CN106591491A - 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用 - Google Patents

一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为环介导等温扩增反应体系中包括Taq SSB蛋白。本繁忙方法一方面能够降低和阻止引物二聚体的生成，解决了由于LAMP多条引物产生引物二聚体的问题，另一方面提高了LAMP反应的扩增效率，同时省略了甜菜碱的添加。

Description

一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
引物二聚体是一种由引物之间发生非特异性扩增反应而产生的非目标DNA片段，由于碱基只有4个，4个碱基之间由于两两互补，因此在扩增反应中不可避免的会产生非特异性扩增反应。产生引物二聚体，一方面这样消耗了反应基质中的反应底物，会降低反应的扩增效率，另一方面产生的引物二聚体会对一些最后结果判断产生误判的现象，加大了研究者的研究困难。有研究通过采用纳米金区分反应底物的方式来提高反应的扩增效率，降低引物二聚体的生成，但是采用纳米金的方式加大了实验难度和实验操作；还有研究通过采用设计核酸序列的方式来进行消除引物二聚体的方法，但是这样同样加大了实验的设计的难度，造成实验的繁琐。环介导等温扩增反应过程中涉及到六条引物，因此生成引物二聚体的概率显著增高，这也成为限制LAMP反应速率的的一个重要因素，引物之间由于发生的非特异性结合，会消耗反应体系中的反应底物，从而降低了反应的效率，使得反应速率降低，最终导致检测灵敏度降低，目前还未发现有效解决LAMP反应过程中产生二聚体的问题。
热稳定单链结合蛋白(TaqSSB蛋白)是从耐热的微生物中分离得到的单链DNA结合蛋白质。因为具有极高的热稳定性，热稳定性单链DNA结合蛋白Taq SSB可用于需要高温反应条件的实验中。
传统的LAMP扩增体系通常包括LAMP引物，水，dNTP，镁离子，甜菜碱，Bst酶，缓冲液等基础反应底物。LAMP特异性的引物是在针对特定性待检物进行设计的，Bst酶是LAMP反应体系中的核心，dNTP用来提供4中碱基，镁离子是用来通过影响BstDNA酶的活性来影响扩增反应，甜菜碱添加能够有效减少碱基的堆叠，从而促进LAMP的反应，以上成分缺一不可。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种提高环介导等温扩增反应效率的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种提高环介导等温扩增反应效率的方法，所述环介导等温扩增反应体系还包括Taq SSB蛋白。
优选地，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。
更优选地，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为3ng/μL-5ng/μL。
最优选地，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为4ng/μL。
本发明还提供了一种上述方法在检测细菌和病毒中的应用。
优选地，上述方法在检测致病菌中的应用。
尤其是在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
所述应用是：所述环介导等温扩增反应体系包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，Bst 2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragmen，10×BstThermoPol buffer，dNTPs，Mg2+，TaqSSB蛋白，DNA模板，蒸馏水。
所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，每25μL所述环介导等温扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，0.5μL-1.2μL 8U Bst酶，1μL-3μL10×Bst buffer，0.8mM-2.8mM dNTPs，1mM-6mM MgSO4，2ng/μL-6ng/μL TaqSSB蛋白，1μL-2μL DNA模板，蒸馏水；所述外引物和内引物的浓度之比为1:2-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:8。
本发明中TaqSSB蛋白能够非特异性的结合到单链的引物上，这样就使得反应物质充分结合进行反应，防止引物的错配而产生引物二聚体现象，同样合适浓度的TaqSSB蛋白在反应体系中是必要的，浓度过低不足以使引物和蛋白结合，过高浓度的TaqSSB蛋白会阻止引物以及其他反应底物的结合反应。
