CN103484536A - 一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用，属于食品安全技术领域。由LAMP（环介导等温扩增）扩增反应体系，Bst DNA聚合酶，探针和胶体金试纸条组成。本发明解决了现有的LAMP检测方法的结果判读不能实现现场检测的问题，试纸条的结果判读方法简单不需要仪器，肉眼判读即可。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用，属于食品安全技术领域。
背景技术
阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是一种革兰氏阴性、无芽孢的兼性厌氧细菌。它能导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，能引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎。因此，阪崎肠杆菌是许多国家食品中微生物的必检指标之一。然而，传统的检测方法操作复杂、耗时长以及需要复杂昂贵的仪器。环介导等温扩增技术由Notomi等于2000年建立，该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下（60-65℃）高效（0.5-1.0h）扩增目标DNA，具有很高的特异性和灵敏度。然而，传统的电泳检测方法费时费力、染料和浊度检测方法易受肉眼观察误差，均不适宜现场检测。本方法所采用的试纸条技术快速灵敏且结果判读容易，适用于现场检测。
发明内容
本发明提供了一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒。
所述试剂盒组成如下：所述试剂盒由LAMP扩增反应体系，Bst DNA聚合酶，探针和胶体金试纸条组成；所述探针带有抗原物质用于标记LAMP扩增产物；所述试纸条上设有检测线和控制线，检测线上埋有抗体，与抗原物质标记的LAMP扩增产物结合显色；所述LAMP扩增反应体系由LAMP引物组和扩增反应液组成；所述扩增反应液含有0.4～2.4mmol/L dNTP、甜菜碱和2mmol/L～6mmol/L MgCl2，Bst DNA聚合酶相对于50μL的PCR反应体系添加范围为4U～8U。
本发明中采用生物素及其抗体作为显色反应的成分，根据本发明原理，采用其他抗原或抗体均可达到本发明的技术效果。
所述LAMP引物组从以下四组中任选其一：1）SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6；2）SEQ IDNO.7-SEQ ID NO.12；3）SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18；4）SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.24。
LAMP引物组中外引物、内引物、环引物比例关系可以经过有限次实验确定，实验发现外引物与内引物比例为1:4～1:9，外引物与环引物比例为1:1～1:5时扩增效果较好。
所述探针上携带抗原，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25－SEQ ID NO.28所示，根据LAMP引物组核苷酸序列，根据扩增得到的LAMP产物，可以设计出多种探针。
PCR扩增反应液含有dNTP、甜菜碱和MgCl2，其作用为辅助LAMP引物组PCR扩增阪崎肠杆菌DNA特异性序列,所述dNTP浓度优选0.4～2.4mmol/L，MgCl2优选2mmol/L～6mmol/L。
所述Bst DNA聚合酶相对于50μLPCR反应体系添加范围为4U～8U。
本发明还提供了一种应用上述试剂盒快速检测乳中阪崎肠杆菌的方法。
为解决上述技术问题，提供技术方案如下:提取受检乳的DNA，以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物，用试纸条鉴定扩增产物。
所述试剂盒应用的具体步骤为：
第一步：受检乳样的DNA提取；向受检乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等体积的氯仿离心后取上清；在取得的上清中加入预冷的异丙醇颠倒混匀；将其转移到吸附柱AC中离心后加入漂洗液漂洗；加入洗脱缓冲液孵育后离心；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中离心后得到的液体即为乳中DNA。
第二步：以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物，LAMP扩增条件为：90℃～99℃PCR反应5～10min，迅速置于0～4℃加入Bst酶，60～65℃酶促反应40～90min，升温至80～100℃使酶钝化2～10min。
第三步：扩增产物的试纸条鉴定；将探针与扩增产物杂交，在60～65℃杂交2-10分钟然后将杂交产物与缓冲液孵育，最后将试纸条放入，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。
本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高。本发明制备的胶体金试纸条技术能够简化电泳方法的复杂仪器且大大缩短了反应时间。相较于浊度法和染料法，则没有肉眼观测的误差。更适宜现场检测。本发明为乳中阪崎肠杆菌的现场检测开辟了新思路。用此方法在阪崎肠杆菌样品不合格产品中同样检出阪崎肠杆菌。
附图说明
图1为具体实施方式实例4步骤2检测结果电泳图；
（1，对照；2，实施例1；3，实施例2；4，实施例3；5，实施例4）。
图2为具体实施方式实例4步骤2试纸条检测结果；（1，对照；2，实施例1；3，实施例2；4，实施例3；5，实施例4）。
图3为具体实施方式实例2灵敏度测试实验中LAMP扩增的电泳图；（1，marker；2，去离子水；3，阪崎肠杆菌浓度109cfu/mL；4，阪崎肠杆菌浓度108cfu/mL；5，阪崎肠杆菌浓度107cfu/mL；6，阪崎肠杆菌浓度106cfu/mL；7，阪崎肠杆菌浓度105cfu/mL；8，阪崎肠杆菌浓度104cfu/mL；9，阪崎肠杆菌浓度103cfu/mL；10，阪崎肠杆菌浓度102cfu/mL；11，阪崎肠杆菌浓度101cfu/mL；12，阪崎肠杆菌浓度100cfu/mL；13，阪崎肠杆菌浓度10-1cfu/mL；）。
图4为具体实施方式实例4灵敏度测试实验中LAMP扩增的试纸条检测结果；（1，去离子水；2，阪崎肠杆菌浓度109cfu/mL；3，阪崎肠杆菌浓度108cfu/mL；4，阪崎肠杆菌浓度107cfu/mL；5，阪崎肠杆菌浓度106cfu/mL；6，阪崎肠杆菌浓度105cfu/mL；7，阪崎肠杆菌浓度104cfu/mL；8，阪崎肠杆菌浓度103cfu/mL；9，阪崎肠杆菌浓度102cfu/mL；10，阪崎肠杆菌浓度101cfu/mL；11，阪崎肠杆菌浓度100cfu/mL；12，阪崎肠杆菌浓度10-1cfu/mL；）。
具体实施方式
实施例1
