CN105651991A - 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法 - Google Patents

一种快速检测阪崎肠杆菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105651991A
CN105651991A CN201610034173.4A CN201610034173A CN105651991A CN 105651991 A CN105651991 A CN 105651991A CN 201610034173 A CN201610034173 A CN 201610034173A CN 105651991 A CN105651991 A CN 105651991A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bqy
nano microsphere
solution
enterobacter sakazakii
line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610034173.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105651991B (zh
Inventor
赖卫华
王景云
刘道峰
邓省亮
山珊
熊勇华
魏华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN201610034173.4A priority Critical patent/CN105651991B/zh
Publication of CN105651991A publication Critical patent/CN105651991A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105651991B publication Critical patent/CN105651991B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种快速检测阪崎肠杆菌的检测方法。方案将Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球富集细菌，制备试纸条，上样检测。免去了将阪崎肠杆菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将Ru(bqy)3 2+纳米微球喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。检测方案灵敏度非常高、稳定性很好。

Description

一种快速检测阪崎肠杆菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测阪崎肠杆菌。
技术背景
阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性无芽胞杆菌，为重要的食源性细菌。它感染对象多是婴儿，特别是早产儿、低体重儿或免疫力低下新生儿。配方乳粉是主要的婴幼儿的感染源。阪崎肠杆菌可以引起新生儿严重的菌血症、坏死性小肠结肠炎和脑膜炎等疾病。虽然阪崎肠杆菌发病率不高，但死亡率可达50％-80％。虽然阪崎肠杆菌的大多数感染病例都与婴儿有关，但近来的研究发现该菌还可以感染免疫力低下的成年人尤其是老人。2002年，国际食品微生物标淮委员会对阪崎肠杆菌定为“对特定人群可以产生严重的生命危害及产生慢性实质性或长期影响的后遗症”的致病菌，被列为同单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭菌的A型毒素及B型毒素、微小隐孢子虫有同等的危害。
目前检测阪崎肠杆菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及环介导等温扩增法对阪崎肠杆菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。
胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对致病菌的检测限通常不高于105CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为阪崎肠杆菌的检测提供简单、高效的途径。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的阪崎肠杆菌定性、定量检测技术。
本发明具体方案如下：
一种快速检测阪崎肠杆菌的方法，包括以下步骤：
1)纳米微球的制备：
a.添加0.4-0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2-1.6mmolFeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；
b.取12mgFe3O4纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；
c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)3 2+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600-900μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，用去离子水清洗备用；
d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
e.将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球添加到包含0.06gNaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
2)取0.5-2mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至5-10，加入0.05-0.18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及100-300μg抗阪崎肠杆菌单抗，在温度37℃时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗；
所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL19.07g/mL的硼砂与7mL12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；
所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；
所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；
3)培养阪崎肠杆菌，将菌液调整浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100-150μgFe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗，于温度37℃，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌；