本发明有益效果：
1)本发明提供了一种提高环介导等温扩增反应效率的方法，通过添加TaqSSB蛋白，一方面能够降低和阻止引物二聚体的生成，解决了由于LAMP多条引物产生引物二聚体的现象，另一方面阻止了非特异性扩增，提高特异性扩增，从而提高了LAMP反应的扩增效率；
2)本发明还明确了TaqSSB蛋白的最佳使用浓度范围，避免了添加过低不足以起到作用，添加过高会与引物过多结合，阻止引物与其他反应物质进行充分接触反应，本发明提供的TaqSSB蛋白的使用范围避免了其过高或过低带来的不良影响；
3)发明体系通过添加Taq SSB蛋白还可以省去甜菜碱的添加，同样达到防止碱基堆叠的效果，同时省去甜菜碱添加Taq SSB蛋白不会对检测效果产生影响，本发明节省了原料，降低了成本；
4)本发明大大提高了LAMP反应的灵敏度，本发明所提供的方法针对纯培养物的检测灵敏度低达100cfu/mL，现有LAMP方法检测奶粉中克罗诺杆菌灵敏度为102-103cfu/mL，而本发明针对奶粉中克罗诺杆菌的检测限可低达101CFU/mL，检测灵敏度提高了十倍。并且本发明大大缩短了检测时间，传统LAMP扩增反应需要40-60min，而本发明中LAMP扩增反应时间只需25min，大大缩短了LAMP扩增反应时间，最终整个检测过程可控制在40min以内。
附图说明
图1为阳性LAMP的扩增效率结果图；
(M，marker；1，不加TaqSSB蛋白；2，1ng/μL；3，2ng/μL；4，3ng/μL；5，4ng/μL；6，5ng/μL；7，6ng/μL；8，7ng/μL)。
图2为阴性LAMP的扩增效率结果图；
(M，marker；1，阳性组；2，不加TaqSSB蛋白；3，1ng/μL；4，2ng/μL；5，3ng/μL；6，4ng/μL；7，5ng/μL；8，6ng/μL；9，7ng/μL)。
图3为外引物与内引物浓度比的优化结果图；
(M，marker；1，1:2；2，1:3；3，1:4；4，1:5；5,1:6；6，1:7；7，1:8；9，为阴性)。
图4为外引物与环引物的浓度比优化结果图；
(M，marker；1，1:1；2，1:2；,3，1:3；4，1:4；5，1:5；6,1:6；7，为阴性)。
图5为镁离子浓度的优化结果图；
(M，marker；1，0mM；2，1mM；3，2mM；4，3mM；5，4mM；6，5mM；7，6mM；8，阴性)。
图6为Bst酶添加量的优化甜菜碱结果图；
(M，marker；1，0μL；2，0.5μL；3，0.6μL；4，0.7μL；5，0.8μL；6，0.9μL；7，1.0μL；8，1.1μL；9，1.2μL；10，阴性)。
图7为dNTP浓度的优化结果图；
(M，marker；1，0mM；2，1.2mM；3，1.6mM；4，2mM；5，2.4mM；6，2.8mM；7，3.2mM；8，3.6mM；9，阴性)。
图8为最优LAMP体系扩增结果图；
(1，未加TaqSSB蛋白之前的阳性结果；2，未加TaqSSB蛋白之前的阴性结果；3，加入TaqSSB蛋白之前的阳性结果；4，加入TaqSSB蛋白之前的阴性结果)
图9为纯培养物中灵敏度的检测结果；
(M，marker；1，5×106CFU/mL；2，5×105CFU/mL；3，5×104CFU/mL；4，5×103CFU/mL；5，5×102CFU/mL；6，5×101CFU/mL；7，5×100CFU/mL；8，5×10-1CFU/mL；9，阴性对照)。
图10为不同菌进行LAMP扩增结果；
(M，marker；1，未加TaqSSB蛋白的沙门氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；2，加入TaqSSB蛋白的沙门氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；3，未加TaqSSB蛋白的单增李斯特氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；4，加入TaqSSB蛋白的单增李斯特氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；5，未加TaqSSB蛋白的金黄色葡萄球菌LAMP扩增体系的阳性条带；6，加入TaqSSB蛋白的金黄色葡萄球菌LAMP扩增体系的阳性条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：引物设计及菌种的培养和DNA的提取：
1、引物的设计
本实施例以克罗诺杆菌为检测对象，分别设计了进行LAMP反应的内引物、外引物和环引物，具体核苷酸序列如下：
内引物FIP(SEQID NO.1)：CCGTGTACGCTTGTTCGCTTTCTCTCAAACTCGCAGCAC；