1.受检乳样的DNA提取：向1mL受检乳中加入1mLDNA提取液（0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl，0.1mol/L乙二胺四乙酸EDTA，0.1mol/L磷酸钠Na3PO4，1.5mol/L氯化钠NaCl，1%CTAB十六烷基三甲基溴化铵，pH8.0）、10μL蛋白酶K、10μL溶菌酶、10μL溶壁酶于37℃中以200r/min的转速孵育1.5小时；再向其中加入200μL的20%SDS后于65℃孵育1小时；加入等体积的氯仿13000r/min离心1分钟后取上清；在取得的上清中加入0.6倍体积预冷的异丙醇颠倒混匀；将其转移到吸附柱AC中10000r/min离心30秒后加入700μL漂洗液；10000r/min离心2分钟后倒掉液体，再加入500μL漂洗液再离心尽量除去漂洗液；加入50μL洗脱缓冲液（65℃-70℃水浴）放置2分钟，室温12000r/min离心2分钟；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中12000r/min离心。
2.以提取物作为模板进行LAMP扩增，反应体系为50μL反应体系：
LAMP扩增条件为：99℃PCR反应5min，迅速置于4℃加入Bst酶，60℃反应90min，100℃使酶钝化2min。
3.扩增产物的试纸条检测：取2μL探针5’-CTACGCACGAAGACTCAAACTCT-3’与产物在64℃杂交5分钟，然后取10μL的杂交产物与110μL缓冲液孵育5分钟，最后将试纸条放入孵育15分钟，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。结果如图1、2所示，空白未被扩增检测线无条带。本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高，检出限为3.7×101cfu/mL。本发明使用的胶体金试纸条技术能够简化电泳方法的复杂仪器且大大缩短了反应时间。
实施例2
1.受检乳样的DNA提取方法同实施例1
2.以提取物作为模板进行LAMP扩增，反应体系为50μL反应体系：
LAMP扩增条件为：95℃反应5min，迅速置于2℃加入Bst酶，在63℃反应60min，80℃钝化5min。
3.扩增产物的试纸条检测：取2μL探针5’-CGAAGACTCTCGCACTCGCAGCA-3’与产物在64℃杂交5分钟，然后取10μL的杂交产物与110μL缓冲液孵育5分钟，最后将试纸条放入孵育15分钟，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。结果如图1、2所示，空白未被扩增检测线无条带。
本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高，检出限为4.3×101cfu/mL。
实例3乳中阪崎肠杆菌的检测
1.受检乳样的DNA提取方法同实施例1
2.以提取物作为模板进行LAMP扩增，反应体系为50μL反应体系：
LAMP扩增条件为：90℃反应10min，迅速置于4℃加入Bst酶，65℃反应40min，90℃钝化5min。
3.扩增产物的试纸条检测：取2μL探针5’-CTAGGTCACACGAAGACTGCAGC-3’与产物在64℃杂交5分钟，然后取10μL的杂交产物与110μL缓冲液孵育5分钟，最后将试纸条放入孵育15分钟，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。结果如图1、2所示，空白未被扩增检测线无条带。
本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高，检出限为4.3×101cfu/mL。
实例4乳中阪崎肠杆菌的检测
1.受检乳样的DNA提取方法同实施例1
2.以提取物作为模板进行LAMP扩增，反应体系为50μL反应体系：
LAMP扩增条件为：95℃反应5min，迅速置于4℃加入Bst酶，63℃反应60min，80℃钝化2min。
3.扩增产物的试纸条检测：取2μL探针5’-CTCAAACTCGCAGCACGAAGACT-3’与产物在64℃杂交5分钟，然后取10μL的杂交产物与110μL缓冲液孵育5分钟，最后将试纸条放入孵育15分钟，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。结果如图1、2所示，空白未被扩增检测线无条带。
本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高，检出限为4.3×101cfu/mL。
实施例5关于灵敏度的测试
对本发明实施例2的方法进行灵敏度的测试，具体如下：人工接种阪崎肠杆菌于灭菌乳中，于37℃、200r/min振荡培养8h。调整乳中菌体浓度为109，然后进行10倍梯度稀释，使浓度为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1cfu/mL，分别进行LAMP反应。
LAMP扩增结果的电泳图如图3图4所示，图3从左到右依次为marker、去离子水、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1；图4中从左到右依次为marker、去离子水、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1。
由图3和图4可以看出，LAMP结合试纸条技术可以检测到101cfu/mL的菌体。
本实施方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约2小时即可完成，检测灵敏度高。本发明使用的胶体金试纸条技术能够简化电泳方法的复杂仪器且大大缩短了反应时间。相较于浊度法和染料法，则没有肉眼观测的误差。更适宜现场检测。本发明为乳中阪崎肠杆菌的现场检测开辟了新思路。用此方法在阪崎肠杆菌样品不合格产品中同样检出阪崎肠杆菌。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒及其应用
<160>28
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>1
ctggatcagc tgtactctca 20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gattcgccca taccacgt 18
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>引物
<400>3
aagcgtcaga accgatacgg tcctgagcaa cctggatccg a 41
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>引物
<400>4
caaccagggt ctgtccgaga aaggagatct tgttggacgg ga 42
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>5
aagcccagaa ccacgacgga 20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>6
cgtgctcagt ctgttgttga c 21
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>7
aattgcgcgg tgtgtca 17
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>8
attcggacat ggtttcccc 19
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>9
accgttctct caaactcgca gcacgtacgc ttgttcgctt 40
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>引物
