CN102500291B - 具有壳核结构的磁性荧光纳米颗粒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳核结构的荧光磁性纳米颗粒的制备方法和应用。首先，以Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me＝Co、Mn、Ni)、金属Ni、Co、Fe及其合金Fe-Co、Ni-Fe等纳米粒子的一种或几种作为内核，外包二氧化硅壳，制备具有核壳结构的二氧化硅磁性微球，再将荧光物质(Eu3+、Sm3+、Dy3+、Tb3+等的螯合物)吸附在二氧化硅的壳层上。然后，再在其外面包裹上一层二氧化硅以提高其荧光磁性微球稳定性，防止团聚和荧光物质外泄。由于壳层里包裹了大量的稀土荧光物质，因此所制备样品的荧光强度信号大大增强。该纳米颗粒具有富集和标记的双重功能，在生物医学领域有着更广阔的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于纳米材料、生物医学技术领域，具体涉及一种磁性荧光复合纳米颗粒的制备及其应用。
【背景技术】
现代生物医学研究领域中，标记和富集分离是必不可少的步骤。稀土荧光纳米颗粒具有荧光寿命长、Stokes位移大、激发谱较宽而发射峰尖锐等标记优势，已逐步取代传统有机荧光染料，运用于生物标记和医学诊断领域，但不具备采集和分离功能。磁性纳米颗粒具有良好的超顺磁性和表面易功能化等特点，能与欲分离的目标物相结合，在外磁场的作用下定向集中，但本身不具备标记的功能。随着科技的进步，单一的荧光纳米材料或磁性纳米材料已经难以满足学科发展需求。兼具荧光可示踪性和超顺磁响应性的双功能磁性荧光纳米颗粒具有富集和标记的双重功能，在生物医学领域有着更广阔的应用前景。
运用传统的自主装、共沉淀等方法制备出的纳米颗粒表面粗糙、均匀性较差、荧光易淬灭等缺陷。本发明将微乳液法和layer-by-layer自组装法相结合，首先以Fe3O4纳米粒子作为磁性核，外包二氧化硅壳，制备具有核壳结构的二氧化硅磁性微球，再将稀土荧光物质吸附在二氧化硅的壳层上，二氧化硅壳层表面可以结合大量的稀土荧光物质。然后，再在其外面包裹上一层二氧化硅以提高其荧光磁性微球稳定性，防止团聚和荧光物质泄漏。由于颗粒里包裹了大量的稀土荧光物质，因此，所制备颗粒的荧光强度高。该磁性荧光纳米颗粒的表面可进行各种修饰，直接连接生物活性物质，将在免疫分析、疾病诊断、定量检测、磁共振成像、光动力治疗等方面发挥重要作用，极大地推动生物科学技术的发展。
【发明内容】
本发明目的在于提供一种粒径小、磁响应性强、荧光信号强、抗光漂白性强、生物相容性好、易于表面修饰的单分散磁性荧光纳米颗粒。该颗粒可以应用于生物标记、分离、富集、检测等领域。
本发明的磁性荧光纳米颗粒是以磁性纳米粒子为核，核外层包裹一层多孔性的SiO2，荧光物质通过共价、静电吸附等方式固定在孔内及颗粒表面，再在此颗粒的表面包裹一层SiO2。其粒度控制在10-500nm之间。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒的磁性内核可以是Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me＝Co、Mn、Ni)、金属Ni，Co，Fe及其合金Fe-Co，Ni-Fe等的一种或几种，优选Fe3O4。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒中含有的荧光物质可以是稀土元素(如：Eu3+、Sm3+、Dy3+、Tb3+等)与螯合剂形成的螯合物，该螯合物可以在紫外光激发下发射出明亮的特征性荧光。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒的制备过程中，运用的稀土元素螯合剂可以是多氨基多羧酸类螯合剂、菲咯啉类螯合剂、β-二酮类螯合剂、水杨酸类螯合剂、吡啶类螯合剂等化合物，能与三价稀土元素螯合形成螯合物、在紫外光激发下发射稀土元素特征性荧光。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒中的螯合物可以采用以下任一种方式固定在多孔二氧化硅的孔内及表面：共价偶联、静电吸附等，优选共价偶联。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒的最外层是SiO2包覆层，既可通过正硅酸乙酯水解得到表面带有羟基的硅层，又可通过硅烷偶联剂水解得到表面带有特定功能基团的硅层，便于直接与生物分子共价偶联或静电吸附，制成生物分子探针。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒具有荧光量子效率高、激发光谱带较宽、发射谱带窄、Stokes位移大、荧光寿命长等特点。
