WO2018207760A1 - キナーゼ基質 - Google Patents

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WO2018207760A1
WO2018207760A1 PCT/JP2018/017726 JP2018017726W WO2018207760A1 WO 2018207760 A1 WO2018207760 A1 WO 2018207760A1 JP 2018017726 W JP2018017726 W JP 2018017726W WO 2018207760 A1 WO2018207760 A1 WO 2018207760A1
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amino acid
acid sequence
kinase
polypeptide
seq
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石濱　泰
直幸 杉山
大 坂本
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国立大学法人京都大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide that can be used as a kinase substrate.
  • the intracellular signal transduction mechanism forms a complex network in which many molecules cooperate, and in many diseases, mutations in protein kinase, a protein kinase, and abnormal signal transduction due to activation due to overexpression are involved. .
  • kinase mixed sample such as a cell extract
  • low kinase specificity of the substrate peptide is a problem, and it is difficult to accurately evaluate individual kinase activities.
  • antibodies targeting phosphorylation motifs have a problem that it is difficult to measure the activity separately if the kinase phosphorylation motif itself is not highly specific.
  • phosphorylation proteomics using LC-MS can quantitatively analyze a large amount of phosphorylation sites occurring in cells by a single analysis, but since it is unknown which kinase has been activated, the kinase activity is highly accurate and It has not yet been predicted exhaustively.
  • Patent Document 2 reports a substrate polypeptide for measuring the activity of Erk2, JNK1, and p38 ⁇ belonging to mitogen-activated protein kinases (MAPKs), which is a kind of serine threonine kinase.
  • a peptide having a can be a substrate for Erk2, JNK1, and p38 ⁇ . Therefore, even if these peptides are used, it cannot be determined whether the activity of Erk2, JNK1, or p38 is being measured.
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide that is phosphorylated specifically and with high sensitivity to each kinase. Furthermore, an object of the present invention is to provide a set of kinase substrates capable of analyzing a kinome with higher accuracy.
  • the present inventors have determined that PWM (position weighting matrix, based on more than 190,000 in vitro kinase-substrate information on about 400 kinases obtained by the inventors, Specific for each kinase by using FINC (fold-increase, hereinafter abbreviated as FINC) considering synergistic effects and Gini coefficient to further enhance substrate specificity.
  • FINC fold-increase, hereinafter abbreviated as FINC
  • the inventors have found that a substrate polypeptide that can be phosphorylated with high sensitivity can be designed.
  • the present inventor has further earnestly studied, and as a result, the amino acid sequence of (a) or (b): (a) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 187, or (b) the sequence
  • the amino acid sequence shown in any of Nos. 1-187 includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added, or inserted, and the reactivity to the target kinase is a reaction to other kinases It has been found that the above-mentioned problems can be solved if the polypeptide is twice or more the sex. As a result of further research based on these findings, the present inventor completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 2. The polypeptide according to Item 1, wherein the amino acid sequence is the amino acid sequence of (a).
  • the amino acid sequence of (a) is the amino acid sequence of the following (a1): (A1) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 13, 18, 21, 23, 32, 33, 78, 149, 169, 171, 172, 176, and 182; And the amino acid sequence of (b) is the amino acid sequence of (b1) below: (B1) 1 or several amino acids with respect to the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 13, 18, 21, 23, 32, 33, 78, 149, 169, 171, 172, 176, and 182 Is an amino acid sequence substituted, deleted, added or inserted, Item 3.
  • the polypeptide according to Item 1 or 2 wherein
  • the amino acid sequence of (a) is the amino acid sequence of (a2) below: (A2) SEQ ID NOs: 1, 12, 15, 32, 39, 50, 62, 63, 64, 73, 77, 78, 82, 83, 95, 100, 103, 105, 108, 130, 131, 137, 142 , 146, 149, 161, 176, and the amino acid sequence shown in any of 187
  • the amino acid sequence of (b) is the amino acid sequence of (b2) below: (B2) SEQ ID NO: 1, 12, 15, 32, 39, 50, 62, 63, 64, 73, 77, 78, 82, 83, 95, 100, 103, 105, 108, 130, 131, 137, 142 , 146, 149, 161, 176, and an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence shown in any one of Item 3.
  • the polypeptide according to Item 1 or 2 wherein
  • the amino acid sequence of (a) is the amino acid sequence of the following (a3): (A3) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 249 to 251; And the amino acid sequence of (b) is the amino acid sequence of (b3) below: (B3) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 249 to 251; Item 3.
  • Item 6. The polypeptide according to any one of Items 1 to 5, wherein the amino acid mutation in the amino acid sequence of (b), (b1), (b2), or (b3) is an amino acid substitution.
  • Item 7. The polypeptide according to Item 6, wherein the amino acid to be substituted in the amino acid sequence of (b), (b1), (b2), or (b3) is an amino acid other than the amino acid specified by the consensus sequence of the target kinase. .
  • Item 9 Any one of Items 6 to 8, wherein the amino acid after substitution in the amino acid sequence of (b), (b1), (b2), or (b3) is an amino acid other than serine, threonine, tyrosine, methionine, and cysteine.
  • Item 10 The polypeptide according to any one of Items 1 to 9, wherein the number of constituent amino acids is 20 or less.
  • Item 11 A kinase substrate comprising the polypeptide according to any one of Items 1 to 10.
  • a kinase substrate array comprising the polypeptide according to any one of Items 1 to 10 and a solid phase, wherein the polypeptide is immobilized on the solid phase.
  • a reagent for measuring a kinase activity comprising the kinase substrate according to Item 11.
  • a kit for measuring a kinase activity comprising at least one selected from the group consisting of the kinase substrate according to Item 11 and the kinase substrate array according to Item 12.
  • Item 15 A method for measuring a kinase activity, comprising a step of bringing the polypeptide according to any one of Items 1 to 10 into contact with a test sample.
  • a kinome analysis method for a test sample comprising the step of bringing the polypeptide according to any one of Items 1 to 10 into contact with the test sample.
  • Item 17 A method for evaluating the ability of a test substance to regulate kinase activity, comprising the step of bringing the polypeptide according to any one of Items 1 to 10 into contact with a test sample in the presence of the test substance.
  • the polypeptide of the present invention is phosphorylated specifically and with high sensitivity to each kinase.
  • it is possible to measure activity by distinguishing kinases having similar specificity, which has been difficult to measure by separate methods in the conventional method. Therefore, a plurality of kinase activities in cells or tissues to be measured can be measured quickly and simultaneously, and an intracellular kinome can be analyzed easily and accurately.
  • Example 2 the results of examining the reactivity of the polypeptide CK1dtide-1 to various recombinant kinases are shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide CK1dtide 2 with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the results of examining the reactivity of the polypeptide ERK2tide-1 to various recombinant kinases are shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide ERK2tide (R) 2 with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide CK2a2tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide IKKbtide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide MARK2tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide MAPKAPK3tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide JNK1tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide CDC2tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide DYRK4tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide PLK1tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide MLKtide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide CAMK2atide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide NEK6tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Example 2 the result of having investigated the reactivity of polypeptide IRAK1tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis indicates the name of the kinase used in the test, and the vertical axis indicates the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • Test 1 of Example 3 The result of Test 1 of Example 3 is shown.
  • the substrate peptide and concentration used are shown on the side of the matrix, the amount of cell extract used is shown on the upper side, and the correlation coefficient is shown on the right side. Relative peak area shows the relative value of the measured phosphorylation amount.
  • B The result of Test 1 of Example 3 is shown.
  • the substrate peptide used on the upper side of the graph is shown, the horizontal axis shows the amount of the cell extract used, and the vertical axis shows the relative value of the measured phosphorylation amount.
  • C The result of Test 2 of Example 3 is shown.
  • the substrate peptide used is shown on the upper side of the graph, the horizontal axis shows the amount of the substrate peptide used, and the vertical axis shows the relative value of the measured phosphorylation amount.
  • D shows the result of Test 3 of Example 3.
  • the substrate peptide used is shown on the upper side of the graph, the horizontal axis shows the MAPK used, and the vertical axis shows the relative value of the measured phosphorylation amount.
  • the amount of MAPK used is shown on each column of the graph.
  • E shows the result of Test 4 of Example 3.
  • the vertical axis represents the recovery rate of the substrate peptide after the kinase reaction under the ATP-free condition, and the horizontal axis represents the substrate peptide used.
  • the MAPK cascades of the four major subfamilies of MAPK conserved in mammals (ERK1 / 2, p38, JNK, ERK5), the names of the drugs that suppress them, and the positions on the suppression cascade are shown.
  • the heat map of the phosphorylation variation ratio of a substrate peptide at the time of making each inhibitor of Example 4 act is shown.
  • the amount of phosphorylation of the substrate peptide when each inhibitor is allowed to act in Example 4 is shown.
  • the substrate peptide used on the upper side of the graph is shown, the horizontal axis shows the MAPK inhibitor used (control is no use of the inhibitor), and the vertical axis shows the measured phosphorylation amount.
  • Example 5 the result of having investigated the reactivity of polypeptide Erk7tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis shows the kinase used in the test, and the vertical axis shows the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • the order of kinases on the horizontal axis is from the left, CDC7_ASK, CK2A1, CK2a2, CDK2_CYCE1, ERK7, CDK9_CYCLINK, DYRK1A, DYRK4, DYRK2, DYRK3, HIPK1, HIPK2, HIPK3, HIPK4, ICK, MOK, CDK3, CD3, CD3 CDK7_CYCH_MAT1, CDK9_CYCT1, ERK5, CDC2_CycB1, CDK2_CYCA2, CDK5_P25, CDK3_CYCE1, NLK, JNK1, JNK2, JNK3, ERK1, ERK2, P38D, P38G, K38, P3B, MAP2, P38B, CLK2, K38 TAK1, CAMKK1, CAMKK2, ACTR2, HRI, PEK, CK1A, CK1d, CK1E, CK1G1, CK1G2, CK1G3,
  • Example 5 the result of having investigated the reactivity of polypeptide PLK3tide with respect to various recombinant kinases is shown.
  • the horizontal axis shows the kinase used in the test, and the vertical axis shows the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant kinase.
  • the arrangement order of the kinases on the horizontal axis is the same as in FIG.
  • Example 7 the result of having investigated the reactivity of polypeptide TYRO3tide with respect to various recombinant tyrosine kinases is shown.
  • the horizontal axis represents the tyrosine kinase used in the test, and the vertical axis represents the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant tyrosine kinase.
  • the order of kinases on the horizontal axis is ABL1, ABL2, ACK, TNK1, ALK, LTK, AXL, MER, TYRO3, CTK, DDR2, EGFR, ERBB4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, FAK, PYK2, FER, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF1R, INSR, IRR, JAK1, JAK2, JAK3, LIMK1, MET, RON, TAK1, MUSK, FLT3, FMS, KIT, PDGFRA, PDGFRB, RET, ROS, BLK, BR
  • Example 7 the result of having investigated the reactivity of polypeptide EGFRtide with respect to various recombinant tyrosine kinases is shown.
  • the horizontal axis represents the tyrosine kinase used in the test, and the vertical axis represents the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant tyrosine kinase.
  • the arrangement order of the kinases on the horizontal axis is the same as in FIG.
  • Example 7 the result of having investigated the reactivity of polypeptide FERtide with respect to various recombinant tyrosine kinases is shown.
  • the horizontal axis represents the tyrosine kinase used in the test, and the vertical axis represents the relative value of the amount of polypeptide phosphorylated by each recombinant tyrosine kinase.
  • the arrangement order of the kinases on the horizontal axis is the same as in FIG.
  • polypeptides In one embodiment of the present invention, the amino acid sequence of (a) or (b): (a) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 187 and 249 to 251; or (b) SEQ ID NO: 1 Other amino acid sequences comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence shown in any one of -187 and 249-251, and are reactive to the target kinase
  • the present invention relates to a polypeptide (in this specification, sometimes referred to as “polypeptide of the present invention”) that is at least twice as reactive as to. This will be described below.
  • SEQ ID NOs: 1 to 187 and 249 to 251 each show specific reactivity against different kinases (target kinases) (ie, each of the different kinases (target kinases)
  • the amino acid sequence that is specifically phosphorylated by The target kinases for which these amino acid sequences exhibit specific reactivity are as shown in Tables 78 to 82 of Example 1-2 described later.
  • SEQ ID NO: 176 exhibits specific reactivity with CK2a2.
  • SEQ ID NOs: 1 to 187 are amino acid sequences showing specific reactivity with serine / threonine kinases
  • SEQ ID NOs: 249 to 251 are amino acid sequences showing specific reactivity with tyrosine kinases.
  • amino acid sequences (a) and (b) among SEQ ID NOs: 1 to 187 and 249 to 251, preferably from the viewpoint of showing more specific reactivity with the target kinase, preferably SEQ ID NOs: 1, 13, 18, 21, 23, 32, 33, 78, 149, 169, 171, 172, 176, 182 and the like, more preferably SEQ ID NOs: 13, 32, 149, 171, 176, 182 and the like are more preferable. SEQ ID NOs: 32, 149, 171, 176 and the like can be mentioned.
  • another preferred example is preferably SEQ ID NO: 1, 12, 15, 32, 39, 50, 62, 63, 64, 73, 77, 78, 82, 83, 95, 100, 103. , 105, 108, 130, 131, 137, 142, 146, 149, 161, 176, 187, etc., more preferably SEQ ID NOs: 1, 12, 15, 32, 50, 63, 64, 77, 78, 82, 83, 95, 103, 108, 131, 146, 149, 161, 187 and the like, and more preferably SEQ ID NOs: 15, 64, 77, 78, 95, 131, 146, 149, 161 and the like. More preferably, SEQ ID NOs: 64, 95, 161 and the like can be mentioned, and SEQ ID NOs: 64, 95 and the like can be particularly preferable.