4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH8.50.1MTris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将阪崎肠杆菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1-2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；
5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌稀释到50-150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；
6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有阪崎肠杆菌，T线不显色则说明样品中没有阪崎肠杆菌或是含有阪崎肠杆菌的量低于103CFU/mL；
7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的阪崎肠杆菌数量。
所述步骤1)Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球粒径为80-210nm；
步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴滤纸、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。使用阪崎肠杆菌Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球免疫层析试纸条，同时使用荧光读取仪定量检测的方法，其特征在于：配制已知系列浓度的阪崎肠杆菌溶液，用荧光读取仪测出其对应的荧光强度，根据这一系列数值与对应浓度建立标准曲线，然后将检测样品的试纸条放入荧光读取仪中，根据荧光读取仪输出的数值，查标准曲线图即可得出样本中阪崎肠杆菌的含量。
本发明有以下优点：
1)本发明具有操作简单、检测时间短(10-15min)等优点，适于进行现场检测；
2)本发明技术方案检测稳定性好，检测灵敏度高，检测限能达到103CFU/mL。采用的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，不仅具有磁性纳米粒子的超顺磁性能，对样品进行浓缩富集，而且具有Ru(bqy)3 2+纳米微球强的光学信号、Ru(bqy)3 2+纳米微球表面高效偶联抗体的性能，从而提高了试纸条的检测灵敏度。
3)本发明无需将阪崎肠杆菌从免疫磁珠上洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将免疫标记物喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。
4)能同时对目标物阪崎肠杆菌进行定性及定量检测。
5)本发明的标记物为羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，该标记物主要通过化学偶联的方式标记抗体，相比传统胶体金(物理吸附作用)，能够捕获更多抗体，从而提高检测灵敏度，另外，该标记物羧基修饰的稳定结构能提高材料的稳定性，提高保存期为1年，传统胶体金保存期为6个月。
6)本发明的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球由于核内Fe3O4纳米粒子的作用，能更好的防止壳内荧光染料Ru(bqy)3 2+的泄漏，从而提高荧光强度。
附图说明
图1本发明Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球免疫层析试纸条对阪崎肠杆菌的检测
具体实施方式
本发明技术方案制备的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球与阪崎肠杆菌单抗偶联，制备免疫Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，并应用于免疫层析试纸条对阪崎肠杆菌进行检测。该试纸条基于双抗夹心的模式，在硝酸纤维膜上分别喷涂阪崎肠杆菌兔多抗和驴抗鼠二抗作为检测线和质控线，如果样品中含有一定浓度的阪崎肠杆菌时，阪崎肠杆菌就会首先与免疫Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球结合形成Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-抗体-抗原复合物，该复合物流经检测线被阪崎肠杆菌兔多抗捕获在检测线区域聚集，聚集到一定浓度形成肉眼可见的条带或者试纸条读取仪可以检测的信号，多余的免疫Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球移动到质控线被驴抗鼠二抗捕获聚集形成肉眼可见的条带，判断其为阳性，如果样品中不含待检物，免疫Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球只与控制线上的驴抗鼠二抗反应形成肉眼可见的条带，检测线不显色，判断其为阴性。如果质控线处没有颜色或者没有明显信号，说明试纸条有质量问题，测试无效。
以下结合本发明的技术方案提供实施例。以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
荧光读取仪购于上海互帼科技仪器有限公司。
偶联缓冲液配制方法如下：将3mL浓度为19.07g/mL的硼砂与7mL浓度为12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；
清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；
封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；
实施例一：使用Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球免疫层析试纸条对牛奶中阪崎肠杆菌的检测
1.制备偶联单抗的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球
1.1Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球的制备：添加0.6mmolFeCl3·6H2O和0.3mmolFeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到90℃，然后将4.7mL25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h。用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；取12mgFe3O4纳米粒子用3mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.5mL的NH4OH溶液，再将50uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；把100uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，3mL去离子水和1mL0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)3 2+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入750μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，用去离子水清洗备用；将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球添加到包含0.06gNaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
