 유방을 포함하는 상이한 인간 기관의 다중의 상이한 포르말린 고정된 조직의 다중 Liquid Tissue™ 용해물로부터 검출된 것들을 포함한다. 상기 펩타이드 각각은 포르말린 고정된 조직에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 정량적 SRM/MRM 검정을 위해 유용한 것으로 고려된다. 이들 실험의 추가의 데이터 분석은 어떠한 선호도가 임의의 특정 기관 부위로부터 기원하는 임의의 특이적 펩타이드에 대해 관찰되지 않음을 지적했다. 따라서, 이들 펩타이드 각각은 임의의 생물학적 샘플 또는 체내 임의의 기관 부위로부터 기원하는 임의의 포르말린 고정된 조직 기원의 Liquid Tissue™ 용해물에 대한 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 SRM/MRM 검정을 수행하기 위해 적합한 것으로 사료된다.

또 다른 구현예에서, SRM/MRM 검정은 TOPO2A 및 TOPO1 각각에 대한 1개 또는 2개의 펩타이드(예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드로부터)를 사용한다. 또 다른 구현예에서, SRM/MRM 검정은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1 및/또는 TUBB3 각각에 대한 1개 또는 2개의 펩타이드 (예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드로부터)를 사용한다.

다른 구현예에서, ENT1 및 ERCC1 단백질 중 하나 또는 둘다가 분석되고 FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 1개, 2개, 3개 또는 4개가 SRM/MRM 검정(들)을 사용하여 검정된다. 상기 구현예의 하나의 일례에서, FOLR1, RRM1 단백질의 하나 또는 둘다에 대한 적어도 하나의 펩타이드 또는 적어도 2개의 펩타이드는 SRM/MRM 검정에 의해 검정되고(예를 들어, 표 1에 열거된 FOLR1, RRM1 펩타이드); ENT1, ERCC1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A의 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개에 대한 적어도 하나의 펩타이드 또는 적어도 2개의 펩타이드가 검정된다 (예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드). 상기 구현예의 또 다른 일례에서: ENT 및 PRM1 단백질 중 하나 또는 둘다에 대한 적어도 하나 또는 적어도 2개의 펩타이드는 SRM/MRM 검정에 의해 검정되고 (예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드); 임의의 ERCC1, FOLR1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A의 적어도 하나 또는 적어도 2개의 펩타이드가 검정된다 (예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드). 동위원소로 표지되지만 이들 구현예의 어느 하나에 제시된 하나 이상의 펩타이드와 동일한 펩타이드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되고 이들의 제제 용도, 특히 질량 분광측정 표준으로서 사용하기 위한 용도가 하기에 기재된다.

하나의 구현예에서, 표 1 중 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 펩타이드의 임의의 조합 (예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상)은 하기의 면역학적 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 질량 분광측정에 의존하지 않는 방법에 의해 검정된다(예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA). 하나의 구현예에서, 상기 검정은 포르말린 고정된 조직을 사용하여 수행된다. 펩타이드(들)의 양 (절대적 또는 상대적)과 관련된 정보가 어떻게 수득되는지에 상관 없이, 상기 정보는 본원에 기재된 방법들 중 어느 하나에 사용될 수 있고, 상기 방법은 환자 또는 대상체에서 암의 존재를 지시(진단)하거나, 암의 단계/등급/상태를 결정하거나, 예후를 제공하거나, 환자 또는 대상체에 대한 치료제 또는 치료 용법을 결정함을 포함한다.

다른 구현예에서, ENT1 및 ERCC1 단백질의 하나 또는 둘다가 검정되고 FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 1개, 2개, 3개 또는 4개는 하기 면역학적 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 질량 분광측정에 의존하지 않는 방법에 의해 검정된다 (예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA). 상기 구현예의 하나의 일례에서: ENT1 및 ERCC1 단백질 중 하나 또는 둘다에 대해 적어도 1개 또는 적어도 2개의 펩타이드가 분석되고(예를 들어, 표 1에 열거된 ENT1 및 ERCC1 펩타이드); FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개에 대한 적어도 1개 또는 적어도 2개의 펩타이드가 분석된다(예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드). 상기 구현예의 또 다른 일례에서: FOLR1 및 RRM1 ?백질 중 하나 또는 둘다에 대해 적어도 1개 또는 적어도 2개의 펩타이드가 검정되고 (예를 들어, 표 1에 열거된 FOLR1 및 RRM1 펩타이드); 임의의 ENT1, ERCC1, TUBB3, TOPO1, 및 TOPO2A 단백질에 대해 적어도 1개 또는 적어도 2개의 펩타이드가 검정된다 (예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드).

SRM/MRM 검정을 수행하는 경우 중요한 고려 사항은 펩타이드의 분석에 사용될 수 있는 장비의유형이다. SRM/MRM 검정이 MALDI, 이온 포집 또는 삼중 4중극자를 포함하는 임의의 유형의 질량 분광측정기에 대해 개발될 수 있고 수행될 수 있지만, 현재 SRM/MRM 검정을 위해 가장 유리한 장비 플랫폼은 흔히 삼중 4중극자 장비 플랫폼인 것으로 고려된다. 상기 유형의 질량 분광측정기는 세포 내에 함유된 모든 단백질 기원의 수십만 내지 수백만개의 개별 펩타이드로 이루어 질 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 내 단일의 단리된 표적 펩타이드를 분석하기 위해 가장 적합한 장비인 것으로 고려될 수 있다.

ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 유래된 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 가장 효율적으로 수행하기 위해 상기 분석에서 펩타이드 서열 뿐만 아니라 정보를 활용하는 것이 요구될 수 있다. 상기 추가의 정보는 검정이 효과적으로 수행될 수 있도록 특이적 표적화된 펩타이드(들)의 올바르고 집중된 분석을 수행하기 위해 질량 분광측정기 (예를 들어 삼중 4중극자 질량 분광측정기)를 명령하고 지시하는데 사용될 수 있다.

일반적으로 표적 펩타이드에 대한 그리고 특이적 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드에 대한 추가의 정보는 각각의 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온 및 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 1개, 2개, 3개, 4개 이상을 포함할 수 있다. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 사용될 수 있는 추가의 펩타이드 정보는 표 1의 목록으로부터 기원하는 열두개(12)의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드들에 대해 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같은 펩타이드에 대해 기재된 상기 추가의 정보는 제조되고, 수득되고, 다른 프로테아제 또는 프로테아제의 조합(예를 들어, 트립신 및/또는 Lys C)의 작용에 의해 생성된 것들을 포함하는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 임의의 다른 펩타이드의 분석에 적용될 수 있다.

표 2

일부 구현예에서, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 검정을 위해 적합한 펩타이드들 (예를 들어, 표 1에 제시되고 서열번호 1-103으로 나타낸 펩타이드들)은 절단되는 경우 서브-펩타이드를 생성하는 펩타이드 서열 내부에 추가의 단백질용해 부위를 함유할 수 있다. 상기 서브-펩타이드들은 목적하는 프로테아제의 단백질용해 절단 부위에 대해 동정된 펩타이드의서열을 평가함에 의해 인지될 수 있다. 하나의 구현예에서, 트립신처리 펩타이드들은 트립신에 의한 추가의 절단시 서브-펩타이드들을 유도할 수 있는 추가의 내부 트립신 절단을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 트립신처리 펩타이드들은 트립신, GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 Lys C의 임의의 1개 또는 2개 이상에 의한 절단시 서브펩타이드의 형성을 유도할 수 있는 트립신, GluC, AspN, 키모트립신 및/또는 Lys C를 포함하지만 이에 제한되지 않는 프로테아제에 대한 내부 부위를 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, Lys C 펩타이드들은 GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 트립신의 임의의 1개 또는 2개 이상에 의한 절단시 서브-펩타이드의 형성을 유도할 수 있는 GluC, AspN, 키모트립신 및/또는 트립신과 같은 다른 프로테아제에 대한 내부 부위를 함유할 수 있다. 상기 서브-펩타이드들, 및 서열번호 1 내지 103에 제시된 펩타이드들의 임의의 하나 이상의 특이적으로 트립신, GluC, AspN, 키모트립신 및/또는 LysC 절단 단편들은 상기 기재내용에 제시되고 이의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.

본원에 제시된 구현예는 표 1 및 2에서 하나 이상의 펩타이드들을 포함하는 조성물을 포함하고

동위원소로 표지되지만 다른 한편 표 1 및 2에서 나타낸 하나 이상의 펩타이드들과 동일한 펩타이드를 임의로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 표 1 및 2에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 모든 103개의 펩타이드들을 포함한다. 상기 조성물은 임의로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있고 상기 단백질의 아미노산 서열은 동위원소로 표지되지만 다른 한편 표 1 및 2에 나타낸 하나 이상의 펩타이드들과 동일한 펩타이드들을 포함한다. 표 1 및 2에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 펩타이드들을 포함하는 동위원소 표지된 합성또는 천연 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 사용되는 경우, 프로테아제 처리는 동위원소로 표지되지만 다른 한편 표 1 및 2에서의 펩타이드와 동일한 펩타이드를 방출시킨다.

상기 동위원소로 표지된 생물학적 또는 생합성 펩타이드들은 예를 들어, 동위원소로 표지된 아미노산을 사용하여 프로그램화된 세포 용해물 또는 조직 배양물에서 제조될 수 있다. 동위원소로 표지된 펩타이드들 각각은 하기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 동위원소로 표지될 수 있다: 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합. 동위원소로 표지되거나 표지되지 않든 상관 없이 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 펩타이드들을 포함하는 조성물은 상기 단백질 기원의 모든 펩타이드(예를 들어, 완전한 세트의 트립신처리 펩타이드들)를 함유할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터의 조합의 모든 펩타이드 및 특히 표 1 및 2에 나타낸 모든 펩타이드를 함유하지 않는다. 펩타이드들을 포함하는 조성물은 건조되거나 동결건조된 물질, 액체 (예를 들어, 수성) 용액 또는 현탁액, 어레이 또는 블롯 형태로 존재할 수 있다.