  • Another preferred example from the same viewpoint is preferably SEQ ID NOs: 249 to 251.
  • the amino acid sequence (a) is preferable from the viewpoints of specificity and sensitivity.
  • the “one or several” amino acids resulting in substitution or the like is not particularly limited as long as the specific reactivity with respect to the target kinase is not significantly impaired, for example, 1 to 5, preferably The number is 1 to 4, more preferably 1 to 3, further preferably 1 to 2, and still more preferably 1.
  • the amino acid mutation in the amino acid sequence (b) may be any of amino acid substitution, deletion, addition and insertion, but is preferably substitution.
  • the amino acid to be substituted in the amino acid sequence (b) is preferably an amino acid other than the amino acid specified by the consensus sequence of the target kinase, from the viewpoint of specificity, sensitivity and the like.
  • the “consensus sequence” of the target kinase is the consensus sequence described in Tables 1 to 14 of Example 1-1 described later. For example, when the target kinase is CK2a2, the consensus sequence includes ⁇ ... SD.EE '', ⁇ ... SD.E ... '', ⁇ ...... SE.E ... "and” ... SD.D ... ". “.” Represents an arbitrary amino acid.
  • any may be selected, but it is desirable to select a consensus sequence having a higher FINC shown in Tables 1 to 14.
  • the “amino acid specified by the consensus sequence of the target kinase” means the sixth amino acid (S), the seventh amino acid (D), the ninth amino acid (E ) And the 10th amino acid (E).
  • the amino acid to be substituted in SEQ ID NO: 176 is selected from the other amino acids (amino acids 1 to 5, 8, 10 to 11 from the N terminus of SEQ ID NO: 176).
  • the amino acid after substitution in the amino acid sequence (b) is preferably an amino acid determined based on the PWM of the target kinase from the viewpoint of specificity, sensitivity and the like.
  • the “PWM” of the target kinase is described in Tables 15 to 77 in Example 1-1 described later.
  • “Determining based on PWM” means first specifying the position of the substitution target amino acid in PWM, specifically, the position of “0” in PWM is the sixth amino acid from the N-terminus of SEQ ID NOS: 1 to 187 Corresponding to (phosphorylated amino acid: S), the N-terminal position of the amino acid is indicated by “ ⁇ ” in PWM, and the C-terminal position of the amino acid is indicated by “+” in PWM.
  • amino acids after substitution are determined as “amino acids after substitution”.
  • amino acids other than E that have a high PWM score are K, R, A, and D.
  • the amino acid after substitution in the amino acid sequence (b) is selected from the viewpoints of specificity, sensitivity, etc., among the amino acid sequences described in Tables 78 to 82 of Example 1-2 described below. Selected from amino acids in parentheses.
  • the amino acid after substitution in the case of substituting the first amino acid (E) from the N-terminal side of the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 176) is from K, R, A, and D
  • the amino acid after substitution when the second amino acid (Q) is selected is selected from D and E
  • the amino acid after substitution when the third amino acid (D) is substituted is A, E, And G
  • the amino acid after substitution when substituting the fourth amino acid (E) is selected from D and V
  • the amino acid after substitution when substituting the fifth amino acid (W) is D Yes
  • the amino acid after substitution when substituting the eighth amino acid (D) is selected from E and G
  • the amino acid after substitution when substituting the tenth amino acid (E) is G, D, and Selected from A.
  • the substitution in the amino acid sequence (b) may be a conservative substitution.
  • a conservative substitution means that an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution technique.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine
  • substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
  • serine, threonine, tyrosine, methionine, and cysteine are preferably excluded from the selected amino acid branch after substitution.
  • the polypeptide of the present invention may be a polypeptide consisting only of the amino acid sequence (a) or (b), or includes the amino acid sequence (a) or (b), in other words, “amino acid sequence (a) or It may be a polypeptide comprising (b) "and” another amino acid sequence ".
  • the polypeptide of the present invention has an amino acid sequence in which arginine is added to the C terminus of the amino acid sequence (a) or arginine added to the C terminus of the amino acid sequence (b). It is preferable that the amino acid sequence is formed.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 50 or less, preferably 40 or less, more preferably 30 or less, still more preferably 20 or less, and even more preferably 15 or less.
  • the polypeptide of the present invention can be subjected to various tags (for example, biotin tag, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, etc.) are also included.
  • tags for example, biotin tag, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, etc.
  • the polypeptide of the present invention includes those in which the terminal amino acid is chemically modified as long as the phosphorylation reaction by the target kinase is not significantly inhibited.
  • the polypeptides of the present invention include those in which the C-terminus is a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ) or an ester (—COOR).
  • the polypeptide of the present invention preferably has an amide (—CONH 2 ) at the C-terminus.
  • R in the ester for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group is used.
  • a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl
  • the amino group of the N-terminal amino acid is a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc., preferably an acetyl group). It includes those that are protected.
  • a protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc., preferably an acetyl group.
  • the polypeptide of the present invention includes those in which amino acids other than the terminal are chemically modified as long as the phosphorylation reaction of the polypeptide of the present invention by the target kinase is not significantly inhibited.
  • the polypeptide of the present invention The amino acids other than the terminal are not chemically modified. Examples of the chemical modification in this case include amidation and esterification of a carboxyl group; and protection of an amino group by a protecting group. About esterification and a protecting group, it is the same as that of the above-mentioned chemical modification of the terminal.
  • the polypeptide of the present invention includes a salt form with an acid or a base.
  • the salt is not particularly limited, and either an acidic salt or a basic salt can be employed.
  • acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple Organic acid salts such as acid salts, citrate salts, methanesulfonate salts, and paratoluenesulfonate salts; and amino acid salts such as aspartate salts and glutamate salts.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the polypeptide of the present invention includes a solvate form.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the oligopeptide of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method depending on its amino acid sequence.
  • the oligopeptide of the present invention exhibits specific reactivity with the target kinase (that is, it is specifically phosphorylated by the target kinase). More specifically, in the oligopeptide of the present invention, the reactivity with respect to the target kinase is 2 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, the reactivity to other kinases, More preferably, it is 50 times or more, and still more preferably 100 times or more. The reactivity can be evaluated by the method of Example 2, 5, or 7 described later.
  • “Other kinase” refers to a kinase other than the target kinase (for Ser. Nos. 1 to 187, serine / threonine kinase (preferably 30% or more, 50% or more, 70% or more, or 90% or more of all serine / threonine kinases) Serine / threonine kinases) and SEQ ID NOS: 249 to 251 are not particularly limited as long as they are tyrosine kinases (preferably 30%, 50%, 70%, or 90% or more tyrosine kinases of all tyrosine kinases). .
  • ⁇ Kinase '' is preferably IKKb, CK2a2, CK1d, PLK1, ALK2, WNK3, IRAK1, NEK6, MLK1, MST3, TSSK1, MARK2, CaMK2a, MAPKAPK3, PKD3, ROCK1, PHKG2, PKCa, LATS1, PIM1, PAK2, AurC At least one selected from the group consisting of RSK1, AKT1, PKACa, CAMKK1, GSK3b, CDC2, JNK1, p38a, ERK2, MAP3K2, and DYRK4 except the target kinase (preferably 2, 5, 10, 20 Species, 30 species, all species).
  • the “other kinase” is preferably ABL1, ABL2, ACK, TNK1, ALK, LTK, AXL, MER, TYRO3, CTK, DDR2, EGFR, ERBB4 EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, FAK, PYK2, FER, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF1R, INSR, IRR, JAK1, , JAK3, LIMK1, MET, RON, TAK1, MUSK, FLT3, FMS, KIT, PDGFRA, PDGFRB, RET, ROS, BLK, BRK, FGR, FRK, FYN, HCK, LCK, LYNA, LYNB, SRC, SRM, YES SYK, ZAP70, BMX, B
  • Kinase activity measurement method and kinome analysis method comprises the step of contacting the polypeptide of the present invention with a test sample, the kinase activity measurement method or the test sample kinome analysis method (this specification) In some cases, it may be referred to as “the measuring method of the present invention”). This will be described below.
  • the test sample is not particularly limited as long as it can contain a kinase.
  • the test sample is, for example, an extract of a cell sample or a tissue sample collected from an organism (hereinafter collectively referred to as “biological sample”) or a purified product thereof; a sample derived from body fluid or body fluid; purification of kinase A thing etc. can be employ
  • the polypeptide of the present invention is specifically modified for the target kinase, it is suitable for measurement of a test sample containing a plurality of kinases.
  • the test sample is preferably a biological sample extract or a purified product thereof, a body fluid or a sample derived from a body fluid, and a composition containing a plurality of purified kinase products.
  • the organism from which the test sample is derived is not particularly limited as long as it can contain a kinase, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits. Among these, human is preferable.
  • the tissue sample is not particularly limited, and examples thereof include epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve tissue and the like.
  • Biological samples include, for example, blood cells, hematopoietic stem / progenitor cells, gametes (sperm, ovum), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, neurons, hepatocytes, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine Cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells (eg kidney cancer cells, leukemia cells, esophageal cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells, lung cancer cells, Prostate cancer cells, skin cancer cells, breast cancer cells, cervical cancer cells, etc.).
  • gametes sperm, ovum
  • fibroblasts epithelial cells
  • vascular endothelial cells neurons
  • hepatocytes keratinocytes
  • muscle cells epidermal cells
  • endocrine Cells ES cells
  • iPS cells tissue stem cells
  • cancer cells eg kidney cancer cells, le
  • the extract of the biological sample is not particularly limited as long as it is a cell membrane or nuclear membrane disruption in the biological sample.
  • the destruction of the cell membrane or the nuclear membrane can be obtained by subjecting a biological sample to a solubilization treatment.
  • the solubilization treatment can be carried out by subjecting the biological sample to ultrasonic treatment, suction agitation with a pipette, etc. in a buffer for solubilization treatment (hereinafter referred to as “solubilizing agent”).
  • the solubilizer is a buffer solution containing a substance that destroys the cell membrane or the nuclear membrane.
  • the solubilizer may further contain a substance that inhibits denaturation or degradation of the kinase.
  • substances that disrupt cell membranes or nuclear membranes include surfactants and chaotropic agents, but are not particularly limited.
  • the surfactant can be used as long as it does not inhibit the activity of the kinase to be measured.
  • examples of surfactants include polyoxyethylene alkyl phenyl ethers such as Nonidet P-40 (NP-40) and Triton X-100 (registered trademark of Dow Chemical Company); deoxycholic acid, CHAPS, etc. Is mentioned.
  • Substances that disrupt cell membranes or nuclear membranes may be used alone or in admixture of two or more.
  • the concentration of the substance that breaks the cell membrane or the nuclear membrane in the solubilizer is usually 0.1 to 2% w / v%.
  • substances that inhibit kinase denaturation or degradation include, but are not limited to, protease inhibitors.
  • the protease inhibitor include metalloprotease inhibitors such as EDTA and EGTA; serine protease inhibitors such as PMSF, trypsin inhibitor and chymotrypsin; and cysteine protease inhibitors such as iodoacetamide and E-64, but are not particularly limited.
  • Substances that inhibit denaturation or degradation of these kinases may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the substance that inhibits denaturation or degradation of the kinase in the solubilizer is usually 0.5 to 10 mM in the case of EDTA, EGTA, and PMSF.
  • Purification of an extract of a biological sample can be performed according to or according to a known method. For example, removal of insoluble matters, concentration of kinase, and the like can be mentioned.
  • the method for concentrating the kinase is not particularly limited, and examples thereof include an immunoprecipitation method using an antibody against the kinase.
  • the body fluid examples include whole blood, serum, plasma, saliva, spinal fluid, joint fluid, urine, tissue fluid, sweat, tears, saliva and the like.
  • the sample derived from the body fluid is not particularly limited as long as it is a sample prepared from the body fluid, and examples thereof include a sample obtained by concentrating and purifying a kinase contained in the body fluid from the body fluid.
  • the polypeptide of the present invention is specifically modified with respect to the target kinase, it is suitable for measurement of a test sample containing a plurality of kinases.
  • the polypeptide of the present invention used in the method of the present invention is preferably a plurality of types corresponding to the target kinase of 2, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 187. It is preferable that it is polypeptide of.
  • a plurality of types of polypeptides corresponding to a plurality of types of target kinases are used, it becomes possible to specifically and simultaneously measure the activities of various types of kinases.
  • the contact between the test sample and the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as the kinase can modify the polypeptide of the present invention by its enzymatic action.
  • the contact is usually performed in a buffer in the presence of ATP, an ATP-labeled product, an ATP derivative, or the like.
  • a buffer capable of maintaining a pH (usually 6 to 8, preferably 7 to 7.8) at which the kinase activity can be maintained is suitably used.
  • a buffer capable of maintaining a pH (usually 6 to 8, preferably 7 to 7.8) at which the kinase activity can be maintained is suitably used.
  • HEPES buffer Tris hydrochloric acid buffer, or the like is used.
  • the buffer contains a metal ion necessary for exerting the activity of the kinase, for example, magnesium ion, manganese ion, etc., as necessary.
  • the ATP-labeled product is not particularly limited, and examples thereof include a radioisotope ATP-labeled product in which a phosphorus atom constituting ATP is replaced with a radioisotope (for example, 32 P).
  • the ATP derivative is not particularly limited.
  • ATP- ⁇ S adenosine-5 ′-( ⁇ -thio) -triphosphate
  • JP-A-2002-335997 JP-A-2015-192635
  • DNP dinitrophenyl
  • the polypeptide of the present invention is modified based on the enzymatic action of the kinase in accordance with the kinase activity of the test sample.
  • the mode of modification differs depending on the contact conditions. For example, if ATP is used, the modification is addition of a phosphate group, and if a radioisotope ATP label is used, the modification is radioisotope-labeled phosphorus. If an ATP- ⁇ S is used, the modification is an addition of a thiophosphate group, and if a DNP group-linked ATP derivative is used, it is an addition of a DNP group-linked phosphate group.