本发明提出的具有核壳结构的磁性荧光纳米颗粒无生物毒性，可以用于生物医学领域中的生物标记、分离、富集、检测等领域。
【附图说明】
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1是磁性荧光纳米颗粒透射电镜照片(左图)和发射光谱(右图)
【具体实施方式】
尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。
实施例1 超顺磁性纳米颗粒的制备
称取2.71g FeCl3·6H2O和1.18g FeCl2·4H2O溶于50ml蒸馏水中，搅拌混匀后，加入4mL浓氨水，室温搅拌反应30min，在磁场作用下，收集产物，去除上清。用去离子水洗涤产物3次，200mL/次。用去离子水将颗粒定容至50mL。
实施例2 Fe3O4SiO2纳米颗粒的制备
分别取7.5mL环己烷、1.77mL Triton X-100、1.8mL正己醇于10mL烧瓶中，混合均匀；加入480μL Fe3O4水溶液，搅拌5min以后形成油包水的微胶囊，随后加入100μL TEOS，搅拌混匀，加入60μL氨水；锡纸包裹，反应24h；加入等体积的丙酮，涡旋，打破微乳液体系；置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；依次用丙酮、无水乙醇、水洗涤颗粒，50mL/次，洗涤过程中，涡旋、超声破碎颗粒。将颗粒重悬于50mL 1M盐酸中，室温静置24h。置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次；将颗粒重悬于20mL无水乙醇中。
实施例3 包覆稀土荧光络合物
往50μL 0.1M BHHCT溶液中加入6.3μL三氨丙基三乙氧基硅烷，涡旋混匀，室温静置20min，加入50μL 0.1M EuCl3溶液，混匀，室温静置20min。将此液体转至实施例2中所得的Fe3O4SiO2无水乙醇悬液中，避光，80℃冷凝回流18h。置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次。将颗粒置于60℃真空干燥箱中干燥约12h后，得到表面包覆有荧光络合物的磁性纳米颗粒。
实施例4 包覆SiO2层
用乙醇、氨水混合液(无水乙醇∶氨水＝10∶1)将实施例4所得颗粒稀释至1.2L，加入28mL TEOS，缓慢搅拌下，避光、室温反应24h。置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次；将颗粒重悬于5mL无水乙醇中。即得磁性荧光纳米颗粒，该颗粒的电镜照片及发射光谱见图1。
实施例5 稀土荧光纳米颗粒的表面修饰(以引入环氧基为例)
将实施例4中的颗粒置于45mL无水乙醇中，加入1mL 3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)，避光，80℃冷凝回流18h。置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次。将颗粒置于60℃真空干燥箱中干燥约12h后，得到表面带有环氧基基团的磁性荧光纳米颗粒。
实施例6 与生物分子共价偶联(以抗体为例)
取1mg制备好的磁性荧光微球，PBS定容到4mL，加入水溶性0.5mg抗体，37℃低速磁力搅拌2h，加入0.01M Tris-HCl(pH8.0)，继续搅拌1h，磁分离，1×PBS洗涤数次，加入储存液4℃保存待用。
实施例7用于免疫层析检测(以检测大肠杆菌O157:H7为例)
用点膜仪在硝酸纤维素膜上按照1μL/cm的量喷涂1.0mg/mL兔抗O157:H7多抗和1.0mg/mL的羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。依次将硝酸纤维素膜、样品垫、吸收垫粘贴于PVC衬板上，组装成免疫层析试纸条。然后，切割成4mm宽的试纸条，置于密封袋中，加干燥剂，密封，4℃保存备用。
