CN110438203A - 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高环介导等温（LAMP）扩增反应效率的方法及其应用，将富勒烯加入LAMP扩增反应体系当中进行等温扩增富勒烯，包括制备富勒烯试剂、LAMP扩增反应体系优化和LAMP扩增产物检测。本方法可有效提高LAMP扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。该方法可以被应用于食品安全检测领域，具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用。
背景技术
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是2000年发明的一种等温核酸体外扩增技术。该技术依赖于一种具有链置换特性的DNA聚合酶（如Bst酶），利用一对外引物（F3/B3）和一对内引物（FIP/BIP）与靶基因的6个不同区域退火杂交，使产物自我配对形成一种特殊的哑铃状结构，再通过内引物与哑铃状结构的互补配对，在等温条件下进行，扩增15min-1h即可产生109～1010倍的扩增子。由于该技术灵敏度高，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于LAMP扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间难免发生非特异性结合产生引物二聚体，会消耗反应体系中的反应底物，从而降低了反应的效率，降低检测灵敏度降低，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何建立一种既有更高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增的LAMP扩增反应体系，一直是LAMP扩增技术领域急需解决的技术难题。
富勒烯是一种完全由碳组成的中空分子，形状呈球型、椭球型、柱型或管状。近年来，富勒烯被较多地应用于材料科学、电子学和纳米技术等领域。但尚未有将富勒烯应用于提高LAMP扩增反应效率的报道。
发明内容
针对现有LAMP扩增技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于提供了一种提高LAMP扩增反应效率的方法。通过向LAMP扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，以提高灵敏度和特异性。
本发明的再一目的在于，提供所述方法的应用。
本发明目的通过下述方案实现：
一种提环介导等温扩增反应效率的方法，其特征在于，通过向环介导等温（LAMP）扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，包括如下步骤：
（1）富勒烯制备：富勒烯试剂利用现有技术制备；
（2）LAMP扩增反应体系优化：将富勒烯加入LAMP扩增反应体系当中，然后进行LAMP扩增；
（3）LAMP扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
本发明提供了一种提高LAMP扩增反应效率的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决在LAMP扩增检测方面遇到的技术难题。
本发明中，在25 µL的LAMP扩增反应体系中加入富勒烯的终浓度为0.25-40 μg/L。
本发明还提供一种在致病微生物检测中的应用。以及，
本发明也提供一种在检测肉品掺假中的应用。
本发明所述的应用中，LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，Bst DNA聚合酶，10×聚合酶缓冲液，dNTP，Mg2+，甜菜碱，富勒烯，双蒸水中的一种或多种。
本发明方法中，在一具体实施方案（含环引物）中，所述LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8U，1×聚合酶缓冲液，dNTP 1.0-1.6 mmol/L，Mg2+ 2-9 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，富勒烯0.25-40 μg/L，环引物LF和/或LB各0.8 μmol/L。在另一具体实施方案（不含环引物）中，所述LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8U，1×聚合酶缓冲液，dNTP 1.0-1.6 mmol/L，Mg2+ 2-9 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，富勒烯0.25-40 μg/ L。环引物有助于提高反应效率。例如，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 10 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO4 2 mM。1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理。
本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。
本发明还提出了所述方法在致病微生物检测中的应用，其中所述应用包括但不限于细菌、病毒及其他可致病的微生物。其中，所述细菌，包括但不限于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌及其他细菌。其中，所述病毒，包括但不限于猪瘟病毒、鲤春病毒血症病毒、草鱼坏死病毒及其他病毒。
本发明还提出了所述方法在检测肉品掺假中的应用。
本发明为生物技术领域提供了一种提高LAMP扩增反应效率的方法。本发明有益效果包括：采用本发明检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点。与目前常用LAMP扩增检测方法相比，本发明通过向LAMP扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，操作简单，效果极佳，非常适于食品安全检测等机构推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。
附图说明
附图1表明本发明实施例1富勒烯对鲤春病毒血症病毒LAMP扩增反应体系的优化；
附图2表明本发明实施例2富勒烯对金黄色葡萄球菌LAMP扩增反应体系的优化。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
一种提环介导等温扩增反应效率的方法，通过向金黄色葡萄球菌环介导等温（LAMP）扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，按如下步骤：
（1）制备LAMP扩增反应体系（除富勒烯外），组成如下表：
其中引物LF、FIP、BIP、F3和B3为鲤春病毒血症病毒特异性LAMP扩增引物，模板为鲤春病毒血症病毒cDNA。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料富勒烯，每25 µL的体系中加入0.4 µL的富勒烯溶液，同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在60℃条件下进行LAMP反应60min，80℃终止反应3 min。
