CN103479999B - 一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子及其制备方法，它是将居里温度为48～90℃的锰锌铁氧体Mn_1-xZn_xFe₂O₄（0.1≤x≤0.9）表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆层表面接枝环氧基，通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端而成。本发明用硅酸四乙酯包覆二氧化硅的方法对磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面进行改性，从而可使磁性合金纳米粒子良好地单分散于水中，并保持长期不沉淀、不析出。然后，再用3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷进行处理，使二氧化硅包覆层表面接枝环氧基，并通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端，从而获得可用于人体肿瘤主动靶向性磁流体热疗的水溶性的自动控温的对肿瘤细胞有主动靶向性的液态磁流体加热介质。

Description

一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种铁氧体纳米粒子的制备方法，应用于磁流体热疗技术领域。

背景技术

由于人口老龄化、环境污染、工作压力、不良生活方式和社会无序竞争带来的精神压力等因素日益加重，癌症的患病人数和死亡人数在世界范围都在不断增长。手术、化疗、放疗依然是目前最主要的三种肿瘤治疗手段，但手术治疗的损伤和风险以及放化疗的巨大毒副作用严重影响了肿瘤患者的生存质量和存活率。因此，研究、开发新的具有靶向性的、更加有效、更加安全、低副作用的、无创或微创的肿瘤治疗方法势在必行。

磁流体热疗（magnetic fluid hyperthermia,MFH）是一项通过对肿瘤组织进行加热、高温杀伤肿瘤细胞，从而治疗肿瘤的新方法。MFH是基于交变磁场（alternating magnetic field，AMF）下磁性介质感应产热的物理学原理，利用磁性物质能在交变磁场中升温的物理特性，对肿瘤细胞进行治疗的一项技术，其优点在于合金磁性MFH介质可通过居里温度（Curietemperature）现象实现自动控温，治疗过程中无需测温；治疗采用的铁磁性介质生物安全性及组织相容性良好，且治疗后可保留在体内，因此可实现介质一次植入后多次重复热疗。与传统的热疗技术如红外热疗、超声热疗、微波热疗和射频电磁波热疗相比，磁流体热疗技术具有可高效治疗深层肿瘤、副作用小、微创甚至无创的特点。

常用的磁性元素是Fe、Ni和Co。但磁性纯金属的居里温度一般都比较高，Fe的居里温度为770℃，Ni的居里温度为358℃，Co的居里温度为1130℃。用于人体肿瘤的磁流体热疗温度都太高。为了降低居里点，可掺入一些非磁性元素，例如：Mn、Zn等把居里温度降到热疗所需的温度范围，从而在磁流体热疗中起到自动控温的作用。

研究通过用SiO₂包覆金属纳米粒子，可在金属纳米粒子表面形成亲水的硅羟基（Si-OH），从而可使金属纳米粒子单分散于水中，获得良好的水溶性。同时，硅羟基还可为后期接枝有机分子提供亲水的羟基表面基团。

以往的研究表明肿瘤细胞表面常常高表达细胞因子，如皮肤和粘膜的鳞状细胞癌的肿瘤细胞高表达表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）和C-Met。最近的研究发现引起肿瘤发生的、存在于肿瘤组织内的、被称为“肿瘤干细胞”（caner stem cells,CSC）的肿瘤细胞亚群（subpopulation）常常在细胞表面高表达一些特异的细胞因子，如头颈的鳞状细胞癌的肿瘤干细胞表面高表达CD44、CD133。这些肿瘤细胞和肿瘤干细胞表面高表达的各种细胞因子可以作为肿瘤靶向治疗的靶标，水溶性的共价偶联抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标抗体的纳米粒子能够通过静脉注射、主动靶向定位到各个部位相应的肿瘤细胞和肿瘤干细胞表面，甚至能主动靶向于发生远位转移的相应的肿瘤细胞和肿瘤干细胞表面，从而实现对肿瘤细胞的主动靶向性磁流体热疗。