取1mL待测大肠杆菌O157:H7菌液，加入20μL制备好的单抗-磁性荧光纳米颗粒复合物溶液，室温孵育5min，磁力吸附，除去上清。取60μL结合液重悬颗粒，将重悬液滴加到样品垫上，室温反应10min，紫外灯下观察检测结果。
试纸条检测结果表明：用该磁性荧光纳米颗粒制备的E.coli O157:H7检测试纸条灵敏性为4.0×104cell/mL，只与E.coli O157:H7有交叉反应，与E.coliO26:H11、E.coli O111:H8、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、溶血性链球菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、板崎肠杆菌、霍乱弧菌等均无交叉反应。检测571份样品，免疫层析法与实时PCR总符合率为95.97％。
实施例8用于核酸纯化(以提取人血液DNA为例)
取100μL正常人血，加入900μL裂解液(6M异硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，pH7.0)和200μg磁性荧光纳米颗粒，反应10min，磁性分离，弃掉液体。用裂解液洗涤磁性荧光纳米颗粒2次，再用75％乙醇洗涤磁性荧光纳米颗粒2次，用10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱核酸，磁力吸附，取上清，即为DNA。将所得DNA用分光光度计进行检测，检测结果见表1。
表1 6份血液DNA测定数据
| 样品编号 | A260/A280 | 核酸质量(μg) |
| 1 | 1.78 | 3.1 |
| 2 | 1.89 | 2.3 |
| 3 | 1.85 | 3.9 |
| 4 | 1.88 | 2.0 |
| 5 | 1.79 | 5.5 |
| 6 | 1.80 | 4.7 |
根据表1的数据，所提取的DNA纯度良好，产量较大，与进口试剂盒(如Qiagen的产品)的提取效果相当。
Claims (1)
1.一种磁性荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于，以具有超顺磁性的纳米颗粒为核，外包二氧化硅，再通过共价键方式将稀土纳米颗粒固定在二氧化硅壳层上，再在其外面包裹上一层二氧化硅；其制备步骤和条件如下：
1）超顺磁性纳米颗粒的制备
称取2.71g FeCl3·6H2O和1.18gFeCl2·4H2O溶于50ml蒸馏水中，搅拌混匀后，加入4mL浓氨水，室温搅拌反应30min，在磁场作用下，收集产物，去除上清；用去离子水洗涤产物3次，200mL/次，并用去离子水将颗粒定容至50mL；
2）Fe3O4SiO2 纳米颗粒的制备
分别取7.5mL环己烷、1.77mL Triton X-100、1.8mL正己醇于10mL烧瓶中，混合均匀；加入480μL Fe3O4水溶液，搅拌5min以后形成油包水的微胶囊，随后加入100μL TEOS，搅拌混匀；加入60μL氨水；锡纸包裹，反应24h；加入等体积的丙酮，涡旋，打破微乳液体系；置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；依次用丙酮、无水乙醇、水洗涤颗粒，50mL/次，洗涤过程中，涡旋、超声破碎颗粒；将颗粒重悬于50mL 1M盐酸中，室温静置24h；置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次；将颗粒重悬于20mL无水乙醇中；
3）包覆稀土荧光络合物
往50μL 0.1M BHHCT溶液中加入6.3μL三氨丙基三乙氧基硅烷，涡旋混匀，室温静置20min，加入50μL 0.1M EuCl3 溶液，混匀，室温静置20min；将此液体转至步骤2）中所得的Fe3O4SiO2无水乙醇悬液中，避光，80℃冷凝回流18h；置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次；将颗粒置于60℃真空干燥箱中干燥12h后，得到表面包覆有荧光络合物的磁性纳米颗粒；
4）包覆SiO2 层
用无水乙醇:氨水＝10:1的乙醇、氨水混合液将步骤3）所得颗粒稀释至1.2L，加入28mL TEOS，缓慢搅拌下，避光、室温反应24h；置于磁场中，静置片刻，吸弃液体；用去离子水、无水乙醇各洗涤颗粒3次，50mL/次；将颗粒重悬于5mL无水乙醇中，即得磁性荧光纳米颗粒。
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