内引物BIP(SEQID NO.2)：GGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA；
外引物F3(SEQID NO.3)：AAATGCGCGGTGTGTCAG；
外引物B3(SEQID NO.4)：GGTTTCCCCATTCGGACAT；
环引物LF(SEQID NO.5)：AACCTCACAACCCGAAGA；
环引物LB(SEQID NO.6)：AGCGCCGGTAAGGT GATA。
2、菌种的培养：
选取阪崎克鲁诺杆菌ATCC29544(中国食品药品检定研究院)作为实验菌株进行相关实验，菌株从保藏在-80℃冰箱中取出，按3％的接种量接种到TSB液体培养基中，活化培养12h，之后进行TSA固体培养基上进行三区划线,培养16h,挑取单菌落于TSB液体培养基中，12h后进行DNA提取。
3、DNA的提取：
采用水浴法提取培养后的菌液的DNA，10000r/min离心3min后，加入TE缓冲液50uL,水浴100℃，10min后进行冰浴5min,然后离心10000r/min，1min取上清，上清即为DNA模板。
实施例2：Taq SSB蛋白的添加效果及添加量的确定
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8UBst 2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPolbuffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
分别添加Taq SSB蛋白，使Taq SSB蛋白在体系中达到不同的浓度，按照上述方法进行LAMP反应，同时进行琼脂糖凝胶电泳的方式，通过观察引物二聚体生成的亮度以及LAMP产物的亮度来确定该蛋白的效果，以此评估引物二聚体的生成量。具体实验分组如下：
空白组：不添加Taq SSB蛋白，即Taq SSB蛋白添加量为0；实验组：分别向LAMP扩增反应体系添加Taq SSB蛋白，使Taq SSB蛋白在反应体系中的浓度分别为1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL。
通过琼脂糖凝胶电泳方法检测阳性LAMP的扩增效率，结果如图1所示，其中泳道1为空白组即为不加TaqSSB蛋白，泳道2为TaqSSB蛋白的浓度为1ng/μL，泳道3为TaqSSB蛋白的浓度为2ng/μL，泳道4为TaqSSB蛋白的浓度为3ng/μL，泳道5为TaqSSB蛋白的浓度为4ng/μL，泳道6为TaqSSB蛋白的浓度为5ng/μL，泳道7为TaqSSB蛋白的浓度为6ng/μL，泳道8为TaqSSB蛋白的浓度为7ng/μL。条带越亮代表扩增效率越好，通过观察图1中条带的亮度可知：添加Taq SSB蛋白的实验组(泳道2-8)条带的亮度明显亮于没有添加Taq SSB蛋白的实验组(泳道1)，并且当TaqSSB蛋白的浓度在2ng/μL-5ng/μL之间(泳道3-6)时，条带亮度优于其他泳道亮度，当TaqSSB蛋白的浓度在4ng/μL之间(泳道5)时，条带最亮，因此，添加TaqSSB蛋白可以明显提高LAMP的反应扩增效率，减少引物二聚体的生成，TaqSSB蛋白的浓度在2ng/μL-5ng/μL之间LAMP的反应扩增效率更高，TaqSSB蛋白的浓度在4ng/μL时LAMP的反应扩增效率最好。
通过琼脂糖凝胶电泳方法检测阴性LAMP中引物二聚体的生成量，结果如图2所示，其中泳道1为阳性组，泳道2为空白组即为不加TaqSSB蛋白，泳道3为TaqSSB蛋白的浓度为1ng/μL，泳道4为TaqSSB蛋白的浓度为2ng/μL，泳道5为TaqSSB蛋白的浓度为3ng/μL，泳道6为TaqSSB蛋白的浓度为4ng/μL，泳道7为TaqSSB蛋白的浓度为5ng/μL，泳道8为TaqSSB蛋白的浓度为6ng/μL，泳道9为TaqSSB蛋白的浓度为7ng/μL。最底端极为二聚体的生成量，条带越亮代表引物二聚体的生成量越多，通过图2可知不加TaqSSB蛋白的泳道2中条带最亮，生成的引物二聚体的量最多，泳道3-9中添加了TaqSSB蛋白并且浓度不同，条带亮度明显低于泳道2条带亮度，说明引物二聚体的生成量明显减少，因此通过比较泳道2-9可知：添加TaqSSB蛋白可以明显减少引物二聚体的生成。泳道3、4、8、9中存在引物二聚体的条带，但条带亮度低于泳道2，说明引物二聚体的生成量减少，而泳道5、6、7中引物二聚体的条带亮度极弱，几乎没有，说明引物二聚体的生成量极少，几乎没有，因此当TaqSSB蛋白的浓度在1ng/μL-7ng/μL(泳道3-9)之间时，可以减少引物二聚体的生成量，而当TaqSSB蛋白的浓度在3ng/μL-5ng/μL(泳道5-7)之间时，可以阻止引物二聚体的生成。综上，TaqSSB蛋白的浓度在1ng/μL-7ng/μL之间均可以达到减少引物二聚体生成的效果，TaqSSB蛋白的浓度在3ng/μL-5ng/μL之间均可以达到阻止引物二聚体生成的效果。
