KR20190050806A - 튜블린 베타-3 쇄(tubb3) 단백질을 위한 srm/mrm 검정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 선택적 반응 모니터링(SRM) 질량 분석법에 의해 포르말린에 고정된 생물학적 샘플에서 직접 TUBB3 단백질을 정량하는데 특히 유리한 튜블린 베타-3 쇄 단백질(TUBB3)로부터의 특정 펩타이드 및 상기 펩타이드의 유도된 이온화 특성을 제공한다. 단백질 샘플은 리퀴드 티슈 시약 및 프로토콜을 사용하여 생물학적 샘플로부터 제조되고 TUBB3 단백질은 샘플의 SRM/MRM 질량 분석법에 의해 정량되며, 여기서 특정 펩타이드가 정량된다. 환자 종양 샘플 중의 TUBB3의 측정 수준을 기준 수준과 비교하여, 측정된 TUBB3 수준이 기준 수준보다 낮은 경우 환자를 탁산-기반 치료 처방계획으로 치료하는 치료방법이 제공된다. 적합한 기준 수준은, 예를 들면, 약 700amol/㎍ 조직이다.
Description
본 출원은 발명의 명칭이 튜블린 베타-3 쇄(TUBB3) 단백질을 위한 SRM/MRM 검정인 2016년 9월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/384,202호 및 2016년 9월 30일자로 출원된 제62/402,984호에 대한 우선권을 청구하며, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
암은 성장하고 분열하는 세포를 사멸시키기 위해 다양한 방식으로 기능하는 치료제의 집합체로 치료된다. 일반적인 그룹의 화학요법제들이 개별적으로 또는 조합하여 수십 년간 사용되어 왔으며, 임상 종양학 실습에서 전통적이고 일상적인 암 치료가 되어 왔다. 이러한 제제들은 전형적으로 대부분의 암 세포의 주요 특성 중의 하나인 빠르게 분열하는 모든 세포를 사멸시키는 작용을 한다. 그러나, 이러한 제제들은 성장하는 정상 세포도 사멸시키기 때문에, 암 세포를 사멸시키기 위한 "표적화된" 접근법으로 간주되지는 않는다. 최근에 암 세포 만을 특이적으로 표적화하는 대규모 그룹의 암 치료법들이 개발되었는데, 이 치료법의 치료제는 암 세포에 의해서만 발현되고 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는 단백질을 특이적으로 공격한다. 이러한 접근법이 암 치료법에 대한 "표적화된" 접근법으로 간주된다. 가장 최근에, "표적화된" 방식으로 암 세포를 사멸시키는 또 다른 접근법은 암 환자의 면역계가 암 세포를 사멸시키는 능력을 증진시키도록 면역계를 특이적으로 조절하였다.
튜블린 베타-3 쇄("TUBB3")를 표적화하는 치료제가 초기 임상 실험에서 가능성을 보였다. 그러나, 암 세포가 다량의 TUBB3 단백질을 발현하는 환자만이 이러한 TUBB3-표적화된 치료제로의 치료로부터 가장 혜택을 받을 것으로 예상된다. 본원에 기술된 방법은, TUBB3가 정상 조직 및/또는 정상 상피 세포에서는 정상적으로 발현되지 않기 때문에, TUBB3 신호 경로의 활성화의 적절한 척도를 전달하는 정량적 단백체학-기반 검정을 제공한다. 특히, 본 방법은 포르말린 고정된 암 환자의 조직에서 TUBB3을 정량하고 암 치료법에 대한 개선된 치료 결정을 더욱 가능하게 하는 질량 분석 검정을 제공한다.
TUBB3의 부분서열에서 유래하는 특정 펩타이드가 제공된다. 이러한 펩타이드에 대한 펩타이드 서열 및 단편화/전이 이온은 다중 반응 모니터링(MRM) 검정이라고도 할 수 있는 질량 분광법-기반 선택적 반응 모니터링(SRM) 검정에서 유용하며, 이것을 본원에서는 SRM/MRM이라고 한다. TUBB3 단백질의 SRM/MRM 정량 분석을 위한 펩타이드의 사용이 기술되어 있다.
이러한 SRM/MRM 검정은 TUBB3 단백질의 특정 펩타이드에 대한 상대적 또는 절대적 정량 수준을 측정하는데 사용될 수 있으며 질량 분석법에 의해 생물학적 샘플로부터 수득된 소정의 단백질 제제에서 TUBB3 단백질의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, SRM/MRM 검정은 포르말린 고정된 암 환자 조직과 같은 환자 조직 샘플로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합 단백질 용해물 샘플에서 직접 펩타이드를 측정할 수 있다. 포르말린-고정된 조직으로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함되어 있다. 미국 특허 제7,473,532호에 기술된 방법은 통상적으로 미국 메릴랜드주 소재의 익스프레션 패톨로지 인크 (Expression Pathology Inc.)로부터 이용 가능한 리퀴드 티슈(Liquid Tissue) 시약 및 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
암 환자로부터의 조직의 가장 널리 이용 가능한 형태는 포르말린 고정되고, 파라핀 매립된 조직이다. 수술적으로 제거된 조직의 포름알데히드/포르말린 고정은 전세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 흔한 방법이며 표준 병리학 실습을 위해 허용된 관례이다. 포름알데히드의 수용액을 포르말린이라고 한다. "100%" 포르말린은 산화 및 중합도를 제한하기 위해 소량의 안정화제(통상적으로 메탄올)를 함유하는, 물 중의 포름알데히드의 포화 용액(약 40부피% 또는 37질량%)으로 이루어진다. 조직이 보존되는 가장 흔한 방식은 전체 조직을 흔히 10% 중성 완충 포르말린이라고 불리는 수성 포름알데히드 중에 장시간(8시간 내지 48시간) 동안 담근 다음 고정된 전체 조직을 장기간 저장을 위해 실온에서 파라핀 왁스에 매립시키는 것이다. 따라서, 포르말린 고정된 암 조직을 분석하기 위한 분자 분석 방법이 암 환자 조직의 분석을 위해 유용하다.
SRM/MRM 검정의 결과는 조직(생물학적 샘플)이 수집되고 보존되는 환자 또는 대상체의 특정 조직 샘플(예컨대, 암 조직 샘플) 내의 TUBB3 단백질의 정확하고 정밀한 정량적 수준을 상관시키는데 사용될 수 있다. 이것은 암에 대한 진단 정보를 제공할 뿐만 아니라, 의사 또는 다른 전문 의료진이 환자를 위한 적합한 치료법을 결정할 수 있게 한다. 이병 조직 또는 기타 환자 샘플 중의 단백질 발현의 수준에 대한 진단적 및 치료적으로 중요한 정보를 제공하는 이러한 검정을 동반 진단 검정(companion diagnostic assay)이라고 한다. 예를 들면, 이러한 검정은 암의 병기 또는 정도를 진단하고 환자가 가장 잘 반응할 것 같은 치료제를 결정하도록 설계될 수 있다.
본원에서는, 질량 분석법을 사용하여 사람 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물(digest) 중의 TUBB3 단편 펩타이드(서열번호 1)의 양을 검출하고, 유리하게는 정량하는 단계; 샘플 중의 TUBB3 단백질의 수준(상대적 또는 절대적 수준)을 계산하는 단계를 포함하는, 포르말린-고정된 조직의 사람 생물학적 샘플에서 사람 TUBB3 단백질의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 단백질 소화물은 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하기 전에 분별될 수 있다. 상기 단백질 소화물은 프로테아제 소화물을 함유할 수 있는 반면, 조직은 파라핀-매립된 조직, 예를 들면 종양으로부터 수득되는 조직일 수 있다.