  • the quantitative value of the amount of modification can be used as the kinase activity value.
  • the measurement of the amount of modification can be performed according to or according to a known method depending on whether the polypeptide of the present invention is a single type or a plurality of types, the mode of modification, and the like. Measurement is performed by, for example, reaction with an antibody against a peptide to which a phosphate group, a DNP-linked phosphate group, or the like is added; a fluorescent substance having a binding site to a thiophosphate group (eg, alkyl halide, maleimide, aziridine site, etc.), biotin , Reaction with enzymes, reaction with antibodies against various substances (eg fluorescent substances, biotin, enzymes, etc.), luminescence reaction / detection based on enzyme action, fluorescence detection, radiation detection, chromatography, mass spectrometry, etc. Or it can carry out combining suitably.
  • a fluorescent substance having a binding site to a thiophosphate group eg, alkyl halide, maleimide, aziridine site,
  • Kinase substrate (array), reagent for measuring kinase activity (or kit) comprises a kinase substrate comprising the polypeptide of the present invention (sometimes referred to herein as “substrate of the present invention”), the polypeptide of the present invention and a solid phase, and A kinase substrate array in which the polypeptide of the present invention is immobilized on a solid phase (sometimes referred to herein as “substrate array of the present invention”), a reagent for measuring kinase activity containing the substrate of the present invention (In this specification, it may be referred to as “the reagent of the present invention”), and a kinase activity measurement kit comprising at least one selected from the group consisting of the substrate of the present invention and the substrate array of the present invention ( In the present specification, it may be referred to as “kit of the present invention”).
  • kit of the present invention comprising at least one selected from the group consisting of the substrate of the present invention and the substrate array
  • the solid phase in the substrate array of the present invention is not particularly limited as long as it can immobilize the polypeptide of the present invention.
  • the solid phase include substrates such as glass, polydimethylsiloxane, and gold.
  • the shape of the substrate can be applied to any of the substrates reported so far, such as a flat plate, a pillar array, and a well array.
  • glass is coated with a silane coupling agent, or the surface is coated with a polysaccharide, and polydimethylsiloxane is coated with a surface such as a polysaccharide, or the surface is modified with plasma or the like.
  • functional groups such as amino groups and carboxyl groups are introduced by modification with thiol derivatives.
  • the polypeptide of the present invention can be immobilized by using a crosslinking agent or the like for this, converting the terminal carboxy group into an active ester, or introducing a formyl group or a maleimide group, and then reacting the peptide end as a cysteine residue. .
  • the polypeptide of the present invention is specifically modified with respect to the target kinase, it is suitable for measurement of a test sample containing a plurality of kinases.
  • the polypeptide of the present invention contained in the substrate array of the present invention is preferably a plurality of corresponding to 2, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 187 target kinases.
  • a species polypeptide is preferred.
  • the reagent of the present invention may be composed of the substrate of the present invention or may contain other components.
  • examples of other components include a base, a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a thickener, a moisturizer, a colorant, and a fragrance.
  • chelating agents include a base, a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a thickener, a moisturizer, a colorant, and a fragrance.
  • chelating agents include a base, a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a
  • the content of the substrate of the present invention in the reagent of the present invention is not particularly limited, but can be, for example, 0.0001 to 100% by mass.
  • the kit of the present invention may consist of at least one selected from the group consisting of the substrate of the present invention and the substrate array of the present invention, or in addition to this, Instruments, reagents, and the like that can be used to perform the measurement method may be included.
  • instruments include test tubes, microtiter plates, agarose particles, latex particles, purification columns, epoxy-coated slide glasses, and gold colloid-coated slide glasses.
  • reagents include ATP, ATP-labeled products, ATP derivatives, buffers, antibodies to peptides to which phosphate groups and DNP-linked phosphate groups have been added, substances having binding sites for thiophosphate groups (for example, fluorescent substances) , Biotin, enzyme, etc.), antibodies against various substances (for example, fluorescent substances, biotin, enzyme, etc.), luminescence detection reagents for various enzymes, positive control samples having kinase activity, negative control samples having no kinase activity, and the like.
  • the test substance kinase comprises a step of contacting the polypeptide of the present invention with a test sample in the presence of the test substance.
  • the present invention relates to a method for evaluating activity-modulating ability (in this specification, sometimes referred to as “the evaluation method of the present invention”). This will be described below.
  • polypeptide of the present invention and the test sample are as described in “2. Kinase activity measurement method and kinome analysis method” above.
  • the test substance can be widely used regardless of whether it is a naturally occurring compound or a man-made compound. Moreover, the composition which mixed not only the refined compound but various compounds, and the extract of animals and plants can also be used.
  • the compounds include not only low molecular compounds but also high molecular compounds such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides.
  • the test substance is a substance that can indirectly regulate the kinase activity in the test sample (for example, a substance that inhibits a protein or enzyme in the middle of the cascade of the kinase), and the activity of the kinase in the test sample directly. It can be a substance that can be regulated to a specific level (for example, a substance that inhibits the function of kinase).
  • the kinase activity value (test value) obtained by the method including the above steps is the same as the kinase activity value measured in the absence of the test substance.
  • control value the step of evaluating that the test substance has the ability to regulate kinase activity is included.
  • the test substance when the test value is higher than the control value (for example, 2 times, 5 times, 10 times, 20 times, 50 times, 100 times), the test substance And / or the test value is lower than the control value (eg, 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1 / 100), it includes a step of evaluating that the test substance has the ability to inhibit kinase activity.
  • the control value for example, 2 times, 5 times, 10 times, 20 times, 50 times, 100 times
  • the test substance And / or the test value is lower than the control value (eg, 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1 / 100)
  • the evaluation method of the present invention can be used for drug discovery target search, drug sensitivity prediction, side effect prediction, drug screening, and the like.
  • Example 1-1 Extraction of substrate consensus sequence and preparation of PWM The Hela cell extract was dephosphorylated and then reacted separately with each human kinase recombinant in the presence of ATP and metal ions. After digestion with trypsin, the phosphorylated peptide was concentrated by metal oxide chromatography, and then the sequence of the phosphorylated peptide and the modification site were identified by LC-MS measurement. Using the information of more than 190,000 in vitro kinase-substrate information on about 400 kinds of kinases obtained in this way, extraction of substrate consensus sequence and creation of PWM were performed according to the following procedure.
  • the PWM of each kinase substrate was prepared with reference to a report by Wasserman et al. (Reference 2: W. W. Wasserman and A. Sandelin, Nat. Rev. Genet. 5, 276 (2004)).
  • the appearance probability p (b, i) of amino acid b at the i-th sequence in the substrate group was calculated using the following equation.
  • f b, i is the number of occurrences of amino acid b in sequence i
  • N is the total number of sequences
  • c (b) is a pseudocount of amino acid b
  • p (b) is the probability of occurrence of amino acid b in the human proteome Indicates.
  • Tables 15 to 77 show the PWM generated for each kinase.
  • Example 1-2 Substrate Peptide Sequence Design Using a consensus sequence and PWM, candidate substrate peptide groups were designed by the following procedure. (1) The length of the peptide was 12 amino acids, and the phosphoacceptor (serine or tyrosine) was the sixth position from the N-terminus. (2) The C-terminal amino acid was fixed with arginine. (3) The amino acid located in the consensus sequence which takes the maximum value of fold increase in the extracted was fixed. (4) The remaining amino acids used the top 5 amino acids in the PWM. (5) Serine, threonine, tyrosine, methionine, and cysteine were not used in any part other than phosphoacceptor in any process. The degree of coincidence (PWM score) of each kinase with PWM was calculated for the obtained substrate peptide candidate group using the following formula.
  • q i represents the i-th amino acid in peptide q 1.
  • amino acids located in the phosphoacceptor were not used to calculate the PWM score.
  • the gini coefficient in the PWM score was calculated with reference to the report by Graczyk et al. (Reference 3: PP Graczyk, J. Med. Chem. 50, 5773 (2007)).
  • Tables 78 to 82 show sequences obtained by removing C-terminal arginine from the obtained substrate peptide sequences.
  • “-” indicates a delimiter of each amino acid in the amino acid sequence
  • the SEQ ID NO: indicates the substrate peptide sequence in which the sequence of amino acids outside the parentheses is designed. SEQ ID NO: is shown. It should be noted that amino acids in parentheses are those with a positive PWM score and a gini coefficient of 0.8 or more, and amino acids outside the parentheses may be replaced with any of the amino acids in the parentheses.
  • Example 2 Evaluation of specificity of designed substrate kinase peptides 1
  • a polypeptide in which arginine was added to the C-terminus of the substrate peptide sequence designed in Example 1, the N-terminal amino group was acetylated, and the C-terminal carboxyl group was amidated was synthesized.
  • Table 83 shows the target kinase and substrate peptide sequences (sequences excluding arginine added to the C terminus) of some of the synthesized polypeptides.
  • polypeptide As a kinase substrate, various human recombinant kinases (IKKb, CK2a2, CK1d, PLK1, ALK2, WNK3, IRAK1, NEK6, MLK1, MST3, TSSK1, MARK2, CaMK2a, MAPKAPK3, PKD3, ROCK1, PHKG2 , PKCa, LATS1, PIM1, PAK2, AurC, RSK1, AKT1, PKACa, CAMKK1, GSK3b, CDC2, JNK1, p38a, ERK2, MAP3K2, and DYRK4) were examined. Specifically, it was performed as follows.
  • the analytical column is a self-contained sprayer integrated column packed with ReproSil-Pur C18-AQ (particle size 3 ⁇ m, Dr. Maisch) in a fused silica capillary with a sharp tip (length: 15 cm, inner diameter: 100 ⁇ m) (Reference 4: Y. Ishihama, J. Rappsilber, JS Andersen, and M. Mann, J. Chromatogr. A 979, 233 (2002).), HTC-PAL (CTC Analytics), liquid for autosampler For the chromatograph, Ultimate3000 RSLCnano (Thermo Fisher Scientific) was used.
  • the mobile phase A was 0.5% acetic acid
  • the mobile phase B was 80% acetonitrile, and 0.5% acetic acid.
  • Q Exactive, Finnigan LTQ (Thermo Fisher Scientific) or TripleTOF 5600+ (Sciex) was used, and MS / MS spectra were acquired in Data Dependent Acquisition (DDA) mode.
  • DDA Data Dependent Acquisition
  • Mascot v2.5 Automatic database search by Mascot v2.5 was performed on the obtained MS / MS spectrum.
  • the database used was a file describing the name of the substrate peptide and its sequence in FASTA format.
  • Skyline Reference 5: B. Schilling, MJ Rardin, BX MacLean, a. M.
  • the amount of phosphorylation (peak area) of each kinase by the kinase substrate is shown in FIGS. 1 to 16, it was experimentally shown that the polypeptide containing the substrate peptide sequence designed by the method of Example 1 is specifically phosphorylated with respect to the target kinase. Therefore, SEQ ID NOs: 1 to 187 have a substrate consensus sequence, and the kinase activity value is actually 2 from the peptide sequence designed on the basis that the PWM score of amino acids other than the substrate consensus sequence is a positive value and the gini coefficient is 0.8 or more. It is related to becoming more than double.
  • Example 3 Measurement of intracellular kinase activity using substrate peptide
  • the substrate peptide designed by the method of Example 1 since the substrate peptide designed by the method of Example 1 has specificity for the target kinase, it is like a cell extract. Even in a mixed kinase sample, it is possible to measure enzyme activity specifically for the target kinase. Therefore, in this example, the quantitativeness, selectivity, and peptide recovery rate in the kinase activity measurement using the substrate peptide and the cell extract were evaluated. Specifically, it was performed as follows.
  • polypeptides other than TSSKtide1, LATStide3, and RSKtide2 are polypeptides in which arginine is added to the C-terminus and the N-terminal amino group is acetylated.
  • the cell extract used in this example was prepared as follows. HeLa cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (containing 10% fetal calf serum and kanamycin) under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . HeLa cells were serum starved in low serum medium (containing 0.1% fetal calf serum and kanamycin) for 16 hours. After that, add the DMSO (dimethyl sulfoxide) solution of each inhibitor to the kinase inhibitor treatment group so that the drug concentration in the medium is 10 ⁇ M, and add only the same amount of DMSO to the control sample and let it infiltrate for 20 minutes. It was.
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 10% fetal calf serum and kanamycin
  • low serum medium containing 0.1% fetal calf serum and kanamycin
  • EGF dissolved in PBS was added so that the concentration in the medium would be 150 ng / mL.
  • the cells were recovered using a scraper.
  • HeLa cell pellet was lysed (10 mM phosphate buffer pH 7.0, 0.5% NP-40, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM MgCl 2 , 50 mM ⁇ -glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 , 2 It was suspended on ice with mM dithiothreitol, 1% protease inhibitor cocktail. After centrifugation at 4 ° C. and 10,000 g for 15 minutes, the supernatant was used as a cell extract. The total protein concentration in the cell extract was quantified by the BCA method (BSA standard).
  • ⁇ Test 1> A phosphorylation reaction was performed with the aforementioned substrate peptide groups (50 pmol each) and HeLa cell extract (0, 0.3, 1, 3, 10, 30 ⁇ g), and the quantitative properties thereof were evaluated. Specifically, it was performed as follows. 25 ⁇ L of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 5 mM ATP, 10 mM MgCl 2 , 0.1 mM dithiothreitol, 1% protease inhibitor cocktail, 1% phosphatase inhibitor cocktail for each substrate peptide mixture (50 pmol each) The cell extract was added in and allowed to react at 25 ° C. for 45 minutes.