하나의 구현예에서, 특이적 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드에 대한 추가의 정보는 각각의 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온 및 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 Lys C 단백질용해로부터 비롯되는 펩타이드들에 대한 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 특이적 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드들에 대한 추가의 정보는 각각의 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온 및 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 트립신 단백질용해로부터 비롯되는 펩타이드에 대한 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함한다.

여전히 또 다른 구현예에서, 특이적 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드에 대한 추가의 정보는 각각의 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온 및 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 트립신 및/또는 Lys C 단백질용해로부터 비롯되는 펩타이드에 대한 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함한다. 하나의 구현예에서, 관련 추가의 정보와 함께 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 각각으로부터의 단일 트립신 처리 및/또는 Lys C 단백질용해 펩타이드는 진단학적 결정에서 사용된다.

특정 구현예

발명의 특정 구현예는 하기된 바와 같다.

1. 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 질량 분광측정기를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물에서 하나 이상의 변형되고/되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량하고; 상기 샘플에서 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준을 계산함을 포함하고; 상기 양은 상대적 양 또는 절대적 양인, 방법.

2. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량하기 전에 상기 단백질 분해물을 분획화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

3. 구현예 2에 있어서, 상기 분획화 단계가 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체

크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 이루어진그룹으로부터 선택되는, 방법.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물이 Liquid Tissue™ 프로토콜에 의해 제조되는, 방법.

5. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물을 포함하는, 방법.

6. 구현예 5에 있어서, 상기 단백질 분해물이 트립신 및/또는 lys C 분해물을 포함하는, 방법.

7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 질량 분광측정기가 탠덤 질량

분광측정기, 이온 포집 질량 분광측정기, 삼중 4중극자 질량 분광측정기, MALDI-TOF 질량 분광측정기, MALDI 질량 분광측정기, 및/또는 타임 오브 플라이트 질량 분광측정기를 포함하는, 방법.

8. 구현예 7에 있어서, 사용되는 질량 분광측정기 방식이 선택된 반응

모니터링 (SRM), 다중 반응 모니터링 (MRM), 및/또는 다중 선택된 반응 모니터링 (mSRM), 또는 이의 조합인, 방법.

9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56. 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78. 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 및 서열번호 103으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 뇨 샘플, 혈청 샘플, 복수 샘플, 객담 샘플, 림프액, 침샘 샘플, 세포 또는 고체 조직인, 방법.

11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 포르말린 고정된 조직인, 방법.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 파라핀 매립된 조직인, 방법.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 종양으로부터 수득된, 방법.

14. 구현예 13에 있어서, 상기 종양이 1차 종양인, 방법.

15. 구현예 13에 있어서, 상기 종양이 2차 종양인, 방법.

16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형되고/되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드를 정량함을 추가로 포함하는, 방법.

17(a). 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드들을 정량하는 것이 하나의 생물학적 샘플 중에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 약 8 내지 약 45개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 상이하고 별도의 샘플 또는 생물학적 샘플에서 동일한 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양과 비교함을 포함하는, 방법.

17(b). 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 것이 하나의 생물학적 샘플에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56. 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78. 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 및 서열번호 103.

18. 구현예 17(a) 또는 17(b)에 있어서, 하나 이상의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 것이 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함에 의해 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드 각각의 양을 결정함을 포함하고, 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드 각각이 동일한 아미노산 서열을 갖는 부가된 내부 표준 펩타이드와 비교되는, 방법.

19. 구현예 18에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소로 표지된 펩타이드인, 방법.

20. 구현예 19에 있어서, 상기 동위원소로 표지된 내부 표준 펩타이드가 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중동위원소를 포함하는, 방법.

21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 단백질 분해물에서 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량하는 것이 환자 또는 대상체에서 변형되고/되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 존재 및 암과의 연합의 존재를 지적하는, 방법.

22. 구현예 21에 있어서,

하나 이상의 변형되고/되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 양을 검출하고/하거나 정량한 결과를 암의 진단학적 단계/등급/상태와 서로 관련시킴을 추가로 포함하는, 방법.

23. 구현예 22에 있어서, 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 양을 검출하고/하거나 정량하는 결과를 암의 진단학적 단계/등급/상태와 서로 관련시키는 것이 암의 단계/등급/상태에 대한 추가의 정보를 제공하기 위해 멀티플렉스 포맷으로 다른 단백질 기원의 다른 단백질 또는 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량하는 것과 조합되는, 방법.

24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 환자 또는 대상체에 대해 하나 이상의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 존재, 부재 또는 양, 또는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 양을 기준으로 하는 치료를 선택함을 추가로 포함하는, 방법.

25. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득된 환자 또는 대상체에게 치료학적 유효량의 치료학적 제제를 투여함을 추가로 포함하는 방법으로서, 투여되는 치료학적 제제 및/또는 치료학적 제제의 양이 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양 또는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 양을 기준으로 하는, 방법.

26. 구현예 24 또는 25에 있어서, 상기 치료 또는 치료학적 제제가 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질을 발현하는 암 세포로 지시되는, 방법.

27. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 Liquid Tissue™ 프로토콜 및 시약을 사용하여 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 정량하기 위해 가공된 포르말린 고정된 종양 조직인, 방법.

28. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1,ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드가 표 1에서 하나 이상의 펩타이드인, 방법.