TUBB3 단편 펩타이드는 하나의 생물학적 샘플 중의 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 상이한 별도의 생물학적 샘플 중의 동일한 TUBB3 단편 펩타이드의 양과 비교함으로써 정량될 수 있다. TUBB3 단편 펩타이드 또한 기지량으로 첨가된 내부 표준 펩타이드와의 비교에 의해 정량될 수 있으며, 이 경우 생물학적 샘플 중의 TUBB3 단편 펩타이드를 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩타이드와 비교하며; 상기 내부 표준 펩타이드는 동위원소 표지된 펩타이드이다.
단백질 소화물 중의 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계는 대상체에서 변형된 또는 비변형된 TUBB3 단백질의 존재 및 암과의 관련성을 나타내는데 사용될 수 있다. TUBB3 단편 펩타이드의 양, 또는 TUBB3 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과는 암의 진단 병기/등급/상황과 상관될 수 있다. TUBB3 단편 펩타이드의 양, 또는 TUBB3 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 병기/등급/상황과 상관시키는 단계는, 암의 진단 병기/등급/상황에 관한 추가의 정보를 제공하기 위해 다중적 포맷으로 다른 단백질 또는 다른 단백질 유래의 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계와 조합될 수 있다.
상기한 바와 같이 사람 TUBB3의 수준을 측정한 후, 생물학적 샘플이 수득되는 환자를 치료학적 유효량의 치료제로 치료할 수 있으며, 이 경우 상기 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양은 TUBB3 단편 펩타이드의 양 또는 TUBB3 단백질의 수준에 기초한다. 치료제는, 예를 들면, TUBB3 단백질에 결합하고/하거나 이의 생물학적 활성을 억제할 수 있다.
또한, 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 제조된 단백질 소화물 중의 서열번호 1의 펩타이드와 같은 명시된 TUBB3 단편 펩타이드의 수준을 정량하고 질량 분석법을 사용한 선택적 반응 모니터링에 의해 샘플 중의 TUBB3 펩타이드의 수준을 계산하는 단계, TUBB3 단편 펩타이드의 수준을 기준 수준과 비교하는 단계 및 (i) TUBB3 단편 펩타이드의 수준이 기준 수준보다 낮은 경우 탁산-기반 화학요법 처방계획으로 환자를 치료하거나 (ii) TUBB3 단편 펩타이드의 수준이 기준 수준보다 높은 경우 유효량의 탁산을 포함하지 않는 치료 처방계획으로 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 기준 수준은, 예를 들면, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 250amol/㎍, +/- 150amol/㎍, +/- 100amol/㎍, +/- 50amol/㎍, 또는 +/- 25amol/㎍일 수 있다. 생물학적 샘플의 단백질 소화물은 리퀴드 티슈 프로토콜에 의해 제조될 수 있으며 트립신 소화물과 같은 프로테아제 소화물을 포함할 수 있다.
암을 앓고 있는 환자는 위암을 앓을 수 있으며, TUBB3 수준이 컷오프 미만인 경우 환자는 FOLFIRI에 이어 도세탁셀 및 시스플라틴(CDDP)으로 치료될 수 있거나, TUBB3 수준이 컷오프 초과인 경우 FOLFIRI 또는 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료될 수 있다.
암을 앓고 있는 환자는 삼중 음성 유방암을 앓을 수 있으며, TUBB3 수준이 컷오프 미만인 경우 환자는 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이어 탁산)로 치료될 수 있거나, TUBB3 수준이 컷오프 초과인 경우 CMF(사이톡산, 메토트렉세이트 및 5-FU)으로 치료될 수 있다.
이러한 방법들 중의 어느 것에서도, 질량 분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중 사극자 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/사극자 질량 분석법 및/또는 비행 시간 질량 분석법일 수 있다. 사용되는 질량 분석법의 방식은 선택적 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM) 및/또는 다중 선택적 반응 모니터링(mSRM)일 수 있다.
상기한 치료의 방법에서 종양 샘플은 세포, 세포의 집합, 또는 고형 조직일 수 있으며, 파라핀 매립된 조직을 포함한 포르말린 고정된 고형 조직일 수 있다. 또한, 명시된 TUBB3 단편 펩타이드를 검출하고 정량하는 단계는, 어떤 제제를 치료를 위해 사용할지에 대한 치료 결정이 생물학적 샘플 중에서 다른 펩타이드/단백질과 조합하여 특정 TUBB3 단편 펩타이드의 특정 수준을 기초로 하도록, 다중적으로 다른 단백질 유래의 다른 펩타이드를 검출하고 정량하는 단계와 조합될 수 있다.
도 1은 위암 환자의 전체 생존율 중간값(OS)이 정의된 컷오프 미만(<700amol/㎍)인 환자의 경우보다 정의된 컷오프 초과(>700amol/㎍)인 TUBB3의 수준을 갖는 환자의 경우 유의적으로 더 짧다는 것을 보여준다(1566일 vs. 801일, P = 0.0282).
도 2는 FOLFIRU에 이어 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료된 환자에 대해 정의된 TUBB3 컷오프 초과(>700amol/㎍) 및 미만의 위암 환자의 OS에 있어 차이가 거의 없음을 보여준다.
도 3은 FOLFIRI에 이은 도세탁셀(탁소테레) 및 시스플라틴(CDDP) 대 FOLFIRU에 이은 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료된 환자에 대해 정의된 TUBB3 컷오프 초과(>700amol/㎍)의 위암 환자의 OS에 있어서 유의적인 차이를 보여준다.
도 4는 700amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 비재발성 생존율(relapse-free survival; RFS)에 있어서의 차이를 보여준다.
도 5는 850amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 RFS에 있어서의 차이를 보여준다.
도 6은 930amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 RFS에 있어서의 차이를 보여준다.
도 7은 930amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 OS에 있어서의 차이를 보여준다.
도 2는 FOLFIRU에 이어 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료된 환자에 대해 정의된 TUBB3 컷오프 초과(>700amol/㎍) 및 미만의 위암 환자의 OS에 있어 차이가 거의 없음을 보여준다.
도 3은 FOLFIRI에 이은 도세탁셀(탁소테레) 및 시스플라틴(CDDP) 대 FOLFIRU에 이은 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료된 환자에 대해 정의된 TUBB3 컷오프 초과(>700amol/㎍)의 위암 환자의 OS에 있어서 유의적인 차이를 보여준다.
도 4는 700amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 비재발성 생존율(relapse-free survival; RFS)에 있어서의 차이를 보여준다.
도 5는 850amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 RFS에 있어서의 차이를 보여준다.
도 6은 930amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 RFS에 있어서의 차이를 보여준다.
도 7은 930amol/㎍의 컷오프 TUBB3 수준 초과 및 미만에서 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이은 탁산)로 치료된 삼중 음성 유방암 환자의 OS에 있어서의 차이를 보여준다.
