CN104583395B - 用于捕获和释放微生物的微结构体 - Google Patents

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Abstract

提供了利用微结构体来捕获和释放微生物的方法，所述方法包括以下步骤：提供涂覆有用于使微生物附着和解附的蛋白的微结构体；在含有微生物的溶液中，将所述微结构体与含有辅助微生物附着的物质的溶液混合，以制备混合溶液；搅拌所述混合溶液以使所述微生物附着于所述微结构体；从所述混合溶液中分离出附着有微生物的微结构体；和将所述微结构体暴露于其中辅助所述微生物附着的物质以低浓度存在的环境中，从而使所述微生物从所述微结构体上解附。

Description

用于捕获和释放微生物的微结构体
技术领域
本发明涉及用于捕获和释放微生物的微结构体。
背景技术
为了有效治疗疑似败血症或菌血症的患者，进行血液培养物测试以便准确地诊断出造成败血症的病原生物体和对该病原生物体有效的治疗剂。一般而言，血液培养物测试通过以下程序进行。首先，从患者体内无菌采集血液。对于血液采集，使用如注射器等合适的工具来使皮肤免受正常存在于皮肤上的微生物和处于周遭环境中的微生物的污染。血样与液体血液培养基混合，并在通常1至2天中观察在37℃培养期间微生物是否生长。接种有血液的培养基分别在有氧和无氧条件下培养。因此，能够在培养基中培养出厌氧微生物(在氧气存在下无法生长)以及好氧微生物(在氧气存在下能够生长)或者兼性厌氧微生物(在存在或不存在氧气的情况下都能够生长)。含培养基的培养瓶的底部通常涂覆有趋于在微生物生长时变色或发出荧光的化学物质。因此，能够识别颜色变化或荧光的血液培养系统的使用使得能够自动检测培养基中微生物的生长。在将微生物从患者体内提取出并进行培养直至微生物的数目达到最佳水平(105细胞/ml)之后，执行后续过程(例如，鉴定病原体株和抗生素易感性测试)。此时，需要纯培养以便从血液培养物溶液中选择性分离出病原体株并培养该病原体株。根据通用的纯培养方法，血液培养后的培养物溶液(含有微生物)在琼脂培养基上铺板，以便获得必需量的微生物。此时，微生物需要16小时至24小时来形成集落。常规的纯培养方法要求相对较长的时间，这使得对细菌败血症的治疗效果显著变差。因此，需要更短的培养时间以进行更快速的抗生素易感性测试。
常规方法还需要将微生物从食物或天然环境中分离出以便鉴定并培养该微生物的过程。然而，以极小的量存在于此类环境中的微生物不易进行分离。即使微生物以相对较大的量存在时，也必须采用耗时的微生物培养过程来分离所述微生物。
因此，需要以有效且省时的方式从例如源自生物体的组织、血液、粪便和尿液、食物以及自然环境等各种环境中分离出微生物的方法。
发明内容
根据本公开的一个方面，提供了包含微结构体的用于捕获和释放微生物的结构体，每个微结构体具有其上可附着一个或多个微生物的表面区域以及涂覆于所述微结构体上且能够通过人工控制而使微生物附着/解附的蛋白。
根据本公开的另一方面，提供了利用微结构体来捕获和释放微生物的方法，所述方法包括：提供涂覆有用于使微生物附着和解附的蛋白的微结构体；在含有微生物的溶液中，将所述微结构体与含有辅助微生物附着的物质的溶液混合，以制备混合溶液；搅拌所述混合溶液以使微生物附着于微结构体；从所述混合溶液中分离出附着有微生物的微结构体；和降低辅助所述微生物附着的物质的浓度，从而使微生物从微结构体上解附。
附图说明
图1是显示细菌结合至人甘露糖结合凝集素(MBL)或从其解离的模型的图示。
图2显示了描绘细菌附着至MBL涂覆的微结构体的状态的(a)示意图和(b)实际光学显微图片。
图3是说明捕获和分离微生物的方法的一个实施方式的流程图。
图4显示的光学显微图片示出了对抗体涂覆的微结构体与MBL涂覆的微结构体的细菌捕获和释放性质进行比较的实验结果。
图5至8显示了将附着至MBL涂覆的微结构体和抗体涂覆的微结构体的细菌从微结构体分离并进行培养之后，每小时记录的细胞数。
具体实施方式