1.2.偶联反应：取1.0mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至8，加入0.05-0.18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及200μg抗阪崎肠杆菌单抗，在温度37℃时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取1mL封闭剂与磁珠混合封闭0.5-1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗。
2.使用免疫Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球捕获牛奶中的阪崎肠杆菌
取25mL的灭菌后牛奶加入到225mL培养基中，接种一定浓度的阪崎肠杆菌，在36℃的条件下，震荡培养8-18h。将菌液浓度调整为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL。
取1mL各浓度菌液、1mL待测样品溶液，分别加入120μgFe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗，温度37℃，转速10-15rpm混合孵育30-60min；孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌。
3.制作阪崎肠杆菌免疫层析试纸条
将样本垫用pH8.50.1MTris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出置于干燥缸中备用；将阪崎肠杆菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡。将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。
4.利用双抗夹心法对样品进行目测和使用仪器测定结果
将捕获收集到的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌稀释到100μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有阪崎肠杆菌，T线不显色则说明样品中没有阪崎肠杆菌或是含有阪崎肠杆菌的量低于103CFU/mL。
参考所做的标准曲线图，确定样品中阪崎肠杆菌的数量。定量检验菌浓度的范围在103-106CFU/mL。本发明方法检测稳定，检测线可以低至103CFU/mL，速度快，效果好。
实施例二：使用Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球免疫层析试纸条对牛肉中阪崎肠杆菌的检测
1.制备偶联单抗的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球
1.1Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球的制备：添加0.6mmolFeCl3·6H2O和0.3mmolFeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到90℃，然后将4.7mL25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h。用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；取12mgFe3O4纳米粒子用3mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.5mL的NH4OH溶液，再将50uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；把100uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，3mL去离子水和1mL0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)3 2+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入750μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，用去离子水清洗备用；将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球添加到包含0.06gNaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
1.2.偶联反应：取1.0mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至8，加入0.05-0.18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及200μg抗阪崎肠杆菌单抗，在温度37℃时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取1mL封闭剂与磁珠混合封闭0.5-1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗。
2.使用偶联单抗的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球捕获牛肉中的阪崎肠杆菌
取25mg的灭菌的牛肉肉糜加入到225mL培养基中，接种一定浓度的阪崎肠杆菌，在36℃的条件下，震荡培养8-18h。将菌液浓度调整为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL。
取1mL各浓度菌液、1mL待测样品溶液，分别加入120μgFe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗，温度37℃，转速10-15rpm混合孵育30-60min；孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌。
3.制作阪崎肠杆菌免疫层析试纸条
将样本垫用pH8.50.1MTris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出置于干燥缸中备用；将阪崎肠杆菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡。将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。
4.利用双抗夹心法对样品进行目测和使用仪器测定结果
将捕获收集到的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌稀释到100μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有阪崎肠杆菌，T线不显色则说明样品中没有阪崎肠杆菌或是含有阪崎肠杆菌的量低于103CFU/mL。
参考所做的标准曲线图，确定样品中阪崎肠杆菌的数量。定量检验菌浓度的范围在103-106CFU/mL。本发明方法检测稳定，检测限可以低至103CFU/mL，速度快，效果好。