29. 표 1에서의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 펩타이드 및/또는 이에 대한 항체를 포함하는 조성물.

30. 구현예 30에 있어서, 표 2의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 펩타이드 또는 이에 대한 항체를 포함하는, 조성물.

예시적 SRM/MRM 검정 방법

하기된 방법이 다음을 위해 사용되었다: 1) ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에 대한 질량 분광측정-기반 SRM/MRM 검정을 위해 사용될 수 있는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 후보 펩타이드를 동정하는 것, 2) ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 표적 펩타이드에 대해 개별 SRM/MRM 검정 또는 검정들을 개발하는 것, 및 3) 정량적 검정을 암 진단 및/또는 최적의 치료요법의 선택에 적용하는 것.

1. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질에 대한 SRM/MRM 후보물 단편 펩타이드의 동정:

a. 단백질을 분해하기 위해 프로테아제 또는 프로테아제들 (트립신을 포함하거나 포함하지 않을 수있는)을 사용하여 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 Liquid Tissue™ 단백질 용해물을 제조한다.

b. 포집 탠덤 질량 분광측정기상에서 Liquid Tissue™ 용해물에서 모든 단백질 단편을 분석하고 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 모든 단편 펩타이드를 동정한다(여기서, 개별 단편 펩타이드는 인산화 또는 당화와 같은 임의의 펩타이드 변형을 함유하지 않는다)

c. 이온 포집 탠덤 질량

분광측정기 상에서 Liquid Tissue™ 용해물에서 모든 단백질 단편을 분석하고 예를 들어, 인산화되거나 당화된 잔기와 같은 펩타이드 변형을 함유하는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1,

TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 모든 단편 펩타이드를 동정한다.

d. 전체 전장의 ENT1,

ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질들로부터 특이적 분해 방법에 의해 생성된 모든 펩타이드는 잠재적으로 측정될 수 있지만 SRM/MRM 검정의 개발을 위해 사용되는 바람직한 펩타이드는 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 제조된 복잡한 Liquid Tissue™ 단백질 용해물에서 직접적으로 질량 분광측정기에 의해 동정되는 것들이다

e. 펩타이드는 환자 또는 대상체 조직에서 특이적으로 변형되고 (인산화된. 당화된 등)

이온화하고, 따라서, 질량 분광측정기에서 검출될 수 있고, 이 경우는

포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 Liquid Tissue™ 용해물을 분석하는 것이 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 펩타이드 변형을 분석하기 위한 후보 펩타이드로서 동정되는 경우이다

2. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 단편 펩타이드에 대한 질량 분광측정 검정

a. 개별 단편 펩타이드에 대한 삼중 4중극자 질량 분광측정에 대한 SRM/MRM 검정

Liquid Tissue™ 용해물에서의 동정은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터 기원하는 펩타이드에 적용된다

i. 최적의 크로마토그래피 조건에 대한 단편 펩타이드에 대한 최적의 체류 시간을 결정하고, 상기 조건은

겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는다

ii. 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 각각의 펩타이드에 대한 전구체 전하 상태,

각각의 펩타이드에 대한 전구체 m/z 값, 각각의 펩타이드에 대한 m/z 전이 이온, 및 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 각각의 단편 펩타이드에 대한 각각의 전이 이온의 이온 유형을 결정한다.

iii. SRM/MRM 검정은 이어서 삼중 4중극자 질량 분광측정기에 대한 (i) 및 (ii)로부터의 정보를 사용하여 수행될 수 있고, 여기서 각각의 펩타이드는 삼중 4중극자 질량 분광측정기에 대해 수행된 바와 같이 독특한 SRM/MRM 검정을 정확하게 한정하는 특징적이고 독특한 SRM/MRM 시그니처 피크를 갖는다.

b. SRM/MRM 질량 분광측정 분석으로부터의 독특한 SRM/MRM 사구네이쳐 피크 면적의 함수로서 검출되는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 단편 펩타이드의 양이 특정 단백질 용해물에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 상대적 및 절대적 양 둘다를 지적할 수 있도록 SRM/MRM 분석을 수행한다.

i. 상대적 정량은 다음에 의해 성취될 수 있다:

1. 하기의 증가되거나 감소된 존재를 결정한다:

하나의 포르말린 고정된 생물학적 샘플 기원의 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출된 소정의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드로부터의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 최소 제2, 제3, 제4 이상의 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 적어도 제2, 제3, 제4 이상의 Liquid Tissue™ 용해물에서 동일한 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단편 펩타이드의 동일한 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교함에 의해 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 증가되거나 감소된 존재를 결정한다.

2. 하나의 포르말린 고정된 생물학적 샘플 기원의 Liquid Tissue™ 용해물에서 검츨된 소정의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드로부터의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 상이하고 별도의 생물학적 공급원으로부터 유래된 다른 샘플에서, 다른 단백질 기원의 단편 펩타이드로부터 발생된 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교함에 의해 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 증가되거나 감소된 존재를 결정하고, 여기서, 펩타이드 단편에 대한 상기 2개의 샘플 간의 상기 SRM/MRM 시그니처 피크 면적 비교는 각각의 샘플에서 분석된 단백질의 양으로 표준화한다.