现将参照附图详细描述本公开的实施方式。提供这些实施方式是为使本公开完善，且这些实施方式将完整地向本领域技术人员表明本公开的范围。因此，本公开可以实施为许多不同的形式，且不应认为其限于本文阐述的示例性实施方式。在附图中，要素的尺寸，如宽度、长度和厚度等，可能进行了夸张放大以使其清晰。在整个附图中，相同的附图标记表示相同要素。附图是从观察者的角度来解读的。应该理解，当提及某要素处于另一要素“之上”时，其可直接位于所述另一要素上方，或者在两者之间也可以存在一个或多于一个中间要素。
在一方面，本公开提供了用于以容易的方式捕获或释放微生物的新型结构体。本公开的结构体包括微结构体，每个微结构体具有其上可附着一个或多个微生物的表面区域以及涂覆于所述微结构体上且能够通过人工控制来使微生物附着/解附的蛋白。
微结构体设计为在结构上适于捕获和释放微生物。每个微结构体的表面区域大至足以捕获一个或多个微生物。即，每个微结构体的尺寸都大于微生物的尺寸。
本文所用的术语“微结构体”是指其尺寸等于或大于如细菌等微生物的尺寸的结构体，且所述结构体的最长边至少为1μm。例如，每个微结构体可以是其宽度、厚度和长度中的至少一个为1μm至1mm的结构体。微结构体的宽度、厚度和长度维度中的至少一个通常可以是数十至数百微米。微结构体可以具有如球形、多面体、平面性或棒形结构等各向同性结构。作为选择，微结构体可以具有各向异性结构，或者可以不定形。例如，微结构体可以是直径为数十微米的球形结构。优选地，微结构体是宽度为数十微米的平面形或圆盘形结构。当微结构体的形状为平面形时，每个微结构体可以附着至少一个微生物。另外，多个微生物附着并分布在平面形微结构体的前侧与后侧。该平面分布有利于在用成像系统观察微生物的后续过程中对目标聚焦或者确定微生物的数目。
微结构体可以通过多种技术制造。例如，可以使用美国专利公开第2007/0105972号所公开的连续流光刻法(continuous flow lithograph)或韩国专利第0875900号中公开的利用数字微镜装置(DMD)的光流控光刻法(optofluidic lithography)来以更快更容易的方式制造具有各种形状、尺寸和化学组成的微结构体。
微结构体可以是通过使例如紫外固化性聚合物或单体等固化性材料固化而生成的聚合物。所述固化性材料可包括能够形成水凝胶的液相亲水性聚合物。
此类能形成水凝胶的固化性材料的实例包括：如聚二甲基硅氧烷等含硅聚合物、聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯以及它们的共聚物。例如，由于作为固化性材料的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)在聚乙二醇(PEG)链的两端都具有丙烯酸酯官能团，其能够通过自由基聚合而交联形成三维水凝胶。固化性材料还可以包括任何类型的其状态能够从液态变为固态的介质。
用紫外光透过形成在数字微镜装置中的光掩膜图案或掩膜图案照射固化性材料使得能够制造各种形式的微结构体。
微结构体涂覆有能够通过人工控制而使微生物附着/解附的蛋白。所述蛋白使微结构体适于捕获和释放微生物。蛋白的表面与微生物相互作用。蛋白的表面特征可以通过人工控制如pH、温度和外部金属离子浓度等因素而改变。例如，微结构体可以在预定的pH范围、预定的温度范围或预定的离子浓度范围内捕获或释放微生物。
每个微结构体还可以包括具有官能团的保护层。优选地，使用以二氧化硅涂覆的层作为保护层。如羧基等官能团的引入有助于涂覆用于使微生物附着/解附的蛋白(例如MBL)。
当微结构体基于水凝胶时，以二氧化硅涂覆的层增加了微结构体的稳定性并且防止MBL被吸附至水凝胶内。用于引入MBL的官能团可以通过以二氧化硅涂覆的层的表面-OH基团而引入。
蛋白可以结合存在于微生物表面上的糖蛋白或糖。微生物例如可以为病毒、细菌和原生动物。用于使微生物附着/解附的蛋白例如可以为钙依赖性血清蛋白。具体地，所述钙依赖性血清蛋白可以是甘露糖结合凝集素(MBL)。甘露糖结合凝集素(MBL)也称甘露糖结合蛋白(MBP)。MBL是钙离子(Ca2+)-依赖性凝集素(C型凝集素)，其活化凝集素途径或者充当调理素而显著改善白细胞的吞噬作用。用于使微生物附着/解附的蛋白的特性可以通过辅助微生物附着的物质而进行人工控制。例如，MBL可以通过钙离子而结合微生物。
图1是显示作为微生物的细菌结合作为蛋白的人甘露糖结合凝集素(MBL)或从其上解离的模型的图示。当钙离子(Ca2+)以高浓度存在时，MBL经由钙离子结合微生物细胞壁的糖残基并以强作用力保持微生物(见图1的(a))。同时，当钙离子(Ca2+)以低浓度存在时，MBL不再与微生物细胞壁结合，并且微生物因此得到释放(见图1的(b))。
参见图1，MBL具有2至6个糖识别结构域(CRD)。MBL能通过钙离子捕捉存在于如细菌等微生物表面上的糖。因此，MBL涂覆的微结构体能够在钙离子以高浓度(例如，20mM以上)存在的环境中捕获微生物。MBL能有利地高效捕获激活所有类型的细菌。通过降低环境钙离子浓度能够容易地将细菌与MBL分离。所收集的细菌可以进行培养或者直接用于抗生素易感性测试(AST)。
图2显示了描绘细菌附着至MBL涂覆的微结构体的状态的(a)示意图和(b)实际光学显微图片。图2(b)显示了作为细菌物种的枯草芽孢杆菌ATCC 6633附着至作为微结构体的圆盘形PEG的状态。微结构体的直径为100μm且高度为25μm。
在另一方面，本公开提供了利用微结构体捕获和分离微生物的方法。图3是说明捕获和分离微生物的方法的一个实施方式的流程图。参照图3，在步骤S1中，提供了以用于使微生物附着/解附的蛋白涂覆的微结构体。
在步骤S2中，在含微生物的溶液中，微结构体与含有辅助微生物附着的物质的溶液混合而制备混合溶液。微生物可以为例如，存在于一般培养溶液中的细菌、血液培养后的培养细菌或者存在于各种环境(例如，源自生物体的血液、粪便、尿液或组织、食物或天然环境)中的细菌。在微结构体以MBL涂覆的情形中，含有辅助微生物附着的物质的溶液可以为例如细胞用缓冲溶液，诸如含有钙离子的TE或磷酸盐缓冲盐水。
在步骤S3中，搅拌混合溶液以使微生物附着至微结构体。例如，可以通过在30℃至37℃以50rpm至100rpm摇振来适当地搅拌混合溶液。
在步骤S4中，从混合溶液中分离出附着有微生物的微结构体。可以利用过滤来分离微结构体。作为选择，在微结构体包含磁性材料时可以利用磁力分离。
在步骤S5中，微结构体暴露于其中辅助微生物附着的物质以低浓度存在的环境中。由于这种暴露之故，微生物能够从微结构体上解附。附着有微生物的微结构体可以暴露于其中排除了辅助微生物附着的物质的溶液，且因此能够使微生物与微结构体分离。例如，对于含有因钙离子的存在而与微生物附着的MBL-微结构体的溶液，可以用不含钙离子的TE或PBS处理以将钙从其中除去，然后将微结构体置于普通微生物培养基中。由于MBL经钙离子与微生物表面结合，因而附着有微生物的微结构体暴露于其中钙离子以低浓度(例如，1mM以下)存在的液态环境中使得能够将钙离子与MBL分离，从而促进微生物与微结构体解附。解附的微生物保持基本完好，且因此能在后续步骤中在培养基中有效培养。
如上所述，使用MBL涂覆的微结构体使得能够捕获以低浓度存在的未知种类的细菌。其后，可以从培养基中的微结构体上容易地分离出捕获的细菌，使细菌培养效率提高。因此，本公开的方法可以用于以下应用。
第一，本公开可以应用于细菌抗生素易感性测试系统。根据本公开的方法的高捕获率和培养效率能够将纯培养所需时间(通常为16至24小时)显著缩短。例如，根据本公开，含有浓度为105cfu/ml的细菌的血液能够在约3小时内培养至107cfu/ml的较高浓度。
第二，本公开可以用于有效地分离存在于例如源自生物体的组织、血液、粪便或尿液、食物或天然环境等各种环境中的微生物(例如细菌或病毒)。因此，可以减少鉴定所述微生物所需的时间。必要时，本公开还能用于有效地培养所述微生物。
第三，本公开可以用于细菌的储存。CRYOBANKTM是用于储存和保藏细菌菌株的商用系统，其利用了吸附细菌能力较差的陶瓷珠，使得难以在其中储存大量细菌。因此，与常规的珠系统相比，预期本公开在细菌捕获和培养效率方面将更为有利。
第四，本公开还可以用于其中捕获细菌并将捕获的细菌细胞利用珠进行裂解从而有效分离DNA和蛋白的应用，如来自Hyglos的细菌捕获试剂盒。由于常规的商购珠裂解试剂盒使用抗体来捕获细菌，其能应用于特定的菌株，但无法用于广泛的菌株。相比之下，本公开可以用于容易地捕获许多种类的菌株。
本公开具有与现有技术显著不同的优点。根据现有技术，细菌收集方法被宽泛地分为两组。一组涉及将细菌抗体与珠附着(Sanchez,J.8t Jonson,G.Binding of bacteriato carbohydrates immobilized on beads to demonstrate the presence of cell-associated hemagglutinins in Vibrio cholerae.APMIS 98:353-357,1990)，另一组涉及将MBL涂覆在纳米珠上(Keun-Hwa Park,Kenji Kurokawa,Human Serum Mannose-binding Lectin Senses Wall Teichoic Acid Glycopolymer of Staphylococcusaureus,Which is Restricted in Infancy第285卷/第35期/2010年8月27日)。在前一种方法中，一类细菌与特定种类的抗体高度特异性地结合。然而，抗体的使用不能确保以高效率捕获多种细菌或者未知细菌。根据后一种方法，纳米级的珠与微米级的细菌附着以捕获该细菌。该方法确保了以高效率来捕获细菌，但难以使珠与细菌解附。此外，纳米尺寸的珠可能对于细胞有毒性，从而影响细菌生长。结果，该方法难以应用于捕获细菌的培养或者在如AST等其他应用中的使用。即，纳米珠的使用有助于确定细菌的存在，但是却使该方法难以用于除细菌收集和鉴定之外的其他目的。
将参照以下实施例对本公开进行更为详细的说明。然而，这些实施例并非旨在限制本公开的主旨。
实施例
微结构体的制造
通过光流控无掩膜光刻法(OFML)将PEG-DA固化以制备圆盘形珠，该圆盘形珠具有50μm至200μm的不同直径和约10μm至50μm的不同厚度，主要为直径100μm和厚25μm。使圆盘形珠含有一定量的磁性材料，从而使得PEG-DA与磁性材料的体积比为10:1。由于存在磁性材料，珠在后续过程中容易与混合溶液分离。在珠表面涂覆二氧化硅。其后，利用如ECD/NHS等催化剂将抗体或MBL附着于珠表面。抗体或MBL的添加量使得其浓度达到约1μg/ml至125μg/ml(通常为5μg/ml)。
MBL涂覆的微结构体和抗体涂覆的微结构体的细菌捕获和释放性质的比较
根据下述实验程序比较MBL涂覆的微结构体的细菌捕获和释放性质与抗体涂覆的微结构体的细菌捕获和释放性质。
首先，对被细菌感染的血液进行培养，直至细胞数达到最大值108/ml。制备了浓度为100个/ml至107个/ml的样品。将微结构体以对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具特异性的抗体进行涂覆。另外地，将微结构体以MBL进行涂覆。将微结构体于37℃在细菌培养溶液(各1ml)中于50rpm至100rpm摇振1小时。各细菌培养液中的微结构体的数目调节至5000个。作为摇振的结果，细菌附着至微结构体。
培养完成后，使用磁性法或过滤法来分离附着有细菌的珠。其后，将珠转移至新鲜培养液中。使细菌能从结构体上自然解附。将从微结构体分离的纯细菌培养1至4小时。每小时对从抗体涂覆的微结构体和MBL涂覆的微结构体上释放的培养细菌进行测定和比较(C-chip，NanoEntek)。
图4显示的光学显微图片示出了比较抗体涂覆的微结构体与MBL涂覆的微结构体的细菌捕获和释放性质的实验结果。在图4中上方的图片中，比较了MBL-微结构体(左)附着微生物的能力与抗体-微结构体(右)附着微生物的能力。在下方图片中，比较了MBL-微结构体(左)和微生物解附的能力与抗体-微结构体(右)和微生物解附的能力。