实施例3：引物浓度比的确定
1、外引物与内引物浓度比的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8U Bst 2.0DNA WarmStart TM polymeraselarge fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
固定其他成分的浓度，调整外引物与内引物的浓度比进行LAMP反应优化：泳道1-8分别为1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，9为阴性。根据上述外引物与内引物浓度比配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择外引物与内引物的最佳浓度比，由图3可知，泳道5-8(外引物与内引物的浓度比为1:6-1:9)条带亮度明显优于其他条带，泳道5–9扩增效果较好，其中泳道6(外引物与内引物的浓度比为1:7)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度比为1:7。
2、外引物与环引物的浓度比优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB，1μL 8U Bst 2.0DNA WarmStart TMpolymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
固定其他成分的浓度，调整外引物与环引物的浓度比例为以下比例优化：条带1-6分别为1；1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6,7为阴性。根据上述外引物与环引物浓度比配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择外引物与环引物的最佳浓度比由图4可知，泳道4–6(外引物与环引物的浓度比1:4-1：5)条带亮度明显优于其他条带，泳道4–6扩增效果较好，其中泳道5(外引物与环引物的浓度比1:5)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度比为1：5。
实施例4：镁离子浓度的确定
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，1μL 8U Bst2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
镁离子的浓度影响DNA聚合酶的活性，进而产生对反应产物产量的影响，还会影响到引物的退火。固定其他成分的浓度，调整镁离子浓度为以下浓度：条带1-7分别为0mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM。根据上述镁离子的浓度配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择镁离子的最佳浓度，由图5可知，泳道4–7(3mM-6mM)条带亮度明显优于其他条带，泳道–扩增效果较好，其中泳道5(4mM)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为4mM。
实施例5：dNTP浓度的确定
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，1μL 8U Bst2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×Bst ThermoPol buffer，4mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
dNTP的浓度大小会影响DNA聚合酶的扩增效率。固定其他成分的浓度，调整dNTP的浓度为以下浓度：条带1-8分别为0mM，1.2mM，1.6mM，2mM，2.4mM，2.8mM，3.2mM，3.6mM，9为阴性。根据上述dNTP的浓度配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择dNTP的最佳浓度，由图6可知，泳道3–6(1.6mM–2.8mM)条带亮度明显优于其他条带，泳道3–6扩增效果较好，其中泳道5(2mM)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为2mM。实施例6：Bst DNA聚合酶添加量的优化