3. 소정의 ENT1, ERCC1, FOLR1, TUBB3, RRM1, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 기원하는 동일한 Liquid Tissue™ 용해물 내 상이한 단백질로부터 유래된 다른 단편 펩타이드로부터의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교하여 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 변화하는 수준을 다양한 세포 조건하에서 이들의 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질의 수준으로 표준화시킴에 의해 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 증가되거나 감소된 존재를 결정한다.

4. 이들 검정은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드 둘다에 적용될 수 있고, 여기서, 상기 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이에 제한되지 않고 변형된 펩타이드의 상대적 수준은 비변형된 펩타이드의 상대적 양을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정된다.

ii. 소정의 펩타이드의 절대적 정량은 개별 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 기원의 소정의 단편 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 상기 생물학적 샘플 기원의 단백질 용해물로 스파이크된 내부 단편 펩타이드 표준물의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교함에 의해 성취될 수 있다.

1. 내부 표준물은 조사된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질로부터의 표지된 합성 버전의 단편 펩타이드이다. 상기 표준물은 공지된 양으로 샘플에 스파이크되고, SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 생물학적 샘플에서 별도로 내부 단편 펩타이드 표준 및 본래의 단편 펩타이드 둘다에 대해 결정되고 이어서 피크 면적 둘다를 비교할 수 있다.

2. 이것은 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드에 적용될 수 있고, 여기서, 상기 변형은인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이에 제한되지 않고 변형된 펩타이드의 절대 수준은 비변형된 펩타이드의 절대적 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정될 수 있다.

3. 단편 펩타이드 정량을 암 진단 및 치료에 적용한다.

a. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고 암 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 환자 또는 대상체 종양 조직에서 암의 단계/등급/상태에 대한 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 발현의 이전에 결정된 연합이 확인됨을 입증한다

b. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고 상이한 치료 전략으로부터의 임상 결과와 상호관련성을 입증하고, 여기서, 상기 상호관련성은 상기 분야에서 이미 입증되었거나 환자 또는 대상체의 코호트 및 상기 환자 또는 대상체로부터의 조직에 걸친 상호관련성 연구를 통해 향후에 입증될 수 있다. 일단, 이전에 확립된 상호관련성 또는 향후에 유래될 상호관련성은 상기 검정에 의해 확인되고, 이어서 상기 검정 방법을 사용하여 최적의 치료 전략을 결정할 수 있다.

상기 내부 표준은 조사된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 (또는 단백질용해시 방출된 표지된 합성 버전의 단편 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드) 기원의 표지된 합성 버전의 단편 펩타이드일 수 있다. 상기 표준물은 공지된 양으로 샘플로 스파이크되고 상기 SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 별도로 생물학적 샘플에서 내부 단편 펩타이드 표준물 및 본래의 단편 펩타이드 둘다에 대해 결정하고 이어서 2개 피크 면적을 비교할 수 있다. 이것은 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드에 적용될 수 있고, 여기서, 상기 변형은인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이에 제한되지 않고 변형된 펩타이드의 절대 수준은 비변형된 펩타이드의 절대적 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정될 수 있다.

특정 펩타이드에 대한 특이적 및 고유 특성은 이온 포집 및 삼중 4중극자 질량 분광측정 둘다에대한 모든 펩타이드의 분석에 의해 발생되었다. 상기 정보는 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, 전구체의 전이 m/z 값 및 동정된 전이 각각의 이온 유형을 포함한다. 상기 정보는 흥미롭게도 상기 단백질 기원의 모든 펩타이드가 본원에 기재된 바와 같이 SRM/MRM을 사용하는 상기 용해물에서 검출될 수 없어 이는 검출되지 않은 펩타이드가 포르말린 고정된 샘플/조직으로부터의 액체 조직 용해물에서 직접 펩타이드/단백질을 정량하는데 사용하기 위한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위한 후보 펩타이드인 것으로 고려될 수 없음을 지적하기 때문에 포르말린 고정된 샘플/조직 기원의 액체 조직 용해물에서 직접 각각 그리고 모든 후보 SRM/MRM 펩타이드에 대해 실험적으로 결정되어야만 한다.

특이적 펩타이드에 대한 특정 SRM/MRM 검정은 삼중 4중극자 질량 분광측정기 상에서 수행된다. 특정 SRM/MRM 검정에 의해 분석된 실험적 샘플은 예를 들어, 포르말린 고정되고 파라핀 매립된조직으로부터 제조된 액체 조직 단백질 용해물이다. 상기 검정으로부터의 데이터는 포르말린 고정된 샘플에서 상기 펩타이드에 대한 고유 SRM/MRM 시그니처 피크의 존재를 지적한다.

상기 펩타이드에 대한 특이적 전이 이온 특성을 사용하여 포르말린 고정된 생물학적 샘플에서 특정 펩타이드를 정량적으로 측정한다. 이들 데이터는 분석된 단백질 용해물의 마이크로그램 당 펩타이드의 몰량의 함수로서 상기 펩타이드의 절대량을 지적한다.

포르말린 고정된 환자-유래되거나 대상체-유래된 조직의 분석을 기반으로 조직에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 수준의 평가는 각각의 특정 환자 또는 대상체에 대한 진단학적, 예후적 및 치료학적-관련 정보를 제공할 수 있다. 본원에 기재된 것은 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법이고, 상기 방법은 질량 분광측정기를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물에서 하나 이상의 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출하고/하거나 정량하고; 상기 샘플에서 변형되거나 비변형된 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준(여기서, 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다)을 계산함을 포함한다. 관련 구현예에서, 하나 이상의 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 것은 공지된 양의 부가된 내부 표준 펩타이드와 비교함에 의해 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드 각각의 양을 결정함을 포함하고, 여기서, 상기 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1,TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 단편 펩타이드 각각은 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩타이드와 비교한다. 일부 구현예에서, 내부 표준은 동위원소 표지된 내부 표준이고, 펩타이드는 18O, 17O, 34S, ¹⁵N, ¹³C, ²H 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중동위원소를 포함한다.

본원에 기재된 생물학적 샘플에서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질(또는 이의 대용물로서 단편 펩타이드) 수준을 측정하기 위한 방법은 환자 또는 대상체에서 암의 진단학적 지표로서 사용될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준 측정으로부터의 결과를 사용하여 조직에서 발견되는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준을 정상 및/또는 암성 또는 전암성 조직에서 발견되는 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 수준과 서로 관련시킴에 의해 (예를 들어,비교함에 의해) 암의 진단학적 단계/등급/상태를 결정할 수 있다.

포르말린 고정된 환자 조직에서 특이적 단백질의 수준을 검출하기 위한 사용에 있어서 현재 방법은 면역조직화학(IHC)이다. 상기 방법은 환자 종양 조직 샘플 기원의 단일 조직 절편에 대한 시점에서 유일하게 하나의 단백질을 분석한다. 따라서, 다수의 단백질을 분석하기 위해, 다수의 조직 절편이 조사되어야 하고, 이는 많은 시간과노동을 소모한다. IHC는 표적 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용하고, 단백질에 대한 항체의 비특이적 결합의 잠재성 때문에 임의의 IHC 실험에서 시그날 백그라운드가 고유적으로 클 가능성이 있다. 추가로, IHC는 기껏해야 단지 반-정량적이다. 이들 문제점으로 인해, IHC는 다수의 단백질에 대해 동시에 객관적인 정량적 분석을 제공하는데 실패한다. 현재 구현예는 유의적인 시간과 돈을 절약하는 환자 조직 샘플의 단일 절편을 활용하면서 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 발현에 대해 보다 더 가치있는 데이터를 제공하는 100% 검정 특이성과 동시에 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 객관적 정량을 제공할 수 있다.

상기 멀티플렉스 SRM/MRM 검정은 또한 EGFR, IGF-1R, 및 cMet와 같은 약물 표적 단백질을 포함하는, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 이외의 다른 추가의 단백질의 동시 분석을 포함할 수 있다. 이것은 추가 단백질의 분석이 또한 어느 추가의 약물이 특정 암을 치료하기 위해 유용할 수 있는지를 지적하기 때문에 가치 있다. 추가의 예시적 약물 표적 단백질의 분석을 기초로 하는 추가의 약물의 예는 EGFR 수용체를 표적화하는 에르비툭스, IGF-1R을 표적화하는 피기투무맙, 및 c-Met 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2)를 표적화하는 포레티닙을 포함한다.

핵산 및 단백질 둘다는 동일한 Liquid Tissue™ 생분자 제제로부터 분석될 수 있기 때문에, 단백질이 분석되는 동일한 샘플에서 핵산으로부터 질환 진단 및 약물 치료 결정에 대한 추가의 정보를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질이 증가된 수준으로 특정 세포에 의해 발현된다면, SRM에 의한 분석시 상기 데이터는 세포의 상태 및 조절되지 않은 성장에 대한 이들의 잠재력에 대한 정보를 제공할 수 있고, 잠재적인 약물 내성 및 암의 "u병이 수득될 수 있다. 동시에, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 유전자 및/또는 핵산 및 이들이 암호화하는 단백질 (예를 들어, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변이)의 상태에 대한 정보는 동일한 Liquid Tissue™ 생분자 제제에 존재하는 핵산으로부터 수득될 수 있고 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가될 수 있다. ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A로부터 기원하지 않고 동일한 생분자 제제에 존재하는 임의의 유전자 및/또는 핵산은 ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, ENT1, ERCC1, FOLR1, RRM1, TUBB3, TOPO1, 및/또는 TOPO2A 단백질 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 추가의 단백질에 대한 정보는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 조사함에 의해 평가될 수 있다. 상기 핵산은 예를 들어, 하기 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상에 의해 조사될 수 있다: 서열분석 방법, 폴리머라제 연쇄 반응 방법, 제한 단편 다형태 분석, 결실의 동정, 삽입 및/또는 단일 염기쌍 다형태, 전이, 전위 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이의 존재의 결정.