본원에 기술된 검정은 TUBB3 단백질의 비변형된 특정 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정한다. TUBB3 단백질의 상대적 정량 수준은 SRM/MRM 방법에 의해, 예를 들면, 상이한 샘플 중의 개별 TUBB3 펩타이드의 SRM/MRM 특색(signature) 피크 면적(예컨대, 특색 피크 면적 또는 통합된 단편 이온 강도)를 비교함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 각 펩타이드가 자체의 특이적인 SRM/MRM 특색 피크를 갖는, 다수의 TUBB3 특색 펩타이드에 대한 다수의 SRM/MRM 특색 피크 면적을 비교하여, 하나의 생물학적 샘플 중의 상대적 TUBB3 단백질 함량을 결정하고 이것을 하나 이상의 추가의 또는 상이한 생물학적 샘플 중의 TUBB3 단백질 함량과 비교하는 것도 가능하다. 이러한 방식으로, TUBB3 단백질의 특정 펩타이드 또는 펩타이드들의 양 및 이에 따른 TUBB3 단백질의 양은, 동일한 실험 조건하에 2개 이상의 생물학적 샘플에 있어서 동일한 TUBB3 펩타이드 또는 펩타이드들에 대하여 결정된다. 또한, 상대적 정량은 생물학적 샘플 유래의 동일한 단백질 제제 내에서, SRM/MRM 방법에 의한 그 펩타이드에 대한 특색 피크 면적을 상이한 단백질, 또는 단백질들 유래의 또 다른 상이한 펩타이드 또는 펩타이드들에 대한 특색 피크 면적과 비교함으로써, 단일 샘플 내에서 TUBB3 단백질 유래의 소정의 펩타이드 또는 펩타이드들에 대해 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, TUBB3 단백질의 특정 펩타이드의 양 및 이에 따른 TUBB3 단백질의 양은 동일한 샘플 내에서 서로에 대해 결정된다.
이러한 접근법들은 샘플 간 및 샘플 내에서의 또 다른 펩타이드 또는 펩타이드들의 양에 대해 TUBB3 단백질의 개별 펩타이드 또는 펩타이드들을 정량하는데, 여기서 특색 피크 면적에 의해 결정된 양은 생물학적 샘플 유래의 단백질 제제 중의 TUBB3 펩타이드의 양을 가중하는 부피 또는 중량에 대한 절대 중량에 관계없이 서로 상대적이다. 상이한 샘플들 간의 개별 특색 피크 면적에 대한 상대적 정량 데이터는 샘플당 분석된 단백질의 양에 대해 정규화된다. 상대적 정량은 다른 펩타이드/단백질과 관련된 하나의 펩타이드/단백질의 상대적 단백질 양에 대해 통찰하기 위해 단일 샘플에서 및/또는 다수의 샘플에 걸쳐 동시에 다수의 단백질 및 TUBB3 단백질 유래의 여러 펩타이드에 걸쳐 수행될 수 있다.
TUBB3 단백질의 절대적 정량 수준은, 예를 들면, 하나의 생물학적 샘플에서 TUBB3 단백질 유래의 개별 펩타이드의 SRM/MRM 특색 피크 면적을 스파이크 내부 표준(spiked internal standard)의 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교하는 SRM/MRM 방법에 의해 결정될 수 있다. 한 양태에서, 상기 내부 표준은 하나 이상의 중동위 원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 정확히 동일한 TUBB3 펩타이드의 합성 형태이다. 동위원소 표지된 내부 표준은, 질량 분석법으로 분석하는 경우, 네이티브 TUBB3 펩타이드 특색 피크와는 다르고 구별되기 때문에, 비교 피크(comparator peak)로서 사용될 수 있는, 예측 가능하고 일관된 SRM/MRM 특색 피크를 생성하도록 합성될 수 있다. 따라서, 내부 표준이 공지된 양으로 생물학적 샘플 유래의 단백질 제제에 스파이크되어 질량 분석법에 의해 분석되는 경우, 네이티브 펩타이드의 SRM/MRM 특색 피크 면적을 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교하고, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플 유래의 원래의 단백질 제제에 존재하는 네이티브 펩타이드의 절대 몰농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드에 대한 절대적 정량 데이터는 샘플당 분석되는 단백질의 양에 따라 표시된다. 절대적 정량은 단일 샘플에서 및/또는 여러 샘플에 걸쳐서 동시에 다수의 펩타이드, 이에 따라 다수의 단백질에 대하여 수행되어 개별 생물학적 샘플에서 및 개별 샘플의 전체 코호트에서 절대 단백질 양에 대해 통찰할 수 있다.
SRM/MRM 검정 방법은, 예를 들면 포르말린 고정된 조직과 같은 환자-유래 조직에서 직접 암의 병기에 대한 진단을 돕고, 어떠한 치료제가 그 환자를 치료하는데 사용하기에 가장 유리한지를 결정하는데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 부분 또는 전체 종양의 치료학적 제거를 위해서와 같이 수술을 통해, 또는 의심되는 질환의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 수행되는 생검 절차를 통해 환자로부터 제거되는 암 조직을 특정 단백질 또는 단백질들 및 어떤 형태의 단백질이 그 환자 조직에 존재하는지 아닌지를 결정하기 위해 분석한다. 게다가, 하나의 단백질, 또는 다중 단백질의 발현 수준을 결정하고 건강한 조직에서 발견되는 "정상" 또는 기준 수준과 비교할 수 있다. 건강한 조직에서 발견되는 단백질의 정상 또는 기준 수준은, 예를 들면, 암을 갖지 않는 하나 이상의 개인의 관련 조직으로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 정상 또는 기준 수준은 암에 의해 영향을 받지 않은 관련 조직의 분석에 의해 암을 갖는 개인에 대해 수득될 수 있다.
또한, 단백질 수준(예컨대, TUBB3 수준)의 검정은 또한 TUBB3 수준을 이용함으로써 암으로 진단된 환자 또는 대상체에서 암의 병기를 진단하는데에도 사용될 수 있다. 개별 TUBB3 펩타이드의 수준은 분석된 단백질 용해물의 총량 당 SRM/MRM 검정에 의해 결정된 펩타이드의 몰량으로서 정의된다. 따라서, TUBB3에 관한 정보는 TUBB3 단백질(또는 TUBB3 단백질의 단편 펩타이드)의 수준을 정상 조직에서 관찰되는 수준과 상관시킴으로써 암의 병기 또는 등급을 결정하는데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 일단 정량적 양의 TUBB3 단백질이 암 세포에서 결정되면, 그 정보를, 예를 들면, 검정된 단백질 또는 단백질(들)(예컨대, TUBB3)의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 암 조직을 특이적으로 치료하도록 개발된 치료제의 목록에 매칭시킬 수 있다.
또한, 환자로부터 수득된 포르말린-고정된 종양 조직의 샘플에서 TUBB3 수준을 측정하고, 해당 측정 수준을 사전에 결정된 컷오프 수준과 비교함으로써 암의 개선된 치료방법도 제공된다. 측정된 TUBB3 수준이 사전에 결정된 컷오프 미만인 경우, 환자는 탁산-기반 치료제를 포함하는 치료 처방계획으로 치료된다. 치료된 TUBB3 수준이 컷오프 초과인 경우, 아래에 보다 상세하게 기술된 바와 같은 대안적인 치료 처방계획을 실시한다. 유리하게는, 대안적인 치료 처방계획은 탁산-기반 치료제를 함유하지 않는다. 위암 및 삼중-음성 유방암을 치료하는 개선된 방법이 제공된다.
TUBB3 단백질 검정의 정보를, 예를 들면, TUBB3 단백질 또는 해당 단백질을 발현하는 세포/조직을 특이적으로 표적화하는 치료제의 목록에 매칭시키는 것은, 질환을 치료하기 위한 소위 맞춤형 약물 접근법(personalized medicine approach)이다. 본원에 기술된 검정 방법은 진단 및 치료 결정을 위한 소스로서 환자 자신의 조직 유래의 단백질 분석을 이용함으로써 맞춤형 약물 접근법의 기반을 형성한다.
원칙적으로, 예를 들면 공지된 특이성의 프로테아제(예컨대 트립신)로 소화시킴으로써 제조된 TUBB3 단백질로부터 유도된 임의의 예측되는 펩타이드는, 질량 분석법-기반 SRM/MRM 검정을 사용하여 샘플에서 TUBB3 단백질의 풍도(abundance)를 결정하기 위한 대리 리포터(surrogate reporter)로서 사용될 수 있다. 그러나, 놀랍게도, TUBB3 단백질 유래의 다수의 잠재적인 펩타이드 서열은 즉시 눈에 띄지 않는다는 이유로 질량 분석법-기반 SRM/MRM 검정에서 사용하기에 적합하지 않거나 비효과적인 것으로 밝혀졌다. 이것은 포르말린 고정된 조직으로부터 유도된 펩타이드에서 특히 그러하다. MRM/SRM 검정을 위해 가장 적합한 펩타이드를 예측하는 것이 가능하지 않았기 때문에, 실제 리퀴드 티슈 용해물에서 펩타이드를 실험적으로 확인하여 TUBB3 단백질에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 SRM/MRM 검정을 개발하는 것이 필요하였다. 어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 펩타이드는 잘 이온화되지 않거나 다른 단백질과 구별되는 단편을 생산하지 않기 때문에 질량 분석법으로 검출하기가 어려울 것으로 보인다. 또한, 펩타이드는 분리시(예컨대, 액체 크로마토그래피) 잘 분해되지 못하거나, 유리 또는 플라스틱 제품에 달라붙을 수 있다.
TUBB3 단편 펩타이드는 미국 특허 제7,473,532호에 제공된 리퀴드 티슈 프로토콜의 사용을 비롯한 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 상기 리퀴드 티슈 프로토콜 및 시약은 조직/생물학적 샘플에서 단백질의 단백질가수분해에 의해 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 조직의 질량 분광 분석에 적합한 펩타이드 샘플을 생산할 수 있다. 상기 리퀴드 티슈 프로토콜에서, 조직/생물학적 샘플을 장시간 동안 완충액 중에서 가열하여(예컨대, 약 10분 내지 약 4시간의 기간 동안 약 80℃ 내지 약 100℃) 단백질 가교-결합을 역전시키거나 해제한다. 사용되는 완충액은 중성 완충액 (예컨대, Tris-기반 완충액, 또는 세제를 함유하는 완충액)이다. 열 처리 후 조직/생물학적 샘플을 상기 생물학적 샘플의 조직 및 세포 구조를 파열하고 상기 샘플을 액화시키기에 충분한 시간(예컨대, 37℃ 내지 65℃의 온도에서 30분 내지 24시간의 기간) 동안 트립신, 키모트립신, 펩신 및 엔도프로테이나제 Lys-C를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 프로테아제로 처리한다. 가열 및 단백질가수분해의 결과는 액체, 가용성, 희석가능한 생체분자 용해물이다.
아래에 기술된 TUBB3 펩타이드는 포르말린 고정된 암 조직으로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합 리퀴드 티슈 용해물 내에 모든 단백질의 프로테아제 소화에 의해 TUBB3 단백질로부터 유도되었다. 달리 언급하지 않는 한, 각 경우에 프로테아제는 트립신이다. 그후, 리퀴드 티슈 용해물을 질량 분석법으로 분석하여, 검출된 TUBB3 단백질로부터 유도된 펩타이드를 결정하고, 질량 분석법에 의해 이를 분석하였다. 질량-분광 분석을 위한 펩타이드의 바람직한 특정 하위세트의 확인은 다음을 기준으로 한다; 1) 단백질의 펩타이드 또는 펩타이드들이 리퀴드 티슈 용해물의 질량 분광 분석에서 이온화하는지의 여부에 대한 실험적 측정 및 2) 상기 펩타이드가 리퀴드 티슈 용해물을 제조하는데 사용되는 프로토콜 및 실험 조건에서 생존할 수 있는 능력.
포르말린(포름알데히드) 고정된 조직으로부터 직접 입수된 세포의 단백질 용해물은, 조직 미세해부를 통해 세포를 샘플 시험관에 수집한 후, 세포를 장시간 동안 리퀴드 티슈 완충액 중에서 가열하는 리퀴드 티슈 시약 및 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 일단 포르말린-유도된 가교 결합이 부정적으로 영향을 받게 되면, 해당 조직/세포는, 예를 들면, (다른 프로테아제가 사용될 수도 있지만) 트립신과 같은 프로테아제를 사용하여 예측 가능한 방식으로 완전히 소화된다. 각 단백질 용해물은 프로테아제로의 온전한 폴리펩타이드의 소화에 의해 펩타이드의 집합체로 바뀐다. 각 리퀴드 티슈 용해물을 (예컨대, 이온 트랩 질량 분석법에 의해) 분석하여, 해당 펩타이드의 다수의 전반적인 단백체 조사를 수행하였는데, 여기서 데이터는 각 단백질 용해물에 존재하는 모든 세포성 단백질로부터 질량 분석법으로 확인할 수 있는 한 많은 펩타이드를 확인함으로써 제공된다. 이온 트랩 질량 분석계, 또는 단일 복합 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 많은 펩타이드를 확인하기 위한 전반적인 프로파일링을 수행할 수 있는 또 다른 형태의 질량 분석계가 사용된다. 그러나, 이온 트랩 질량 분석계가 펩타이드의 전반적인 프로파일을 수행하는데 유리하게 사용될 수 있다. MALDI, 이온 트랩, 또는 삼중 사극자를 포함한 임의 유형의 질량 분석계 상에서 SRM/MRM 검정을 개발하여 수행할 수 있지만, 유리하게는 삼중 사극자 기기 플랫폼이 SRM/MRM 검정에 사용된다. 이러한 유형의 질량 분석계는 세포 내에 함유된 모든 단백질의 수십만 내지 수백만 개의 펩타이드로 이루어질 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 내에서 분리된 하나의 표적 펩타이드를 분석하기에 적합한 기기이다.
일단, 사용 조건하에서 단일 용해물에 대한 단일 MS 분석에서 가능한 한 많은 펩타이드가 확인된다면, 그 목록의 펩타이드를 수집하여 그 해당 용해물에서 검출된 단백질을 결정하는데 사용하였다. 그 공정을 다수의 리퀴드 티슈 용해물에 대해 반복하였으며, 펩타이드의 매우 큰 목록을 단일 데이터세트로 수집분석하였다. 그러한 유형의 데이터세트는 (프로테아제 소화 후) 분석된 생물학적 샘플의 유형 및 구체적으로 생물학적 샘플의 리퀴드 티슈 용해물에서 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내기 때문에, 예를 들면 TUBB3 단백질과 같은 특정 단백질에 대한 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
한 양태에서, TUBB3 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로 확인된 TUBB3 트립신분해성 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는 포르말린 고정되고, 파라핀 매립된 조직으로부터 제조된 리퀴드 티슈 용해물 중에서 질량 분석법에 의해 검출되었다. 이러한 펩타이드는 사람 생물학적 샘플 중에서, 예컨대 포르말린 고정된 환자 조직 중에서 직접 TUBB3 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 검정에서 사용될 수 있다.