理想的用于人体肿瘤磁流体热疗的加热磁流体介质应是能通过共价偶联的抗体主动靶向肿瘤细胞、通过居里温度现象实现自动控温、并具有优良的水溶性的超顺磁性液态流体。

发明内容

本发明的目的是提供一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子及其制备方法。

本发明采取的技术方案为：

一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子，它是将居里温度为48～90℃的锰锌铁氧体Mn_1-xZn_xFe₂O₄（0.1≤x≤0.9）表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆层表面接枝环氧基，通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端而成。

一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，包括步骤如下：

（1）锰锌铁氧体的制备：将MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O按照Mn_1-xZn_xFe₂O₄，0.1≤x≤0.9的比例称取配成混合溶液，然后放入水浴中加热并搅拌，将NaOH溶液滴加到搅拌中的混合溶液中，加完后使水浴升温至70～80℃，保温1～2h，然后降温冷却至室温并静置，倒去上清液，洗涤、抽滤，固体放入干燥箱中干燥，将试样研磨、过筛，得到锰锌铁氧体（Mn_1-xZn_xFe₂O₄）粉体；

（2）用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体：将锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，超声震荡使其分散均匀，置于60～70℃水浴中，并加入少量氨水调pH=8～10，然后将硅酸四乙酯加入其中，持续搅拌4～6h，冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末；

（3）磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：先用无水乙醇和去离子水交替清洗锰锌铁氧体纳米粒子粉体，并在氮气中干燥，然后置于等离子清洗器中处理使硅片表面生成一层活性的羟基，将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到3～缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，并置于37±2℃气浴恒温振荡器反应24～48h，反应完成后用无水乙醇清洗，并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末；

（4）环氧基开环共价偶联抗体氨基端：将表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液中，置于4±2℃放置12～24h,就可获得共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子磁流体。

上述制备方法中：步骤（1）所述的MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O、NaOH的用量比例按摩尔比1-x:x:2:8，0.1≤x≤0.9;氢氧化钠溶液的浓度1mol/L;氯化盐混合溶液总浓度为1mol/L。

步骤（2）中无水乙醇和蒸馏水组成醇水体系，醇水体系中的乙醇、水体积比为50:1；锰锌铁氧体的用量为每毫升醇水体系中含有0.3～0.5mg；硅酸四乙酯为每升醇水体系中加正硅酸乙酯0.026～0.0432mol；氨的摩尔浓度为每升醇水体系中含有氨0.38～0.45mol。

步骤（3）中二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液用0.3～0.5mg；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液体积浓度为5～10%。

步骤（4）所述的抗体稀释溶液浓度为10μg/mL；表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.3～0.5mg。

本发明采用新的工艺制备掺入锰（Mn）和锌（Zn）的四氧化二铁（Fe₂O₄）锰锌铁氧体纳米粒子，通过调整锰和锌的含量控制磁流体的居里温度，考虑到体内磁流体热疗时血流循环和向癌旁周围组织的散热因素，制备了居里温度约为48～90℃的锰锌铁氧体纳米粒子。

纳米颗粒在未经表面修饰的情况下一般会发生相互聚集，而达到能量最低，不能发挥纳米粒子的小尺寸效应，同时发生聚集沉淀的纳米粒子也无法用于静脉注射靶向肿瘤细胞。为使磁性合金纳米粒子获得优良的水溶性，本发明用硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS）包覆二氧化硅的方法对磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面进行改性，由于二氧化硅包覆层表面有亲水性的硅羟基，从而可使磁性合金纳米粒子良好地单分散于水中，并保持长期不沉淀、不析出。然后，本发明又用3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GPTMS)处理二氧化硅包覆的磁性锰锌铁氧体纳米粒子，在二氧化硅包覆层表面接枝环氧基，通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端，同时环氧基团偶联氨基开环之后会生成一个电中性的亲水羟基，共价偶联抗体的纳米粒子仍然能保持良好的水溶性。从而获得可用于人体肿瘤主动靶向性磁流体热疗的水溶性的自动控温的对肿瘤细胞有主动靶向性的液态磁流体加热介质。

附图说明

图1为掺入各种锰（Mn）和锌（Zn）含量的四氧化二铁（Fe₂O₄）锰锌铁氧体纳米粒子的居里温度分析图；a～f分别代表X=0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9；

图2为掺入各种锰（Mn）和锌（Zn）含量的四氧化二铁（Fe₂O₄）锰锌铁氧体纳米粒子的超顺磁性分析图；a～f分别代表X=0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9；

图3为掺入各种锰（Mn）和锌（Zn）含量的四氧化二铁（Fe₂O₄）锰锌铁氧体纳米粒子的X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）分析图；A～F分别代表X=0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的锰锌铁氧体纳米粒子，图3a为原图谱，图3b中每曲线依次增加200；

图4为X=0.3的锰锌铁氧体纳米粒子试样的透射电镜TEM照片；图4a为放大200000倍，图4b为放大400000倍；

图5为X=0.5的锰锌铁氧体纳米粒子试样的TEM照片；图5a为放大200000倍，图5b为放大400000倍；

图6为X=0.3的锰锌铁氧体纳米粒子包覆SiO₂后的TEM照片，a、b分别是用Y=2和4的硅酸四乙酯TEOS包覆SiO₂的锰锌铁氧体纳米粒子TEM照片；

图7为包覆了SiO₂的与未包覆SiO₂的锰锌铁氧体纳米粒子水溶液经超声混匀后常温静置1周后的对比照片；右瓶为包覆了SiO₂的锰锌铁氧体纳米粒子水溶液，呈现为均匀的棕色溶液，左瓶为未包覆SiO₂的锰锌铁氧体纳米粒子，在水中完全沉淀于容器底部；

图8为磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面二氧化硅接枝的环氧基开环共价偶联抗体氨基端示意图；

图9为加入共价偶联抗EGFR抗体的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子培养的部分细胞内有蓝色染色（图9a），而对照细胞均无蓝色染色（图9b）。

具体实施方式

下面结合优选实施例进一步说明。

实施例1

1.磁性锰锌铁氧体的制备：

反应方程式：

(1-x)Mn²⁺+xZn²⁺+2Fe³⁺+8OH^-=Mn_1-xZn_xFe₂O₄+4H₂O

组分设计：设计x=0.1、0.3、0.5、0.7、0.9样品，进行材料制备。MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O、NaOH的用量比例按分组为1-x:x:2:8;氢氧化钠溶液的浓度1mol/L;氯化盐混合溶液总浓度为1mol/L。以分析纯的MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O、NaOH为原料制备不同配比的锰锌铁氧体。首先，按计算结果称取一定量的MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O，并加入烧杯中配制成一定量的混合溶液；其次，称取相应量的NaOH，配制成溶液；然后，将混合溶液加入到三口烧瓶中，放入水浴中加热并以一定速度进行机械搅拌，将NaOH溶液加到三口瓶中，使水浴升温至80℃，保温一小时，然后降温冷却至室温并静置5h，倒去上清液，洗涤、抽滤至pH接近7，再放入干燥箱中干燥10h。最后将试样研磨、过筛，得到锰锌铁氧体（Mn_1-xZn_xFe₂O₄）粉体。

从附图1可以看出，在x=0.3附近居里温度取得最小值，大约为322.06K，即48.91℃。当x=0时，居里温度为417.15K，即144℃；而当x=0.7时，居里温度为362.96K，即89.81℃；其他成分的样品，居里温度处于二者之间。这表明我们已经制备了居里温度在48.91℃～89.81℃之间可调的纳米铁氧体粉末。

从附图2可以看出，从x=0.1到x=0.9，饱和磁感应强度先增大后减小，在x=0.1时取得最大值；在x=0.0～0.5范围内，饱和磁感应强度均较大，而当x值更大时，饱和磁感应强度很小。所得锰锌铁氧体的磁滞回线基本完全重合，这表明所得锰锌铁氧体基本处于超顺磁状态。

2.用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体纳米粒子：

以上述步骤制得的锰锌铁氧体为原料进行表面SiO₂包覆，二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.3mg；硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS）的量为Y mL，Y取2。首先将一定量锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，加到1000mL烧杯中，然后超声震荡30min使其分散均匀。将烧杯放入60℃水浴中，并加入少量氨水（5～10mL，pH8～10），然后将Y mL TEOS加入到烧杯中，持续搅拌4h。冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末。

3.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：

先用无水乙醇和去离子水交替清洗上述步骤制得的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体3次，并干燥,然后置于等离子清洗器中处理2min(电压600V,氧气流量800mL/min),使二氧化硅包覆层表面生成一层活性的羟基(接触角<5°)。等离子处理后的二氧化硅表面应立即进行后续的表面化学修饰,因为这些活性的羟基是不稳定的，在空气中容易再次交联形成硅氧桥键。按每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.3二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体的浓度要求；将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到5%(，体积分数)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GPTMS，97%)的乙醇溶液中，并置于37℃气浴恒温振荡器反应24h，反应完成后用无水乙醇清洗5次,并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末。

4.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面二氧化硅接枝的环氧基开环共价偶联抗体氨基端:

将上述步骤制得的表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液（10μg/mL,0.5～1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.3mg，置于4℃放置12h，就可获得共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子磁流体。抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体，根据不同肿瘤的性质可以联合加入，也可以单独加入。

实施例2

1.磁性锰锌铁氧体的制备：同实施例1；

2.用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体纳米粒子：

以上述步骤制得的锰锌铁氧体为原料进行表面SiO₂包覆，二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.5mg；硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS）的量为Y mL，Y取3。首先将一定量锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，加到1000mL烧杯中，然后超声震荡30min使其分散均匀。将烧杯放入60℃水浴中，并加入少量氨水（5～10mL，pH8～10），然后将Y mL TEOS加入到烧杯中，持续搅拌6h。冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末。

3.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：

先用无水乙醇和去离子水交替清洗上述步骤制得的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体3次，并干燥,然后置于等离子清洗器中处理5min(电压600V,氧气流量800mL/min),使二氧化硅包覆层表面生成一层活性的羟基(接触角<5°)。等离子处理后的二氧化硅表面应立即进行后续的表面化学修饰,因为这些活性的羟基是不稳定的，在空气中容易再次交联形成硅氧桥键。按每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.5mg二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体的浓度要求；将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到10%(，体积分数)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GPTMS，97%)的乙醇溶液中，并置于37℃气浴恒温振荡器反应48h，反应完成后用无水乙醇清洗5次,并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末。

4.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面二氧化硅接枝的环氧基开环共价偶联抗体氨基端:

将上述步骤制得的表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液（5μg/mL,0.5～1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.5mg，置于4℃放置24h，就可获得共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子磁流体。抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体，根据不同肿瘤的性质可以联合加入，也可以单独加入。

实施例3

1.磁性锰锌铁氧体的制备：同实施例1；

2.用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体纳米粒子：

以上述步骤制得的锰锌铁氧体为原料进行表面SiO₂包覆，二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.4mg；硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS）的量为Y mL，Y取4。首先将一定量锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，加到1000mL烧杯中，然后超声震荡30min使其分散均匀。将烧杯放入60℃水浴中，并加入少量氨水（5～10mL，pH8～10），然后将Y mL TEOS加入到烧杯中，持续搅拌5h。冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末。

3.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：

先用无水乙醇和去离子水交替清洗上述步骤制得的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体3次，并干燥,然后置于等离子清洗器中处理4min(电压600V,氧气流量800mL/min),使二氧化硅包覆层表面生成一层活性的羟基(接触角<5°)。等离子处理后的二氧化硅表面应立即进行后续的表面化学修饰,因为这些活性的羟基是不稳定的，在空气中容易再次交联形成硅氧桥键。按每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.4mg二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体的浓度要求；将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到7%(，体积分数)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GPTMS，97%)的乙醇溶液中，并置于37℃气浴恒温振荡器反应30h，反应完成后用无水乙醇清洗5次,并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末。

4.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面二氧化硅接枝的环氧基开环共价偶联抗体氨基端:

将上述步骤制得的表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液（15μg/mL,0.5～1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.3～0.5mg，置于4℃放置20h，就可获得共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子磁流体。抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体，根据不同肿瘤的性质可以联合加入，也可以单独加入。

实施例4

1.磁性锰锌铁氧体的制备：同实施例1；

2.用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体纳米粒子：

以上述步骤制得的锰锌铁氧体为原料进行表面SiO₂包覆，二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.5mg；硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate,TEOS）的量为Y mL，Y取5。首先将一定量锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，加到1000mL烧杯中，然后超声震荡30min使其分散均匀。将烧杯放入60℃水浴中，并加入少量氨水（5～10mL，pH8～10），然后将Y mL TEOS加入到烧杯中，持续搅拌6h。冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末。

3.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：

先用无水乙醇和去离子水交替清洗上述步骤制得的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体3次，并干燥,然后置于等离子清洗器中处理5min(电压600V,氧气流量800mL/min),使二氧化硅包覆层表面生成一层活性的羟基(接触角<5°)。等离子处理后的二氧化硅表面应立即进行后续的表面化学修饰,因为这些活性的羟基是不稳定的，在空气中容易再次交联形成硅氧桥键。按每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.3mg二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体的浓度要求；将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到8%(，体积分数)3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GPTMS，97%)的乙醇溶液中，并置于37℃气浴恒温振荡器反应26h，反应完成后用无水乙醇清洗5次,并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末。

4.磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面二氧化硅接枝的环氧基开环共价偶联抗体氨基端:

将上述步骤制得的表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液（8μg/mL,0.5～1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.5mg，置于4℃放置20h，就可获得共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子磁流体。抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体，根据不同肿瘤的性质可以联合加入，也可以单独加入。

共价偶联抗体的水溶性自动控温锰锌铁氧体纳米粒子主动靶向定位肿瘤细胞实验：

将抗人表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）单克隆抗体共价偶联至二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子表面。用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640细胞培养基在含5%CO₂的细胞培养箱中培养Tca8113人舌癌细胞至贴壁处于对数生长期，按40～60μL/mL浓度将上述共价偶联抗EGFR抗体的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子加入到细胞培养基中，继续培养4～6h后，用4%戊二醛固定细胞，清洗3次，用含2%普鲁斯兰（氰亚铁酸钾）、6%HCl的PBS溶液避光染色30min，清洗3次，用显微镜观察细胞染色情况。普鲁斯兰染色可将铁复合物染为蓝色，结果如附图9，加入上述步骤制得的共价偶联抗EGFR抗体的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子培养的部分细胞内有蓝色染色（图9a），而加入未偶联抗EGFR抗体的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子培养的对照细胞均无蓝色染色（图9b），说明共价偶联抗EGFR抗体的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子可以靶向人舌癌细胞，而且还可以内化进入人舌癌细胞内。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (6)

1.一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子，它是将锰锌铁氧体Mn_1-xZn_xFe₂O₄表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆层表面接枝环氧基，通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端而成，其中0.1≤x≤0.9；

所述锰锌铁氧体居里温度为48℃～90℃；

具体制备步骤为：

(1)锰锌铁氧体的制备：将MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O按照Mn_1-xZn_xFe₂O₄，0.1≤x≤0.9的比例称取配成混合溶液，然后放入水浴中加热并搅拌，将NaOH溶液滴加到搅拌中的混合溶液中，加完后使水浴升温至70～80℃，保温1～2h，然后降温冷却至室温并静置，倒去上清液，洗涤、抽滤，固体放入干燥箱中干燥，将试样研磨、过筛，得到锰锌铁氧体粉体；