（3）在扩增产物中加入SYBR Green I进行琼脂糖凝胶电泳显色检测。
扩增结果如图1所示，样品1-6均不加入模板鲤春病毒血症病毒cDNA，第一组不加入本发明优化材料富勒烯，第二组加入本发明优化材料富勒烯。从图中可以看出，未加入优化材料富勒烯的体系部分样品（样品3、4、6）显色为亮绿色，显示有非特异性扩增；而加入优化材料富勒烯的体系显色均为橙色，显示消除了非特异性扩增。该LAMP扩增结果显示，本发明可以消除非特异性扩增，避免假阳性，优化效果显著。
实施例2
一种提环介导等温扩增反应效率的方法，通过向金黄色葡萄球菌环介导等温（LAMP）扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，按如下步骤：
（1）制备LAMP反应体系，组成如实施例1，不同之处在于引物FIP、BIP、F3和B3为金黄色葡萄球菌特异性LAMP扩增引物（体系中未添加环引物LF），模板为金黄色葡萄球菌DNA（来源于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC 1.2465，菌株经培养后使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA），模板量做了系列稀释。富勒烯加样量为2.0 µL（终浓度为20 μg/ L）。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料富勒烯，每个25 µL的体系中加入2.0 µL的富勒烯溶液，同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在63℃条件下进行LAMP反应60min，80℃终止反应5 min。
（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图2所示，样品1-9分别为每个反应体系中模板量分别为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和0（即阴性对照），M为分子量标记（TakaRa公司DL2000，分别为2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）。可以看出在没有添加富勒烯的处理中，模板量为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg和100 fg的反应体系电泳呈现特征性的梯形条带，判断为阳性；模板量为10 fg和0的反应体系未出现特征性的梯形条带，判断为阴性，表明不添加优化材料富勒烯的反应体系最低可检测到100 fg的模板（相当于20个细菌）。在添加富勒烯的处理中，模板量为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg和10 fg的反应体系电泳呈现特征性的梯形条带，判断为阳性，模板量为0的反应体系未出现特征性的梯形条带，判断为阴性，表明添加优化材料富勒烯的反应体系最低可检测到10 fg的模板（相当于2个细菌）。该LAMP扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。
实施例3
针对羊肉制品中是否掺加有狗肉LAMP扩增反应体系的优化改进，包括下列步骤：
（1）制备LAMP反应体系，组成如实施例1，不同之处在于引物LF、FIP、BIP、F3和B3为狗的特异性LAMP扩增引物，模板为待测肉品的DNA，模板加入量分别为10 ng、1 ng、100 pg、10pg、1 pg、100 fg和0（即阴性对照）。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料富勒烯，每个25 µL的体系中加入3.0 µL的富勒烯溶液（终浓度为30 µg/L），同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在62℃条件下进行LAMP反应60 min。80℃终止反应10 min。
（3）在扩增产物中加入SYBR Green I进行显色检测。
由扩增结果可知，在没有添加富勒烯的处理中，模板量为10 ng、1 ng和100 pg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性；模板量为1 pg、100 fg和0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料富勒烯的反应体系最低可检测到100 pg的模板。在添加富勒烯的处理中，模板量为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg和1 pg的反应体系呈亮绿色，判断为阳性，模板量为100 fg和0的反应体系呈橙色，判断为阴性，表明添加优化材料富勒烯的反应体系最低可检测到1 pg的模板。该LAMP扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。
Claims (8)
1.一种提环介导等温扩增反应效率的方法，其特征在于，通过向环介导等温（LAMP）扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，包括如下步骤：
（1）LAMP扩增反应体系优化：将富勒烯加入LAMP扩增反应体系当中，然后进行LAMP扩增；
（2）LAMP扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
2.根据权利要求1所述的一种提高LAMP扩增反应效率的方法， 其特征在于，在25 µL的LAMP扩增反应体系中加入富勒烯的终浓度为0.25-40 μg/L。
3.根据权利要求1或2所述方法在致病微生物检测中的应用。
4.根据权利要求1或2所述方法在检测肉品掺假中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，Bst DNA聚合酶，10×聚合酶缓冲液，dNTP，Mg2+，甜菜碱，富勒烯，双蒸水中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8U，1×聚合酶缓冲液，dNTP1.0-1.6 mmol/L，Mg2+ 2-9 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，富勒烯0.25-40 μg/L，环引物LF和/或LB各0.8 μmol/L。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液选用1×Thermopol反应缓冲液，包含Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L， (NH4)2SO410 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO4 2 mM；1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理；恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8U，1×聚合酶缓冲液，dNTP1.0-1.6 mmol/L，Mg2+ 2-9 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，富勒烯0.25-40 μg/ L。
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