<400>10
ggcagtgcgc cggttataac cagaggcgat ggttca 36
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>11
accgaacctc acaacaga 18
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>12
agatacgccg gtaaggtg 18
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>13
ccatgctcgg gtagtcac 18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>14
gcattctgca ttggacgc 18
<210>15
<211>39
<212>DNA
<213>引物
<400>15
tgggtgtacg cttgttcgtt tttctcagac tcgcaggtc 39
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>引物
<400>16
tgcagtcaga ggcgatgccg gttataacgg tattac 36
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>17
gccgaagaaa cctcactg 18
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>18
gtaagccgcg aggttagc 18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>19
tgcaaagcgg tgtcagtg 18
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>20
tccccttatg gtcggttca 19
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>21
accgtgtacg cttgttcgct ttctctcaaa ctcgcagcac 40
<210>22
<211>35
<212>DNA
<213>引物
<400>22
tcagcggcag ggaggcgaac cagttcactt ataac 35
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>23
acagacaacg cctcgaa 17
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>24
agcgcgtcat gctgaat 17
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>用于检测产物
<400>25
ctacgcacga agactcaaac tct 23
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>用于检测产物
<400>26
cgaagactct cgcactcgca gca 23
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>用于检测产物
<400>27
ctaggtcaca cgaagactgc agc 23
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>用于检测产物
<400>28
ctcaaactcg cagcacgaag act 23
Claims (9)
1.一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由LAMP扩增反应体系，Bst DNA聚合酶，探针和胶体金试纸条组成；所述探针带有抗原物质用于标记LAMP扩增产物；所述试纸条上设有检测线和控制线，检测线上埋有抗体，与抗原物质标记的LAMP扩增产物结合显色；所述LAMP扩增反应体系由LAMP引物组和扩增反应液组成；所述扩增反应液含有0.4～2.4mmol/L dNTP、甜菜碱和2mmol/L～6mmol/L MgCl2，Bst DNA聚合酶相对于50μL的PCR反应体系添加范围为4U～8U。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，LAMP引物组从以下四组中任选其一：1）SEQID NO.1-SEQ ID NO.6；2）SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12；3）SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18；4）SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.24。
3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6，所述探针核苷酸序列为SEQ ID NO.25。
4.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组为SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.12，所述探针核苷酸序列为SEQ ID NO.26。
5.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组为SEQ ID NO.13-SEQ IDNO.18，所述探针核苷酸序列为SEQ ID NO.27。
6.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组为SEQ ID NO.19-SEQ IDNO.24，所述探针核苷酸序列为SEQ ID NO.28。
7.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，PCR扩增反应体系组成如下：
反应体系为50μL反应体系。
8.权利要求1所述试剂盒在乳中阪崎肠杆菌检测中的应用。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）受检乳样的DNA提取；向受检乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等体积的氯仿离心后取上清；在取得的上清中加入预冷的异丙醇颠倒混匀；将其转移到吸附柱AC中离心后加入漂洗液漂洗；加入洗脱缓冲液孵育后离心；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中离心后得到的液体即为乳中DNA；
2）以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物，LAMP扩增条件为：90℃～99℃PCR（聚合酶链式反应）反应5～10min，迅速置于0～4℃加入Bst酶，60～65℃酶促反应40～90min，升温至80～100℃使酶钝化2～10min；
3）扩增产物的试纸条鉴定；将探针与扩增产物杂交，在60～65℃杂交2-10分钟然后将杂交产物与缓冲液孵育，最后将试纸条放入，观察试纸条检测线是否有条带进行结果判读。
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