방법 및 조성물의 상기 기재 및 예시적 구현예는 본 발명의 범위를 설명한다. 그러나, 당업자에게 자명한 변형 때문에, 본 발명은 상기된 특정 구현예에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> EXPRESSION PATHOLOGY, INC. <120> SRM ASSAYS TO CHEMOTHERAPY TARGETS <130> 01152-8034 <150> US 62/019,830 <151> 2014-07-01 <150> US 62/023,725 <151> 2014-07-11 <160> 103 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Gln Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ala Pro Leu Pro Glu Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Pro Gln Ser Val Arg 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Leu Gly Ser Leu Val Ala Ile Leu Leu Val Phe Leu Ile Thr Ala 1 5 10 15 Ile Leu Val Lys 20 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Glu Gly Pro Gly Glu Gln Glu Thr Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Asp Leu Ile Ser Lys 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Ser Ile Ala Gly Ser Ser Thr Trp Glu Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Trp Leu Pro Ser Leu Val Leu Ala Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Asn Ser Ile Ile Val Ser Pro Arg 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Asn Pro Val Leu Lys 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Tyr His Asn Leu His Pro Asp Tyr Ile His Gly Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Leu Leu Val Gln Val Asp Val Lys 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Pro Gln Gln Ala Leu Lys 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Tyr Leu Glu Thr Tyr Lys 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Glu Gln Asp Phe Val Ser Arg 1 5 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Thr Asp Ser Gln Thr Leu Leu Thr Thr Phe Gly Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Ser Arg 20 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Phe Asp Val Leu His Glu Pro Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Ala Trp Ala Arg 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Asn Trp His Lys 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 His Pro Asp Tyr Ala Ile Leu Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ile Ala Val Ser Asn Leu His Lys 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Thr Leu Asp Ile Val Leu Ala Asn Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Asn Ser Ala Ile Ile Tyr Asp Arg 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Phe Ser Tyr Asn Tyr Phe Gly Phe Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Ser Val Gly Ile His Lys 1 5 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Asp Ile Asp Ala Ala Ile Glu Thr Tyr Asn Leu Leu Ser Glu Arg 1 5 10 15 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Asp Ser Ile Glu Gly Ile Tyr Asp Thr Leu Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Val Asp Gln Gly Gly Asn Lys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Leu Tyr Ala Ser Tyr Glu Lys 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ser Asn Gln Gln Asn Leu Gly Thr Ile Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Leu Ala Glu Val Thr Lys 1 5 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Tyr Pro Phe Glu Ser Ala Glu Ala Gln Leu Leu Asn Lys 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Gln Gly Pro Tyr Glu Thr Tyr Glu Gly Ser Pro Val Ser Lys 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Val Leu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Val Asn Pro His Leu Leu Lys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Thr Val Trp Glu Ile Ser Gln Lys 1 5 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Ala Phe Ile Asp Gln Ser Gln Ser Leu Asn Ile His Ile Ala Glu 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Gly Lys 20 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 His Ser Asn Ser Glu His Lys 1 5 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Asn Gly Phe Ser Ser Pro Pro Gln Ile Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Glu Pro Glu Asp Asp Gly Tyr Phe Val Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Lys 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Val Pro Glu Pro Asp Asn Lys 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Trp Trp Glu Glu Glu Arg 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Tyr Pro Glu Gly Ile Lys 1 5 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gly Pro Val Phe Ala Pro Pro Tyr Glu Pro Leu Pro Glu Asn Val Lys 1 5 10 15 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Glu Glu Val Ala Thr Phe Phe Ala Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ala Gln Thr Glu Ala Arg 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Val Pro Ser Pro Pro Pro Gly His Lys 1 5 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Val Thr Trp Leu Val Ser Trp Thr Glu Asn Ile Gln Gly Ser Ile Lys 1 5 10 15 <210> 51 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Val Glu His Ile Asn Leu His Pro Glu Leu Asp Gly Gln Glu Tyr Val 1 5 10 15 Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Lys 20 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gln Pro Glu Asp Asp Leu Phe Asp Arg 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Leu Asn Thr Gly Ile Leu Asn Lys 1 5 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Leu Thr Ala Pro Asp Glu Asn Ile Pro Ala Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Gln Leu Ala Asp Ala Arg 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Leu Glu Val Gln Ala Thr Asp Arg 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gln Ile Ala Leu Gly Thr Ser Lys 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Trp Gly Val Pro Ile Glu Lys 1 5 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Gln Ser Ser Thr Ser Thr Thr Gly Ala Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ser Ser Asp Glu Ser Asn Phe Asp Val Pro Pro Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gly Tyr Asp Ser Asp Pro Val Lys 1 5 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Val Pro Asp Glu Glu Glu Asn Glu Glu Ser Asp Asn Glu Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Gln Glu Leu Asp Thr Leu Lys 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ser Pro Ser Asp Leu Trp Lys 1 5 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Glu Asp Leu Ala Thr Phe Ile Glu Glu Leu Glu Ala Val Glu Ala Lys 1 5 10 15 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gln Asp Glu Gln Val Gly Leu Pro Gly Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Val Ile His Glu Gln Val Asn His Arg 1 5 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Phe Gln Gln Ile Ser Phe Val Asn Ser Ile Ala Thr Ser Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 His Val Asp Tyr Val Ala Asp Gln Ile Val Thr Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Leu Val Asp Val Val Lys 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Gly Gly Val Ala Val Lys 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Gln Val Gln Leu Asn Lys 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Leu Asp Asp Ala Asn Asp Ala Gly Gly Arg 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Thr Leu Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Val Gly Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Tyr Gly Val Phe Pro Leu Arg 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ile Val Gly Leu Gln Tyr Lys 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asn Tyr Glu Asp Glu Asp Ser Leu Lys 1 5 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Leu Leu Ile Asn Phe Ile His His Asn Trp Pro Ser Leu Leu Arg 1 5 10 15 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Phe Leu Glu Glu Phe Ile Thr Pro Ile Val Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ser Ser Thr Pro Asn His Lys 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Gly Leu Gly Thr Ser Thr Ser Lys 1 5 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Tyr Ser Gly Pro Glu Asp Asp Ala Ala Ile Ser Leu Ala Phe Ser Lys 1 5 10 15 <210> 83 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Leu Leu Gly Leu Pro Glu Asp Tyr Leu Tyr Gly Gln Thr Thr Thr Tyr 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Asn Asp Phe Ile Asn Lys 20 25 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Glu Leu Ile Leu Phe Ser Asn Ser Asp Asn Glu Arg 1 5 10 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Phe Leu Tyr Asp Asp Asn Gln Arg 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ile Pro Asn Phe Asp Val Arg 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Glu Ile Val Asn Asn Ile Arg 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Thr Trp Thr Gln Thr Tyr Lys 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Pro Pro Leu Ile Thr Asp Tyr Arg 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Glu Tyr His Thr Asp Thr Thr Val Lys 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Val Gly Leu His Lys 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Tyr Asp Thr Val Leu Asp Ile Leu Arg 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Asp Phe Phe Glu Leu Arg 1 5 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Glu Val Thr Phe Val Pro Gly Leu Tyr Lys 1 5 10 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala Ala Asp Asn Lys 1 5 10 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Val Thr Ile Asp Pro Glu Asn Asn Leu Ile Ser Ile Trp Asn Asn Gly 1 5 10 15 Lys <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gly Ile Pro Val Val Glu His Lys 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Asn Gly Tyr Gly Ala Lys 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Phe Thr Val Glu Thr Ala Ser Arg 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Tyr Asp Ile Ala Gly Ser Thr Lys 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Val Phe Leu Asn Gly Asn Lys 1 5 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Met Ser Ser Thr Phe Ile Gly Asn Ser Thr Ala Ile Gln Glu Leu Phe 1 5 10 15 Lys <210> 103 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Leu Ala Thr Pro Thr Tyr Gly Asp Leu Asn His Leu Val Ser Ala Thr 1 5 10 15 Met Ser Gly Val Thr Thr Ser Leu Arg 20 25