LAMP扩增反应体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB2μL 10×BstThermoPol buffer，2mM dNTPs，3mM MgSO4，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
Bst酶是LAMP反应体系中的核心。固定其他成分的浓度，调整Bst酶的添加量为下：条带1-9为0μL，0.5μL，0.6μL，0.7μL，0.8μL，0.9μL，1.0μL，1.1μL，1.2μL，10为阴性。选取最优添加量。根据上述Bst酶的添加量配置LAMP反应体系，进行LAMP反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。根据电泳图上LAMP条带的有无和亮暗来选择BstDNA聚合酶的添加量。，由图7可知，泳道5–8(0.8μL-1.1μL)条带亮度明显优于其他条带，泳道5–8扩增效果较好，其中泳道6(0.9μL)条带最亮，扩增效果最好，最佳浓度为0.9μL。
实施例7：
通过实施例2-6确定的各参数的浓度，得到的扩增效果最好的LAMP体系为：扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，0.9μL 8U Bst DNA聚合酶，2.5μL 10×Bst buffer，2mM dNTPs，4mMMg2+，4ng/μL TaqSSB蛋白，2μL DNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。
扩增程序为：将25uL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并黑暗处放置。
实施例8：LAMP反应灵敏度试验
取纯克罗诺杆菌的培养物的菌液，平板计数法所得菌液浓度为5×10-1CFU/mL、5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106CFU/mL，采用上述实施例1中叙述方法提取DNA，并采用实施例7中LAMP体系和程序进行LAMP扩增实验，将所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每个扩增产物检测重复3次，通过琼脂糖凝胶电泳方法测试检测的灵敏度如图9所示。图9中M，marker；1，5×106CFU/mL；2，5×105CFU/mL；3，5×104CFU/mL；4，5×103CFU/mL；5，5×102CFU/mL；6，5×101CFU/mL；7，5×100CFU/mL；8，5×10-1CFU/mL；9，阴性对照。
结果表明，当菌液浓度为5×100CFU/mL时通过琼脂糖凝胶电泳显示能看到一条较弱条带，当菌液浓度为5×10-1CFU/mL时通过琼脂糖凝胶电泳显示无条带显示，因此本发明方法灵敏度可达5×100CFU/mL。现有LAMP方法反应的灵敏度仅能达到4.3×10-1CFU/mL(如CN 201310287426.5)。本发明方法的灵敏度相比于现有技术提高了10倍，能够很好的达到检测效果。
本发明中LAMP扩增反应时间只需25min，而现有LAMP扩增反应需要40min-60min，本发明方法比传统LAMP扩增反应时间缩短了15-35min，因此，本申请相比于现有LAMP方法大大缩短了LAMP反应时间。
实施例9LAMP反应体系的特异性
针对7株克罗诺杆菌和16株非克罗诺杆菌(如表1)进行特异性验证试验来验证加入TaqSSB蛋白后的扩增体系的特异性。其中加入TaqSSB蛋白后的扩增的7株克罗诺杆菌，有明显的梯形条带，呈阳性，其余加入TaqSSB蛋白后的扩增的16株非阪崎克罗诺杆菌，无梯形条带产生，呈阴性，结果与未加入该蛋白之前扩增特异性结果一致。说明本方法对检测克罗诺杆菌特异性强。
表1菌株名称及来源
实施例10LAMP反应体系的应用
本实施例选择3种致病菌(沙门氏菌CMCC50222，单增李斯特氏菌CMCC54004，金黄色葡萄球菌CMCC26112)作为检测对象，菌株信息具体如表1中所示。分别针对不同的检测对象设计LAMP引物，并对各自特异性引物进行扩增备用。同时对不同的DNA进行核酸扩增，以DNA作为阳性DNA模板，进行不同菌的加入TaqSSB蛋白的扩增效率的实验。
反应体系1按照实施例7中的LAMP体系：每25μL所述LAMP扩增反应体系包括1.4μM内引物FIP和1.4μM内引物BIP，0.2μM外引物F3和0.2μM外引物B3，1μM环引物LF和1μM环引物LB，1μL 8U Bst 2.0DNA WarmStart TM polymerase large fragment，2μL 10×BstThermoPol buffer，1.5mM dNTPs，2μLDNA模板，其余用ddH2O补足至25μL。反应体系2按照实施例7中的LAMP体系按照上述体系分别加入4ng/μLTaqSSB蛋白以完成上述扩增2。用两个反应体系分别进行3种菌的LAMP扩增。