서열번호 1
ISVYYNEASSHK
이러한 TUBB3 트립신분해성 펩타이드는 폐, 결장 및 유방을 비롯한 상이한 사람 기관의 여러가지 상이한 포르말린 고정된 조직에 대한 다수의 리퀴드 티슈 용해물로부터 검출하였다. 상기 펩타이드는 포르말린 고정된 조직 중의 TUBB3 단백질의 정량적 SRM/MRM 검정에 유용하다. 추가의 데이터 분석은 임의의 특정 기관 부위의 임의의 특정 펩타이드에 대한 선호도가 관찰되지 않았음을 보여주었다. 따라서, 서열번호 1의 펩타이드가 임의의 생물학적 샘플 또는 신체의 임의의 기관 부위에서 유래하는 임의의 포르말린 고정된 조직의 리퀴드 티슈 용해물에 대한 TUBB3 단백질의 SRM/MRM 검정을 수행하는데 적합하다.
서열번호 1의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 가장 효율적으로 시행하기 위해서는, 분석에서 펩타이드 서열 이외에 정보를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 추가의 정보는, 질량 분석계(예컨대, 삼중 사극자 질량 분석계)를 안내하고 지시하는데 사용되어, 표적화된 특정 펩타이드(들)의 정확하고 초점이 맞춰진 분석을 수행할 수 있어, 해당 검정이 효율적으로 수행될 수 있다.
특정 TUBB3 펩타이드에 관한 추가의 정보는 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온 및 각 전이 이온의 이온 유형 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 아래 표는 서열번호 1의 펩타이드를 사용하기 위해 TUBB3 단백질에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하는데 사용될 수 있는 추가의 펩타이드 정보를 보여준다.
아래에 기술된 방법은 1) TUBB3 단백질에 대한 질량 분석법-기반 SRM/MRM 검정에 사용될 수 있는 TUBB3 단백질로부터 후보 펩타이드를 확인하는데, 2) 상관시키기 위해 TUBB3 단백질로부터의 표적 펩타이드에 대한 개별 SRM/MRM 검정, 또는 검정들을 개발하는데, 그리고 3) 정량 검정을 암 진단 및/또는 최적 치료법의 선택에 적용하는데 사용하였다.
검정 방법
1. TUBB3 단백질에 대한 SRM/MRM 후보 단편 펩타이드의 확인
a. 단백질을 소화시키기 위해, 프로테아제 또는 프로테아제들 (트립신을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음)을 사용하여 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 리퀴드 티슈 단백질 용해물을 제조함
b. 이온 트랩 탠덤 질량 분석계 상에서 리퀴드 티슈 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고 TUBB3 단백질로부터의 모든 단편 펩타이드를 확인함 (여기서, 개별 단편 펩타이드는 인산화 또는 당화와 같은 어떠한 펩타이드 변형도 함유하지 않음)
c. 이온 트랩 탠덤 질량 분석계 상에서 리퀴드 티슈 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고 예를 들면 인산화 또는 당화된 잔기와 같은 펩타이드 변형을 지니는 TUBB3 단백질로부터의 모든 단편 펩타이드를 확인함
d. 전체 전장 TUBB3 단백질로부터 특이적 소화 방법에 의해 생성된 모든 펩타이드가 잠재적으로 측정될 수 있지만, SRM/MRM 검정의 개발을 위해 사용되는 바람직한 펩타이드는 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 제조된 복합 리퀴드 티슈 단백질 용해물에서 직접 질량 분석법에 의해 확인되는 것들임
e. 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터 리퀴드 티슈 용해물을 분석할 때, 환자 조직에서 특이적으로 변형(인산화, 당화 등)되고 이온화되어 질량 분석계에서 검출되는 펩타이드를 TUBB3 단백질의 펩타이드 변형을 분석하기 위한 후보 펩타이드로서 확인함
2. TUBB3 단백질로부터의 단편 펩타이드에 대한 질량 분석 검정
a. 리퀴드 티슈 용해물에서 확인된 개별 단편 펩타이드에 대한 삼중 사극자 질량 분석계 상에서의 SRM/MRM 검정을 TUBB3 단백질 유래의 펩타이드에 적용함
i. 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 최적의 크로마토그래피 조건을 위해 단편 펩타이드에 대한 최적의 체류 시간을 결정함
ii. 각 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 각 펩타이드에 대한 전구체 전하 상태, 각 펩타이드에 대한 전구체 m/z 값, 각 펩타이드에 대한 m/z 전이 이온 및 각 단편 펩타이드에 대한 각 전이 이온의 이온 유형을 결정함
iii. 이후, SRM/MRM 검정은 삼중 사극자 질량 분석계 상에서 (i) 및 (ii)로부터의 정보를 사용하여 수행될 수 있음 (여기서, 각 펩타이드는 삼중 사극자 질량 분석계에서 수행된 바와 같은 독특한 SRM/MRM 검정을 정확하게 규정하는 특징적이고 독특한 SRM/MRM 특색 피크를 가짐)
b. SRM/MRM 질량 분광계 분석으로부터 독특한 SRM/MRM 특색 피크 면적의 함수로서, 검출되는 TUBB3 단백질의 단편 펩타이드의 양이 특정 단백질 용해물 중의 단백질의 상대적 및 절대적 양 모두를 나타낼 수 있도록 SRM/MRM 분석을 수행함
i. 상대적 정량은 다음에 의해 달성될 수 있다:
1. 하나의 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터의 리퀴드 티슈 용해물에서 검출된 소정의 TUBB3 펩타이드로부터의 SRM/MRM 특색 피크 면적을 적어도 제2, 제3, 제4 또는 그 이상의 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터의 적어도 제2, 제3, 제4 또는 그 이상의 리퀴드 티슈 용해물에서 동일한 TUBB3 단편 펩타이드의 동일한 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교함으로써 TUBB3 단백질의 증가된 또는 감소된 존재를 결정함
2. 하나의 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터의 리퀴드 티슈 용해물에서 검출된 소정의 TUBB3 펩타이드로부터의 SRM/MRM 특색 피크 면적을 상이한 별도의 생물학적 공급원으로부터 유도된 다른 샘플에서 다른 단백질의 단편 펩타이드로부터 전개된 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교함으로써 TUBB3 단백질의 증가된 또는 감소된 존재를 결정함 (여기서, 펩타이드 단편에 대한 2개 샘플 간의 SRM/MRM 특색 피크 면적 비교를 각 샘플에서 분석된 단백질의 양으로 정규화함)
3. 다양한 세포 조건하에서 TUBB3 단백질의 변화 수준을, 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질의 수준으로 정규화하기 위해 소정의 TUBB3 펩타이드에 대한 SRM/MRM 특색 피크 면적을 포르말린 고정된 생물학적 샘플로부터의 동일한 리퀴드 티슈 용해물 내의 상이한 단백질로부터 유도된 다른 단편 펩타이드의 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교함으로써 TUBB3 단백질의 증가된 또는 감소된 존재를 결정함
4. 이러한 검정은 TUBB3 단백질의 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드 모두에 적용할 수 있음 (여기서, 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 변형된 펩타이드의 상대적 수준은 비변형된 펩타이드의 상대적 양을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정됨)
ii. 소정의 펩타이드의 절대적 정량은 개별 생물학적 샘플에서의 TUBB3 단백질로부터 소정의 단편 펩타이드에 대한 SRM/MRM 특색 피크 면적을 생물학적 샘플 유래의 단백질 용해물에 스파이크된 내부 단편 펩타이드 표준의 SRM/MRM 특색 피크 면적과 비교함으로써 달성될 수 있음
1. 내부 표준은 조사중인 TUBB3 단백질 유래의 단편 펩타이드의 표지된 합성 형태이다. 이러한 표준은 기지량의 샘플에 스파이크되며, SRM/MRM 특색 피크 면적은 내부 단편 펩타이드 표준 및 생물학적 샘플 중의 네이티브 단편 펩타이드 모두에 대해 개별적으로 결정된 다음, 피크 면적 모두를 비교할 수 있음
2. 이것은 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드 모두에 적용될 수 있음 (여기서, 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 변형된 펩타이드의 절대적 수준은 비변형된 펩타이드의 절대적 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정될 수 있음)
3. 단편 펩타이드 정량의 암 진단 및 치료에의 적용
a. TUBB3 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고, 환자 종양 조직에서 암의 병기/등급/상태에 대한 TUBB3 단백질 발현에 있어서, 암 분야에서 잘 이해되는 바와 같은, 앞서 결정된 연관성이 확인됨을 입증함
b. TUBB3 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고, 상이한 치료 전략으로부터의 임상 결과와의 상관성을 입증하며, 여기서 이러한 상관성은 이미 당해 분야에서 입증되었거나 환자의 코호트 및 이러한 환자의 조직에 걸친 상관성 연구를 통해 장차 입증될 수 있음. 일단 이미 확립된 상관성 또는 장래에 유도될 상관성들이 이러한 검정에 의해 확인되면, 해당 검정 방법을 최적 치료 전략을 결정하는데 사용할 수 있음.