  • the kinase reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 1% trifluoroacetic acid. Interface by StageTip (Reference 6: J. Rappsilber, Y. Ishihama, and M. Mann, Anal. Chem. 75, 663 (2003)) equipped with SDB-XC and SCX Empore Disk (GL Sciences) after the kinase reaction After removing the activator, desalting and purification were performed by SDB-XC StageTip. The phosphorylated polypeptide in the obtained sample was quantified by LC-MS in the same manner as in Example 2.
  • Results are shown in FIGS. 17A and 17B.
  • the quantitative value of the phosphorylated form by LC-MS has a high linearity with respect to the amount of the cell extract, and succeeded in quantitatively measuring the activity of the cell extract-derived kinase using the substrate peptide (FIG. 17A).
  • FIG. 17B The quantitative value of the phosphorylated form by LC-MS has a high linearity with respect to the amount of the cell extract, and succeeded in quantitatively measuring the activity of the cell extract-derived kinase using the substrate peptide.
  • CK2a2 recombinant kinase
  • Results are shown in FIG. 17C. Although a decrease in sensitivity was observed in the presence of the cell extract, it was confirmed that the same linearity as in the absence was maintained.
  • ⁇ Test 3> In order to confirm kinase selectivity in cell extracts, substrate peptides designed to react only with ERK2 react individually with recombinants of MAPK3 species (ERK2, p38a, JNK1) in the presence of cell extracts I let you. Specifically, the test was performed in the same manner as in Test 1 except that the MAPK3 species was added to the kinase reaction solution.
  • Results are shown in FIG. 17D.
  • the substrate peptide of ERK2 was confirmed to increase phosphorylation specifically according to the amount of ERK2 added.
  • MAPKs conserved in mammals have four major subfamilies, ERK1 / 2, p38, JNK, and ERK5, which form their own MAPK cascade.
  • FIG. 18 (Reference 7: M. Cargnello and PP Roux, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, 50 (2011)).
  • These MAPK pathway groups have different cellular functions, for example, Raf-MEK1 / 2-ERK1 / 2 pathway is related to cell proliferation and growth, and MEK3 / 6-p38 pathway is related to stress and immune response. Yes. Therefore, it is important in drug discovery research to evaluate each MAPK cascade separately.
  • the effect of each MAPK pathway inhibitor on intracellular kinase activity was examined by taking advantage of the kinase specificity of the substrate peptide. Specifically, it was performed as follows.
  • a polypeptide in which arginine was added to the C-terminus of the substrate peptide sequence designed in Example 1, the N-terminal amino group was acetylated, and the C-terminal carboxyl group was amidated was synthesized.
  • Table 85 shows the target kinase and substrate peptide sequences (sequences excluding arginine added to the C terminus) of some of the synthesized polypeptides.
  • Selumetinib (MEK1 inhibitor), SB202190 (p38a / b inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor), XMD8-92 (ERK5 inhibitor) were used as kinase inhibitors.
  • the cell sample uses a HeLa cell extract obtained in the same manner as in Example 3 except that EGF stimulation is performed after treating each inhibitor, and includes 33 types of serine / threonine kinases and a kinase group on the MAPK pathway. Intracellular kinase activity was measured using a substrate peptide mixture for 75 kinases. As a result of the measurement, the phosphorylation fluctuation ratio of the obtained substrate peptide is shown in FIG. 19 as a heat map. The phosphorylation fluctuation ratio showed a profile peculiar to each inhibitor, and it was possible to evaluate the influence of the MAPK inhibitor on the kinase group.
  • Example 5 Evaluation of specificity of designed substrate kinase peptides 2
  • a polypeptide in which arginine was added to the C-terminus of the substrate peptide sequence designed in Example 1, the N-terminal amino group was acetylated, and the C-terminal carboxyl group was amidated was synthesized.
  • Table 86 shows the target kinase, the substrate peptide sequence (sequence excluding arginine added to the C terminus), the SEQ ID NO, and the Gini coefficient.
  • the amount of phosphorylation by the target kinase relative to the total phosphorylation amount by each kinase of the kinase substrate (phosphorylation amount: target kinase / total kinase total), and the phosphorylation by the target kinase when the phosphorylation amounts by each kinase are arranged in descending order Rank of oxidation amount (ranking of target kinases is shown in Table 86.
  • the phosphorylation amount of each kinase by the kinase substrate whose target kinase is PLK3 is shown in FIG. 21, and the kinase substrate whose target kinase is ERK7.
  • Fig. 22 The amount of phosphorylation by each recombinant kinase is shown in Fig. 22. From Table 86 and Figs.21 to 22, the polypeptide containing the substrate peptide sequence designed by the method of Example 1 is specific for the target kinase. It has been experimentally shown to be phosphorylated.
  • Example 6 Kinase substrate peptide design 2 A substrate peptide candidate group was designed in the same manner as in Example 1-2 using the consensus sequence and PWM prepared in Example 1-1 (the PWM used is shown in Table 87).
  • Table 88 shows a part of the sequence obtained by removing C-terminal arginine from the obtained substrate peptide sequence.
  • “-” indicates the delimiter of each amino acid in the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: is the SEQ ID NO of the substrate peptide sequence in which the amino acid sequence outside the parentheses is designed Indicates.
  • amino acids in parentheses are those with a positive PWM score and a gini coefficient of 0.8 or more, and amino acids outside the parentheses may be replaced with any of the amino acids in the parentheses.
  • Example 7 Evaluation of the specificity of designed substrate kinase peptides 3
  • a polypeptide in which arginine was added to the C-terminus of the substrate peptide sequence designed in Example 6, the N-terminal amino group was acetylated, and the C-terminal carboxyl group was amidated was synthesized.
  • Table 89 shows the target kinases, substrate peptide sequences (sequences excluding arginine added to the C terminus), and SEQ ID NOs for some of the synthesized polypeptides.
  • various human tyrosine recombinant kinases (ABL1, ABL2, ACK, TNK1, ALK, LTK, AXL, MER, TYRO3, CTK, DDR2, EGFR, ERBB4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, FAK, PYK2, FER, FES, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF1R, INSR, IRR, JAK1, JAK2, JAK3, LIMK1, MET3, LIMK1 RON, TAK1, MUSK, FLT3, FMS, KIT, PDGFRA, PDGFRB, RET, ROS, BLK, BRK, FGR, FRK, FYN, HCK, LCK, LYNA, LYNB, SRC, SRM, YES, SYK, Z
  • FIG. 23 shows the amount of phosphorylation by each recombinant kinase of the kinase substrate whose target kinase is TYRO3
  • FIG. 25 shows the amount of phosphorylation of the kinase substrate in which FER is FER by each recombinant kinase. 23 to 25, it was experimentally shown that the polypeptide containing the substrate peptide sequence designed by the method of Example 6 is specifically phosphorylated with respect to the target tyrosine kinase.

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Abstract

各キナーゼに対して特異的且つ高感度にリン酸化されるポリペプチドを提供すること、及びキノームをより高い精度で解析可能な、キナーゼ基質のセットを提供することを課題とし、（a）又は（b）のアミノ酸配列：（a）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は（b）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、を含み、且つ対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上であるポリペプチド。

Description

キナーゼ基質
　本発明は、キナーゼ基質として利用できるポリペプチド等に関する。
　細胞内では様々な機能を発現するために情報を伝達する分子機構が存在し、タンパク質の翻訳後修飾、特にタンパク質のリン酸化はそのシグナル伝達において重要な役割を果たしている。細胞内シグナル伝達機構は多数の分子が連携する複雑なネットワークを形成しており、多くの疾患ではタンパク質リン酸化酵素であるプロテインキナーゼの変異や過剰発現による活性化によるシグナル伝達異常が関与している。
　疾患の進行度や細胞種などにより多様に変化するシグナル伝達系全体を把握し、創薬研究や個別化治療を推進するためには、518種存在するとされるヒトキノーム（ヒトキナーゼ総体）の活性を包括的に捉えることが重要である。このような背景から、シグナル伝達に関与するキナーゼ群の活性を計測する手法が開発され使用されている。キナーゼの活性を計測する一般的な方法として、基質となるタンパク質あるいはペプチドを試料中のキナーゼと反応させ、リン酸化された基質を測定することでキナーゼ活性を計測する方法が用いられている（例えば、特許文献１－４）。リン酸化ペプチド又はタンパク質を検出する手段としては、抗リン酸化抗体を用いたELISA、mobility shift assay、ペプチドアレイ、プロテインアレイ、LC-MSなどがある。
　しかしながら、これらの方法では細胞抽出物のようなキナーゼ混合試料を使用する場合、基質ペプチドのキナーゼ特異性の低さが問題となり、個々のキナーゼ活性を正確に評価するのは困難である。同様にリン酸化モチーフをターゲットとした抗体も、キナーゼのリン酸化モチーフ自体の特異性が高くないことなら、区別した活性計測が難しいという問題がある。一方、LC-MSを用いたリン酸化プロテオミクスでは一度の分析によって細胞内で起こる大量のリン酸化部位を定量的に解析できるが、どのキナーゼが活性化されたかが不明なため、キナーゼ活性を高精度且つ網羅的に予測するには至っていない。
　例えば、特許文献２では、セリンスレオニンキナーゼの一種である分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（MAPK）類に属するErk2、JNK1、p38αの活性測定用の基質ポリペプチドが報告されているが、同一の配列を有するペプチドがErk2、JNK1、p38αの基質となり得る。そのため、これらのペプチドを用いても、Erk2、JNK1、p38のいずれかの活性を測定しているのか判別できない。
特開2007-236388号公報 特開2008-289374号公報 国際公開第2011/030890号 国際公開第2010/040024号