(2)用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体：将锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，超声震荡使其分散均匀，置于60～70℃水浴中，并加入少量氨水调pH＝8～10，然后将硅酸四乙酯加入其中，持续搅拌4～6h，冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末；

(3)磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：先用无水乙醇和去离子水交替清洗锰锌铁氧体纳米粒子粉体，并在氮气中干燥，然后置于等离子清洗器中处理使二氧化硅表面生成一层活性的羟基，将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，并置于37±2℃气浴恒温振荡器反应24～48h，反应完成后用无水乙醇清洗，并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末；

(4)环氧基开环共价偶联抗体氨基端：将表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液中，置于4±2℃放置12～24h。

2.一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，其特征是，包括步骤如下：

(1)锰锌铁氧体的制备：将MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O按照Mn_1-xZn_xFe₂O₄，0.1≤x≤0.9的比例称取配成混合溶液，然后放入水浴中加热并搅拌，将NaOH溶液滴加到搅拌中的混合溶液中，加完后使水浴升温至70～80℃，保温1～2h，然后降温冷却至室温并静置，倒去上清液，洗涤、抽滤，固体放入干燥箱中干燥，将试样研磨、过筛，得到锰锌铁氧体粉体；

(2)用二氧化硅包覆磁性锰锌铁氧体：将锰锌铁氧体与适量蒸馏水和无水乙醇制成混合液，超声震荡使其分散均匀，置于60～70℃水浴中，并加入少量氨水调pH＝8～10，然后将硅酸四乙酯加入其中，持续搅拌4～6h，冷却降温，进行抽滤、洗涤、干燥得到表面包覆有SiO₂的锰锌铁氧体粉末；

(3)磁性锰锌铁氧体纳米粒子表面的二氧化硅接枝环氧基：先用无水乙醇和去离子水交替清洗锰锌铁氧体纳米粒子粉体，并在氮气中干燥，然后置于等离子清洗器中处理使二氧化硅表面生成一层活性的羟基，将等离子体处理好的二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子粉体迅速加入到3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，并置于37±2℃气浴恒温振荡器反应24～48h，反应完成后用无水乙醇清洗，并在37℃氮气中干燥，得到表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末；

(4)环氧基开环共价偶联抗体氨基端：将表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末加入到相应的抗各种肿瘤细胞和肿瘤干细胞靶标的抗体稀释溶液中，置于4±2℃放置12～24h。

3.根据权利要求2所述的一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，其特征是：步骤(1)所述的MnCl₂.4H₂O、ZnCl₂、FeCl₃.6H₂O、NaOH的用量比例按摩尔比1-x:x:2:8，0.1≤x≤0.9；氢氧化钠溶液的浓度1mol/L；氯化盐混合溶液中氯化盐总浓度为1mol/L。

4.根据权利要求2所述的一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，其特征是：步骤(2)中无水乙醇和蒸馏水组成醇水体系，醇水体系中的乙醇、水体积比为50∶1；锰锌铁氧体的用量为每毫升醇水体系中含有0.3～0.5mg；硅酸四乙酯为每升醇水体系中加正硅酸乙酯0.026～0.0432mol。

5.根据权利要求2所述的一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，其特征是：步骤(3)中二氧化硅包覆的锰锌铁氧体纳米粒子的用量为每毫升3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液用0.3～0.5mg；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液体积浓度为5～10％。

6.根据权利要求2所述的一种共价偶联抗体的水溶性自动控温铁氧体纳米粒子的制备方法，其特征是，步骤(4)所述的抗体稀释溶液浓度为5～15μg/mL；表面环氧基化的磁性锰锌铁氧体纳米粒子粉末的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.3～0.5mg。