Claims (14)

1. 포르말린-고정된 조직의 생물학적 샘플에서 TUBB3 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 질량 분광분석법을 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물(protein digest)에서 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출 및 정량하는 단계; 및 상기 샘플에서 상기 TUBB3 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고;
   여기서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드는 서열번호: 103의 펩타이드이고,
   상기 양은 상대적 양 또는 절대적 양인, 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양을 검출 및 정량하기 전에 상기 단백질 분해물을 분획화(fractionating)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물이 Liquid Tissue™ 프로토콜에 의해 제조되는, 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물을 포함하는, 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 질량 분광분석법이 탠덤 질량 분광분석법, 이온 포집 질량 분광분석법, 삼중 4중극자 질량 분광분석법, MALDI-TOF 질량 분광분석법, MALDI 질량 분광분석법, 및/또는 타임 오브 플라이트 질량 분광분석법을 포함하는, 방법.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 뇨 샘플, 혈청 샘플, 복수 샘플, 객담 샘플, 림프액, 침샘 샘플, 세포 또는 고체 조직인, 방법.
7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, TUBB3 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 것이 하나의 생물학적 샘플에서 서열번호: 103에 나타낸 바와 같은 TUBB3 단백질의 약 8 내지 약 45 개의 아미노산 잔기들의 아미노산 서열을 포함하는 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양을, 상이한 별도의 생물학적 샘플에서 동일한 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양과 비교함을 포함하는, 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드를 정량하는 것이 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함에 의해 생물학적 샘플에서 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양을 결정함을 포함하고, 상기 생물학적 샘플에서 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩타이드와 비교되는, 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드는 동위원소로 표지된 펩타이드인, 방법.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 제품을 포함하는, 환자 또는 대상체에서 TUBB3 단백질의 존재 및 폐암을 포함한 암과의 연관성을 나타내는, 키트.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 연관성은 상기 TUBB3 단백질 단편 펩타이드의 양 또는 상기 TUBB3 단백질의 양을 검출 및 정량한 결과를 폐암을 포함한 상기 암의 진단학적 단계/등급/상태와 관련시키는 것인, 키트.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 키트는 다른 단백질들 또는 다른 단백질들 기원의 펩타이드들의 양을 검출 및 정량하는 것을 수행하기 위한 제품을 추가로 포함하는, 키트.
14. 서열번호: 103의 펩타이드 및/또는 이에 대한 항체를 포함하는, 조성물.