특정 TUBB3 펩타이드에 관한 특이적이고 독특한 특징은 이온 트랩 및 삼중 사극자 질량 분석계 모두에서의 모든 TUBB3 펩타이드의 분석에 의해 개발되었다. 그러한 정보는 펩타이드의 단일동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, 전구체의 전이 m/z 값 및 확인된 전이의 각 이온 유형을 포함한다. 그 정보는 포르말린 고정된 샘플/조직의 리퀴드 티슈 용해물에서 직접 각각의 그리고 모든 후보 SRM/MRM 펩타이드에 대해 실험적으로 결정되어야 하는데; 그 이유는 흥미롭게도, TUBB3 단백질 유래의 모든 펩타이드가 본원에 기술된 바와 같은 SRM/MRM을 사용하여 이러한 용해물에서 검출될 수 있는 것이 아니기 때문이며, 이것은 검출되지 않은 TUBB3 펩타이드가 포르말린 고정된 샘플/조직의 리퀴드 티슈 용해물에서 직접 펩타이드/단백질을 정량하는데 사용하기 위한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위한 후보 펩타이드로 고려될 수 없음을 나타낸다.
특정 TUBB3 펩타이드를 위한 특정 SRM/MRM 검정은 삼중 사극자 질량 분석계 상에서 수행된다. 특정 TUBB3 SRM/MRM 검정에 의해 분석된 실험 샘플은, 예를 들면 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 조직으로부터 제조된 리퀴드 티슈 단백질 용해물이다. 이러한 검정의 데이터는 포르말린 고정된 샘플에서 이러한 TUBB3 펩타이드에 대한 독특한 SRM/MRM 특색 피크의 존재를 나타낸다.
이러한 펩타이드에 대한 특이적인 전이 이온 특성은 포르말린 고정된 생물학적 샘플에서 특정 TUBB3 펩타이드를 정량적으로 측정하는데 사용된다. 이러한 데이터는 상기 TUBB3 펩타이드의 절대적 양을 분석된 단백질 용해물의 마이크로그램당 펩타이드의 몰 양의 함수로서 나타낸다. 포르말린 고정된 환자-유래 조직의 분석에 기초한 조직 중의 TUBB3 단백질 수준의 평가는 각각의 특정 환자에 관한 진단, 예후 및 치료 관련 정보를 제공할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 질량 분석법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물 중의 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및 샘플 중의 TUBB3 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 튜블린 베타-3 쇄 단백질(TUBB3)의 수준을 측정하는 방법을 기술하는데, 여기서 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련 실시양태에서, TUBB3 단편 펩타이드를 정량하는 단계는 기지량으로 첨가된 내부 표준 펩타이드와의 비교에 의해 생물학적 샘플 중의 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 결정함을 포함하며, 여기서 내부 표준 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서 내부 표준은 180, 170, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중동위 원소를 포함하는 동위원소 표지된 내부 표준 펩타이드이다.
본원에 기술된 생물학적 샘플 중의 TUBB3 단백질 (또는 이의 대용물로서의 단편 펩타이드)의 수준을 측정하는 방법은 환자 또는 대상체의 암의 진단 지표로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, TUBB3 단백질의 수준의 측정 결과는 조직에서 발견되는 TUBB3 단백질의 수준을 정상 및/또는 암성 또는 전암성 조직에서 발견되는 그 단백질의 수준과 상관관계를 나타냄(예컨대, 비교)으로써 암의 진단적 병기/등급/상태를 결정하는데 사용될 수 있다.
당업자라면 탁산 제제를 추가의 약물 또는 약물의 조합을 포함하는 치료 처방계획의 일부로서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 환자 종양 샘플 중의 TUBB3의 수준은 보통 amol/㎍로 나타내지만, 다른 단위도 사용될 수 있다. 당업자라면 기준 수준을 중앙값 근처의 범위로서, 예를 들면, +/- 250, 150, 100, 50 또는 25amol/㎍으로 나타낼 수 있음을 인지할 것이다. 아래 상세하게 기술된 위암의 첫 번째 구체적인 예에서, TUBB3 단백질에 대한 적합한 기준 수준은 700amol/㎍인 것으로 밝혀졌다. 삼중-음성 유방암의 두 번째 예에서, 컷오프도 700amol/㎍인 것으로 밝혀졌지만, 850 및 930amol/㎍의 컷오프도 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 당업자라면 이러한 기준 수준보다 높거나 낮은 수준도 임상 결과 및 경험에 기초하여 선택될 수 있음을 인지할 것이다.
TUBB3 수준이 사전에 결정된 기준 수준 미만인 경우에는 환자를 탁산-기반 치료제로 치료하고, TUBB3 수준이 사전에 결정된 기준 수준 초과인 경우에는 환자를 대안적인 처방계획으로 치료하는 개선된 치료방법이 제공된다. 위암의 경우에, 아래에 기술된 바와 같이, TUBB3 수준이 컷오프 미만인 경우 환자는 FOLFIRI에 이어 도세탁셀(탁소테레) 및 시스플라틴(CDDP)과 같은 처방계획으로 치료될 수 있는데 반해, TUBB3 수준이 컷오프 초과인 경우에는 FOLFIRI 또는 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료될 수 있다. 삼중 음성 유방암의 경우에, TUBB3 수준이 컷오프 미만인 경우 환자는 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이어 탁산)로 치료될 수 있는 반면, TUBB3 수준이 컷오프 초과인 경우 환자는 CMF(사이톡산, 메토트렉세이트 및 5-FU)로 치료될 수 있다.