　本発明は、各キナーゼに対して特異的且つ高感度にリン酸化されるポリペプチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、キノームをより高い精度で解析可能な、キナーゼ基質のセットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、本発明者らが取得した約400種のキナーゼに関する190,000個超のin vitroキナーゼ－基質間情報に基づいた、PWM （position weighting matrix、以下PWMと略する。）や相乗効果を考慮したFINC（fold-increase、以下FINCと略する。）、更に基質特異性を高めるためにGini係数などを用いることによって、各キナーゼに対して特異的且つ高感度にリン酸化される基質ポリペプチドを設計できるという知見を得た。この知見に基づいて本発明者はさらに鋭意研究を重ねた結果、（a）又は（b）のアミノ酸配列：（a）配列番号1～187のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は（b）配列番号1～187のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、を含み、且つ対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上であるポリペプチドであれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　下記（a）又は（b）のアミノ酸配列：
（a）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
を含み、且つ対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上であるポリペプチド。
　項２．　前記アミノ酸配列が前記（a）のアミノ酸配列である、項１に記載のポリペプチド。
　項３．　前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a1）のアミノ酸配列：
（a1）配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、及び182のいずれかに示されるアミノ酸配列、
であり、且つ
前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b1）のアミノ酸配列：
（b1）配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、及び182のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
である、項１又は２に記載のポリペプチド。
　項４．　前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a2）のアミノ酸配列：
（a2）配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、及び187のいずれかに示されるアミノ酸配列、
であり、且つ
前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b2）のアミノ酸配列：
（b2）配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、及び187のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
である、項１又は２に記載のポリペプチド。
　項５．　前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a3）のアミノ酸配列：
（a3）配列番号249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、
であり、且つ
前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b3）のアミノ酸配列：
（b3）配列番号249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
である、項１又は２に記載のポリペプチド。
　項６．　前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列におけるアミノ酸変異が、アミノ酸の置換である、項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
　項７．　前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換対象のアミノ酸が、対象キナーゼのコンセンサス配列で特定されるアミノ酸以外のアミノ酸である、項６に記載のポリペプチド。
　項８．　前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換後のアミノ酸が、対象キナーゼのPosition Weight Matrixに基づいて決定されたアミノ酸である、項６又は７に記載のポリペプチド。
　項９．　前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換後のアミノ酸が、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、及びシステイン以外のアミノ酸である、項６～８のいずれかに記載のポリペプチド。
　項１０．　構成するアミノ酸数が20以下である、項１～９のいずれかに記載のポリペプチド。
　項１１．　項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドからなる、キナーゼ基質。
　項１２．　項１～１０のいずれかに記載のポリペプチド及び固相を含み、且つ前記ポリペプチドが固相に固定されている、キナーゼ基質アレイ。
　項１３．　項１１に記載のキナーゼ基質を含有する、キナーゼ活性測定用試薬。
　項１４．　項１１に記載のキナーゼ基質及び項１２に記載のキナーゼ基質アレイからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キナーゼ活性測定用キット。
　項１５．　項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを接触させる工程を含む、キナーゼ活性測定方法。
　項１６．　項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを接触させる工程を含む、被検試料のキノーム解析方法。
　項１７．　項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを被検物質の存在下で接触させる工程を含む、被検物質のキナーゼ活性調節能を評価する方法。
　本発明のポリペプチドは、各キナーゼに対して特異的且つ高感度にリン酸化される。本発明のポリペプチドを利用することで、従来法では分別して活性を計測することが困難であった、特異性が類似したキナーゼを区別して活性を計測することが可能となる。そのため、測定の対象となる細胞や組織中の複数のキナーゼ活性を迅速且つ一斉に計測することができ、簡便且つ正確に細胞内キノームを解析することが可能である。
実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドCK1dtide 1の反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドCK1dtide 2の反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドERK2tide 1の反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドERK2tide 2の反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドCK2a2tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドIKKbtideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドMARK2tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドMAPKAPK3tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドJNK1tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドCDC2tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドDYRK4tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドPLK1tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドMLKtideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドCAMK2atideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドNEK6tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 実施例2において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドIRAK1tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼ名を示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。 （Ａ）実施例3の試験1の結果を示す。マトリックスの横側には用いた基質ペプチド及び濃度を示し、上側には用いた細胞抽出物の量を示し、右側には相関係数を示す。Relative peak areaは測定されたリン酸化量の相対値を示す。（Ｂ）実施例3の試験1の結果を示す。グラフ上側に用いた基質ペプチドを示し、横軸は用いた細胞抽出物の量を示し、縦軸は測定されたリン酸化量の相対値を示す。（Ｃ）実施例3の試験2の結果を示す。グラフ上側に用いた基質ペプチドを示し、横軸は用いた基質ペプチドの量を示し、縦軸は測定されたリン酸化量の相対値を示す。（Ｄ）実施例3の試験3の結果を示す。グラフ上側に用いた基質ペプチドを示し、横軸は用いたMAPKを示し、縦軸は測定されたリン酸化量の相対値を示す。グラフの各カラム上にMAPKの使用量を示す。（Ｅ）実施例3の試験4の結果を示す。縦軸はATP無添加条件下でのキナーゼ反応後の基質ペプチドの回収率を示し、横軸は用いた基質ペプチドを示す。 哺乳類で保存されているMAPKの4つの主要なサブファミリー（ERK1/2、p38、JNK、ERK5）のMAPKカスケード、及びそれを抑制する薬剤名及び抑制するカスケード上の位置を示す。 実施例4の、各阻害薬を作用させた場合の、基質ペプチドのリン酸化変動比のヒートマップを示す。 実施例4の、各阻害薬を作用させた場合の、基質ペプチドのリン酸化量を示す。グラフ上側に用いた基質ペプチドを示し、横軸は用いたMAPK阻害薬を示し（controlは阻害薬の使用無し）、縦軸は測定されたリン酸化量を示す。 実施例5において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドErk7tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼを示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。横軸のキナーゼの並び順は、左から、CDC7_ASK、CK2A1、CK2a2、CDK2_CYCE1、ERK7、CDK9_CYCLINK、DYRK1A、DYRK4、DYRK2、DYRK3、HIPK1、HIPK2、HIPK3、HIPK4、ICK、MOK、GSK3b、CDK6_CYCD3、CDK6_CYCLIND1、CDK7_CYCH_MAT1、CDK9_CYCT1、ERK5、CDC2_CycB1、CDK2_CYCA2、CDK5_P25、CDK3_CYCE1、NLK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、P38D、P38G、p38a、P38B、CLK1、CLK3、MAP2K1、MAP2K7、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K2、STK33、TAK1、CAMKK1、CAMKK2、ACTR2、HRI、PEK、CK1A、CK1d、CK1E、CK1G1、CK1G2、CK1G3、BMPR1B、ALK2、ALK4、TGFBR1、BARK1、GPRK5、GPRK7、RHOK、BUBR1、PLK1、PLK3、TLK1、TLK2、CHK2、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MAPKAPK5、PKD2、PKD1、PKD3、CAMK1D、CAMK2B、CaMK2a、CAMK2G、CAMK2D、CHK1、LATS1、LATS2、IRAK1、CAMK4、DCLK1、DCLK2、MNK2、PKCG、PKCa、PKCB1、PKCT、PKCH、PKCZ、PKN1、PKN2、PLK4、AURB、AURA、AurC、PAK1、PAK2、PAK3、AKT1、AKT2、AKT3、SGK1、SGK2、SGK3、CGK2、PKG1B、PKG1A、PKACa、PKACB、PRKX、MSK1、MSK2、RSK1、RSK2、RSK4、RSK3、P70S6K、DAPK1、NDR1、NDR2、ROCK1、ROCK2、P70S6KB、PIM2、PIM1、PIM3、PAK5、PAK4、PAK6、BRSK2、AMPKA1_B1_G1、AMPKA2_B1_G1、NUAK1、NUAK2、MELK、MARK2、MARK1、MARK4、MARK3、QIK、NIM1、SIK、TSSK1、TSSK2、SKMLCK、COT、PHKG1、IKKA、IKKb、IKKE、TBK1、NEK2、NEK6、NEK7、MLK2、MLK1、MLK3、NEK9、TTBK1、MAP3K1、GCK、MST1、MST2、HGK、MINK、KHS1、TNIK、MST3、MST4、YSK1、PHKG2、TAO2、ZAK、NEK4、SGK496、ULK3、LIMK1、WNK1、WNK2、WNK3、TAO1の順である。 実施例5において、各種組換えキナーゼに対するポリペプチドPLK3tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたキナーゼを示し、縦軸は各組換えキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。横軸のキナーゼの並び順は図２１と同じである。 実施例7において、各種組換えチロシンキナーゼに対するポリペプチドTYRO3tideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたチロシンキナーゼを示し、縦軸は各組換えチロシンキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。横軸のキナーゼの並び順は、左から、ABL1、ABL2、ACK、TNK1、ALK、LTK、AXL、MER、TYRO3、CTK、DDR2、EGFR、ERBB4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、FAK、PYK2、FER、FES、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、INSR、IRR、JAK1、JAK2、JAK3、LIMK1、MET、RON、TAK1、MUSK、FLT3、FMS、KIT、PDGFRA、PDGFRB、RET、ROS、BLK、BRK、FGR、FRK、FYN、HCK、LCK、LYNA、LYNB、SRC、SRM、YES、SYK、ZAP70、BMX、BTK、ITK、TEC、TXK、TIE2、TRKA、TRKB、TRKC、FLT1、FLT4、KDR、WEE1である。 実施例7において、各種組換えチロシンキナーゼに対するポリペプチドEGFRtideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたチロシンキナーゼを示し、縦軸は各組換えチロシンキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。横軸のキナーゼの並び順は図２３と同じである。 実施例7において、各種組換えチロシンキナーゼに対するポリペプチドFERtideの反応性を調べた結果を示す。横軸は試験に用いたチロシンキナーゼを示し、縦軸は各組換えチロシンキナーゼによりリン酸化されたポリペプチド量の相対値を示す。横軸のキナーゼの並び順は図２３と同じである。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。また、本明細書におけるアミノ酸の略表記は一文字表記を用い、アミノ酸配列は左側をN末端側として記載する。
　1．ポリペプチド
　本発明は、その一態様において、（a）又は（b）のアミノ酸配列：（a）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は（b）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、を含み、且つ対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上であるポリペプチド（本明細書において、「本発明のポリペプチド」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　アミノ酸配列（a）及び（b）において、配列番号1～187及び249～251は、それぞれ別々のキナーゼ（対象キナーゼ）に対して特異的な反応性を示す（即ち、それぞれ別々のキナーゼ（対象キナーゼ）により特異的にリン酸化される）アミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列が特異的な反応性を示す対象キナーゼは、後述の実施例1-2の表７８～８２のとおりである。例えば、配列番号176はCK2a2に対して特異的な反応性を示す。配列番号1～187はセリン／スレオニンキナーゼに対して特異的な反応性を示すアミノ酸配列であり、配列番号249-～251はチロシンキナーゼに対して特異的な反応性を示すアミノ酸配列である。
　アミノ酸配列（a）及び（b）において、配列番号1～187及び249～251の中でも、対象キナーゼに対してより特異的な反応性を示すという観点から、好ましくは配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、182等が挙げられ、より好ましくは配列番号13、32、149、171、176、182等が挙げられ、さらに好ましくは配列番号32、149、171、176等が挙げられる。
　また、同様の観点から別の好ましい例としては、好ましくは配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、187等が挙げられ、より好ましくは配列番号1、12、15、32、50、63、64、77、78、82、83、95、103、108、131、146、149、161、187等が挙げられ、さらに好ましくは配列番号15、64、77、78、95、131、146、149、161等が挙げられ、よりさらに好ましくは配列番号64、95、161等が挙げられ、特に好ましくは配列番号64、95等が挙げられる。
　さらに、同様の観点からさらに別の好ましい例としては、好ましくは配列番号249～251等が挙げられる。
　アミノ酸配列（a）及び（b）の中でも、特異性、感度等の観点から、アミノ酸配列（a）が好ましい。
　アミノ酸配列（b）において、置換などを生じたアミノ酸の「1又は数個」とは、対象キナーゼに対する特異的な反応性が著しく損なわれない限り特に制限されないが、例えば1～5個、好ましくは1～4個、より好ましくは1～3個、さらに好ましくは1～2個、よりさらに好ましくは1個である。
　アミノ酸配列（b）におけるアミノ酸変異は、アミノ酸の置換、欠失、付加、及び挿入のいずれでもよいが、好ましくは置換である。
　アミノ酸配列（b）における置換対象のアミノ酸は、特異性、感度等の観点から、対象キナーゼのコンセンサス配列で特定されるアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。対象キナーゼの「コンセンサス配列」は、後述の実施例1-1の表１～１４に記載のコンセンサス配列である。例えば、対象キナーゼがCK2a2である場合、そのコンセンサス配列には、「......SD.E.E.」、「......SD.E...」、「......SE.E...」、及び「......SD.D...」がある。なお、「．」は任意の一アミノ酸を示す。このようにコンセンサス配列が複数個ある場合は、いずれを選択してもよいが、表１～１４に示されるFINCがより高いコンセンサス配列を選択することが望ましい。対象キナーゼがCK2a2である場合の最もFINC（Fold Increase）が高いコンセンサス配列（......SD.E.E.）は配列番号176に含まれている。配列番号176の場合、「対象キナーゼのコンセンサス配列で特定されるアミノ酸」とは、配列番号176のN末端から6番目のアミノ酸（S）、7番目のアミノ酸（D）、9番目のアミノ酸（E）、及び10番目のアミノ酸（E）である。配列番号176における置換対象のアミノ酸は、それ以外のアミノ酸（配列番号176のN末端から1～5、8、10～11番目のアミノ酸）から選択される。
　アミノ酸配列（b）における置換後のアミノ酸は、特異性、感度等の観点から、対象キナーゼのPWMに基づいて決定されたアミノ酸であることが好ましい。対象キナーゼの「PWM」は、後述の実施例1-1の表１５～７７に記載される。「PWMに基づいて決定」とは、まず、置換対象アミノ酸のPWM中の位置を特定、具体的には、PWM中の「0」の位置は配列番号1～187のN末端から6番目のアミノ酸（リン酸化対象アミノ酸：S）に対応すること、該アミノ酸のN末端側の位置はPWM中で「－」で示されること、及び該アミノ酸のC末端側の位置はPWM中で「＋」で示されることに基づいて、置換対象アミノ酸のPWM中の位置を特定し、次に特定されたPWM中の位置におけるスコアがより高いアミノ酸（好ましくはスコアが正の値のアミノ酸、より好ましくはスコア上位5アミノ酸）を「置換後のアミノ酸」として決定することにより行われる。例えば、配列番号176のN末端側から1番目のアミノ酸の場合、E以外でPWMスコアが高いアミノ酸は、K, R, A, Dとなる。
　本発明の好ましい一態様においては、アミノ酸配列（b）における置換後のアミノ酸は、特異性、感度等の観点から、後述の実施例1-2の表７８～８２に記載されるアミノ酸配列中、括弧内のアミノ酸から選択される。例えば、対象キナーゼがCK2a2である場合、対応するアミノ酸配列（配列番号176）のN末端側から1番目のアミノ酸（E）を置換する場合の置換後のアミノ酸はK、R、A、及びDから選択され、2番目のアミノ酸（Q）を置換する場合の置換後のアミノ酸は、D及びEから選択され、3番目のアミノ酸（D）を置換する場合の置換後のアミノ酸は、A、E、及びGから選択され、4番目のアミノ酸（E）を置換する場合の置換後のアミノ酸は、D及びVから選択され、5番目のアミノ酸（W）を置換する場合の置換後のアミノ酸はDであり、8番目のアミノ酸（D）を置換する場合の置換後のアミノ酸は、E及びGから選択され、10番目のアミノ酸（E）を置換する場合の置換後のアミノ酸は、G、D、及びAから選択される。
　本発明の好ましい一態様においては、アミノ酸配列（b）における置換は、保存的置換であってもよい。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　特異性、感度等の観点から、置換後のアミノ酸の選択枝からは、好ましくはセリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、及びシステインは除外される。
　本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列（a）又は（b）のみからなるポリペプチドであってもよいし、アミノ酸配列（a）又は（b）を含む、換言すれば「アミノ酸配列（a）又は（b）」と「他のアミノ酸配列」とからなるポリペプチドであってもよい。後者の場合、本発明の好ましい一態様においては、本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列（a）のC末端にアルギニンが付加されてなるアミノ酸配列又はアミノ酸配列（b）のC末端にアルギニンが付加されてなるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
　本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、特に制限されないが、例えば50以下、好ましくは40以下、より好ましくは30以下、さらに好ましくは20以下、よりさらに好ましくは15以下である。
　本発明のポリペプチドは、対象キナーゼによるリン酸化反応が著しく阻害されない限りにおいて、必要に応じて適当なリンカーを介して、各種タグ（例えばビオチンタグ、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等）が付加されたものも包含する。
　本発明のポリペプチドは、対象キナーゼによるリン酸化反応が著しく阻害されない限りにおいて、末端のアミノ酸が化学修飾されたものも包含する。
　本発明のポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）であるもの、等も包含する。本発明のポリペプチドは、C末端がアミド（－CONH2）であるものが好ましい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　さらに、本発明のポリペプチドは、N末端のアミノ酸のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など、好ましくはアセチル基）で保護されているもの、なども包含する。
　本発明のポリペプチドは、対象キナーゼによる本発明のポリペプチドのリン酸化反応が著しく阻害されない限りにおいて、末端以外のアミノ酸が、化学修飾されたものも包含するが、好ましくは、本発明のポリペプチドは末端以外のアミノ酸は化学修飾されていない。この場合の化学修飾としては、例えばカルボキシル基のアミド化、エステル化等；　保護基によるアミノ基の保護等が挙げられる。エステル化、保護基については、上記した末端の化学修飾と同様である。
　本発明のポリペプチドは、酸または塩基との塩の形態も包含する。塩は、特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、溶媒和物の形態も包含する。溶媒は、特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
　本発明のオリゴペプチドは、対象キナーゼに対して特異的な反応性を示す（即ち、対象キナーゼにより特異的にリン酸化される）。より具体的には、本発明のオリゴペプチドは、対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上、よりさらに好ましくは50倍以上、よりさらに好ましくは100倍以上である。反応性は後述の実施例2、5、又は7の方法で評価することができる。
　「他のキナーゼ」とは、対象キナーゼ以外のキナーゼ（配列番号1～187についてはセリン／スレオニンキナーゼ（好ましくは全セリン／スレオニンキナーゼの30％以上、50％以上、70％以上、又は90％以上のセリン／スレオニンキナーゼ）、配列番号249～251についてはチロシンキナーゼ（好ましくは全チロシンキナーゼの30％以上、50％以上、70％以上、又は90％以上のチロシンキナーゼ））である限り特に制限されない。
　一実施形態において（例えば配列番号1～187について、特に配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、及び182について）、「他のキナーゼ」は、好ましくはIKKb、CK2a2、CK1d、PLK1、ALK2、WNK3、IRAK1、NEK6、MLK1、MST3、TSSK1、MARK2、CaMK2a、MAPKAPK3、PKD3、ROCK1、PHKG2、PKCa、LATS1、PIM1、PAK2、AurC、RSK1、AKT1、PKACa、CAMKK1、GSK3b、CDC2、JNK1、p38a、ERK2、MAP3K2、及びDYRK4から対象キナーゼを除いてなる群より選択される少なくとも1種（好ましくは2種、5種、10種、20種、30種、全種）である。
　別の実施形態において（例えば配列番号1～187について、特に配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、及び187について）、「他のキナーゼ」は、好ましくはCDC7_ASK、CK2A1、CK2a2、CDK2_CYCE1、ERK7、CDK9_CYCLINK、DYRK1A、DYRK4、DYRK2、DYRK3、HIPK1、HIPK2、HIPK3、HIPK4、ICK、MOK、GSK3b、CDK6_CYCD3、CDK6_CYCLIND1、CDK7_CYCH_MAT1、CDK9_CYCT1、ERK5、CDC2_CycB1、CDK2_CYCA2、CDK5_P25、CDK3_CYCE1、NLK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、P38D、P38G、p38a、P38B、CLK1、CLK3、MAP2K1、MAP2K7、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K2、STK33、TAK1、CAMKK1、CAMKK2、ACTR2、HRI、PEK、CK1A、CK1d、CK1E、CK1G1、CK1G2、CK1G3、BMPR1B、ALK2、ALK4、TGFBR1、BARK1、GPRK5、GPRK7、RHOK、BUBR1、PLK1、PLK3、TLK1、TLK2、CHK2、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MAPKAPK5、PKD2、PKD1、PKD3、CAMK1D、CAMK2B、CaMK2a、CAMK2G、CAMK2D、CHK1、LATS1、LATS2、IRAK1、CAMK4、DCLK1、DCLK2、MNK2、PKCG、PKCa、PKCB1、PKCT、PKCH、PKCZ、PKN1、PKN2、PLK4、AURB、AURA、AurC、PAK1、PAK2、PAK3、AKT1、AKT2、AKT3、SGK1、SGK2、SGK3、CGK2、PKG1B、PKG1A、PKACa、PKACB、PRKX、MSK1、MSK2、RSK1、RSK2、RSK4、RSK3、P70S6K、DAPK1、NDR1、NDR2、ROCK1、ROCK2、P70S6KB、PIM2、PIM1、PIM3、PAK5、PAK4、PAK6、BRSK2、AMPKA1_B1_G1、AMPKA2_B1_G1、NUAK1、NUAK2、MELK、MARK2、MARK1、MARK4、MARK3、QIK、NIM1、SIK、TSSK1、TSSK2、SKMLCK、COT、PHKG1、IKKA、IKKb、IKKE、TBK1、NEK2、NEK6、NEK7、MLK2、MLK1、MLK3、NEK9、TTBK1、MAP3K1、GCK、MST1、MST2、HGK、MINK、KHS1、TNIK、MST3、MST4、YSK1、PHKG2、TAO2、ZAK、NEK4、SGK496、ULK3、LIMK1、WNK1、WNK2、WNK3、及びTAO1から対象キナーゼを除いてなる群より選択される少なくとも1種（好ましくは2種、5種、10種、20種、30種、50種、70種、100種、150種、全種）である。
　さらに別の実施形態において（例えば配列番号249～251について）、「他のキナーゼ」は、好ましくはABL1、ABL2、ACK、TNK1、ALK、LTK、AXL、MER、TYRO3、CTK、DDR2、EGFR、ERBB4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、FAK、PYK2、FER、FES、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、INSR、IRR、JAK1、JAK2、JAK3、LIMK1、MET、RON、TAK1、MUSK、FLT3、FMS、KIT、PDGFRA、PDGFRB、RET、ROS、BLK、BRK、FGR、FRK、FYN、HCK、LCK、LYNA、LYNB、SRC、SRM、YES、SYK、ZAP70、BMX、BTK、ITK、TEC、TXK、TIE2、TRKA、TRKB、TRKC、FLT1、FLT4、KDR、及びWEE1から対象キナーゼを除いてなる群より選択される少なくとも1種（好ましくは2種、5種、10種、20種、30種、50種、70種、全種）である。
　2．キナーゼ活性測定方法、キノーム解析方法
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドと被検試料とを接触させる工程、を含む、キナーゼ活性測定方法又は被検試料のキノーム解析方法（本明細書において、「本発明の測定方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　被検試料は、キナーゼを含み得る試料である限り特に制限さない。被検試料は、例えば細胞試料又は生物から採取された組織試料（以下、これらを総称して「生物試料」と示す。）の抽出物又はその精製物；　体液又は体液由来の試料；　キナーゼの精製物等を採用することができる。本発明のポリペプチドは対象キナーゼに対して特異的に修飾されるものであるので、複数のキナーゼを含む被検試料の測定に適している。この観点から、被検試料は生物試料の抽出物又はその精製物や、体液又は体液由来の試料、更には複数のキナーゼ精製物を含む組成物等であることが好ましい。
　被検試料の由来する生物は、キナーゼを含み得る生物である限り特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類動物が挙げられる。これらの中でも、ヒトが好ましい。
　組織試料としては、特に制限されず、例えば上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等の試料が挙げられる。
　生物試料は、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞（例えば腎臓がん細胞、白血病細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、肝臓がん細胞、すい臓がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、乳がん細胞、子宮頚がん細胞等）等を含む。
　生物試料の抽出物は、生物試料中の細胞膜又は核膜破壊物である限り、特に制限されない。細胞膜又は核膜の破壊は、生物試料に対して可溶化処理を施すことによって得られる。可溶化処理は、生物試料に対して、可溶化処理用の緩衝液（以下、「可溶化剤」という）中で超音波処理、ピペットでの吸引攪拌などを施すことなどによって行なうことができる。
　可溶化剤は、細胞膜又は核膜を破壊する物質を含有する緩衝液である。可溶化剤は、キナーゼの変性又は分解を阻害する物質などをさらに含有してもよい。
　細胞膜又は核膜を破壊する物質としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤などが挙げられるが、特に限定されない。界面活性剤は、測定対象のキナーゼの活性を阻害しない範囲で用いることができる。界面活性剤としては、例えば、ノニデットP－40（NP－40）、トリトンX－100〔ダウケミカルカンパニー（Dow  Chemical  Company）の登録商標〕などのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；デオキシコール酸、CHAPSなどが挙げられる。細胞膜又は核膜を破壊する物質は、単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。可溶化剤における細胞膜又は核膜を破壊する物質の濃度は、通常、0.1～2 w／v％である。
　キナーゼの変性又は分解を阻害する物質としては、例えば、プロテアーゼインヒビターなどが挙げられるが、特に限定されない。プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、EDTA、EGTAなどのメタロプロテアーゼインヒビター；PMSF、トリプシンインヒビター、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼインヒビター；ヨードアセトアミド、E－64などのシステインプロテアーゼインヒビターなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのキナーゼの変性又は分解を阻害する物質は、単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。可溶化剤における前記キナーゼの変性又は分解を阻害する物質の濃度は、通常、EDTA、EGTAおよびPMSFの場合、0.5～10mMである。
　生物試料の抽出物の精製は、公知の方法に従って、又は準じて行うことができる。例えば、不溶物の除去や、キナーゼの濃縮等が挙げられる。キナーゼの濃縮方法としては、特に制限されないが、例えばキナーゼに対する抗体を用いた免疫沈降法等が挙げられる。
　体液としては、例えば全血、血清、血漿、唾液、髄液、関節液、尿、組織液、汗、涙、唾液などが挙げられる。体液由来の試料としては、体液から調製される試料である限り特に制限されず、例えば体液から、該体液に含まれるキナーゼを濃縮、精製などして得られる試料などが挙げられる。
　本発明のポリペプチドは対象キナーゼに対して特異的に修飾されるものであるので、複数のキナーゼを含む被検試料の測定に適している。この観点から、本発明の方法に用いる本発明のポリペプチドは、好ましくは2種、5種、10種、20種、50種、100種、150種、187種の対象キナーゼに対応する複数種のポリペプチドであることが好ましい。複数種の対象キナーゼに対応する複数種のポリペプチドを使う場合、多種のキナーゼの活性測定を、特異的に、かつ同時におこなうことが可能になる。
　被検試料と本発明のポリペプチドとの接触は、キナーゼがその酵素作用によって本発明のポリペプチドを修飾し得る条件下である限り特に制限されない。該接触は、通常は、ATP、ATP標識物、ATP誘導体等の存在下、緩衝液中で行われる。
　緩衝液としては、キナーゼの活性を発揮できるpH（通常、6～8、好ましくは7～7.8）を維持できる緩衝液が好適に用いられ、例えばHEPES緩衝液、Tris塩酸緩衝液等が用いられる。緩衝液は、必要に応じて、キナーゼの活性の発揮に必要な金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン等を含有する。
　ATP標識物としては、特に制限されないが、例えばATPを構成するリン原子を放射性同位元素（例えば32P）に置き換えてなる、放射性同位体ATP標識物が挙げられる。
　ATP誘導体としては、特に制限されないが、例えば特開2002－335997号公報に開示されるATP-γS（アデノシン-5'-(γ-チオ)-三リン酸塩）、特開2015-192635号公報に開示されるATPのγ位にジニトロフェニル（DNP）基が連結されてなるDNP基連結ATP誘導体等が挙げられる。
　上記した接触により、被検試料のキナーゼの活性に応じて、本発明のポリペプチドのが、キナーゼの酵素作用に基づいて修飾される。修飾の態様は、接触の条件によって異なり、例えばATPを用いた場合であれば修飾はリン酸基の付加であり、放射性同位体ATP標識物を用いた場合であれば修飾は放射性同位元素標識リン酸基の付加であり、ATP-γSを用いた場合であれば修飾はチオリン酸基の付加であり、DNP基連結ATP誘導体を用いた場合であればDNP基連結リン酸基の付加である。
　本発明の測定方法では、上記修飾の量（＝修飾物の量）を測定することにより、キナーゼ活性を測定することができる。換言すれば、上記修飾の量の定量値を、キナーゼ活性値とすることができる。
　上記修飾の量の測定は、本発明のポリペプチドが1種であるか複数であるか、修飾の態様等に応じて、公知の方法に従って、又は準じて行うことができる。測定は、例えばリン酸基やDNP基連結リン酸基等が付加されたペプチドに対する抗体との反応；　チオリン酸基への結合部位（例えばアルキルハライド、マレイミド、アジリジン部位等）を有する蛍光物質、ビオチン、酵素等との反応、各種物質（例えば蛍光物質、ビオチン、酵素等）に対する抗体との反応、酵素作用に基づく発光反応・検出、蛍光検出、放射線検出、クロマトグラフィー、質量分析等を単独で、或いは適宜組み合わせて行うことができる。
　3．キナーゼ基質（アレイ）、キナーゼ活性測定用試薬（又はキット）
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドからなるキナーゼ基質（本明細書において、「本発明の基質」と示すこともある。）、本発明のポリペプチド及び固相を含み、且つ本発明のポリペプチドが固相に固定されている、キナーゼ基質アレイ（本明細書において、「本発明の基質アレイ」と示すこともある。）、本発明の基質を含有するキナーゼ活性測定用試薬（本明細書において、「本発明の試薬」と示すこともある。）、及び本発明の基質及び本発明の基質アレイからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キナーゼ活性測定用キット（本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある。）に関する。以下、これらについて説明する。
　本発明の基質アレイにおける固相は、本発明のポリペプチドを固定可能なものである限り特に制限されない。固相としては、例えばガラス、ポリジメチルシロキサン、金などの基板が挙げられる。基板の形状は、平板なもの、ピラーを並べたもの、ウェルを並べたものなど、これまでに報告されたいずれの基板にも適用可能である。これらの基板上にガラスではシランカップリング剤や、表面を多糖などでコートすることにより、ポリジメチルシロキサンでは、表面を多糖などでコートしたり、表面をプラズマなどで修飾することで、また、金ではチオール誘導体で修飾することにより、アミノ基、カルボキシル基などの官能基を導入する。これに架橋剤などを用いたり、末端カルボシキシル基を活性エステル化したり、ホルミル基やマレイミド基を導入後、ペプチド末端をシステイン残基として反応させることにより本発明のポリペプチドを固定化することができる。
　本発明のポリペプチドは対象キナーゼに対して特異的に修飾されるものであるので、複数のキナーゼを含む被検試料の測定に適している。この観点から、本発明の基質アレイが含む本発明のポリペプチドは、好ましくは2種、5種、10種、20種、50種、100種、150種、187種の対象キナーゼに対応する複数種のポリペプチドであることが好ましい。複数種の対象キナーゼに対応する複数種のポリペプチドを使う場合、多種のキナーゼの活性測定を、特異的に、かつ同時におこなうことが可能になる。
　本発明の試薬は、本発明の基質からなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。その他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の試薬における本発明の基質の含有量は、特に制限されないが、例えば0.0001～100質量％とすることができる。
　本発明のキットは、本発明の基質及び本発明の基質アレイからなる群より選択される少なくとも1種のみからなるものであってもよいし、又は必要に応じてこれに加えて、本発明の測定方法の実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。
　器具としては、例えば試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、エポキシコーティングスライドガラス、金コロイドコーティングスライドガラスなどが挙げられる。
　試薬としては、例えばATP、ATP標識物、ATP誘導体、緩衝液、リン酸基やDNP基連結リン酸基等が付加されたペプチドに対する抗体、チオリン酸基への結合部位を有する物質（例えば蛍光物質、ビオチン、酵素等）、各種物質（例えば蛍光物質、ビオチン、酵素等）に対する抗体、各種酵素の発光検出試薬、キナーゼ活性を有する陽性対照試料、キナーゼ活性を有しない陰性対照試料等が挙げられる。
　4．被検物質のキナーゼ活性調節能を評価する方法
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドと被検試料とを被検物質の存在下で接触させる工程を含む、被検物質のキナーゼ活性調節能を評価する方法（本明細書において、「本発明の評価方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明のポリペプチド及び被検試料は上記「2．キナーゼ活性測定方法、キノーム解析方法」で説明した通りである。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。被検物質は、被検試料中のキナーゼ活性を間接的に調節し得る物質（例えば、キナーゼのカスケード途中のタンパク質や酵素等を阻害する物質等）、被検試料中のキナーゼの活性を直接的に調節し得る物質（例えばキナーゼの機能を阻害する物質等）であり得る。
　本発明の評価方法は、より具体的には、上記工程を含む方法により得られたキナーゼ活性の値（被検値）が、被検物質の非存在下で同様に測定されたキナーゼ活性の値（対照値）と異なる場合に、被検物質を、キナーゼ活性調節能を有すると評価する工程を含む。より具体的には、本発明の評価方法は、被検値が対照値よりも高い（例えば、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍）場合には、被検物質を、キナーゼ活性亢進能を有すると評価する工程、及び／又は被検値が対照値よりも低い（例えば、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100）場合には、被検物質を、キナーゼ活性抑制能を有すると評価する工程を含む。
　本発明の評価方法は、創薬標的探索、薬剤感受性予測、副作用予測、薬剤スクリーニング等に利用することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1．キナーゼ基質ペプチドの設計1
　実施例1-1．基質コンセンサス配列の抽出とPWMの作製
　Hela細胞抽出物を脱リン酸化処理した後、ATPと金属イオンの存在下で各ヒトキナーゼ組換え体と個別に反応させた。トリプシン消化後に酸化金属クロマトグラフィーによりリン酸化ペプチドを濃縮後、LC-MS測定によってリン酸化ペプチドの配列と修飾部位の同定を行った。こうして得られた約400種のキナーゼに関する190,000個超のin vitroキナーゼ-基質間情報を利用して、以下の手順で基質コンセンサス配列の抽出及びPWMの作製を行った。
　各キナーゼの基質コンセンサス配列の抽出にはmotif-x（ULR：http://motif-x.med.harvard.edu/）（参考文献1：D. Schwartz and S. P. Gygi, Nat. Biotechnol. 23, 1391 (2005).）を使用し、各設定値はwidth = 13、occurrence = 10、significance=0.000001、background = IPI Human Proteomeとした。各コンセンサス配列に対するfold increaseは以下の式を用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　各キナーゼに対して抽出されたコンセンサス配列とそのFINCを表１～１４に示す。表１～１４中、Motifが各キナーゼに対するコンセンサス配列（左側がN末端側）であり、「．」は任意の一アミノ酸を示し、FINCはバックグラウンド配列に対する濃縮の程度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
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　各キナーゼ基質のPWMはWassermanらの報告（参考文献2：W. W. Wasserman and A. Sandelin, Nat. Rev. Genet. 5, 276 (2004).）を参考に作製した。まず、基質群における配列i番目におけるアミノ酸bの出現確率p(b,i)を以下の式を用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　ここでfb,iは配列i番目におけるアミノ酸bの出現数、Nは全配列数、c(b)はアミノ酸bの擬似カウント （pseudocount）、p(b)はヒトプロテオームにおけるアミノ酸bの出現確率を示す。続いてp(b)をバックグラウンドとし、アミノ酸出現確率比のlog2値wb,iを求めPWMを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
　各キナーゼに対して作製されたPWMを表１５～７７に示す。
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　実施例1-2．基質ペプチド配列の設計
　コンセンサス配列およびPWMを使用して、以下の手順で基質ペプチド候補群を設計した。（1）ペプチドの長さはアミノ酸12残基とし、phosphoacceptor（セリンまたはチロシン）はN末端より6番目の位置とした。（2）C末端アミノ酸はアルギニンで固定した。（3）抽出された中でfold increase最大値をとるコンセンサス配列に位置するアミノ酸を固定した。（4）残りの部位はそれぞれPWMにおいてスコア上位5アミノ酸を使用した。（5）いずれの過程においても、phosphoacceptor以外の部位に、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、システインは使用しなかった。得られた基質ペプチド候補群に対し、各キナーゼのPWMとの一致度（PWMスコア）を以下の式を用いて計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000081
　ここで、qiはペプチドq におけるi番目のアミノ酸を示す。ただし、本研究ではphosphoacceptorに位置するアミノ酸はPWMスコアの計算に使用しなかった。その後、標的キナーゼに対するPWMスコアが最大値をとる候補のみを抽出した。キナーゼ選択性の指標として、Graczyk らの報告（参考文献3：P. P. Graczyk, J. Med. Chem. 50, 5773 (2007).）を参考にPWMスコアにおけるgini係数を算出し、gini係数が0.8以上となるペプチド配列をキナーゼ特異的基質ペプチドと定めた。
　得られた基質ペプチド配列からC末端のアルギニンが除かれてなる配列を表７８～８２に示す。表７８～８２のアミノ酸配列（左側がN末端側）中、「－」は、アミノ酸配列中の各アミノ酸の区切りを示し、配列番号は、括弧外のアミノ酸の配列が設計された基質ペプチド配列の配列番号を示す。なお、括弧内のアミノ酸はPWMスコアが正値で、かつgini係数が0.8以上のアミノ酸であり、括弧外のアミノ酸が、当該括弧内のアミノ酸のいずれかに置きかえられていてもよいことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
　実施例2．設計された基質キナーゼペプチドの特異性の評価1
　実施例1で設計された基質ペプチド配列のC末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化され、且つC末端のカルボキシル基がアミド化されてなるポリペプチドを合成した。合成したポリペプチドの一部について、対象キナーゼ及び基質ペプチド配列（C末に付加されたアルギニンを除いてなる配列）を表８３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
　得られたポリペプチドをキナーゼ基質として用い、各種ヒト組換えキナーゼ（IKKb、CK2a2、CK1d、PLK1、ALK2、WNK3、IRAK1、NEK6、MLK1、MST3、TSSK1、MARK2、CaMK2a、MAPKAPK3、PKD3、ROCK1、PHKG2、PKCa、LATS1、PIM1、PAK2、AurC、RSK1、AKT1、PKACa、CAMKK1、GSK3b、CDC2、JNK1、p38a、ERK2、MAP3K2、及びDYRK4）に対する反応性を調べた。具体的には以下のようにして行った。
　基質ペプチド混合物（それぞれ10 pmol）に対し、1 mM ATP、10 mM MgCl2を含む25 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）32 μL中で組換えキナーゼ溶液（200 ng / μL）0.5 μLを添加し、37℃で3時間反応させた。1% トリフルオロ酢酸50 μLを添加しキナーゼ反応を停止し、SDB-XC StageTipにより脱塩精製した。得られた試料中のリン酸化ポリペプチドを、インターフェースにエレクトロスプレーイオン化法を用いた液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）によりにより定量した。分析用カラムには先端を尖らせたフューズドシリカキャピラリー（長さ15 cm、内径100 μm）にReproSil-Pur C18-AQ（粒子径3 μm、Dr. Maisch）を充填した自家製スプレーヤー一体型カラム（参考文献4：Y. Ishihama, J. Rappsilber, J. S. Andersen, and M. Mann, J. Chromatogr. A 979, 233 (2002).）を用い、オートサンプラーにはHTC-PAL（CTC Analytics）、液体クロマトグラフにはUltimate3000 RSLCnano（Thermo Fisher Scientific）を用いた。移動相Aに0.5% 酢酸、移動相Bに80% アセトニトリル、0.5% 酢酸を使用し、流速500 nL / minにて移動相B 5% → 40%（20分）のグラジエント条件を用いた。質量分析計には、Q Exactive、Finnigan LTQ（Thermo Fisher Scientific）またはTripleTOF 5600+（Sciex）を使用し、Data Dependent Acquisition（DDA）モードにてMS/MSスペクトルを取得した。得られたMS/MSスペクトルに対してMascot v2.5による自動データベース検索を行った。データベースには基質ペプチド名とその配列をFASTAフォーマットにて記載したファイルを用いた。定量解析にはSkyline（参考文献5：B. Schilling, M. J. Rardin, B. X. MacLean,  a. M. Zawadzka, B. E. Frewen, M. P. Cusack, D. J. Sorensen, M. S. Bereman, E. Jing, C. C. Wu, E. Verdin, C. R. Kahn, M. J. MacCoss, and B. W. Gibson, Mol. Cell. Proteomics 11, 202 (2012).）を使用し、LC-MS/MS測定より得られた生データ及びMascotより得られた同定結果を取り込んだ後、ペプチドの抽出イオンクロマトグラムにおけるピーク面積を算出した。1つのペプチドが複数の電荷状態で検出されている場合、最もシグナル強度の大きい電荷状態のスペクトルのみを解析に使用した。一部の測定でペプチドが同定されなかった場合は、m/z および保持時間をもとに手動でピークの同定を行い、ピーク面積を算出した。
　キナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量（ピーク面積）を図１～１６に示す。図１～１６より、実施例1の手法で設計された基質ペプチド配列を含むポリペプチドは、対象キナーゼに対して特異的にリン酸化されることが実験的に示された。従って配列番号1から187は、基質コンセンサス配列を有し、基質コンセンサス配列以外のアミノ酸のPWMスコアが正値かつ、gini係数が0.8以上の基準で設計したペプチド配列から、実際にキナーゼ活性値が2倍以上になることが関連付けられる。
　実施例3．基質ペプチドを用いた細胞内キナーゼ活性計測
　実施例2で示されたように、実施例1の手法で設計された基質ペプチドは対象キナーゼに対する特異性を有していることから、細胞抽出物のようなキナーゼ混合試料中であっても、標的キナーゼ特異的に酵素活性を計測することが可能である。そこで、本実施例では、基質ペプチドと細胞抽出物を用いたキナーゼ活性計測における定量性、選択性およびペプチドの回収率について評価した。具体的には次のようにして行った。
　＜材料の調製＞
　まず、実施例1で設計された基質ペプチド配列のC末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化され、且つC末端のカルボキシル基がアミド化されてなるポリペプチド、及びこれらの修飾が無いポリペプチドを合成した。合成したポリペプチドの一部について、対象キナーゼ及び基質ペプチド配列（C末に付加されたアルギニンを除いてなる配列）を表８４に示す。表８４中、TSSKtide1、LATStide3及びRSKtide2以外のポリペプチドは、全て、C末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化されたポリペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
　次に、本実施例で用いる細胞抽出物を次のようにして調製した。HeLa細胞は、Dulbecco's Modified Eagle Medium（10% ウシ胎児由来血清、カナマイシン含有）中、37℃、5% CO2 条件下で培養した。HeLa細胞を16時間低血清培地（0.1% ウシ胎児由来血清、カナマイシン含有）中で、血清飢餓状態においた。その後、キナーゼ阻害薬処理群には培地中の薬物濃度が10 μMとなるように各阻害薬のDMSO （dimethyl sulfoxide）溶液を添加し、対照試料にはDMSOのみを同量加え、20分間浸透させた。続いて、PBSで溶解したEGFを培地中濃度が150 ng / mLになるよう加え、15分間インキュベートした後、スクレイパーを用いて細胞を回収した。HeLa 細胞ペレットを細胞破砕液 （10 mM リン酸緩衝液pH 7.0、0.5% NP-40、1 mM EDTA、 5 mM EGTA、10 mM MgCl2、50 mM β-glycerophosphate、 1 mM Na3VO4、 2 mM dithiothreitol、 1% protease inhibitor cocktail） にて氷上で懸濁した。4℃、10,000 g にて15 分間遠心を行った後、上清を細胞抽出物として使用した。細胞抽出物中の総タンパク質濃度はBCA法（BSA standard）にて定量した。
　＜試験1＞
　前述の基質ペプチド群（それぞれ50 pmol）とHeLa細胞抽出物（0、0.3、1、3、10、30 μg）によるリン酸化反応を行い、その定量性を評価した。具体的には、次の様にして行った。基質ペプチド混合物（それぞれ50 pmol）に対し、5 mM ATP、10 mM MgCl2、0.1 mM dithiothreitol、1% protease inhibitor cocktail、1% phosphatase inhibitor cocktailを含む25 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）25 μL中で細胞抽出物を添加し、25℃で45分間反応させた。反応後、1% トリフルオロ酢酸50 μLを添加しキナーゼ反応を停止した。キナーゼ反応後にSDB-XCおよびSCX Empore Disk（GL Sciences）を装着したStageTip（参考文献6：J. Rappsilber, Y. Ishihama, and M. Mann, Anal. Chem. 75, 663 (2003).）によって界面活性剤を除去した後、SDB-XC StageTipにより脱塩精製した。得られた試料中のリン酸化ポリペプチドを、実施例2と同様にしてLC-MSにより定量した。
　結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。LC-MSによるリン酸化体の定量値は、細胞抽出物量に対して高い直線性を有し、基質ペプチドを用いて細胞抽出物由来キナーゼの活性を定量的に計測することに成功した（図１７A、図１７B）。
　＜試験2＞
　HeLa細胞抽出物10 μgをマトリックスとして使用し、マトリックス存在下における組換えキナーゼ（0、1、3、10、30、100 ng）に対する定量性を調べた。具体的には、キナーゼ反応液に組換えキナーゼ（CK2a2）を添加する以外は、試験1と同様にして行った。
　結果を図１７Ｃに示す。細胞抽出物存在下において感度の低下は見られるものの、非存在下と同様の直線性を維持していることが確認できた。
　＜試験3＞
　細胞抽出物内におけるキナーゼ選択性を確認するため、ERK2のみに反応するよう設計された基質ペプチドに対し、細胞抽出物存在下においてMAPK3種（ERK2、p38a、JNK1）の組換え体を個別に反応させた。具体的には、キナーゼ反応液に前記MAPK3種を添加する以外は、試験1と同様にして行った。
　結果を図１７Ｄに示す。ERK2の基質ペプチドは、ERK2特異的に、その添加量に応じてリン酸化が亢進することを確認した。
　以上の試験1～3の結果より、細胞抽出物のような複数種のキナーゼ混合試料中であっても、標的キナーゼの活性を定量的に計測できることが示唆された。
　＜試験4＞
　HeLa細胞抽出物との反応時における基質ペプチドの安定性を調べるために、ATP無添加条件下における非リン酸化ペプチドの回収率を測定した。3種のペプチドを使用し、両末端未修飾のペプチドと、N末端アセチル化とC末端アミド化を行ったペプチドを比較した結果、両末端修飾ペプチドにおいて回収率向上が確認された（図１７Ｅ）。これは反応時における基質ペプチド両末端の電荷が除去されたことにより、エンドプロテアーゼによる分解が抑えられたためと考えられた。
　実施例4．基質ペプチドを用いたMAPKパスウェイ変動評価
　哺乳類で保存されているMAPKの中には、ERK1/2、p38、JNK、ERK5という4つの主要なサブファミリーが存在しており、独自のMAPKカスケードを形成している（図１８）（参考文献7：M. Cargnello and P. P. Roux, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, 50 (2011).）。これらMAPKパスウェイ群はそれぞれ異なる細胞機能を担っており、例えば、Raf-MEK1/2-ERK1/2パスウェイは細胞の増殖や成長に関係し、MEK3/6-p38パスウェイはストレスや免疫応答に関わっている。したがって、それぞれのMAPKカスケードを区別して評価することは創薬研究において重要である。本実施例では、基質ペプチドのキナーゼ特異性を活かし、各MAPKパスウェイ阻害薬が細胞内キナーゼ活性へ与える影響を調べた。具体的には以下の様にして行った。
　実施例1で設計された基質ペプチド配列のC末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化され、且つC末端のカルボキシル基がアミド化されてなるポリペプチドを合成した。合成したポリペプチドの一部について、対象キナーゼ及び基質ペプチド配列（C末に付加されたアルギニンを除いてなる配列）を表８５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
　キナーゼ阻害薬には、selumetinib（MEK1阻害薬）、SB202190（p38a/b阻害薬）、SP600125（JNK阻害薬）、XMD8-92（ERK5阻害薬）を用いた。細胞試料には、各阻害薬を処理した後EGF刺激を行う以外は実施例3と同様にして得られたHeLa細胞抽出物を使用し、セリン／スレオニンキナーゼ33種とMAPKパスウェイ上キナーゼ群を含む75キナーゼを対象とした基質ペプチド混合物による細胞内キナーゼ活性計測を行った。測定の結果、得られた基質ペプチドのリン酸化変動比をヒートマップにて図１９に示した。リン酸化変動比は各阻害薬特有のプロファイルを示し、MAPK阻害薬によるキナーゼ群への影響を区別して評価可能であった。
　これらの結果が妥当なものであるか検証するため、各MAPKパスウェイに位置するキナーゼに着目し解析を進めた。MEK1の下流にはERK1/2、さらにその下流にはRSKが存在することが知られており、selumetinibによるMEK1阻害により、ERK1およびRSK2基質ペプチドのリン酸化量減少を確認することができた（図２０）。
　MEK阻害薬処理HeLa細胞において、ERK1/2およびRSK活性が低下することは、過去のリン酸化プロテオーム解析の結果（参考文献8：C. Pan, J. V Olsen, H. Daub, and M. Mann, Mol. Cell. Proteomics 8, 2796 (2009).）と一致しており、本分析法の妥当性を裏付ける結果となった。また、本実験ではp38a/bを標的とする基質ペプチドのリン酸化体は検出できなかったものの、SB202190処理（p38a/b阻害）試料において、p38a/bの下流に位置するMAPKAPK基質ペプチドのリン酸化量が減少しており（図２０）、確かにMAPK阻害薬が細胞内キナーゼ群に与える影響を評価可能であるということが分かった。
　実施例5．設計された基質キナーゼペプチドの特異性の評価2
　実施例1で設計された基質ペプチド配列のC末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化され、且つC末端のカルボキシル基がアミド化されてなるポリペプチドを合成した。対象キナーゼ、基質ペプチド配列（C末に付加されたアルギニンを除いてなる配列）、配列番号、及びGini係数を表８６に示す。
　得られたポリペプチドをキナーゼ基質として用い、各種ヒト組換えキナーゼ（CDC7_ASK、CK2A1、CK2a2、CDK2_CYCE1、ERK7、CDK9_CYCLINK、DYRK1A、DYRK4、DYRK2、DYRK3、HIPK1、HIPK2、HIPK3、HIPK4、ICK、MOK、GSK3b、CDK6_CYCD3、CDK6_CYCLIND1、CDK7_CYCH_MAT1、CDK9_CYCT1、ERK5、CDC2_CycB1、CDK2_CYCA2、CDK5_P25、CDK3_CYCE1、NLK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、P38D、P38G、p38a、P38B、CLK1、CLK3、MAP2K1、MAP2K7、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K2、STK33、TAK1、CAMKK1、CAMKK2、ACTR2、HRI、PEK、CK1A、CK1d、CK1E、CK1G1、CK1G2、CK1G3、BMPR1B、ALK2、ALK4、TGFBR1、BARK1、GPRK5、GPRK7、RHOK、BUBR1、PLK1、PLK3、TLK1、TLK2、CHK2、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MAPKAPK5、PKD2、PKD1、PKD3、CAMK1D、CAMK2B、CaMK2a、CAMK2G、CAMK2D、CHK1、LATS1、LATS2、IRAK1、CAMK4、DCLK1、DCLK2、MNK2、PKCG、PKCa、PKCB1、PKCT、PKCH、PKCZ、PKN1、PKN2、PLK4、AURB、AURA、AurC、PAK1、PAK2、PAK3、AKT1、AKT2、AKT3、SGK1、SGK2、SGK3、CGK2、PKG1B、PKG1A、PKACa、PKACB、PRKX、MSK1、MSK2、RSK1、RSK2、RSK4、RSK3、P70S6K、DAPK1、NDR1、NDR2、ROCK1、ROCK2、P70S6KB、PIM2、PIM1、PIM3、PAK5、PAK4、PAK6、BRSK2、AMPKA1_B1_G1、AMPKA2_B1_G1、NUAK1、NUAK2、MELK、MARK2、MARK1、MARK4、MARK3、QIK、NIM1、SIK、TSSK1、TSSK2、SKMLCK、COT、PHKG1、IKKA、IKKb、IKKE、TBK1、NEK2、NEK6、NEK7、MLK2、MLK1、MLK3、NEK9、TTBK1、MAP3K1、GCK、MST1、MST2、HGK、MINK、KHS1、TNIK、MST3、MST4、YSK1、PHKG2、TAO2、ZAK、NEK4、SGK496、ULK3、LIMK1、WNK1、WNK2、WNK3、及びTAO1）に対する反応性を調べた。具体的には実施例2と同様にして行った。
　キナーゼ基質の、各キナーゼによるリン酸化量の総和に対する対象キナーゼによるリン酸化量（リン酸化量：対象キナーゼ／全キナーゼ合計）、及び各キナーゼによるリン酸化量を多い順に並べた際の対象キナーゼによるリン酸化量の順位（対象キナーゼの順位を表８６に示す。また、対象キナーゼがPLK3であるキナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量を図２１に示し、対象キナーゼがERK7であるキナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量を図２２に示す。表８６及び図２１～２２より、実施例1の手法で設計された基質ペプチド配列を含むポリペプチドは、対象キナーゼに対して特異的にリン酸化されることが実験的に示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
　実施例6．キナーゼ基質ペプチドの設計2
　実施例1-1で作製したコンセンサス配列およびPWMを使用して（使用したPWMを表８７に示す。）、実施例1-2と同様にして、基質ペプチド候補群を設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
　得られた基質ペプチド配列からC末端のアルギニンが除かれてなる配列について、一部を表８８に示す。表８８のアミノ酸配列（左側がN末端側）中、「－」は、アミノ酸配列中の各アミノ酸の区切りを示し、配列番号は、括弧外のアミノ酸の配列が設計された基質ペプチド配列の配列番号を示す。なお、括弧内のアミノ酸はPWMスコアが正値で、かつgini係数が0.8以上のアミノ酸であり、括弧外のアミノ酸が、当該括弧内のアミノ酸のいずれかに置きかえられていてもよいことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
　実施例7．設計された基質キナーゼペプチドの特異性の評価3
　実施例6で設計された
基質ペプチド配列のC末端にアルギニンが付加され、N末端のアミノ基がアセチル化され、且つC末端のカルボキシル基がアミド化されてなるポリペプチドを合成した。合成したポリペプチドの一部について、対象キナーゼ、基質ペプチド配列（C末に付加されたアルギニンを除いてなる配列）、及び配列番号を表８９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　得られたポリペプチドをキナーゼ基質として用い、各種ヒトチロシン組換えキナーゼ（ABL1、ABL2、ACK、TNK1、ALK、LTK、AXL、MER、TYRO3、CTK、DDR2、EGFR、ERBB4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、FAK、PYK2、FER、FES、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF1R、INSR、IRR、JAK1、JAK2、JAK3、LIMK1、MET、RON、TAK1、MUSK、FLT3、FMS、KIT、PDGFRA、PDGFRB、RET、ROS、BLK、BRK、FGR、FRK、FYN、HCK、LCK、LYNA、LYNB、SRC、SRM、YES、SYK、ZAP70、BMX、BTK、ITK、TEC、TXK、TIE2、TRKA、TRKB、TRKC、FLT1、FLT4、KDR、及びWEE1）に対する反応性を調べた。具体的には実施例2と同様にして行った。
　対象キナーゼがTYRO3であるキナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量を図２３に示し、対象キナーゼがEGFRであるキナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量を図２４に示し、対象キナーゼがFERであるキナーゼ基質の、各組換えキナーゼによるリン酸化量を図２５に示す。図２３～２５より、実施例6の手法で設計された基質ペプチド配列を含むポリペプチドは、対象チロシンキナーゼに対して特異的にリン酸化されることが実験的に示された。

Claims (17)

  1. 下記（a）又は（b）のアミノ酸配列：
    （a）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （b）配列番号1～187及び249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
    を含み、且つ対象キナーゼに対する反応性が他のキナーゼに対する反応性の2倍以上であるポリペプチド。
  2. 前記アミノ酸配列が前記（a）のアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a1）のアミノ酸配列：
    （a1）配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、及び182のいずれかに示されるアミノ酸配列、
    であり、且つ
    前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b1）のアミノ酸配列：
    （b1）配列番号1、13、18、21、23、32、33、78、149、169、171、172、176、及び182のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
    である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a2）のアミノ酸配列：
    （a2）配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、及び187のいずれかに示されるアミノ酸配列、
    であり、且つ
    前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b2）のアミノ酸配列：
    （b2）配列番号1、12、15、32、39、50、62、63、64、73、77、78、82、83、95、100、103、105、108、130、131、137、142、146、149、161、176、及び187のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
    である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  5. 前記（a）のアミノ酸配列が、下記（a3）のアミノ酸配列：
    （a3）配列番号249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列、
    であり、且つ
    前記（b）のアミノ酸配列が、下記（b3）のアミノ酸配列：
    （b3）配列番号249～251のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
    である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  6. 前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列におけるアミノ酸変異が、アミノ酸の置換である、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. 前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換対象のアミノ酸が、対象キナーゼのコンセンサス配列で特定されるアミノ酸以外のアミノ酸である、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換後のアミノ酸が、対象キナーゼのPosition Weight Matrixに基づいて決定されたアミノ酸である、請求項６又は７に記載のポリペプチド。
  9. 前記（b）、（b1）、（b2）、又は（b3）のアミノ酸配列における置換後のアミノ酸が、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、及びシステイン以外のアミノ酸である、請求項６～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  10. 構成するアミノ酸数が20以下である、請求項１～９のいずれかに記載のポリペプチド。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドからなる、キナーゼ基質。
  12. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリペプチド及び固相を含み、且つ前記ポリペプチドが固相に固定されている、キナーゼ基質アレイ。
  13. 請求項１１に記載のキナーゼ基質を含有する、キナーゼ活性測定用試薬。
  14. 請求項１１に記載のキナーゼ基質及び請求項１２に記載のキナーゼ基質アレイからなる群より選択される少なくとも1種を含む、キナーゼ活性測定用キット。
  15. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを接触させる工程を含む、キナーゼ活性測定方法。
  16. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを接触させる工程を含む、被検試料のキノーム解析方法。
  17. 請求項１～１０のいずれかに記載のポリペプチドと被検試料とを被検物質の存在下で接触させる工程を含む、被検物質のキナーゼ活性調節能を評価する方法。
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