扩增程序为：将25μL的反应体系于64℃水浴锅中反应25min，80℃终止5min，得到扩增产物，并进行琼脂糖凝胶电泳反应，结果如图10所示。图10中，M，marker；1，未加TaqSSB蛋白的沙门氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；2，加入TaqSSB蛋白的沙门氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；3,未加TaqSSB蛋白的单增李斯特氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；；4,加入TaqSSB蛋白的单增李斯特氏菌LAMP扩增体系的阳性条带；5,未加TaqSSB蛋白的金黄色葡萄球菌LAMP扩增体系的阳性条带；6，加入TaqSSB蛋白的金黄色葡萄球菌LAMP扩增体系的阳性条带。
根据图10可知：加入TaqSSB蛋白后的泳道1-3均呈现阶梯式条带，说明本发明方法对不同检测对象均可以成功进行LAMP扩增，适用于不同的检测对象。
通过添加4ng/μL TaqSSB蛋白来对比添加之前和添加之后的扩增反应效果。对3种菌的进行灵敏度实验，并通过琼脂糖凝胶电泳结果表明：添加TaqSSB蛋白后，每个菌的检测灵敏度都相应提高10倍，能够很好的提高各个反应的扩增效率，提高了LAMP的检测效率。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 内引物FIP
<400> 1
ccgtgtacgc ttgttcgctt tctctcaaac tcgcagcac 39
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 内引物BIP
<400> 2
ggcagtcaga ggcgatgcgc cggttataac ggttca 36
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 外引物F3
<400> 3
aaatgcgcgg tgtgtcag 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 外引物B3
<400> 4
ggtttcccca ttcggacat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 环引物LF
<400> 5
aacctcacaa cccgaaga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 环引物LB
<400> 6
agcgccggta aggtgata 18

Claims (10)

1.一种提高环介导等温扩增反应效率的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系还包括Taq SSB蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为1ng/μL-7ng/μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为3ng/μL-5ng/μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Taq SSB蛋白在环介导等温扩增反应体系中的浓度为4ng/μL。
5.根据权利要求1-4任一所述方法在检测细菌和病毒中的应用。
6.根据权利要求1-4任一所述方法在检测致病菌中的应用。
7.根据权利要求1-4任一所述方法在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，Bst 2.0 DNA WarmStart TM polymerase largefragmen，10×Bst ThermoPol buffer，dNTPs，Mg2+，TaqSSB蛋白，DNA模板，蒸馏水。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，每25μL所述环介导等温扩增反应体系包括：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，0.5μL-1.2μL 8U Bst酶，1μL-3μL 10×Bst buffer，0.8mM-2.8mM dNTPs，1mM-6mM MgSO4，2ng/μL-6ng/μL TaqSSB蛋白，1μL-2μLDNA模板，蒸馏水；所述外引物和内引物的浓度之比为1:2-1:8；所述外引物和环引物的浓度之比为1:2-1:8。
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