핵산과 단백질 모두가 동일한 리퀴드 티슈 생체분자 제제로부터 분석될 수 있기 때문에, 단백질이 분석되는 동일한 샘플에서의 핵산으로부터 질환 진단 및 약물 치료 결정에 관한 추가의 정보를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들면, TUBB3 단백질이 특정 세포에 의해 SRM에 의해 검정되는 경우 증가된 수준으로 발현된다면, 데이터는 세포의 상태 및 제어되지 않는 성장에 대한 이들의 가능성, 최적 요법의 선택 및 잠재적인 약물 내성에 관한 정보를 제공할 수 있다. 동시에, 유전자 및/또는 이들이 암호화하는 핵산 및 단백질의 상태에 관한 정보(예컨대, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변화)도 동일한 리퀴드 티슈 생체분자 제제 중에 존재하는 핵산으로부터 수득될 수 있다. 핵산은 TUBB3 단백질을 비롯한 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, TUBB3 단백질 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 추가의 단백질에 관한 정보는 이들 단백질을 암호화하는 핵산을 조사함으로써 평가될 수 있다. 이러한 핵산은, 예를 들면, 다음 중의 하나 이상, 둘 이상, 또는 셋 이상에 의해 조사될 수 있다: 서열분석 방법, 중합효소 연쇄 반응 방법, 제한 단편 다형성 분석, 결실, 삽입의 확인 및/또는 단일 염기 쌍 다형성, 전이, 전환, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이의 존재의 결정.
TUBB3의
단백체
분석은 위의 급격히 절제된
선암종에서
도세탁셀
요법의 혜택을 예측한다:
ITACA
-S 임상시험에서의 샘플의 재평가
ITACA-S 시험에서 절제 가능한 위 또는 위식도 접합부 선암종을 갖는 환자를 FOLFIRI(이리노테칸 180mg/㎡ 1일, LV 100mg/㎡ 2시간 주입 및 5-FU 400mg/㎡ 볼루스 주사, 1일 및 2일후 600mg/㎡/일 22시간 연속 주입, 4회 주기 동안 q14)에 이어 도세탁셀 75mg/㎡ 1일, 시스플라틴 75mg/㎡ 1일, 3회 주기 동안 q21(순차적 아암) 또는 드 그라몽(De Gramont) 처방계획(5-FU/LV 아암)에 무작위로 할당하였다. 시험의 초기 결론은 보다 집중적인 처방계획이 단일요법에 비해 무병 및 OS에 있어 어떠한 혜택도 나타내지 못한다는 것이었다. 문헌[Ann Oncol. 25: 1373-8 (2014)]을 참조한다.
아래 기술된 분석은 상술한 질량 분석법(MS)-기반 단백체 검정의 사용을 보여주는데, 여기서는 클래스 III β-튜불린(TUBB3) 단백질의 낮거나 부재한 발현으로 탁산-기반 치료법으로 치료된 환자에서 개선된 생존율을 예측한다.
탁산-기반 치료법에 대한 단일 치료반응 예측 바이오마커로서 700amol/㎍의 TUBB3에 대한 컷오프는 TUBB3에 대한 MS-기반 단백체 검정의 LOD에 기초하여 확립되었다. 탁산-기반 화학요법(ITACA-s 시험)을 받은 전이성 위암 환자에서의 치료반응 예측 바이오마커 컷오프는 임상적으로 입증되었다.
탁산-기반 화학요법(ITACA-s 시험)을 제공받은 전이성 위암 환자에서 전향적-후향적으로 결과가 발표된 TUBB3 컷오프는 임상적으로 입증되었다. 전체 생존율 중간값(OS)은 정의된 컷오프 미만(<700amol/㎍)인 환자의 경우보다 컷오프 초과(>700amol/㎍)의 TUBB3의 수준을 갖는 환자의 경우에 현저히 더 짧았다(1566일 vs. 801일, P = 0.0282). 도 1을 참조한다.
흥미롭게도, TUBB3 >700amol/㎍을 갖는 환자는 탁산 아암에서의 환자에 비해 탁산-기반 화학요법으로 치료되지 않은 경우 유의적으로 더 긴 OS를 갖는 것으로 밝혀졌다(1991일 vs. 801일, P = 0.0480). TUBB3 <700amol/㎍을 갖는 환자는 5-FU/LV 아암에서의 환자에 비해 탁산-기반 화학요법으로부터 혜택을 얻는다(1556일 vs. 1227일). 도 2 및 3을 참조한다.
TUBB3의
단백체
분석은 삼중 음성 유방암에서 ACT 요법의 혜택을 예측한다:
삼중 음성 유방암(TNBC)은 다른 유방암 유형에 비해 공격적인 임상 경과 및 증가된 국소 재발율 및 원격 전이율을 갖는 이질적 질환이다[문헌 참조; Jhoensuu et al, Ann Oncol, 23 Suppl 6: p. vi40-5 (2012)]. 전신 화학요법이 질환의 재발을 방지하기 위해 권장되는 경우가 많지만, 다수의 화학요법 바이오마커가 확인되면서, 스크리닝은 일반적이지 않으며 화학요법 처방계획은 개별 종양 생물학을 설명하도록 조절되지 않는다. 환자의 개별 종양의 생물학에 기초하여 어느 환자가 치료법에 반응할지를 확인하는 능력은 불필요한 독성으로부터 환자를 살리면서 가장 효과적인 치료법의 전달을 보장할 수 있다.
아래에 기술된 방법들은 정량적 단백체 접근법을 사용한, 치료 기준(ACT: 독소루비신, 사이클로포스파미드에 이어 도세탁셀)으로 치료된 TNBC 환자(n=97) 간의 종양 분자 프로파일과 생존율 사이의 연관성을 보여준다.
방법: TNBC 환자(n=97)로부터의 포르말린-고정되고, 파라핀-매립된(FFPE) 조직 블럭으로부터의 미세해부된 종양 부위를 리퀴드 티슈® 소화 및 단백체 분석에 적용하였다. TUBB3을 포함한 다수의 단백질의 수준을 정량하는데 다중적 SRM-MS 검정을 사용하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 아주반트 요법 후 생존율 혜택을 예측하는 최적 단백질 발현 역치를 수득하는데 사용하였다.
결과: TUBB3은 97개 환자 샘플 중 69개(71%)에서 표적화된 단백체에 의해 검출 가능하였으며, 8.8배 범위의 발현(700-6161.7amol/㎍)이 측정되었다. TUBB3의 높은 단백질 발현(TUBB3>930amol/㎍)은 보다 짧은 전체 생존율(OS) 및 보다 악화된 비재발성 생존율(RFS)과 상관성이 있었다. RFS 및 전체 생존율(OS)은 TUBB3의 낮은 발현(TUBB3<930amol/㎍)을 갖는 환자에서 통계적으로 유의적으로 더 양호하였다. 데이터는 컷오프가 700amol/㎍임을 보여주지만, 850 및 930amol/㎍의 컷오프도 통계적으로 유의적인 것이었음을 보여준다. 도 4 내지 7을 참조한다.
TUBB3의 광범위한 발현 범위는 특정 치료법이 바이오마커 발현에 기초하여 상이한 반응율을 나타내고 있음을 보여준다. 여기에 나타낸 결과는, TUBB3의 단백질 발현을 측정함으로써 치료의 개선된 방법이 제공되며, TUBB3이 ACT로 치료된 TNBC 환자에서 탁산-기반 요법 내성에 대한 치료반응 예측 마커임을 입증한다.
<110> Expression Pathology, Inc.
<120> SRM/MRM ASSAY FOR THE TUBULIN BETA-3 CHAIN (TUBB3) PROTEIN
<130> 3900.0037i
<140> PCT/US17/50472
<141> 2017-09-07
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ile Ser Val Tyr Tyr Asn Gln Ala Ser Ser His Lys
1 5 10
Claims (45)
- 포르말린-고정된 조직의 사람 생물학적 샘플에서 사람 TUBB3 단백질의 수준을 측정하는 방법으로서,
질량 분석법을 사용하여 상기 사람 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물(digest) 중에서 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및 상기 샘플에서 TUBB3 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고, 상기 TUBB3 단편 펩타이드는 서열번호 1이며, 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준인 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하기 전에 상기 단백질 소화물을 분별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 소화물이 프로테아제 소화물을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직이 파라핀-매립된 조직인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직이 종양으로부터 수득되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드를 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드를 정량하는 단계가, 하나의 생물학적 샘플 중의 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 별도의 상이한 생물학적 샘플 중의 동일한 TUBB3 단편 펩타이드의 양과 비교하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드를 정량하는 단계가, 생물학적 샘플 중의 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 기지량으로 첨가된 내부 표준 펩타이드와의 비교에 의해 결정하는 단계를 포함하되, 상기 생물학적 샘플 중의 상기 TUBB3 단편 펩타이드를 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩타이드와 비교하며; 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소 표지된 펩타이드인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 소화물 중의 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계가, 변형 또는 비변형된 TUBB3 단백질의 존재 및 대상체에서 암과의 연관성을 나타내는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 TUBB3 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 병기/등급/상태와 상관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 TUBB3 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 병기/등급/상태와 상관시키는 단계가, 암의 진단 병기/등급/상태에 관한 추가의 정보를 제공하기 위해 다중적 포맷으로 다른 단백질 또는 다른 단백질 유래의 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계와 조합하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 환자에게 치료학적 유효량의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양을 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 양 또는 TUBB3 단백질의 수준에 기초하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 치료제가 TUBB3 단백질과 결합하고/하거나 이의 생물학적 활성을 억제하는 것인, 방법.
- (a) 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 제조된 단백질 소화물 중에서 특정 TUBB3 단편 펩타이드의 수준을 정량하고, 상기 샘플 중의 TUBB3 펩타이드의 수준을 질량 분석법을 사용한 선택적 반응 모니터링으로 계산하는 단계;
(b) 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 수준을 기준 수준과 비교하는 단계 및
(c) 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 수준이 상기 기준 수준 미만인 경우, 환자를 탁산-기반 화학요법 처방계획으로 치료하는 단계 또는
(d) 상기 TUBB3 단편 펩타이드의 수준이 상기 기준 수준 초과인 경우, 유효량의 탁산을 포함하지 않는 치료 처방계획으로 환자를 치료하는 단계
를 포함하는, 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법. - 제14항에 있어서, 상기 기준 수준이 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 250amol/㎍인 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 기준 수준이 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 150amol/㎍인 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 기준 수준이 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 100amol/㎍인 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 기준 수준이 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 50amol/㎍인 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 기준 수준이 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 700amol/㎍, +/- 25amol/㎍인 것인, 방법.
- 제14항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 소화물이 리퀴드 티슈(Liquid Tissue) 프로토콜에 의해 제조되는 것인, 방법.
- 제14항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 소화물이 프로테아제 소화물을 포함하는 것인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 단백질 소화물이 트립신 소화물을 포함하는 것인, 방법.
[청구항 22]
제14항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중 사극자 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/사극자 질량 분석법 및/또는 비행 시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 방법. - 제22항에 있어서, 사용되는 질량 분석법의 모드가 선택적 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring; SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring; MRM) 및/또는 다중 선택적 반응 모니터링(multiple Selected Reaction Monitoring; mSRM)인 것인, 방법.
- 제14항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 TUBB3 펩타이드가 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
- 제14항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 샘플이 세포, 세포의 집단, 또는 고형 조직인 것인, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 종양 샘플이 포르말린 고정된 고형 조직인 것인, 방법.
- 제26항에 있어서, 조직이 파라핀 매립된 조직인 것인, 방법.
- 제14항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 TUBB3 단편 펩타이드를 정량하는 단계가, 상기 샘플 중의 TUBB3 펩타이드의 양을 기지량의 스파이크된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 네이티브 펩타이드 및 내부 표준 펩타이드가 모두 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 TUBB3 단편 펩타이드의 동일한 아미노산 서열에 상응하는 것인, 방법.
- 제28에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소 표지된 펩타이드인 것인, 방법.
- 제29에 있어서, 상기 동위원소 표지된 내부 표준 펩타이드가 180, 170, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중동위원소를 포함하는 것인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 특정 TUBB3 단편 펩타이드를 검출 및 정량하는 단계가, 어떠한 제제를 치료에 사용할지에 대한 치료 결정이 생물학적 샘플 중에서 다른 펩타이드/단백질과 조합하여 상기 특정 TUBB3 단편 펩타이드의 특정 수준에 기초하도록, 다중적으로 다른 단백질 유래의 다른 펩타이드를 검출 및 정량하는 단계와 조합될 수 있는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 환자가 위암을 앓고 있고, 상기 환자의 TUBB3 수준이 기준 수준 미만인 경우에 상기 환자를 FOLFIRI에 이은 도세탁셀 및 시스플라틴(CDDP)으로 치료하는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 환자가 위암을 앓고 있고, 상기 환자의 TUBB3 수준이 기준 수준 초과인 경우에 상기 환자를 FOLFIRI 또는 5-FU + 폴린산(류코보린)으로 치료하는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 환자가 삼중 음성 유방암을 앓고 있고, 상기 환자의 TUBB3 수준이 기준 수준 미만인 경우에 상기 환자를 ACT(안트라사이클린 및 사이톡산에 이어 탁산)로 치료하는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 환자가 삼중 음성 유방암을 앓고 있고, 상기 환자의 TUBB3 수준이 기준 수준 초과인 경우에 상기 환자를 CMF(사이톡산, 메토트렉세이트 및 5-FU)로 치료하는 것인, 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 850amol/㎍, +/- 250amol/㎍인 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 850amol/㎍, +/- 150amol/㎍인 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 850amol/㎍, +/- 100amol/㎍인 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 850amol/㎍, +/- 50amol/㎍인 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 850amol/㎍, +/- 25amol/㎍인 것인, 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 930amol/㎍, +/- 250amol/㎍인 것인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 930amol/㎍, +/- 150amol/㎍인 것인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 930amol/㎍, +/- 100amol/㎍인 것인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 930amol/㎍, +/- 50amol/㎍인 것인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 기준 수준이, 분석된 생물학적 샘플 단백질에 대해 930amol/㎍, +/- 25amol/㎍인 것인, 방법.
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