参照图4，与抗体-微结构体相比，MBL-微结构体附着了大量的两个不同种类的细菌(铜绿假单胞菌ATCC 27853和金黄色葡萄球菌ATCC 29213)。下方图片示出，与常规抗体-微结构体相比，MBL-微结构体上附着的细菌更有效地解附。从MBL-微结构体上分离的细菌还可以再利用。因此可以证实，与细菌基于与抗体的特异性反应而附着的微结构体相比，所有细菌组都附着的MBL涂覆微结构体显示出高得多的反应效率。这些结果表明，可以在后续抗生素易感性测试中在短时间内从MBL涂覆的微结构体上分离大量的纯细菌，从而证明本公开的方法在时间、成本和灵敏度方面都优于常规的纯分离和培养方法。
图5至8显示了将附着至MBL涂覆的微结构体和抗体涂覆的微结构体的细菌从微结构体分离并进行培养之后每小时记录的细胞数。细菌为铜绿假单胞菌ATCC 27853(图5)、金黄色葡萄球菌ATCC 29213(图6)、埃希式大肠杆菌ATCC 25922(图7)和粪肠球菌ATCC 29212(图8)。
在各图中，(a)显示了源自MBL涂覆的微结构体的细菌细胞数，且(b)显示了源自抗体涂覆的微结构体的细菌细胞数。
参照图5至图8，与分离自抗体-微结构体的细菌相比，分离自MBL-微结构体的细菌生长迅速得多。图中的数字表示每毫升的细菌数目。当细菌数达到107以上时(如红色数字所示)，就可以进行抗生素易感性测试。
图5至8中的结果揭示，附着于MBL-微结构体并从其上解附的细菌的活性比附着于抗体-微结构体并从其上解附的细菌的活性高得多。
虽然已参照前述实施方式对本公开进行了详细描述，但本领域技术人员应该理解，可以在不背离如所附权利要求书所公开的本公开的主旨和范围的情况下对所述实施方式进行各种变形和改动。

Claims (11)

1.一种用于捕获和释放微生物的结构体，所述结构体包括：
微结构体；和
蛋白，所述蛋白涂覆于所述微结构体上，并且所述结构体能够通过人工控制而使所述微生物对所述蛋白附着/解附，所述蛋白是钙依赖性血清蛋白，
所述人工控制改变选自由pH、温度和外部金属离子浓度组成的组中的至少一种因素，
所述微结构体基于使固化性材料固化而生成的水凝胶，其中，所述微结构体还包括具有官能团的二氧化硅涂覆的层，所述官能团有助于涂覆所述蛋白。
2.如权利要求1所述的结构体，其中，所述微结构体的宽度、厚度和长度中的至少一者为1μm至1mm。
3.如权利要求1所述的结构体，其中，所述微结构体为平面形结构或圆盘形结构。
4.如权利要求1所述的结构体，其中，所述微结构体还包括磁性材料。
5.如权利要求1所述的结构体，其中，
所述固化性材料为聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯以及它们的共聚物。
6.如权利要求1所述的结构体，其中，所述钙依赖性血清蛋白为甘露糖结合凝集素(MBL)。
7.一种利用微结构体来捕获和释放微生物的方法，所述方法包括：
提供涂覆有用于使微生物附着/解附的蛋白的微结构体，所述蛋白是钙依赖性血清蛋白；
在含有微生物的溶液中，将所述微结构体与含有辅助微生物附着的物质的溶液混合，以制备混合溶液；
搅拌所述混合溶液以使所述微生物通过所述蛋白附着于所述微结构体；
从所述混合溶液中分离出附着有微生物的微结构体；和
将所述微结构体暴露于其中辅助所述微生物附着的物质以低浓度存在的环境中，从而使所述微生物从所述微结构体上解附，
所述微结构体基于使固化性材料固化而生成的水凝胶，其中，所述微结构体还包括具有官能团的二氧化硅涂覆的层，所述官能团有助于涂覆所述蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述蛋白是甘露糖结合凝集素(MBL)，并且所述辅助微生物附着/解附的物质是钙离子。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述微生物在浓度为20mM以上的钙离子存在下附着于所述微结构体。
10.如权利要求7所述的方法，其中，所述微生物在浓度为1mM以下的钙离子存在下从所述微结构体上解附。
11.如权利要求7所述的方法，其中，
所述固化性材料为聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯以及它们的共聚物。
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