Claims (3)

1.一种快速检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)纳米微球的制备：
a.添加0.4-0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2-1.6mmolFeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；
b.取12mgFe3O4纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；
c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)3 2+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600-900μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，用去离子水清洗备用；
d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
e.将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球添加到包含0.06gNaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球；
2)取0.5-2mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至5-10，加入0.05-0.18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及100-300μg抗阪崎肠杆菌单抗，在温度37℃时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗；
所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL19.07g/mL的硼砂与7mL12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；
所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；
所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；
3)培养阪崎肠杆菌，将菌液调整浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100-150μgFe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗，于温度37℃，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌；
4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH8.50.1MTris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将阪崎肠杆菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1-2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；
5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球-单抗-菌稀释到50-150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；
6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有阪崎肠杆菌，T线不显色则说明样品中没有阪崎肠杆菌或是含有阪崎肠杆菌的量低于103CFU/mL；
7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的阪崎肠杆菌数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球粒径为80-210nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴滤纸、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。
CN201610034173.4A 2016-01-19 2016-01-19 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法 Active CN105651991B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034173.4A CN105651991B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034173.4A CN105651991B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105651991A true CN105651991A (zh) 2016-06-08
CN105651991B CN105651991B (zh) 2018-01-16

Family

ID=56486674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610034173.4A Active CN105651991B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105651991B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950471A (zh) * 2016-05-31 2016-09-21 东北农业大学 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
CN106248933A (zh) * 2016-08-19 2016-12-21 浙江工商大学 基于pgm和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法
CN106978412A (zh) * 2017-02-20 2017-07-25 南昌大学 万古霉素结合牛血清白蛋白包被的磁珠分离金黄色葡萄球菌的新方法
CN110988349A (zh) * 2019-11-12 2020-04-10 西北农林科技大学 一种捕获探针、大肠杆菌o157:h7的双通道检测方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102135541A (zh) * 2010-09-03 2011-07-27 李克生 阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
CN103439496A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 大肠杆菌o157：h7富集和快速检测方法
CN103484536A (zh) * 2013-07-10 2014-01-01 东北农业大学 一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用
CN104698167A (zh) * 2015-03-20 2015-06-10 黑龙江大学 一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102135541A (zh) * 2010-09-03 2011-07-27 李克生 阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
CN103484536A (zh) * 2013-07-10 2014-01-01 东北农业大学 一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用
CN103439496A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 大肠杆菌o157：h7富集和快速检测方法
CN104698167A (zh) * 2015-03-20 2015-06-10 黑龙江大学 一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOLIN HUANG，ET AL: "Fluorescent Ru(phen)32+-Doped Silica Nanoparticles-Based ICTS Sensor for Quantitative Detection of Enrofloxacin Residues in Chicken Meat", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
张大巍: "Ru(phen)32+掺杂二氧化硅纳米粒子的可控制备及性质研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950471A (zh) * 2016-05-31 2016-09-21 东北农业大学 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
CN105950471B (zh) * 2016-05-31 2020-07-14 东北农业大学 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
CN106248933A (zh) * 2016-08-19 2016-12-21 浙江工商大学 基于pgm和磁性纳米微球快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法
CN106978412A (zh) * 2017-02-20 2017-07-25 南昌大学 万古霉素结合牛血清白蛋白包被的磁珠分离金黄色葡萄球菌的新方法
CN110988349A (zh) * 2019-11-12 2020-04-10 西北农林科技大学 一种捕获探针、大肠杆菌o157:h7的双通道检测方法及其应用
CN110988349B (zh) * 2019-11-12 2023-02-28 西北农林科技大学 一种捕获探针、大肠杆菌o157:h7的双通道检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105651991B (zh) 2018-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103439497B (zh) 沙门氏菌富集和快速检测方法
CN105651991A (zh) 一种快速检测阪崎肠杆菌的方法
CN103439496B (zh) 大肠杆菌o157:h7富集和快速检测方法
CN103439495B (zh) 单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法
CN105527427A (zh) 一种快速检测单增李斯特菌的方法
CN111024938B (zh) 一种病原微生物快速检测方法
CN102645536A (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的方法
CN109507419B (zh) 一种检测四环素药物的磁性上转换荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
Zhang et al. Rapid and sensitive pathogen detection platform based on a lanthanide-labeled immunochromatographic strip test combined with immunomagnetic separation
CN104297474A (zh) 一种检测细菌的检测组合
CN105548551A (zh) 一种快速检测副溶血性弧菌的方法
CN105527428A (zh) 一种快速检测大肠杆菌o157：h7的方法
CN102636646A (zh) 快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法
CN106932575B (zh) 纳米免疫磁珠技术联合酶联免疫吸附快速检测鼠伤寒沙门氏菌的方法
CN105651993A (zh) 一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法
CN105548552B (zh) 一种快速检测沙门氏菌的方法
AU2021101696A4 (en) Novel Immunochromatographic Test Strips for Detecting Human Brucellosis Antibody and Preparation Method Thereof
CN104297476A (zh) 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒
CN106771217A (zh) 一种单增李斯特氏菌的快速检测方法
CN102353787B (zh) 一种半定量检测人血清中gfap浓度的胶体金试纸条的制备方法
CN105548542A (zh) 一种快速检测志贺氏菌的方法
CN114705847A (zh) 一种检测黄曲霉毒素m1的比率荧光试纸条、其检测方法和应用
CN103149354A (zh) 一种基于γ-Fe2O3纳米材料免疫磁分离食源性致病菌快速检测方法
CN113970637A (zh) 一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条及其制备方法
CN113687071A (zh) 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant