CN101675164A - 用于分离生物材料的组合物、方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了组合物、方法、装置、以及试剂盒,所述组合物、方法、装置、以及试剂盒包括具有基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2,并且微生物和多核苷酸结合到所述固定金属支承材料,所述组合物、方法、装置、以及试剂盒可用于从样品材料中分离和任选地分析微生物和/或多核苷酸。
Description
本申请要求于2007年4月25日提交的美国临时申请No.60/913,812的优先权,该临时申请全文以引用方式并入本文。
背景技术
当实施检测或分析生物材料的方法时,从样品中分离生物材料(例如细胞、病毒以及多核苷酸)是十分有用甚至必要的。在一些方法中,从样品中分离微生物,并且用枚举法或非枚举法来确定微生物总数或鉴别至少某些微生物。已用的枚举法有(例如)标准平板计数法,大肠杆菌、酵母和霉菌计数法,生物发光测定法以及阻抗或电导系数测量法;已用的非枚举法有(例如)选择性差速贴壁法、DNA杂交法、凝集法以及酶免疫分析法。多核苷酸或部分多核苷酸的鉴别已用于诊断微生物感染、检测遗传变异、将组织分型等。辨别多核苷酸(包括DNA与RNA)的方法通常包括扩增或杂交多核苷酸。扩增法的例子包括:聚合酶链式反应(PCR)法;靶多核苷酸扩增法,例如自主序列复制(3SR)法与链置换扩增(SDA)法;基于附接到靶多核苷酸的信号扩增的方法,例如“支链”DNA扩增法;基于探针DNA扩增的方法,例如连接酶链反应(LCR)法与QB复制酶扩增(QBR)法;基于转录的方法,例如连接激活的转录(LAT)法、基于核酸序列的扩增(NASBA)法、以商品名INVADER的扩增、以及转录介导的扩增(TMA)法;以及各种其他扩增方法,例如修补链反应(RCR)与循环探针反应(CPR)。由于诸如碳水化合物和蛋白质等大量细胞物质或其他污染物会干扰这些方法,因此有必要从样品(通常为复杂的混合物)中分离多核苷酸。
用于从样品中分离多核苷酸的方法是已知的。其中一些方法涉及一系列耗时的提取和洗涤步骤。例如,已通过用清洁剂或离液剂裂解生物材料、用有机溶剂提取、用乙醇沉淀、离心分离、以及对核酸进行透析,从样品(例如血样或组织样品)中分离出了核酸。
在某些分离核酸的方法中还采用了固体提取法。已实际使用了粒子(包括微珠)和薄膜过滤器。例如,在离液条件下,已通过将DNA吸附到二氧化硅粒子上来实施DNA提取。然而,后续的洗涤步骤通常需要诸如乙醇或异丙醇等有机溶剂。此类方法的其他例子已有报道,其包括在某些表面活性剂或聚乙二醇存在情况下,将疏水性表面与高浓度盐一起使用。有机溶剂或高浓度盐的使用限制了提取方法与后续方法(例如微流体系统中的核酸扩增)相结合的灵活性。此外,在提取过程中使用多种试剂不仅成本高而且耗时长。在另一个例子中,用结合在表面的铵基团吸引并结合DNA分子。具有此功能的DNA提取试剂盒可得自(例如)Qiagen(Valencia,CA)。通常在高pH值或高浓度盐的条件下洗提所吸附的DNA,这会干扰诸如DNA扩增等后续方法。可能需要对所得的材料进行大量稀释、脱盐、或中和,而大量稀释会导致灵敏度降低。
用固定金属亲和层析(IMAC)法来分离和/或提纯含无保护嘌呤或嘧啶部分或基团的化合物(例如核酸)已有报道(美国专利公开No.2004/0152076A1)。然而,已发现双链DNA并未结合到层析柱基质上。
随着改进的样品制备方法和检测微生物的重要性日益增长,对用于分离微生物的材料和方法一直有所需求,和/或这些材料和方法在温和条件下可以简便地提取多核苷酸,并且具有足够的灵活性以便在不干扰后续方法的情况下与此类后续方法配合使用,或者这些材料和方法可以减少人工劳动而创造价值。
发明内容
现已发现,可以使用某些固定金属支承材料来从复杂样品材料中分离多核苷酸(包括双链DNA)。虽然不希望受到理论束缚,但申请人确信某些结合到支承材料的金属离子与多核苷酸上的磷酸基相互作用,从而使多核苷酸结合到固定金属支承材料上。此外,可用短时间的中度加热和低浓度缓冲液来释放所捕获的多核苷酸,所述缓冲液与多核苷酸磷酸基竞争或置换多核苷酸磷酸基。所释放的多核苷酸与缓冲液混合可直接用于诸如多核苷酸扩增等后续处理。
还发现固定金属支承材料非特异性地与微生物结合,该微生物然后可从包括复杂样品(例如食物和临床样品)的样品材料中分离。“非特异性结合”是指该结合并不特定于任何类型的微生物或细菌细胞等。因此,例如样品中的所有细菌均可与该样品的其他组分分离,而非针对(例如)某一种细菌菌株。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母细胞、霉菌孢子等均可结合。然后,所得的分离的微生物可经受已知检测方法(例如微生物负载检测)检测。
因此,在一个实施例中,本发明提供一种组合物,该组合物包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,本发明提供一种组合物,该组合物包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;并且
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
在另一个实施例中,本发明提供从样品材料中分离并任选地分析至少一种双链多核苷酸的方法,该方法包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,本发明提供从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的方法,该方法包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
在pH值为4.5至6.5下,使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;并且
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
在另一个实施例中,本发明提供用于处理样品材料的装置,该装置具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,该固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个第二腔室,所述第二腔室与第一腔室分开并能够接收和容纳来自至少一个第一腔室的流体、固定金属支承材料、或它们两者;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,本发明提供用于从样品材料中分离至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括:
具有至少一个能够容纳或引导流体的腔室的装置;包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
至少一种选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、以及洗脱缓冲液组成的组的试剂。
在另一个实施例中,本发明提供用于从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括用于处理样品材料的装置,该装置具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,该固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个第二腔室,所述第二腔室与第一腔室分开并能够接收和容纳来自该至少一个第一腔室的流体、固定金属支承材料、或它们两者;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,提供了一种组合物,该组合物包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
多种微生物,所述多种微生物选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组,并且非特异性地结合到固定金属支承材料;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,提供了分离细菌细胞的方法,该方法包括:
提供包含具有基底的固定金属支承材料的组合物,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;
提供可能具有选自由下列组成的组的多种微生物的样品:细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合;
使组合物与样品接触;其中来自样品的多种微生物的至少一部分非特异性地结合到固定金属支承材料;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
术语“包含”及其改变形式(例如包括、含有等)在说明书和权利要求书出现这些术语之处没有限制的含义。
如本文所用,除非上下文中另外清楚地指明,否则“一个”、“该”、“所述”、“至少一个”、以及“一个或多个”可以互换使用。
另外在本文中,通过端值表述的数值范围包括此范围内所包含的所有数值(如,pH值7至10包括pH值7、7.5、8.0、8.7、9.3、10等)。
本发明的以上发明内容并非意图描述本发明公开的每个实施例或本发明的每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了示例性实施例。
附图说明
图1为根据本发明的装置的俯视图,该装置具有两个分开的腔室并且其中一个腔室中含有固定金属支承材料。
示例性实施例的具体实施方式
本发明提供可用于从样品材料中分离微生物和/或多核苷酸的组合物、方法、装置、以及试剂盒。任选地,可以对所分离的多核苷酸或微生物进行分析。分析包括检测是否存在多核苷酸和/或测定存在的多核苷酸的量。就微生物而言,分析包括检测是否存在微生物(辨识)和/或枚举存在的微生物的量。如本文所用,术语“多核苷酸”是指单链和双链核酸、低聚核苷酸、其中一部分包含低聚核苷酸或多核苷酸的化合物、以及肽核酸(PNA),并且包括线性形式和环状形式。对于某些实施例而言,多核苷酸优选地为单链核酸或双链核酸。
在一个实施例中,提供了一种组合物,该组合物包含:
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
如本文所用,术语“基底”是指具有固体表面的材料,该材料可以为(例如)多种粒子、层析柱内壁、过滤器、微量滴定板、玻璃料、吸头、薄膜、多根纤维、或载玻片。对于某些实施例而言,基底选自由层析柱内壁、过滤器、微板、微量过滤板、微量滴定板、玻璃料、吸头、薄膜、多种微球、多根纤维、以及载玻片组成的组。对于某些实施例而言,基底选自由小珠、凝胶、薄膜、薄板、膜、粒子、纤维、过滤器、平板、条带、管、层析柱、孔、容器壁、毛细管、吸头、以及它们的组合组成的组。所述多种粒子可以为多种微粒(包括微球)、微珠等。此类粒子可以为树脂粒子(例如,琼脂糖、乳胶、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、纤维素、多糖、或它们的组合),或为无机粒子(例如,二氧化硅、氧化铝、或它们的组合)。此类粒子可以有磁性或无磁性。此类粒子可以为尺寸在(例如)约100纳米至约10微米(μ)的胶状物。
所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团可以多种方式结合到基底。例如,所述基团可以通过共价键、离子键、氢键、和/或范得瓦尔(van der Waals)力进行结合。所述基团可直接结合到基底,例如具有聚合物表面的基底,其中聚合物具有共价结合到聚合物链的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团。此类性质的聚合物可包括经-C(O)OH或-P(O)(-OH)2取代的乙烯基单元,例如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基膦酸、以及类似单元。所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团可通过连接基团间接结合到基底。例如,可以使基底上的氨基与具有多个羧基的化合物(例如氨三乙酸)接触,从而形成含酰胺的连接基团,该含酰胺的连接基团将一个或多个羧基(就氨三乙酸而言为两个羧基)附连到基底。具有可用氨基或可通过改性而具有可用氨基的基底已为本领域内的技术人员所知,所述基底包括(例如)基于琼脂糖的基底、基于乳胶的基底、基于聚苯乙烯的基底、以及基于二氧化硅的基底。诸如玻璃或二氧化硅粒子等具有-Si-OH基团的基于二氧化硅的基底可以用已知的氨基硅烷偶联剂(例如3-氨基丙基三甲氧基硅烷)进行处理,从而得到可用氨基。可使用其他已知的硅烷化合物将诸如-C(O)OH或-P(O)(-OH)2等官能团附接到基底,例如具有二氧化硅表面的基底。
如果这些基团所附接的分子通过静电、氢键、配位键、范得瓦尔力(疏水性相互作用)或诸如生物素-亲和素相互作用等特殊化学作用结合到基底,在这种情况下,所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团也可间接结合到基底上。例如,可采用逐层技术将带有C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的聚合物涂布到具有相反电荷的表面上,从而形成具有C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的高密度聚合物。
对于另一例子而言,通过等离子处理可以将带有C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的单体接枝到聚合物表面。
具有多个羧基(如,-C(O)OH或-C(O)O-)的基底是已知的并且可以商购获得。例如,羧化微粒可以商品名(例如)DYNABEADS MYONE(Invitrogen,Carlsbad,CA)和SERA-MAG(Thermo Scientific,通常所说的Seradyn,Indianapolis,IN)购得。
通过使酸基与过量的金属离子(例如作为金属盐(如硝酸盐)溶液)接触,可以将金属离子My+结合到酸基。还可使用其他盐,例如氯化物、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、乙酰丙酮化物、溴化物、氟化物、或碘化物的盐。
在另一个实施例中,提供了一种组合物,该组合物包含:
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
例如当通过将生物材料结合到固定金属支承材料上来制备组合物时,采用4.5至6.5范围内的pH值可以增加选择金属离子的灵活性。
例如,当pH值为4.5至6.5时,金属离子Ga3+有效地与细菌细胞结合,但当pH值为7至9时又可以释放细胞。使用0.1M、pH值为约5.5的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液可方便地提供4.5至6.5范围内的pH值。对于某些实施例(包括任何一种上述组合物)而言,组合物的pH值为5至6。
为了尽可能减少对使用本发明的组合物的方法的干扰,可以任选地不包含可测量含量的盐。可测量含量是指大于约0.2M的含量,并且更优选的是大于约0.1M的含量。对于某些实施例而言,当组合物中存在可测量含量的盐时,所述组合物中包含的可测量含量的任何盐既不是无机盐也不是含1至4个碳原子的盐。
对于某些实施例(包括任何一种上述组合物)而言,所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
所选择的金属离子My+应使得该金属离子能充分地结合多核苷酸的磷酸根部分,从而与样品材料中存在的多核苷酸分子结合。此外,所选择的金属离子还应使得金属离子与金属螯合试剂在洗涤缓冲液中竞争性结合,从而在低试剂浓度和温和条件情况下,有效地并且优选定量地从固定金属支承材料上释放或洗提多核苷酸分子。未加入任何盐来增加离子强度的低试剂浓度可以为约0.1M或更小、0.05M或更小、或0.025M或更小。温和条件可以包括低试剂浓度、约7至10的pH值、不超过约95℃的温度(优选地不超过约65℃),或它们的组合。
对于某些实施例(包括任何一个上述实施例)而言,M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组。镧系元素包括任何一种镧系元素金属:镧、铈、镨、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、以及镥。镧和铈为优选的镧系元素。对于这些实施例中的某些而言,M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、镧、以及铈组成的组。对于这些实施例中的某些而言,M选自由锆、镓、以及铁组成的组。对于这些实施例中的某些而言,M为锆。
对于某些实施例(包括任何一个上述实施例)而言,y为3或4。
对于某些实施例(包括任何一个上述实施例)而言,My+为Zr4+或Ga3+。对于这些实施例中的某些而言,My+为Zr4+。
在另一个实施例中,提供了从样品材料中分离并任选地分析至少一种双链多核苷酸的方法,该方法包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,提供了从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的方法,该方法包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
在pH值为4.5值6.5下,使样品材料与结合到
-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,组合物的pH值为5至6。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,组合物中包含的可测量含量的任何盐不是无机盐或含1至4个碳原子的盐。
样品材料为含有多核苷酸的任何材料。样品材料可以是未加工的样品材料或经过加工的样品材料。未加工的样品材料包括(例如)临床样品或标本(血液、组织等)、食物样品(食品、饲料,包括宠物食品、饮料、食品或饲料的原材料等)、环境样品(水、污垢等)等。经过加工的样品材料包括(例如)含有从未加工的样品材料中分离的细胞或病毒的样品,以及含有从细胞、病毒中分离或由其他来源获得的多核苷酸的样品。样品材料(例如临床样品或标本)的一些例子包括鼻腔样品、喉部样品、唾液样品、血液样品、伤口样品、腹股沟样品、腋窝样品、会阴样品、以及粪便样品。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,样品材料包括含有核酸的生物材料。对于这些实施例中的某些而言,样品材料包括多种细胞、病毒、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,样品材料包括多种细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞,并且可以包括哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物、酵母等等。对于这些实施例中的某些实施例而言,细胞为细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,细胞为细菌细胞。
对于某些实施例(包括其中样品材料包括多种细胞、病毒、或它们的组合的任何一个上述实施例)而言,所述方法还包括:向样品材料中加入裂解试剂,然后使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触。对于这些实施例中样品材料含有至少一种双链多核苷酸的某些实施例而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸。作为另外一种选择,对于这些实施例中样品材料含有至少一种多核苷酸的某些实施例而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸。
裂解可通过酶促方式、化学方式、和/或机械方式来进行。用于裂解的酶包括(例如)溶葡萄球菌酶、溶菌酶、变溶菌素、或其他酶。化学裂解可通过使用表面活性剂、碱、加热、或其他方法来进行。当使用碱来裂解时,可以使用中和试剂来中和裂解后的溶液或混合物。机械性裂解可通过使用诸如小珠或微珠等固体粒子或微粒进行混合或剪切而实现。还可使用超声波降解来裂解。裂解试剂可包括:表面活性剂或清洁剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LLS)、TRITON系列、TWEEN系列、BRIJ系列、NP系列、CHAPS、N-甲基-N-(1-十二酰基)甘氨酸、钠盐等,根据需要进行缓冲;离液剂,例如盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠等;裂解酶,例如溶菌酶、溶葡萄球菌酶、变溶菌素、蛋白酶、链霉蛋白酶、纤维素酶、或任何其他市售的裂解酶;碱性裂解试剂;固体粒子,例如小珠,或它们的组合。
对于某些实施例(包括其中样品材料包括多种细胞、病毒、或它们的组合的任何一个上述实施例)而言,作为另外一种选择,当样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触时,使所述样品材料与裂解试剂接触。在此可供选择的方法中,通过通过如下方法减少步骤:同时将多种细胞、病毒、或它们的组合结合到与-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团结合的多个金属离子My+,裂解所述细胞、病毒或它们的组合,并且结合来自细胞、病毒、或它们的组合的多核苷酸。对于其中样品材料含有至少一种双链多核苷酸的这些实施例中的某些而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸。作为另外一种选择,对于其中样品材料含有至少一种多核苷酸的这些实施例中的某些实施例而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法,其中使包含多种细胞、病毒、或它们的组合的样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触)而言,提供了a)结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少数量的细胞、病毒、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括将包含样品材料的上清液与结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分分离,所述样品材料具有量有所减少的细胞、病毒、或它们的组合。
上清液与固定金属支承材料的分离可以通过(例如)滗析、离心、吸移管吸取、和/或这些方法的组合来进行。当支承材料由磁性粒子构成时,通过施加磁场可以将固定金属支承材料保持在腔室壁或容器壁的适当位置。然后,通过滗析、吸移管吸取、或用压差或重力使上清液流出腔室或容器,从而移除上清液。
对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括洗涤结合到固定金属支承材料的细胞、病毒、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括分析结合到固定金属支承材料的细胞、病毒、或它们的组合。作为另外一种选择,该方法还包括从固定金属支承材料上分离细胞、病毒、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括分析细胞、病毒、或它们的组合。可以使用诸如比色测定、免疫测定等已知的分析方法进行分析。
对于某些实施例(包括其中使多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分结合到固定金属支承材料的任何一种上述方法,除了包括加入裂解试剂的方法之外)而言,该方法还包括向结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分添加裂解试剂。对于这些实施例中的某些(其中样品材料含有至少一种双链多核苷酸)而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸。作为另外一种选择,对于这些实施例中的某些(其中样品材料含有至少一种多核苷酸)而言,该方法还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合,从而得到组合物,所述组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸。
对于某些实施例(包括任何一种包含细胞、病毒、或它们的组合的上述实施例)而言,所述细胞、病毒、或它们的组合为细胞。对于这些实施例中的某些而言,细胞为细菌细胞。该细菌可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。对于这些实施例中细菌细胞结合到固定金属支承材料的某些实施例而言,在存在pH值为4.5至9的结合缓冲液的情况下,细菌细胞结合到固定金属支承材料。对于这些实施例中的某些而言,pH值为4.5至6.5。
在一个实例中,结合缓冲液为约0.1M、pH值为约5.5的MES。可以包括用于改善流动和混合的非离子表面活性剂,例如PLURONICL64(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物,得自BASF(Mt.Olive,NJ))或TRITON X-100(异辛基苯基聚氧乙烯(10)醚,得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))。表面活性剂还可以减少或抑制细菌细胞的凝块。其他可相似地使用的缓冲液包括琥珀酸、乙酸酯、或柠檬酸盐。
对于某些实施例(包括任何一种包括提供组合物的上述方法,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸)而言,该方法还包括分离a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸与b)包含样品材料的上清液,所述样品材料具有量有所减少的至少一种双链多核苷酸。对于这些实施例中的某些实施例而言,该方法还包括用pH值为4.5至9的水性缓冲溶液来洗涤所分离的结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸。对于这些实施例中的某些而言,该水性缓冲溶液的pH值为4.5至6.5。
洗涤缓冲液的例子包括:MES缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、TAPS缓冲液、以及DIPSO(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)缓冲液。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法,其中包含结合到固定金属支承材料上的经分离的至少一种双链多核苷酸)而言,该方法还包括扩增结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,从而得到多种扩增子。在此可使用已知的扩增方法,例如上文所述的适用于扩增DNA的那些方法,例如PCR或TMA。扩增可包括一种或多种酶的参与,例如,用于PCR的热稳定DNA聚合酶,或用于TMA的RNA聚合酶和反转录酶。扩增子可选自由结合到固定金属支承材料的扩增子、未结合的扩增子、以及它们的组合组成的组。作为另外一种选择,该方法还包括从固定金属支承材料上释放结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸;以及从固定金属支承材料上分离至少一种双链多核苷酸。对于这些实施例中的某些实施例而言,该方法还包括扩增至少一种双链多核苷酸。从而提供多种扩增子。对于这些实施例中的某些而言,随着双链多核苷酸的结合或分离,扩增包括将双链多核苷酸加热到至少一个约37至100℃的温度。对于这些实施例中的某些而言,扩增包括将双链多核苷酸加热至约94至97℃的温度。在此温度下,DNA的两条链分开,从而得到单链DNA模板。扩增还可包括在另外的温度下加热,例如在约37至74℃的温度下加热。在这些温度下,可将引物退火至DNA模板,并且通过存在的酶使所得的经退火的引物沿着DNA模板延伸。对于这些实施例中的某些而言,扩增包括在约40至65℃、约55至65℃、约58至62℃、或约60℃的温度下加热。退火和延伸均可在这些温度下进行。然而,可以使用另外的温度来优化所用的特定酶的温度。例如,可以使用约70至74℃的额外温度进行延伸。可以用已知的方法重复循环这些温度或温度范围,以有助于扩增多核苷酸。作为另外一种选择,对于这些实施例中的某些而言,随着双链多核苷酸的结合或分开,扩增包括将双链多核苷酸加热至约37至44℃的温度,例如约42℃。在这些可保持恒定的温度下,诸如RNA聚合酶和反转录酶等酶可以生成RNA扩增子,从而得到高水平的扩增。任选地,在扩增前可以将双链多核苷酸加热至更高的温度(例如约55至100℃)。
对于某些实施例(包括任何一种包括提供组合物的上述方法,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸)而言,该方法还包括分离a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸与b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有量有所减少的至少一种多核苷酸。对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括用pH值为4.5至9的水性缓冲溶液来洗涤所分离的固定金属支承材料(带有结合的多核苷酸)。对于这些实施例中的某些而言,该水性缓冲溶液的pH值为4.5至6.5。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法,其中包含结合到固定金属支承材料上的经分离的至少一种多核苷酸)而言,该方法还包括扩增结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,从而得到多种扩增子。在此可使用已知的扩增方法,例如上文所述的那些方法,例如PCR或TMA。扩增子可选自由结合到固定金属支承材料的扩增子、未结合的扩增子、以及它们的组合组成的组。作为另外一种选择,该方法还包括从固定金属支承材料上释放结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸;以及从固定金属支承材料上分离至少一种多核苷酸。对于这些实施例中的某些而言,该方法还包括扩增至少一种多核苷酸。从而提供多种扩增子。对于这些实施例中的某些而言,随着多核苷酸的结合或分离,扩增包括将该多核苷酸加热到至少一个约37至100℃的温度。对于这些实施例中多核苷酸为双链的某些实施例而言,扩增包括加热至如上文所述的约94至97℃的温度。无论多核苷酸为单链或双链,扩增还可包括在另外的温度下加热,例如在约37至74℃的温度下加热。在这些温度下,可将引物退火至多核苷酸模板,并且通过存在的酶使所得的经退火的引物沿着多核苷酸模板延伸。对于这些实施例中的某些而言,扩增包括在约40至65℃、约55至65℃、约58至62℃、或约60℃的温度下加热。退火和延伸均可在这些温度下进行。然而,可以使用另外的温度来优化所用的特定酶的温度。例如,可以使用约70至74℃的额外温度进行延伸。可以用已知的方法重复循环这些温度或温度范围,以有助于扩增多核苷酸。作为另外一种选择,对于这些实施例中的某些而言,随着多核苷酸的结合或分开,扩增包括将多核苷酸加热至约37至44℃的温度,例如约42℃。在这些可保持恒定的温度下,诸如RNA聚合酶和反转录酶等酶可以生成RNA扩增子,从而得到高水平的扩增。任选地,在扩增前可以将多核苷酸加热至诸如约55至100℃的温度,例如60℃。对于这些实施例中的某些而言,所述至少一种多核苷酸为单链多核苷酸。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法,所述方法包括通过扩增结合到固定金属支承材料的多核苷酸或双链多核苷酸来提供多种扩增子)而言,该方法还包括从固定金属支承材料上分离扩增子。在固定金属支承材料的量足以结合大部分扩增子的情况下,该方法可以包括从固定金属支承材料上释放并分离扩增子,以及任选地从固定金属支承材料上释放并分离结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸或双链多核苷酸。对于这些实施例中的某些实施例而言,在pH值为7至10的情况下释放扩增子,以及任选地释放至少一种多核苷酸或双链多核苷酸。
可使用洗提试剂来释放或洗提扩增子和多核苷酸。合适的洗提试剂的例子包括:TES缓冲液、DIPSO缓冲液、TEA缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、POPSO缓冲液、麦黄酮缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(bicine buffer)、TAPS缓冲液、氢氧化铵、以及氢氧化钠。对于某些实施例(包括任何一种上述实施例,其中包括释放扩增子和/或至少一种多核苷酸或至少一种双链多核苷酸)而言,用选自由磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、以及氢氧化钠组成的组的洗提试剂来进行释放。对于这些实施例中的某些而言,洗提试剂为磷酸盐缓冲液或Tris-EDTA缓冲液。
对于某些实施例(包括其中包括扩增至少一种双链多核苷酸的任何一种上述方法)而言,该方法还包括检测至少一种双链多核苷酸。
对于某些实施例(包括其中包括扩增至少一种多核苷酸的任何一种上述方法)而言,该方法还包括检测至少一种多核苷酸。
可以用探针通过发出荧光来检测扩增产物(扩增子),并由此产生可检测信号,该信号的强度取决于发出荧光的探针分子数量。探针分子可以由具有荧光基团和淬灭基团的低聚核苷酸构成。当在结合到扩增子后或在核酸扩增酶裂解结合到扩增子的探针后进行淬灭基团和荧光基团的分离或拆分时,探针可以发出荧光。作为另外一种选择,结合到扩增子的探针可以在暴露于适当波长的光后发出荧光。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,y为3或4。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,My+为Zr4+或Ga3+。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,My+为Zr4+。
对于某些实施例(包括任何一种上述方法)而言,所述方法在微流体装置内实施。
在另一个实施例中,提供了用于处理样品材料的装置,该装置具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,该固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个第二腔室,所述第二腔室与第一腔室分开并能够接收和容纳来自至少一个第一腔室的流体、固定金属支承材料、或它们两者;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
用于处理样品材料的装置可以提供一个或多个场所和条件用于样品制备、核酸扩增、和/或检测的。样品材料可以位于一个或多个腔室中。该装置可以对一个或多个腔室提供均匀、准确的温度控制。该装置可以提供腔室之间的通道,使得(例如)样品制备可以在一个或多个腔室中进行,并且核酸扩增和检测可以在一个或多个其他腔室中进行。对于某些实施例(包括其中包括用于处理样品材料的装置的任何一个上述实施例)而言,用于处理样品材料的装置为微流体装置。微流体装置的一些例子在以下文献中有所描述:美国专利公开No.2002/0064885(Bedingham等人);US2002/0048533(Bedingham等人);US2002/0047003(Bedingham等人);以及US2003/138779(Parthasarathy等人);美国专利No.6,627,159、6,720,187、6,734,401、6,814,935、6,987,253、7,026,168、以及7,164,107;以及国际专利公开No.WO2005/061084 A1(Bedingham等人)。
一种用于处理样品材料的示例性装置为图1中示出的微流体装置。装置10可以为如图1所示的圆盘形,但也可使用其他形状。优选的形状为可以旋转的形状。图1中的装置10包括第一腔室100和第二腔室200,第二腔室200可以通过通道300与第一腔室100流体连接。腔室100和200的形状可以为如图1所示的圆形,但也可以使用其他形状,例如椭圆形、泪滴形、三角形、以及许多其他形状。图1示出一个腔室100和腔室200的组合,但应当理解装置10中可以包括多个这种组合,并且期望多个组合能够同时处理多个样品。
图1中示出的装置10包括腔室100中的固定金属支承材料50。固定金属支承材料50可以为图1中以小圆示出的多个磁性或非磁性粒子,例如微粒(微球、微珠等)、树脂粒子等。作为另外一种选择,根据上述所采用的基底,固定金属支承材料可以为过滤器、玻璃料、薄膜、多根纤维、载玻片等形式。在另一个替代形式中,固定金属支承材料可以为腔室100的内壁。
在腔室100中进行样品制备,例如结合细胞或病毒、裂解、消化来自细胞或病毒的碎屑、结合多核苷酸、洗涤等,然后把腔室100中的材料通过通道300移入腔室200。在通过结合到固定金属支承材料而将多核苷酸从样品材料上分离之后,可以将固定金属支承材料移至腔室200,或者可以从固定金属支承材料上洗提出多核苷酸,然后将所得的洗提液移至腔室200。通道300可以为腔室100中的流体和/或固定金属支承材料提供进入腔室200的路径。这可以通过(例如)向流体和/或粒子形式的固定金属支承材料施加足够的重力,迫使材料穿过通道300并进入腔室200来进行。作为另外一种选择,可以通过(例如)减小腔室200中的压力、增加腔室100中的压力,或通过这两者来向腔室300施加压差,从而使腔室100中的材料穿过通道300并进入腔室200。腔室100或通道300可以配备可任选的阀门150。阀门150可以制作成在受到足够的重力、熔融、蒸发等情况下打开。例如,阀门可以制作成隔膜形式,其中开口可以通过激光器烧蚀、聚焦的光学加热、或类似方法来形成。此类阀门在(例如)美国专利申请公开No.2005/0126312 A1(Bedingham等人)和2005/0142571 A1(Parthasarathy等人)中有所描述。
虽然图1中未示出,但腔室100和200以及通道300可以与其他腔室、通道、贮存器等流体连接。可以使用这些部件来有助于根据需要向腔室100或200提供或从中移除多种试剂、样品材料、或样品材料的组分。例如,可以向腔室100提供或从中移除样品材料、裂解试剂、消化试剂、洗涤缓冲液、结合缓冲液、洗脱缓冲液等,并且可以向腔室200提供引物、三磷酸核苷酸、扩增酶、探针、缓冲液等。可以将单独的试剂或试剂组合放入不同的腔室(无论是在装置10中或本文所述装置的任何实施例中),以便随后根据需要使这些试剂与样品材料或样品材料的组分接触。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,至少一个第一腔室还含有裂解试剂。裂解试剂可以包括上述裂解试剂的任何一种或任何组合。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,使多种细胞结合到固定金属支承材料上。对于这些实施例中的某些而言,细胞为细菌细胞。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,使至少一种多核苷酸结合到固定金属支承材料上。对于这些实施例中的某些实施例而言,至少一种多核苷酸为至少一种双链多核苷酸。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例,其中使至少一种多核苷酸结合到固定金属支承材料上)而言,第一腔室还含有pH值为4.5至6.5的上清液。对于这些实施例中的某些而言,上清液的pH值为5至6。对于这些实施例中的某些而言,上清液中包含的可测量含量的任何盐不是无机盐或含1至4个碳原子的盐。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例,其中使至少一种双链多核苷酸结合到固定金属支承材料上)而言,第一腔室还含有pH值为4.5至9的上清液。对于这些实施例中的某些而言,上清液的pH值为5.5至8.0。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,y为3或4。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,My+为Zr4+或Ga3+。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,My+为Zr4+。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,该装置为微流体装置。
对于某些实施例(包括任何一个用于处理样品材料的装置的上述实施例)而言,该装置的至少一个腔室含有至少一种附加试剂,所述附加试剂可用于核酸操纵技术的至少一个步骤中。对于这些实施例中的某些而言,至少一种附加试剂可用于样品制备步骤、核酸扩增步骤、和/或核酸检测或分析方法中的检测步骤。样品制备可以包括(例如)捕获含核酸的生物材料、洗涤含核酸的生物材料、裂解含核酸的生物材料(例如细胞或病毒)、消化细胞碎屑、从生物样品中隔离、捕获、或分离至少一种多核苷酸或核酸、和/或洗提核酸。核酸扩增可以包括(例如)生成数量足够用于检测的多核苷酸的互补多核苷酸或多核苷酸的一部分。检测包括(例如)进行观测,例如检测荧光,所述荧光表明多核苷酸的存在和/或多核苷酸的量。对于这些实施例中的某些而言,该装置的至少一个腔室含有至少一种附加试剂,所述附加试剂选自由下列组成的组:核酸扩增酶、低聚核苷酸、探针、三磷酸核苷酸、缓冲液、盐、表面活性剂、染料、核酸对照物、还原剂、牛血清白蛋白、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、以及它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,该装置的至少一个腔室含有至少一种附加试剂,所述附加试剂选自由核酸扩增酶、低聚核苷酸、探针、三磷酸核苷酸、缓冲液、以及盐组成的组。
“核酸扩增酶”是指可以催化现有的DNA或RNA模板产生多核苷酸或核酸的酶。对于某些实施例而言,核酸扩增酶为可以在扩增核酸或核酸的一部分的方法中使用的酶。对于某些实施例而言,核酸扩增酶选自由DNA和/或RNA聚合酶以及反转录酶组成的组。对于某些实施例而言,DNA聚合酶选自由Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、以及Pfu DNA聚合酶组成的组。对于这些实施例中的某些而言,反转录酶选自由AMV反转录酶、M-MLV反转录酶、以及M-MLV反转录酶RNase H-组成的组。反转录病毒的反转录酶,例如M-MLV和AMV,具有RNA指导的DNA聚合酶活性、DNA指导的聚合酶活性、以及RNase H活性。对于某些实施例而言,核酸扩增酶为DNA聚合酶或RNA聚合酶。对于某些实施例而言,核酸扩增酶为Taq DNA聚合酶。对于某些实施例而言,核酸扩增酶为T7RNA聚合酶。
“低聚核苷酸”可以为引物、终止低聚核苷酸、延伸低聚核苷酸、或启动子低聚核苷酸。对于某些实施例而言,低聚核苷酸为引物。此类低聚核苷酸通常由15至30个核苷酸单元构成,这些核苷酸单元确定待扩增核酸的区域(靶序列)。在适当条件下,引物中的碱基结合到所关注的区域中的互补碱基上,然后核酸扩增酶延伸由靶序列确定的引物。许多引物是已知的并可以商购获得,并且可以使用已知方法来设计和制作其他引物。
可以用探针通过发出荧光来检测扩增产物(扩增子),并由此产生可检测信号,该信号的强度取决于发出荧光的探针分子数量。探针分子可以由低聚核苷酸和耦合有淬灭基团的荧光基团构成。当在结合到扩增子后或在核酸扩增酶裂解结合到扩增子的探针后进行淬灭基团和荧光基团的分离或拆分时,探针可以发出荧光。作为另外一种选择,结合到扩增子的探针可以在暴露于适当波长的光后发出荧光。对于某些实施例(包括任何一个上述实施例)而言,探针选自由TAQMAN探针(Applied Biosystems,Foster City,CA)、分子信标、SCORPIONS探针(Eurogentec Ltd.,Hampshire,UK)、SYBR GREEN(Invitrogen,Carlsbad,CA)、FRET杂交探针(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)、Quantitect探针(Qiagen,Valencia,CA)、以及分子炬组成的组。
三磷酸核苷酸(NTP)根据需要包括三磷酸核糖核苷酸和三磷酸脱氧核糖核苷酸,它们用于通过核酸扩增酶由现有的DNA或RNA模板制备多核苷酸或核酸。例如,在扩增DNA时使用dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷酸)组,所述dNTP组通常包括dATP(2′-脱氧腺苷5′-三磷酸)、dCTP(2′-脱氧胞苷5′-三磷酸)、dGTP(2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸)、以及dTTP(2′-脱氧胸苷5′-三磷酸)。
用缓冲液来调节反应介质的pH值。已知有各种各样的缓冲液并且可商购获得。例如,吗啉缓冲液(如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES))可适用于提供约5.0至6.5的有效pH值范围,咪唑缓冲液可适用于提供约6.2至7.8的有效pH值范围,而三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液和某些哌嗪缓冲液(如N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(2-乙磺酸)(HEPES))可适用于提供约7.0至9.0的有效pH值范围。缓冲液可以影响核酸扩增酶(例如聚合酶)的活性和保真性。对于某些实施例而言,缓冲液选自至少一种可以将pH值调节在7.5至8.5范围内的缓冲液。对于这些实施例中的某些而言,所述缓冲液为TRIS型缓冲液。对于这些实施例中的某些实施例而言,所述缓冲液选自由TRIS-EDTA、TRIS缓冲盐水、TRIS乙酸-EDTA、以及TRIS硼酸-EDTA中的至少一种组成的组。这些缓冲液可以包含诸如表面活性剂和洗涤剂等其他物质,例如CHAPS或下述表面活性剂。缓冲液可以不含RNase和DNase。
盐可以影响核酸扩增酶的活性。例如,游离的镁离子对于某些聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的活性而言是必要的。又如,在存在锰离子的情况下,通过用RNA作为模板,Tfl DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶可以催化核苷酸聚合形成DNA。在其他实例中,某些盐(例如氯化钾)的存在可以增加诸如Taq DNA聚合酶等某些聚合酶的活性。对于某些实施例(包括任何一个上述实施例)而言,盐选自由镁盐、锰盐、锌盐、钠盐、以及钾盐中的至少一种组成的组。对于这些实施例中的某些而言,盐为氯化镁、氯化锰、硫酸锌、乙酸锌、氯化钠、以及氯化钾中的至少一种。对于这些实施例中的某些而言,盐为氯化镁。
例如,在诸如微流体装置等装置中可以加入表面活性剂,以便裂解细胞或消除细胞凝块、改善混合、增大流体流。表面活性剂可以为非离子型,例如以(例如)商品名PLURONIC得到的聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)共聚物、聚乙二醇(PEG)、以商品名TWEEN 20得到的聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯、以商品名Triton X-100得到的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇;阴离子型,例如月桂基硫酸锂、N-月桂酰肌氨酸钠盐、以及十二烷基硫酸钠;阳离子型,例如烷基吡啶鎓和季铵盐;两性离子型,例如N-(C10-C16烷基)-N,N-二甲基甘氨酸甜菜碱(甜菜碱类表面活性剂);和/或含氟表面活性剂,例如FLUORAD-FS 300(3M,St.Paul,MN)和ZONYL(Dupont de Nemours Co.,Wilmington,DEL)。
试剂层中可以加入染料,以使得试剂层或接触该试剂层的流体具有色彩或荧光。色彩或荧光可以提供表明试剂层已溶解、分散、或悬浮在接触该试剂层的流体中的视觉迹象或可检测的光吸收或光发射。对于某些实施例而言,染料选自由诸如荧光素、花青素(包括Cy3和Cy5)、Texas Red、ROX、FAM、JOE、SYBR Green、OliGreen、以及HEX等荧光染料组成的组。除了这些荧光染料之外,还可以使用紫外光/可见光染料(例如二氯苯酚、靛酚、番红精、结晶紫)以及市售的食用色素。
核酸对照物为已知量的核酸或含核酸材料,所述材料与样品制备试剂或扩增试剂或检测试剂一起彻底干燥。此内部对照物可以用于监控试剂完整性以及来自样品材料或标本的抑制。线性化的质粒DNA对照物通常用作核酸内部对照物。
还原剂为能够还原二硫键的物质,例如能还原存在于样品材料或标本中的蛋白质中的二硫键,从而降低粘度并且改善样品材料的流动特性和混合特性。对于某些实施例而言,还原剂优选地包含至少一个硫醇基团。还原剂的例子包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、以及2-巯基乙胺。
在核酸扩增时可使用牛血清白蛋白来稳定酶;可以使用二甲基亚砜(DMSO)来抑制DNA模板中二级结构的形成;甘油可以改善扩增过程,可以用作防腐剂,并且可以稳定诸如聚合酶等酶;乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′N′-四乙酸(EGTA)可以用作金属离子螯合剂,还可用于使破坏反应的金属结合酶(RNase)失活。
在另一个实施例中,提供了用于从样品材料中分离至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括:
具有至少一个能够容纳或引导流体的腔室的装置;
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
至少一种选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、以及洗脱缓冲液组成的组的试剂。对于此试剂盒的某些实施例而言,至少一个腔室含有固定金属支承材料。对于这些实施例中的某些而言,固定金属支承材料基底选自由层析柱内壁、过滤器、微板、微量过滤板、微量滴定板、玻璃料、吸头、薄膜、多个微球、多根纤维、以及载玻片组成的组。
在另一个实施例中,提供了用于从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括用于处理样品材料的装置的任何一个上述实施例,所述试剂盒具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,该固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个与第一腔室分开并能够接收和容纳来自至少一个第一腔室的流体、固定金属支承材料、或它们两者的第二腔室;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。对于这些实施例中的某些而言,试剂盒还包括试剂,所述试剂选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、以及它们的组合组成的组。对于这些实施例中的某些而言,至少一个第一腔室含有至少一种试剂,所述试剂选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、以及它们的组合组成的组。对于这些实施例中的某些实施例而言,至少一种多核苷酸为至少一种双链多核苷酸。
对于某些实施例(包括任何一个上述组合物、方法、装置、或试剂盒实施例)而言,固定金属支承材料基底为多个微球。对于这些实施例中的某些而言,微球具有磁性。对于这些实施例中的某些而言,微球的直径为0.1至10微米(μ)。
对于某些实施例(包括包括样品材料的任何一个上述方法、装置、或试剂盒实施例)而言,样品材料选自由食物样品、鼻腔样品、喉部样品、唾液样品、血样、伤口样品、腹股沟样品、腋窝样品、会阴样品、以及粪便样品组成的组。对于某些实施例而言,样品材料为鼻腔样品、粪便样品、或血样。对于某些实施例而言,样品材料为粪便样品。对于某些实施例而言,样品材料为血样。
在另一个实施例中,提供了结合微生物的组合物,该组合物包含:包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组,并且其非特异性地结合到固定金属支承材料的多种微生物;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
在另一个实施例中,提供了分离微生物的方法,该方法包括:提供包含具有基底的固定金属支承材料的组合物,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;提供可能具有选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组的多种微生物的样品;以及使组合物与样品接触;其中来自样品的多种微生物的至少一部分非特异性地结合到固定金属支承材料;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
对于某些实施例(包括上述分离微生物的方法)而言,该方法还包括在来自样品的多种微生物的至少一部分非特异性地结合到固定金属支承材料之后,从其余的样品中分离固定金属支承材料。对于这些实施例中的某而言,该方法还包括检测多种微生物的至少一部分。对于这些实施例中的某些而言,通过选自由生物发光三磷酸腺苷(ATP)检测法、聚二乙炔(PDA)比色检测法、核酸检测法、免疫学检测法、基于生长的检测法、显微镜目测法、磁阻法、以及表面声波检测法组成的组的检测方法来进行检测。
ATP检测可以用作微生物负载的非特异性指标。在从其余样品(可能包含干扰组分,例如细胞外ATP)中分离具有非特异性结合的微生物的固体载体之后,将微生物裂解并与荧光素和荧光素酶接触。然后用(例如)光度计测量所得的生物发光,所述生物发光的强度与所捕获的微生物数量成比例。
可以使用PDA比色检测法,通过比色传感器与微生物接触来检测特定微生物或微生物光谱。比色传感器包括受体和聚合组合物,所述聚合组合物包含丁二炔配混物或聚二乙炔。当微生物被受体结合时,所得的传感器构象变化引起可测量的色彩变化。色彩变化可通过(例如)视觉测量或使用色度计来测量。还可以使用能结合到受体的探针进行间接微生物检测。使用此类比色传感器的PDA比色检测法是已知的,并且在(例如)美国专利申请公开No.2006/0134796A1、国际公开No.WO 2004/057331A1和WO 2007/016633A1、以及受让人共同未决的美国专利申请No.60/989298中有所描述。
用于检测核酸(包括DNA和RNA)的方法通常包括,将所捕获的微生物裂解使细胞的核酸可用于检测之后扩增或杂交上述核酸。
免疫学检测法包括检测作为细菌表面上的标记物的生物分子(例如蛋白质、蛋白聚糖、或其他具有抗原活性的物质)。抗原物质的检测通常通过抗体、选自诸如噬菌体显示等处理的多肽、或来自筛选处理的核酸配体。免疫学检测法是已知的,该方法的例子包括免疫沉淀法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。可以用多种方法来检测抗体结合,包括用荧光染料、量子点、或可以产生化学发光或色彩变化的酶来标记一级抗体或二级抗体。已经使用了读板仪与侧流装置来检测和量化结合现象。
基于生长的检测法是熟知的,并且通常包括平板涂布微生物,在特定条件下培养微生物以增加微生物数量,以及枚举微生物。PETRIFILM菌落总数测试片(PETRIFILM Aerobic Count Plates)(3M公司,St.Paul,MN)可用于此用途。
磁阻检测法通过检测磁性粒子产生的磁场来进行检测。
用于检测微生物的表面声波检测法也是已知的,并且在(例如)国际公开No.WO 2005/071416中有所描述。例如,体声波阻抗传感器已用于检测固体培养基表面上的微生物生长和数量。可以通过此方法检测的微生物的浓度范围为每毫升3.4×102至6.7×106个细胞。参见Le Deng et al.,J.Microbiological Methods,Vol.26,Iss.10-2,197-203(1997)(Le Deng等人,《微生物方法》1997年第26卷10-2期,第197-203页)。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,y为3或4。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,My+为Zr4+、Ga3+、或Fe3+。对于这些实施例中的某些而言,My+为Zr4+或Ga3+。对于这些实施例中的某些而言,My+为Zr4+。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,多种微生物包括两种或更多种不同类型的细菌、酵母、霉菌、或它们的组合。对于这些实施例中的某些而言,多种微生物包括两种或更多种不同类型的细菌。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,微生物选自由芽孢杆菌(Bacillus)、博德特氏杆菌(Bordetella)、疏螺旋体菌(Borrelia)、弯曲菌(Campylobacter)、梭状芽胞杆菌(Clostridium)、棒状杆菌(Cornyebacteria)、肠杆菌(Enterobacter)、肠球菌(Enterococcus)、埃希氏杆菌(Escherichia)、螺杆菌(Helicobacter)、军团菌(Legionella)、李斯特氏菌(Listeria)、分枝杆菌(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、弧菌(Vibrio)、耶尔森氏菌(Yersinia)、念珠菌(Candida)、青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、枝孢菌(Cladosporium)、镰刀菌(Fusarium)、以及它们的组合组成的组。对于仅包括细菌的上述实施例而言,不包括念珠菌、青霉菌、曲霉菌、枝孢菌、以及镰刀菌。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,微生物包括沙门氏菌、大肠杆菌(E.coli)、弯曲菌、李斯特氏菌、或它们的组合。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,固定金属支承材料的基底选自由小珠、凝胶、薄膜、薄板、膜、粒子、纤维、过滤器、平板、条带、管、层析柱、孔、容器壁、毛细管、吸头、以及它们的组合组成的组。对于这些实施例中的某些而言,基底为磁性粒子。对于这些实施例中的某些而言,磁性粒子的直径为约0.02至约5微米。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,组合物的pH值为4.5至6.5。已经发现,在此pH值范围内微生物有效地结合到固定金属支承材料。对于某些实施例而言,pH值优选地为5至6或为约5.5。
对于某些检测方法而言,可以优选地在不存在支承材料的情况下进行检测。PDA传感器(例如)会受到磁性粒子存在的强烈影响。对于某些实施例(包括上述分离微生物的方法)而言,该方法还包括通过将pH值升高到8至10,在一些实施例中升高到约9,来从固定金属支承材料上释放微生物。
当M为锆时,已发现可以在更广泛的pH值范围(例如约4.5至约9的范围)内进行有效的微生物结合。通常,在更高的pH值下,锆比其他金属离子更有效。对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,M为锆,并且组合物的pH值为4.5至9。
对于某些实施例(包括上述结合微生物的组合物和分离微生物的方法)而言,样品选自由临床样品、食物样品、以及环境样品组成的组。这些样品可以是未加工的样品或此前已加工的样品。对于这些实施例中的某些而言,所述样品为食物样品。
实施例列表
以下为上文所述的某些实施例的列表,其中“emb”表示“实施例”,而“embs”表示“多个实施例”。
1.一种组合物,包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
2.一种组合物,包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;并且
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
3.emb 2的组合物,其中所述组合物中包含的可测量含量的任何盐不是无机盐或含1至4个碳原子的盐。
4.emb 2或emb 3的组合物,其中所述组合物的pH值为5至6。
5.embs 1至4中任何一个的组合物,其中所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
6.embs 1至5中任何一个的组合物,其中M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
7.embs 1至6中任何一个的组合物,其中y为3或4。
8.embs 1至7中任何一个的组合物,其中My+为Zr4+或Ga3+。
9.一种从样品材料中分离并任选地分析至少一种双链多核苷酸的方法,包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
10.一种从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的方法,包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
在pH值为4.5至6.5下,使样品材料与结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+接触,从而得到组合物,该组合物包含a)结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,该样品材料具有减少量的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;并且
其中该组合物的pH值为4.5至6.5。
11.emb 10的方法,其中所述组合物中包含的可测量含量的任何盐不是无机盐或含1至4个碳原子的盐。
12.emb 10或emb 11的方法,其中所述组合物的pH值为5至6。
13.embs 9至12中任何一个的方法,其中所述样品材料包括含有核酸的生物材料。
14.emb 13的方法,其中所述样品材料包含多种细胞、病毒、或它们的组合。
15.emb 14的方法,还包括向所述样品材料中加入裂解试剂,然后使该样品材料与多种结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的金属离子My+接触。
16.emb 14的方法,其中当使所述样品材料与多种结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的金属离子My+接触时,使所述样品材料与裂解试剂接触。
17.emb 14的方法,其中使所述样品材料与多种结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的金属离子My+接触形成a)结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分,以及b)包含样品材料的上清液,所述样品材料具有数量有所减少的细胞、病毒、或它们的组合。
18.emb 17的方法,还包括将包含具有数量有所减少的细胞、病毒、或它们的组合的样品材料的上清液与结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分分离。
19.emb 18的方法,还包括洗涤结合到固定金属支承材料的细胞、病毒、或它们的组合。
20.emb 19的方法,还包括分析结合到固定金属支承材料的细胞、病毒、或它们的组合。
21.emb 19的方法,还包括从固定金属支承材料上分离细胞、病毒、或它们的组合。
22.emb 21的方法,还包括分析细胞、病毒、或它们的组合。
23.emb 17或emb 18的方法,还包括向结合到固定金属支承材料的多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分中添加裂解试剂。
24.emb 16或emb 23(均根据emb 9)的方法,还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合从而得到组合物,该组物包含a)至少一种结合到固定金属支承材料的双链多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,所述样品材料具有数量有所减少的所述至少一种双链多核苷酸。
25.emb 16或emb 23(均根据emb 10、11、和12中的任何一个)的方法,还包括裂解细胞、病毒、或它们的组合从而得到组合物,该组合物包含a)至少一种结合到固定金属支承材料的多核苷酸,以及b)包含样品材料的上清液,所述上清液具有数量有所减少的所述至少一种多核苷酸。
26.embs 14至25中任何一个的方法,其中所述细胞、病毒、或它们的组合为细胞。
27.emb 26的方法,其中所述细胞为细菌细胞。
28.emb 27(根据emb 17)的方法,其中细菌细胞在存在pH值为4.5至9的结合缓冲液的情况下结合到固定金属支承材料上。
29.emb 28的方法,其中所述pH值为4.5至6.5。
30.embs 9、24、以及26和27(根据emb 24)中任何一个的方法,还包括将a)至少一种结合到固定金属支承材料的双链多核苷酸与b)包含样品材料的上清液,所述样品材料具有数量有所减少的所述至少一种双链多核苷酸。
31.embs 10、11、12、25、以及26和27(根据emb 19)中任何一个的方法,还包括将a)至少一种结合到固定金属支承材料的多核苷酸与b)包含样品材料的上清液,所述样品材料具有数量有所减少的所述至少一种多核苷酸。
32.emb 30的方法,还包括用pH值为4.5至9的水性缓冲溶液洗涤所分离的结合到固定金属支承材料的至少一种双链多核苷酸。
33.emb 31的方法,还包括用pH值为4.5至6.5的水性缓冲溶液洗涤所分离的结合到固定金属支承材料的至少一种多核苷酸。
34.emb 30或emb 32的方法,还包括扩增结合到固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸,从而得到多种扩增子。
35.emb 34的方法,其中扩增包括将双链多核苷酸加热至约94至97℃的温度。
36.emb 34或emb 35的方法,其中扩增包括将双链多核苷酸加热至约60℃的温度。
37.emb 34的方法,其中扩增包括将双链多核苷酸加热至约37至44℃的温度。
38.emb 37的方法,其中在扩增前将双链多核苷酸加热至约60℃的温度。
39.embs 34至38中任何一个的方法,还包括从固定金属支承材料上分离扩增子。
40.emb 31或emb 33的方法,还包括扩增结合到固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸,从而得到多种扩增子。
41.emb 40的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约94至97℃的温度。
42.emb 40的方法,其中所述至少一种多核苷酸为单链多核苷酸。
43.emb 41或emb 42的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约60℃的温度。
44.emb 40或emb 42的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约37至44℃的温度。
45.emb 44的方法,其中在扩增前将所述至少一种多核苷酸加热至约60℃的温度。
46.embs 40至45中任何一者的方法,还包括从固定金属支承材料上分离扩增子。
47.emb 30或emb 32的方法,还包括从固定金属支承材料上释放结合到固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸;以及
从固定金属支承材料上分离所述至少一种双链多核苷酸。
48.emb 47的方法,还包括扩增所述至少一种双链多核苷酸。
49.emb 48的方法,其中扩增包括将所述双链多核苷酸加热至约94至97℃的温度。
50.emb 49的方法,其中扩增包括将所述双链多核苷酸加热至约60℃的温度。
51.emb 48的方法,其中扩增包括将所述双链多核苷酸加热至约37至44℃的温度。
52.emb 51的方法,其中在扩增前将所述双链多核苷酸加热至约60℃的温度。
53.embs 39、以及48至52中任何一个的方法,还包括检测所述至少一种双链多核苷酸。
54.emb 31或emb 33的方法,还包括从固定金属支承材料上释放结合到固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸;并且
从固定金属支承材料上分离所述至少一种多核苷酸。
55.emb 54的方法,其中在pH值为7至10的情况下释放结合到固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸。
56.emb 54或emb 55的方法,其中使用洗提试剂来释放结合到固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸,该洗提试剂选自由磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、以及氢氧化钠组成的组。
57.embs 54、55、以及56中任何一个的方法,还包括扩增所述至少一种多核苷酸。
58.emb 57的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约94至97℃的温度。
59.emb 57的方法,其中所述至少一种多核苷酸为单链多核苷酸。
60.emb 58或emb 59的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约60℃的温度。
61.emb 57或emb 59的方法,其中扩增包括将所述至少一种多核苷酸加热至约37至44℃的温度。
62.emb 61的方法,其中在扩增前将所述至少一种多核苷酸加热至约60℃的温度。
63.embs 46、以及57至62中任何一个的方法,还包括检测所述至少一种多核苷酸。
64.embs 9至63中任何一个的方法,其中所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
65.embs 9至64中任何一个的方法,其中M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
66.embs 9至65中任何一个的方法,其中y为3或4。
67.embs 9至66中任何一个的方法,其中My+为Zr4+或Ga3+。
68.embs 9至67中任何一个的方法,其中My+为Zr4+。
69.embs 9至68中任何一个的方法,其中所述方法在微流体装置内实施。
70.一种用于处理样品材料的装置,该装置具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,该固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个第二腔室,所述第二腔室与第一腔室分开并能够接收和容纳来自至少一个第一腔室的流体、固定金属支承材料、或它们两者;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组y为3至6的整数;并且x为1或2。
71.emb 70的装置,其中所述至少一个第一腔室还包含裂解试剂。
72.emb70或emb 71的装置,其中多种细胞结合到固定金属支承材料上。
73.embs 70至72中任何一个的装置,其中至少一种多核苷酸结合到固定金属支承材料上。
74.emb 73的装置,其中所述至少一种多核苷酸为至少一种双链多核苷酸。
75.emb 73的装置,其中所述第一腔室还包含pH值为4.5至6.5的上清液。
76.emb 75的装置,其中所述上清液的pH值为5至6。
77.emb 74的装置,其中所述第一腔室还包含pH值为4.5至9的上清液。
78.emb 77的装置,其中所述上清液的pH值为5.5至8.0。
79.emb 75或emb 76的装置,其中上清液中包含的可测量含量的任何盐不是无机盐或含1至4个碳原子的盐。
80.embs 70至79中任何一个的装置,其中所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
81.embs 70至80中任何一个的装置,其中M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
82.embs 70至81中任何一个的装置,其中y为3或4。
83.embs 70至82中任何一个的装置,其中My+为Zr4+或Ga3+。
84.embs 70至83中任何一个的装置,其中My+为Zr4+。
85.embs 70至84中任何一个的装置,其中所述装置为微流体装置。
86.一种用于从样品材料中分离至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括:
具有至少一个能够容纳或引导流体的腔室的装置;
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
至少一种选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、以及洗脱缓冲液组成的组的试剂。
87.emb 86的试剂盒,其中所述至少一个腔室包含固定金属支承材料。
88.emb 86或emb 87的试剂盒,其中所述至少一个腔室为层析柱。
89.emb 86或emb 87的试剂盒,其中所述至少一个腔室位于微流体装置内。
90.emb 86或emb 87的试剂盒,其中所述固定金属支承材料基底选自由层析柱内壁、过滤器、微孔板、微孔滤板、微量滴定板、玻璃料、吸头、薄膜、多个微球、多根纤维、以及载玻片组成的组。
91.一种用于从样品材料中分离并任选地分析至少一种多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括embs 70至85中任何一个的装置。
92.emb 91的试剂盒,还包括试剂,该试剂选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、以及它们的组合组成的组。
93.emb 92的试剂盒,其中至少一个第一腔室含有至少一种试剂,该试剂选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、以及它们的组合组成的组。
94.embs 86至93中任何一个的试剂盒,其中所述至少一种多核苷酸为至少一种双链多核苷酸。
95.embs 1至8中任何一个的组合物,或embs 9至69中任何一个的方法,或embs 70至85中任何一个的装置,或embs 86至94中任何一个的试剂盒,其中所述固定金属支承材料基底为多个微粒。
96.emb 95的组合物,或emb 95的方法,或emb 95的装置,或emb 95的试剂盒,其中所述微粒具有磁性。
97.embs 95和96中任何一个的组合物,或embs 95和96中任何一个的方法,或embs 95和96中任何一个的装置,或embs 95和96中任何一个的试剂盒,其中所述微粒的直径为0.1至10微米。
98.embs 9至69以及embs 95至97中任何一个的方法,或embs 70至85以及embs 95至97中任何一个的装置,或embs 86至94以及embs95至97中任何一个的试剂盒,其中所述样品材料选自由食物样品、鼻腔样品、喉部样品、唾液样品、血样、伤口样品、腹股沟样品、腋窝样品、会阴样品、以及粪便样品组成的组。
99.一种组合物,包含:
包括基底的固定金属支承材料,该基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
多种微生物,所述多种微生物选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组,并且非特异性地结合到固定金属支承材料;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
100.一种分离微生物的方法,包括:
提供包含具有基底的固定金属支承材料的组合物,所述基底具有多个结合到该基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;
提供可能具有多种微生物的样品,所述多种微生物选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组;以及
使所述组合物与所述样品接触;其中来自样品的多种微生物的至少一部分非特异性地结合到固定金属支承材料;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
101.emb 100的方法,还包括在来自样品的多种微生物的至少一部分非特异性地结合到固定金属支承材料之后将固定金属支承材料与剩余样品分离。
102.emb 101的方法,还包括检测所述多种微生物的至少一部分。
103.emb 102的方法,其中通过选自由下列组成的组的检测方法来进行检测:三磷酸腺苷(ATP)生物发光检测法、聚二乙炔(PDA)比色检测法、核酸检测法、免疫学检测法、基于生长的检测法、显微镜目测法、磁阻法、以及表面声波检测法。
104.emb 99的组合物或embs 100至103中任何一个的方法,其中M选自由锆、镓、以及铁组成的组。
105.emb 99或emb 104的组合物或embs 100至104中任何一个的方法,其中y为3或4。
106.embs 99、104或105中任何一个的组合物或embs 100至105中任何一个的方法,其中My+为Zr4+、Ga3+、或Fe3+。
107.emb 99以及embs 104至106中任何一个的组合物或embs 100至106中任何一个的方法,其中所述多个-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团为多个-C(O)O-基团。
108.emb 99和embs 104至107中任何一个的组合物或embs 100至107中任何一个的方法,其中所述多种微生物包括两种或更多种不同类型的细菌、酵母、霉菌、或它们的组合。
109.emb 99以及embs 104至108中任何一个的组合物或embs 100至108中任何一个的方法,其中所述微生物选自由芽孢杆菌、博德特氏杆菌、疏螺旋体菌、弯曲菌、梭状芽胞杆菌、棒状杆菌、肠杆菌、肠球菌、埃希氏杆菌、螺杆菌、军团菌、李斯特氏菌、分枝杆菌、奈瑟氏球菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、耶尔森氏菌、念珠菌、青霉菌、曲霉菌、枝孢菌、镰刀菌、以及它们的组合组成的组。
110.emb 109的组合物或emb 109的方法,其中所述微生物包括沙门氏菌、大肠杆菌、弯曲菌、李斯特氏菌、或它们的组合。
111.embs 99以及104至110中任何一个的组合物或embs 100至110中任何一个的方法,其中所述基底选自由小珠、凝胶、薄膜、薄板、膜、粒子、纤维、过滤器、平板、条带、管、层析柱、孔、容器壁、毛细管、吸头、以及它们的组合组成的组。
112.emb 111的组合物或emb 111的方法,其中所述基底为磁性粒子。
113.emb 112的组合物或emb 112的方法,其中所述磁性粒子的直径为约0.02至约5微米。
114.embs 99以及104至113中任何一个的组合物或embs 100至113中任何一所述的方法,其中所述组合物的pH值为4.5至6.5。
115.embs 100至114中任何一个的方法,还包括通过将pH值从8升至10来从固定金属支承材料上释放微生物。
116.embs 99以及104至113中任何一个的组合物或embs 100至113中任何一个的方法,其中M为锆,并且所述组合物的pH值为4.5至9。
117.embs 100至116中任何一个的方法,其中所述样品选自由临床样品、食物样品、以及环境样品组成的组。
通过以下实例进一步说明本发明的目标和优点,但不应该将在这些实例中列举的具体材料及其用量以及其他的条件和细节理解为对本发明的不当限制。
实例
实例1:金属离子介导的磁性微粒的制备
金属离子介导的磁性微粒(用作固定金属支承材料)由直径约1μm的具有表面羧酸基团的磁性粒子(DYNABEADS MYONE羧酸,得自Invitrogen,Carlsbad,CA)或得自Thermo Scientific(称为Seradyn,Indianapolis,IN)的SERA-MAG磁性粒子制备。将羧化磁性微粒置于试管内,使用磁体将它们吸引到试管壁进行洗涤,通过抽吸除去液体,用洗涤溶液置换液体空间,将试管移出磁场,再搅拌试管以重新悬浮微粒。
在金属离子处理之前,用pH值为5.5的0.1M MES缓冲液(包含0.1% TRITON X-100)洗涤磁性微粒两次,然后重新悬浮于相同的缓冲液中。洗涤后,向磁性微粒悬浮液中加入每毫克磁性微粒0.2mL的0.1M硝酸镓(III)、或硝酸铁或硝酸锆(IV)在0.01M的HCl中的溶液。在室温下将混合物轻轻振摇1h,随后用上述MES缓冲液洗涤以除去多余的金属离子。将所得的金属离子介导的磁性微粒(Ga(III)-微粒-1、Fe(III)-微粒-1、Zr(IV)-微粒-1、Ga(III)-微粒-2、Fe(III)-微粒-2、以及Zr(IV)-微粒-2)重新悬浮并在4℃下保存于MES缓冲液中。DYNABEADSMYONE羧酸用于制备微粒-1,而SERA-MAG磁性粒子用于制备微粒-2。
实例2:用于DNA捕获和释放的金属离子比较
在本实验中,将得自实例1的40μg Ga(III)-微粒-1与40μg Fe(III)-微粒-1用于分组实验,以结合pH值为5.5的MES缓冲液中的105cfu当量的MRSA DNA(约1.8ng)。上清液命名为SN0。然后,用MES缓冲液洗涤微粒两次,收集每次的上清液(分别命名为SN1和SN2)。为了洗提结合的DNA,将微粒重新悬浮在20mM的磷酸钠缓冲液(PO4,pH 8.5)中,并加热至95℃维持5分钟。收集上清液(命名为SN3)用于mecA-FAM RT-PCR分析。
使用下列最佳浓度的引物、探针和酶以及热循环,对5微升的各样品(SN3)进行mecA基因的实时PCR扩增。下文列出的所有引物和探针的序列以5′→3′的取向给出,并且是已知的而且在Francois,P.,et al.,Journal of Clinical Microbiology,2003,volume 41,254-260(Francois,P.等人,临床微生物学杂志,2003年,第41卷,第254-260页)中有所描述。正向mecA引物为CATTGATCGCAACGTTCAATTT(序列标识号:1)。mecA反向引物为TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA(序列标识号:2)。mecA探针序列TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT(序列标识号:3)通过6-羧基荧光素(FAM)和IBFQ(IOWA BLACK FQ,Integrated DNA Technologies,Corniville,IA)分别在5′-和3′-位置进行双重标记。在包含5μL样品和5μL下列混合物的10μL总体积中进行PCR扩增:两种引物(各0.5μL,均为10μM)、探针(1μL,2μM)、MgCl2(2μL,25mM)以及LightCycler DNA Master杂交探针(1μL,10x,Roche,Indianapolis,IN)。使用以下方案,在LightCycler 2.0实时PCR系统(Roche)上进行扩增:95℃下30秒(变性);45次PCR循环,每次95℃下0秒(比降20℃/秒),60℃下20秒(比降20℃/秒,单次采集)。
将由DNA(等同于结合实验中使用的量)构成的对照样品分别悬浮于MES与磷酸盐缓冲液中。对照DNA样品未与金属离子介导的微粒反应。
表1示出了mecA PCR分析数据。SN0、SN1、以及SN2样品中的高循环阈值(Ct)(相对于对照样品)表明DNA的大量捕获。SN3样品中的类似Ct值(相对于对照样品)表明捕获的DNA的大量释放。
表1.PCR分析数据(样品悬浮于100μL缓冲液中,取5μL所得样品与5μL PCR Master混合物进行PCR扩增。)通过每个样品的两次重复的PCR反应记录Ct值。“Neg”结果表示在进行的45次循环中无可测量的Ct值。
实例3:通过PicoGreen分析定量DNA结合效率和洗提效率
PicoGreen为定量溶液中的dsDNA的常用方法(Nakagawa等人,Biotech & Bioeng.2006,94(5),862-868)。选择λDNA作为展示捕获和释放效率的模型。将得自PicoGreen分析试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)的λDNA在1×TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.0)中从8μg/mL至0.25μg/mL稀释两倍。将100μL的各DNA溶液加入到包含400μgGa(III)-微粒-2的100μL 0.1M的MES缓冲液(pH 5.5)中,然后充分混合10分钟。随后用MES缓冲液将微粒洗涤两次。加入100μl 20mM的磷酸钠缓冲液(pH 8.5),并在65℃下将悬浮液加热5分钟以从微粒上释放DNA。
在另一个实验中,首先在95℃下使DNA变性5分钟,然后立即置于冰上以生成单链DNA。在0℃下于MES中将单链DNA与400μgGa(III)-微粒-2混合10分钟。用MES将微粒洗涤两次后,向微粒中加入100μL 20mM的PO4缓冲液,然后在65℃下将悬浮液加热5分钟以从微粒上释放DNA。再将分离的磷酸盐上清液(SN3)在65℃下孵育1h,使DNA退火。通过PicoGreen分析来定量重新形成的dsDNA。
表2示出了DNA的结合和释放数据。400μg Ga(III)-微粒-2可以吸附大约800ng的ssDNA或dsDNA,捕获效率为约94-99%。表2中的第二列和第四列(从左起)表明从微粒上十分有效地洗提了双链DNA和单链DNA。
表2.通过PicoGreen分析定量的Ga(III)-微粒-2对λDNA的捕集/ 释放效率。下面给出的结果为三次重复分析的平均值。
DNA(μg) | 捕获百分比(dsDNA) | 回收百分比(dsDNA) | 捕获百分比(ssDNA) | 回收百分比(ssDNA) |
800 | 93.62 | 81.72 | 97.42 | 87.34 |
400 | 99.71 | 84.68 | 99.47 | 82.97 |
200 | 99.75 | 81.13 | 99.28 | 79.98 |
100 | 99.69 | 83.86 | 98.82 | 73.60 |
50 | 99.48 | 81.34 | 97.72 | 73.11 |
25 | 99.33 | 81.12 | 96.02 | 89.64 |
实例4:洗脱缓冲液对DNA释放的影响
在具有实例2所述的Ga(III)-微粒-1的MES缓冲液或Tris(10mM,pH值8.5)中进行DNA结合实验。在DNA结合处理之后,用MES缓冲液(0.1M,pH值5.5)、Tris缓冲液(10mM,pH值8.5)、或TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸盐,1mM EDTA,pH值8.5)洗涤Ga(III)-微粒/DNA复合物两次,然后用Tris、TAE、或PO4缓冲液(20mM磷酸钠,pH值8.5)洗提。在一些情况下,洗提工序包括在95℃下将悬浮液加热5分钟。在其他情况下,将悬浮液在室温下保持5分钟以便从微粒上洗提DNA。
如实例2所述的那样,将包含经洗提的DNA的上清液(SN3)用于mecA RT-PCR分析。如实例2所述的那样制备对照样品。
表3中示出的所得的PCR分析数据表明加热与洗脱缓冲液的组成均能影响从小珠上释放DNA的效率。除非用水作为洗脱缓冲液,否则加热会提高从小珠上洗提DNA的效率。在加热条件下,Tris与Tris-乙酸盐缓冲液都能使DNA完全洗提。在室温下,观察到与较高Ct值相对应的相对较小的DNA释放量。磷酸盐缓冲液提供有效的DNA洗提,并且在结合加热的情况下甚至更加有效。
表3.40μg Ga(III)-微粒-1与1.8ng MRSA DNA(等同于105cfuMRSA)的混合物的洗出液的RT-PCR Ct值。通过每个样品的两次重复的PCR反应记录Ct值。所用缓冲液:Tris为10mM Tris-HCl,pH值8.5;TAE为40mM Tris-乙酸盐、1mM EDTA,pH值8.5;PO4为20mM磷酸钠,pH值8.5。
实例5:DNA捕获和释放的孵育时间
在诸如微流应用等某些过程中,DNA捕获和释放的孵育时间可能是重要参数。根据实例2中的工序,用Ga(III)-微粒-1孵育1.8ng DNA(等同于大约105cfu MRSA),孵育时间为1至10分钟的各种时间长度。用MES洗涤缓冲液洗涤微粒之后,加入磷酸盐缓冲液(PO4),在95℃下洗提结合的DNA,洗提时间为1至10分钟的各种时间长度。通过根据实例2的mecA RT-PCR分析来检测上清液。
表4示出PCR分析的Ct值。结果表明使样品结合1至10分钟并洗提10分钟,样品的Ct值并无差异。另外,数据表明对于结合时间为10分钟的样品而言,在1分钟内已在95℃的磷酸盐缓冲液中大量洗提了DNA。
表4.结合和洗提时间对从Ga(III)-微粒上回收DNA的影响。记录 两次重复实验的Ct值。
实例6:具有Ga(III)-微粒-1与未处理的DYNABEADS MYONE
的MRSA DNA系列稀释液
由于临床样品负载中的DNA量可变性极高,因此可以采用广泛DNA浓度范围内的捕获和洗提。本实验中,将MRSA DNA的系列稀释液结合到Ga(III)-微粒-1和未处理的DYNABEADS MYONE羧酸磁性小珠(命名为“对照物”)。具体地讲,在1×TEP缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH值8.5,以及0.2% PLURONIC L64(BASF,Mt.Olive,NJ))中对MRSA DNA进行10倍系列稀释,从等同于每毫升基因组拷贝数(gc/mL)的5×106cfu/mL稀释至5×103cfu/mL。然后将10μL的每种MRSA DNA稀释液加入90μL含60μg Ga(III)-微粒的100mM MES缓冲液(pH值5.5)中。经过15分钟的轻微漩涡后,洗涤微粒悬浮液并且如实例2所述的那样回收上清液。第二次洗涤后,使微粒在100μL20mM的磷酸盐缓冲液(pH值8.5)中重新悬浮,并在95℃下加热10分钟。立即分离加热后的微粒混合物,并收集最终上清液(SN3)用于RT-PCR分析,使用实例2中描述的mecA-FAM分析。
表5示出mecA-FAM PCR分析数据。从Ga(III)-微粒上洗提的DNA(SN3)的所有量表现出与DNA对照物(磷酸盐中)样品类似的Ct值,这表明在这些条件下特定MRSA特异性DNA可以大量结合和释放。所有SN0(“未结合DNA”)上清液主要表现负Ct值,表明Ga(III)-微粒能够在这些实验中测定的DNA浓度范围内结合和洗提。另外,从未处理的微球上洗提的DNA(SN3)的所有量主要表现阴性值(大于或等于30的Ct值),而SN0上清液表现出与DNA对照物(磷酸盐)样品类似的Ct值,表明极少量的DNA结合到未经Ga(III)离子预处理的羧化微粒。
表5:用mecA-FAM PCR分析检测由Ga(III)-微粒和未处理的羧化 微粒捕获和洗提的MRSA DNA。在一些情况下,记录两次重复实验的 Ct值。
实例7:存在MRSE DNA情况下的MSSA DNA检测
能够辨识复杂样品中的稀有菌种是有用的,而在存在对靶菌种具有高DNA同源性的另外菌种的情况下尤其如此。本实验中,在存在耐甲氧西林(Methicillin)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,MRSE)的情况下分析对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,MSSA)。在存在恒定量的MRSE DNA(105cfu当量DNA)的情况下,将105cfu当量的MSSA DNA稀释10倍。将DNA混合物与40μg Ga(III)-微粒-1在MES中孵育并用MES洗涤两次,然后如实例6那样释放结合的DNA,并将磷酸盐缓冲液洗出液用于RT-PCR分析。执行SAfemA PCR以检测MSSA中存在的SAfemA基因。用下列引物、探针和酶的最佳浓度以及热循环来执行SAfemA PCR分析工序。下列所有引物和探针的序列均给定为5′→3′取向并且已知。(参见Francois,P.,et al.,Journal of Clinical Microbiology,2003,volume41,254-260(Francois,P.等人,《临床微生物学杂志》,2003年第41卷,第254-260页)。)正向SAfemA引物为TGCCTTACAGATAGCATGCCA(序列标识号:4)。SAfemA反向引物为AGTAAGTAAGCAAGCTGCAATGACC(序列标识号:5)。通过荧光素(FAM)与IBFQ分别在5′-与3′-位置双重标记SAfemA探针序列TCATTTCACGCAAACTGTTGGCCACTATG(序列标识号:6)。在包含5μL样品和5μL混合物的10μL总体积中进行PCR扩增,所述混合物包含两种引物(每种0.5μL,10μM)、探针(1μL,2μM)、MgCl2(2μL,25mM)、以及LightCycler DNA Master杂交探针(LightCyclerDNA Master Hybridization Probes)(1μL,10×,Roche,Indianapolis,IN)。在LightCycler 2.0(Roche)上按照如下所述进行扩增:95℃下30秒;95℃下0秒、60℃下20秒,循环45次。使用实例2中描述的mecA PCR分析来检测MRSE中的mecA基因。
表6示出两次分析的Ct值。数据表明在每个反应存在5×103cfuMRSE的情况下(将100μL SN3上清液中的5μL用于PCR反应)可以检测到大约5cfu MSSA。这些实验中检测到的被分析物/干扰菌种(即,MSSA∶MRSE)的最高比率为大约1∶1000。从微粒上洗提的DNA的Ct值总是与来自对照物DNA混合物(无微粒)的Ct值相匹配。mecA分析的相对恒定的Ct值验证了每个样品中存在一致量的MRSE。
表6.在存在恒定的高背景(10 5 基因组拷贝数)MRSE DNA情况 下检测MSSA基因组。
实例8:内部对照物质粒DNA的检测
在遗传分析中,内部对照物(IC)测试通常用于检验正确的样品处理和功能分析试剂、微流体转移、以及仪表设备。将Ga(III)-微粒作为试剂时,Ga(III)-微粒可以用于捕获和释放IC DNA,所述IC DNA通常为共价闭合环状质粒DNA。本实验中,在1×TEP缓冲液中将106gc/mL的IC质粒DNA(用SAfemA RT-PCR分析中所用的随机SAfemA探针序列通过克隆SAfemA扩增子来制备)10倍系列稀释至103gc/mL。将10μL的每种IC质粒DNA稀释液添加到90μL含60μg Ga(III)-微粒-1的100mM MES缓冲液(pH值5.5)中。经过15分钟的轻微漩涡后,洗涤微粒,并且如实例2所述的那样收集上清液。第二次洗涤后,使微粒在100μL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH值8.5)中重新悬浮,并在95℃下加热5分钟。立即分离经过加热的微粒混合物,并且收集SN3上清液。使用如实例2所述的相同PCR方案来分析所有上清液。将用于如实例7所描述的SAfemA的相同引物与在5′-与3′-位置分别具有FAM和IBFQ(用于内部对照物DNA)的双重标记随机探针序列(TCATTTCACGCAAACTGTTGGCCACTATG)(序列标识号:6)用于PCR扩增。
表7示出IC-SAfemA PCR分析数据。从Ga(III)-微粒上洗提的样品(SN3)表现与DNA对照样品相似的Ct值,表明在这些工序中可以使用Ga(III)-微粒来结合和洗提SAfemA IC质粒DNA。
表7.使用IC-SAfemA PCR分析检测由Ga(III)-微粒捕获和洗提的 内部对照物(IC)质粒DNA。在一些情况下,记录两次重复实验的Ct值。
实例9:MRSA的提取及随后与Ga(III)-微粒的结合
本实验中,DNA提取自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC菌株#BAA-43(美国标准生物品保藏中心(American Type CultureCollection);Manassas,VA)(MRSA),所用提取方法有两种:溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法或仅用溶葡萄球菌酶的方法。随后将通过这些工序释放的DNA结合到Ga(III)-微粒-1并从Ga(III)-微粒-1上回收。用于本实验的对照物由使用溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法从MRSA上提取而之后不结合到Ga(III)-微粒-1上的DNA组成。
在37℃下于胰酪胨大豆肉汤/0.2% PLURONIC L64(TSBP)中过夜培养MRSA。然后,在TEP缓冲液中将过夜培养物从2.3×107cfu/mL至2.3×103cfu/mL 10倍系列稀释。
对于溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法而言,用26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)处理66.7μL的每种MRSA稀释液,并且在室温下保持5分钟,然后加入6.7μL的20mg/mL蛋白酶K,并且将该混合物在65℃下孵育10分钟并随后在98℃下孵育10分钟。对于仅用溶葡萄球菌酶的方法而言,将66.7μL的每种MRSA稀释液与26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶混合,并且在室温下保持5分钟。然后,将通过这些工序释放的DNA与6μL的100mM MES缓冲液(pH值5.5)混合,该MES缓冲液含有60μg的Ga(III)-微粒-1(如实例1所描述的那样制备)。
对于对照方法而言,采用此前描述的溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法处理66.7μL的每种MRSA稀释液,其之后不结合到Ga(III)-微粒-1。
经过5分钟的轻微漩涡后,分离微粒混合物并且将上清液(SN0)移除并丢弃。然后,用100μL的TEP缓冲液将微粒洗涤两次。第二次洗涤后,使微粒在100μL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH值8.5)中重新悬浮,并在95℃下加热5分钟,收集上清液(SN3)用于使用如上所描述的mecA-FAM分析进行的RT-PCR分析。
表8示出mecA-FAM PCR分析数据。通过提取方法得到的对照物DNA样品表现出不规则的剂量反应Ct趋势(未观察到对于每个1∶10稀释液的预期约3.32的Ct偏移)。当与对照物DNA样品相比时,通过洗提与来自溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法的DNA反应的微粒获得的样品表现出改善的、更加一致的剂量反应Ct趋势(观察到对于每个1∶10稀释液的预期约3.32的Ct偏移)。然而,通过洗提与来自仅用溶葡萄球菌酶的方法的DNA反应的微粒获得的样品(SN3)表现出偏移的、不规则的剂量反应Ct趋势(未观察到对于每个1∶10稀释液的预期约3.32的Ct偏移,并且每个1∶10稀释点的Ct值都偏离了预期值)。
表8:使用mecA-FAM PCR分析检测由Ga(III)-微粒捕获和洗提的 从MRSA提取的DNA。记录两次重复实验的Ct值。
实例10:同时进行MRSA提取和与具有溶葡萄球菌酶Ga(III)-
微粒结合
在单个微流体腔室中使输入样品提取和与Ga(III)-微粒-1结合同时进行可以是有利的。本实验中,从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC BAA-43上提取DNA并同时将DNA结合到Ga(III)-微粒-1上,随后进行或不进行蛋白酶K处理。将这些同时提取和结合的方法与实例9中所述的溶葡萄球菌酶/蛋白酶K提取,然后结合到Ga(III)-微粒-1的对照方法进行对比。
如实例9中所述将MRSA过夜培养。然后,在TEP缓冲液中将过夜培养物从1.4×106cfu/mL至1.4×102cfu/mL10倍系列稀释。
对于对照方法而言,如实例9中所述,采用溶葡萄球菌酶/蛋白酶K方法处理66.7μL的每种MRSA稀释液,并随后结合到Ga(III)-微粒-1上。对于顺序裂解/DNA结合/消化方法而言,将66.7μL的每种MRSA稀释液与26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶混合,在室温下保持5分钟,与6μL含60μg Ga(III)-微粒-1(按实例1所述制备)的100mM MES缓冲液(pH值5.5)混合,在室温下轻微漩涡5分钟,与6.7μL蛋白酶K混合,并且在65℃孵育10分钟并随后在98℃下孵育10分钟。对于同时进行裂解和DNA结合方法而言,将26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶与含有6μL含60μg Ga(III)-微粒-1的100mM MES缓冲液(pH值5.5)混合,并且在室温下轻微漩涡5分钟。然后将此混合物加入66.7μL的每种MRSA稀释液,并且在室温下轻微漩涡5分钟。
轻微漩涡5分钟后,将微粒混合物洗涤两次,用磷酸盐缓冲液洗提DNA,然后根据实例9中的方法收集最终上清液(SN3)。然后,如实例2所述的那样,使用mecA-FAM分析通过RT-PCR对所有样品进行扩增并定量。
表9示出mecA-FAM PCR分析数据。从同时进行裂解和DNA结合的样品中洗提的样品(SN3)表现出与顺序提取/DNA结合样品类似的Ct结果,表明可以在单个步骤中完成细菌的裂解和与微粒的结合。此外,从同时进行裂解和DNA结合的样品中洗提的样品(SN3)表现出与顺序裂解/DNA结合/消化的样品类似的Ct结果,表明对于提取和结合到具有溶葡萄球菌酶的Ga(III)-微粒-1而言,蛋白酶K不是必要的。
表9:使用mecA-FAM PCR分析检测由具有溶葡萄球菌酶的 Ga(III)-微粒-1捕获和洗提的从MRSA提取的DNA。记录两次重复实 验的Ct值。
实例11:MRSA培养物、Ga(III)-微粒与MagNA Pure的比较
本实验中,将使用Ga(III)-微粒-2同时进行MRSA裂解和MRSADNA结合的方法与使用MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(MagNAPure LC DNA Isolation Kit III)(细菌、真菌)试剂盒(仪器和试剂得自Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)从MRSA纯培养物分离核酸的Roche MagNA Pure LC系统进行直接比较。如实例9所述那样过夜培养MRSA(ATCC #BAA-43)。然后,在TEP缓冲液中将过夜培养物从1.3×107cfu/mL至1.3×102cfu/mL10倍系列稀释。
对于MagNA Pure样品而言,遵循制造商对于DNA纯化的说明,不同的是增加下列附加步骤以提高从细菌回收DNA的回收率:将80μL的每种MRSA稀释液与20μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶混合,并且在37℃下孵育30分钟。然后根据制造商的说明,在完成DNA提取之后,将100μL样品与130μL细菌裂解缓冲液和20μL蛋白酶K(试剂盒提供)混合,形成250μL的总输入体积,并洗提成100μL的洗提体积。
对于同时进行裂解和DNA结合的样品而言,如实例10所述,将80μL的每种MRSA稀释液与10μL的100mM MES缓冲液(pH值5.5)混合,该MES缓冲液包含与26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶预混合的100μg Ga(III)-微粒-2。轻微漩涡5分钟后,将微粒混合物洗涤两次,用磷酸盐缓冲液洗提DNA,然后根据实例9中的方法收集最终上清液(SN3)。然后,如实例2所述的那样,使用mecA-FAM分析通过RT-PCR对所有样品进行扩增并定量。
表10示出mecA-FAM PCR分析数据。从同时进行裂解和DNA结合的样品中洗提的样品(SN3)始终表现出比MagNA Pure样品更低的Ct结果,表明同时进行裂解和结合的方法比经过修改的MagNA Pure方法能够更加有效地捕获和/或释放DNA。
表10:使用mecA-FAM PCR分析对同时进行裂解和DNA与 Ga(III)-微粒-2结合的方法与MagNA Pure作为从MRSA纯培养物分离 核酸的方法进行比较。记录两次重复实验的Ct值。
实例12:使用Ga(III)-微粒与MagNA Pure从临床鼻腔拭子样品提
取和检测金黄色葡萄球菌(SA)的比较
对于临床拭子样品而言,在捕获和洗提过程中克服(例如)鼻腔粘液中的PCR抑制剂会非常有利。本实验中,使用实例10的同时进行裂解和DNA结合的工序来捕获和洗提两位不同患者的已知为SA阳性的拭子样品,该样品通过微生物培养法验证。
选择两位患者进行金黄色葡萄球菌研究。用普通拭子从鼻孔收集标本,并且在研究前保存于-80℃下(每位患者的两个拭子称为1-1、1-5与2-1、2-5)。培养物研究显示这两位患者为金黄色葡萄球菌阳性。首先用410μL TEP溶液通过漩涡60秒来洗提每个鼻腔拭子样品。对于每次测试,将80μL拭子洗出液与包含溶于TEP的100μg Ga(III)-微粒-2和9μg溶葡萄球菌酶的160μL液体混合。将混合物在室温下孵育5分钟并不时地轻微摇振,然后用磁性方式分离。倒出上清液,并用100μLTEP将剩余微粒洗涤两次。最后,使微粒在100μL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH值8.5)中重新悬浮,并在97℃下加热10分钟。将所得的上清液用磁性方式分离,然后用于PCR分析。
对于对照MagNA pure样品而言,通过10倍稀释将培养物MRSA样品在80μL TEP中从148,000cfu稀释至148cfu。在每种MRSA样品中加入5ng溶葡萄球菌酶,并轻微搅拌后在37℃下孵育30分钟。然后,将130μL细菌裂解缓冲液(MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III)和20μL蛋白酶K(相同试剂盒提供)加入样品并轻微搅拌,随后在95℃下孵育10分钟。遵循Roche的MagNA Pure LC仪器上的制造商说明来完成DNA提取。
如实例7中所述完成SA-femA qPCR分析。
表11中,从本实验收集的数据显示通过Ga(III)-微粒-2和MagNApure方法得到的Ct值十分接近。从这两位患者的样品未观察到显著的抑制作用。根据MRSA的参考标号,每个拭子具有大约1.4×105cfu的金黄色葡萄球菌。
表11:使用SAfemA-FAM PCR分析检测由具有溶葡萄球菌酶的 Ga(III)-微粒-2从鼻腔拭子样品(已知的培养物SA阳性)中捕获和洗 提的从MRSA提取的加标DNA。记录两次重复实验的Ct值。
实例13:MRSA结合到Ga(III)-微粒和Zr(IV)-微粒上
本实验中,使用1mL的反应体积在TEP中或在100mM MES(pH值5.5)/0.2% PLURONIC L64(MESP)缓冲液中将MRSA捕获到Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2上。如实例1中所述制备Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2。
如实例9中所述那样在TSBP肉汤中过夜培养MRSA。然后,在TEP缓冲液中通过10倍系列稀释将过夜培养物分别稀释至大约1.5×103cfu/mL和1.5×102cfu/mL的最终浓度。对于TEP和MESP样品而言,用990μL TEP或MESP缓冲液将10μL的每种MRSA稀释液分别进一步稀释。对于MRSA捕获而言,将包含100μg Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2的10μL MES缓冲液分别加入每个样品,并在室温下将该混合物轻微漩涡15分钟。将微粒混合物分离,洗涤两次,重新悬浮,将适当体积的每种溶液涂布到血琼脂平板上,在37℃下孵育平板18小时,并且随后枚举菌落,从而定量每种悬浮液中的MRSA。
表12示出所得的平板计数数据。在低pH值(MES)缓冲液条件下,Ga(III)-微粒-2和Zr(IV)-微粒-2上的细菌捕获率有所提高。具体地讲,Ga(III)-微粒-2在TEP缓冲液中的细菌捕获率可忽略不计,而在MES缓冲液中却表现出99%的细菌捕获率。Zr(IV)-微粒-2在TEP缓冲液中表现出89%的细菌捕获率,而在MES缓冲液中却表现出100%的细菌捕获率。
表12:使用1mL反应体积在TEP或MESP缓冲液中MRSA结合 到Ga(III)-微粒-2和Zr(IV)-微粒-2上的平板计数数据。标准溶液示出在 初始经洗涤的细菌悬浮液中的细菌数。
实例14:MRSA结合、裂解、以及将DNA捕获到Ga(III)-微粒和
Zr(IV)-微粒上
本实验中,将MRSA捕获到Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2上,用酶裂解(在微粒上)以释放细菌DNA,然后将该DNA再次捕获到相同微粒上。随后,从微粒上洗提DNA,通过实例2所述的mecA-FAMRT-PCR工序来定量。
如实例11所述那样,将MRSA过夜培养并在TEP缓冲液中从2.0×107cfu/mL至2.0×103cfu/mL10倍系列稀释。将每种MRSA稀释液的等分试样(10μL)用990μL的MESP缓冲液进一步稀释,并与包含100μgGa(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2微粒的10μL MES缓冲液混合,然后如实例13所述那样在室温下轻微漩涡5分钟并洗涤。然后,添加26.7μL的250μg/mL溶葡萄球菌酶,并且在室温下将混合物轻微漩涡5分钟。此方法称为顺序法。
对于对照样品而言,同时进行MRSA裂解和将释放的DNA结合到Ga(III)-微粒-2上(同时法)。将溶葡萄球菌酶(26.7μL,250μg/mL)与10μL包含100μg Ga(III)-微粒-2微粒的MES缓冲液混合,并且在室温下轻微漩涡5分钟。然后,将此混合物加入用90μL的TEP缓冲液进一步稀释的10μL的每种MRSA稀释液,并在室温下轻微地漩涡5分钟。
轻微漩涡5分钟之后,将用于两个方法的微粒混合物分离,并且将上清液(SN0)移除并丢弃。然后,如实例13所述的那样,用100μL的TEP缓冲液将微粒洗涤两次。第二次洗涤之后,如实例2所述那样,使微粒在100μL磷酸盐缓冲液中重新悬浮,在95℃下加热10分钟,分离,然后收集上清液(SN3)用于mecA-FAM RT-PCR分析。
表13示出mecA-FAM RT-PCR定量分析数据。顺序法样品的洗出液表现出与同时法样品类似的Ct结果,表明细菌被顺序地捕获到微粒上并且随后在微粒上裂解,然后释放的DNA被再次捕获到相同的微粒上。此外,具有Zr(IV)-微粒-2的顺序法样品的洗出液的Ct结果总是略微小于具有Ga(III)-微粒-2的顺序法样品,表明Zr(IV)-微粒可以更有效地捕获细菌和/或DNA。
表13:将MRSA顺序地捕获到微粒上并随后在微粒上裂解,然后 将释放的DNA再次捕获到相同微粒上之后,使用mecA-FAM RT-PCR 检测Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2的DNA洗出液。
实例15:MRSA结合到Ga(III)-微粒上
本实验中,在TEP中将MRSA(ATCC BAA-43)捕获到Ga(III)-微粒上。如实例1中所述制备Ga(III)-微粒-2。
如实例9中所述那样在TSBP肉汤中过夜培养MRSA。然后,在TEP缓冲液中通过10倍系列稀释将过夜培养物分别稀释至大约1.5×103cfu/mL和1.5×102cfu/mL的最终浓度。对于MRSA捕获而言,将包含100μg Ga(III)-微粒-2的10μL MES缓冲液分别加入10mL的每种MRSA稀释液,并且在室温下将混合物轻微漩涡15分钟。分离微粒混合物,并移除上清液(SN0)。用100μL TEP缓冲液将微粒洗涤两次,漩涡,分离,并移除上清液(SN1和SN2)。第二次洗涤之后,使微粒在100μL的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8.5)(PB缓冲液)中重新悬浮。将适当体积的每种溶液涂布到血琼脂平板上,在37℃下孵育平板18小时,并且随后枚举菌落,从而定量捕获的MRSA和每种上清液中的MRSA。
表14示出所得的平板计数数据。Ga(III)-微粒-2在1.5×103cfu时捕获大约26%的细菌,而在1.5×102cfu时捕获30%的细菌。
表14:使用1mL反应体积在TEP缓冲液中MRSA结合到Ga(III)- 微粒-2上的平板计数数据。标准溶液示出在初始经洗涤的细菌悬浮液 中的细菌数。
实例16:MRSA结合到Ga(III)-微粒和Zr(IV)-微粒上
本实验中,使用1mL的反应体积在TEP缓冲液和10mM Tris-HCl(pH值8.5)/0.2% PLURONIC L64(TP)缓冲液中将MRSA捕获到Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2上。如实例1中所述制备Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2。
如实例9中所述那样在TSBP肉汤中过夜培养MRSA。然后,通过10倍系列稀释将过夜培养物在TEP缓冲液中稀释至1.5×103cfu/mL的最终浓度,并在TP缓冲液中将其稀释至2.3×103cfu/mL的最终浓度。对于MRSA捕获而言,将包含100μg Ga(III)-微粒-2或Zr(IV)-微粒-2的10μL MES缓冲液分别加入1mL的每种MRSA稀释液,并在室温下将混合物轻微漩涡15分钟。分离微粒混合物,并移除上清液(SN0)。分别用100μL TEP或TP缓冲液将微粒洗涤两次,漩涡,分离,并移除上清液(SN1和SN2)。第二次洗涤之后,使微粒在100μL的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8.5)(PB缓冲液)中重新悬浮。将适当体积的每种溶液涂布到血琼脂平板上,在37℃下培养平板18小时,并且随后枚举菌落,从而定量捕获的MRSA和每种上清液中的MRSA。
表15示出所得的平板计数数据。在TEP缓冲液中,Ga(III)-微粒-2和Zr(IV)-微粒-2均能更加有效地捕获细菌。
表15:使用1mL反应体积在TEP或TP缓冲液中MRSA结合到 Ga(III)-微粒-2和Zr(IV)-微粒-2上的平板计数数据。标准溶液示出在初 始经洗涤的细菌悬浮液中的细菌数。预计计数为10 3 cfu。
实例17:MRSA结合到Ga(III)-微粒上并从Ga(III)-微粒释放MRSA
本实验中,使用1mL反应体积在MESP缓冲液中将MRSA(ATCCBAA-43)捕获到Ga(III)-微粒-2上,随后用高pH值和/或竞争试剂缓冲液从小珠上释放MRSA(ATCC BAA-43)。如实例1中所述制备Ga(III)-微粒-2。
如实例9中所述那样在TSBP肉汤中过夜培养MRSA。然后,在TEP缓冲液中通过10倍系列稀释将过夜培养物稀释至大约2.04×104cfu/mL的最终浓度。对于MRSA捕获而言,将10μL的MRSA稀释液与990μL的100mM MES(pH值5.5)/0.2% PLURONIC L64(MESP)缓冲液和10μL包含100μg Ga(III)-微粒的MES缓冲液混合,并在室温下将混合物轻微漩涡15分钟。分离微粒混合物,并移除上清液。用100μL MESP缓冲液将微粒洗涤两次,漩涡,分离,并移除上清液。第二次洗涤之后,通过漩涡使微粒重新悬浮于100μL的100mM磷酸盐缓冲液(pH值7.0)/0.2% PLURONIC L64、100μL的100mM磷酸盐缓冲液(pH值9.5)/0.2% PLURONIC L64、100μL的10mM Tris-HCl(pH值9.5)/0.2% PLURONIC L64、或100μL的10mM EDTA(pH值8.0)/0.2% PLURONIC L64中。为估计微粒上捕获的MRSA,将适当体积的微粒混合物涂布到血琼脂平板上。为估计从微粒上释放的MRSA,将微粒混合物分离,并且将适当体积的每种上清液涂布到血琼脂平板上,在37℃下培养平板18小时,并且随后枚举菌落,从而定量上清液(SN3)。
表16示出所得的平板计数数据。10mM EDTA(pH值8.0)/0.2%PLURONIC L64从Ga(III)-微粒-2上释放MRSA的效果最好,它从微粒上将24.6%的MRSA释放到上清液(SN3)中。
表16:在100mM磷酸盐缓冲液(pH值7.0)/0.2% PLURONIC L64、100mM磷酸盐缓冲液(pH值9.5)/0.2% PLURONIC L64、10mMTris-HCl(pH值9.5)/0.2% PLURONIC L64、或10mM EDTA(pH值8.0)/0.2% PLURONIC L64中从Ga(III)-微粒-2上释放MRSA的平板计数数据
实例18:用Fe(III)-微粒和Zr(IV)-微粒捕获酵母细胞
将白色念珠菌(Candida albicans)(ATCC MYA-2876)的分离菌落接种到10mL Difco沙氏葡萄糖肉汤(Sabouraud Dextrose broth)(BectonDickinson,Sparks,MD)中,并且在37℃下孵育18-20小时。将约5×107cfu/mL的该过夜培养物在无菌Butterfield缓冲溶液(pH值7.2±0.2;磷酸二氢钾缓冲溶液;VWR目录号83008-093,VWR(West Chester,PA))中稀释以获得100cfu/mL的稀释液。菌落形成单位(cfu)是活性酵母/活酵母的单位。
苹果汁(经巴氏灭菌)从当地食品杂货店(Cub Foods,St.Paul)购得。将体积为11mL的苹果汁加入250mL无菌玻璃瓶(VWR,West Chester,PA)。将体积为99mL的无菌Butterfield缓冲溶液加入苹果汁中。旋摇1分钟混合内容物。使用上述过夜培养物,用念珠菌加标稀释的苹果汁样品,从而获得50cfu/mL的最终浓度。将加标苹果汁样品(1.0mL)加入分别包含100微克Ga(III)-微粒-2、Fe(III)-微粒-2、
Zr(IV)-微粒-2、以及不具有金属离子的对照SERA-MAG磁性粒子的经标记的5mL无菌聚丙烯试管(Falcon,Becton Dickinson,NJ)中,并且在THERMOLYNE MAXIMIX PLUS漩涡混合机(BarnsteadInternational,Iowa)上混合30秒。盖上试管,并在THERMOLYNE VARIMIX摇动器平台(Barnstead International,Iowa)上于室温(25℃)下孵育20分钟。孵育之后,使用磁性托架(Dynal,Carlsbad,CA)将小珠从样品中分离10分钟。对包含1.0mL 50cfu/mL念珠菌并且没有任何磁性小珠的对照试管进行类似处理。将上清液(1mL)移除并且涂布到PETRIFILM酵母和霉菌计数平板(干燥的可再水化培养基,得自3M公司,St.Paul.,MN)上,并且按照制造商说明书孵育5天。将分离的磁性小珠从磁性台架上移去,在1mL无菌Butterfield缓冲液中重新悬浮,然后涂布到PETRIFILM酵母和霉菌计数平板(干燥的可再水化培养基,得自3M公司,St.Paul.,MN)上,并且按照制造商说明书孵育5天。通过人工方式计数分离的酵母落,用涂布的磁性小珠的菌落数除以涂布的未经处理的对照物中的菌落数再乘以100来计算捕获百分比。
CFU是指菌落形成单位,是活性酵母/活酵母的单位。
Fe(III)-微粒-2与Zr(IV)-微粒-2分别结合并聚集67%和81%(标准偏差小于10%)的样品的白色念珠菌细胞。对照粒子结合并聚集33%(标准偏差小于10%)的苹果汁样品的白念珠菌细胞。
实例19:用Ga(III)-微粒、Fe(III)-微粒以及Zr(IV)-微粒来捕获霉
菌细胞
如实例18中所述那样,分别测定Ga(III)-微粒-2、Fe(III)-微粒-2、Zr(IV)-微粒-2、以及无金属离子的对应微粒(每种25μg),但此处用于捕获曲霉菌曲霉(ATCC 16404)的孢子。浓度约1×108孢子/mL的孢子储备物可得自ATCC(The American Type Culture Collection(ATCC;Manassas,VA))。结果示于下表17。
表17:用Ga(III)-微粒-2、Fe(III)-微粒-2、Zr(IV)-微粒-2、以及无 金属离子的对应微粒来捕获曲霉菌曲霉。
微粒 | 捕获百分比 |
无金属离子 | 88 |
Fe(III)-微粒-2 | 93 |
Ga(III)-微粒-2 | 98 |
Zr(IV)-微粒-2 | 100 |
数据代表两个独立实验的特征。
实例20:用Ga(III)-微粒、Fe(III)-微粒以及Zr(IV)-微粒从食物样
品中捕获沙门氏菌
食物样品从当地食品杂货店(Cub Foods,St.Paul)购得。用无菌盘称量食物样品(火腿片/香蕉泥/苹果汁)(11g)并且加至STOMACHER无菌聚乙烯过滤袋(Seward Corp,Norfolk,UK)中。然后,将99mL的Butterfield缓冲溶液加入每个食物样品中。在STOMACHER 400循环机实验室混合器(Seward Corp)中,以2分钟循环共混所得的样品。将共混的样品收集到50mL无菌离心管(BD FALCON,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中,然后以2000转/分钟(rpm)离心分离5分钟来去除大碎屑。所得的上清液用作进一步测试的样品。在溶液(pH值7.2±0.2;磷酸二氢钾缓冲溶液,VWR目录号83008-093,VWR(WestChester,PA))中制备细菌稀释液。使用来自肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的18-20小时过夜培养物(约1×109CFU/mL)的稀释液,以1.6至2.6×102CFU/mL浓度的细菌培养物加标共混的食物样品。将Ga(III)-微粒-2、Fe(III)-微粒-2、以及Zr(IV)-微粒-2加入单独的含1mL加标上清液的5ml无菌聚丙烯试管(Falcon,BectonDickinson,NJ)中。在100μg/mL的浓度情况下,测定金属离子涂布的磁性粒子。盖上试管,在THERMOLYNE MAXIMIX PLUS漩涡混合机(Barnstead International,Iowa)上混合内容物,并且在室温(25℃)下孵育15分钟。盖上试管,并在THERMOLYNE VARI MIX摇动器平台(Barnstead International,Iowa)上于室温(25℃)下孵育20分钟。培养之后,使用磁体(Dynal,Carlsbad,Ca)分离磁性粒子10分钟。对包含100μg/mL未改性的、无金属离子的磁性粒子(直径1微米的Seradyn羧酸,得自Indianapolis,IN)的对照试管进行类似处理。按照制造商说明书,将上清液(1mL)移除并涂布到PETRIFILM菌落总数测试片(3M公司,St.Paul.,MN)上。将分离的磁性粒子重新悬浮于1mL的Butterfield缓冲液,并涂覆到PETRIFILM菌落总数测试片上。在37℃下孵育48小时之后,使用PETRIFILM读板仪(3M公司,St.Paul.,MN)定量细菌菌落。根据(涂布的粒子的菌落数/涂布的未经处理的对照物中的菌落数)×100,计算出捕获百分比。结果示于下表18。
表18:用不具有或具有结合的Ga(III)、Fe(III)、或Zr(IV)的磁性 粒子从食物样品中捕获沙门氏菌。
每个值都基于2次样品测试,并且所有样品的标准偏差均小于10%。
实例21:从加标人全血中提取和检测细菌DNA
可以使用从全血基质中提取和分离细菌DNA的样品制备方法。在此实例中,同时将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC #BAA-43(MRSA)加标的人全血的悬浮液裂解并捕获到Zr(IV)-微粒-2上。洗涤和洗提之后,通过实时PCR将得自Zr(IV)-微粒-2的洗出液与对照样品进行比较。
具体地讲,将MRSA划线接种到非选择性胰酶大豆琼脂(TSA)培养基上,并在37℃下孵育24小时。使用对应于1×108CFU/mL的0.5马克法兰氏浊度标准(McFarland standard),通过在TEP缓冲液(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0和0.2% PLURONIC L64(BASF,MountOlive,NJ))中稀释由新鲜生长物制备细胞悬浮液。制成系列稀释液以获得不同浓度的细菌细胞。
将一百(100)μL相应的细菌稀释液加入到人全血的900μL等分试样中,得到1×102CFU/mL的浓度。将加标全血的两百五十(250)μL等分试样进行分离,以用于进一步处理。将十(10)μL的Zr(IV)-微粒-2(10mg/mL)和40微升的溶葡萄球菌酶(250μg/mL,Sigma)加入加标全血的各等分试样中。在室温下孵育小珠混合物10分钟,并轻轻涡旋。
培养之后,用磁体分离微粒混合物,移除290μL各上清液并弃去(10μL携带体积)。然后,用90μL TEP缓冲液将微粒洗涤三次(也有10μL的携带体积)。第三次洗涤之后,将10μL 20mg/mL的蛋白酶K(Qiagen,Valencia,CA)和80μL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH 8.5)加入到各样品中(100μL总体积)。在65℃下将混合物孵育10分钟,再在95℃下加热10分钟。然后,用磁体分离受热的微粒混合物,并收集各上清液用于如下所述的mecA实时PCR。
独立地,按照其他方面与上文相同的方案使用Zr(IV)-微粒-2提取并分离纯MRSA培养物(无全血)。
使用下列最佳浓度的引物、探针和酶以及热循环方案,对各样品进行mecA基因的实时PCR扩增。下文列出的所有引物和探针的序列以5′→3′取向给出,并且均为已知的而且在Francois,P.,et al.,Journal ofClinical Microbiology,2003,volume 41,254-260(Francois,P.等人,临床微生物学杂志,2003年,第41卷,第254-260页)中有所描述。正向mecA引物为CATTGATCGCAACGTTCAATTT(序列标识号:1)。mecA反向引物为TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA(序列标识号:2)。mecA探针序列TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT(序列标识号:3)通过6-羧基荧光素(FAM)和IBFQ(IOWA BLACK FQ,Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)分别在5′-和3′-位置进行双重标记。在包含5μL样品和5μL下列混合物的10μL总体积中进行PCR扩增:两种引物(各0.5μL,均为10μM)、探针(1μL,2μM)、MgCl2(2μL,25mM)以及LightCycler DNA Master杂交探针(1μL,10×,Roche,Indianapolis,IN)。在LightCycler 2.0实时PCR系统(Roche)上进行扩增,方案如下:95℃下30秒(变性);45次PCR循环,每次95℃下0秒(比降20℃/秒)、60℃下20秒(比降20℃/秒,单次采集)。
使用随Roche LightCycler 2.0实时PCR系统提供的软件来分析结果。在此实例中提供的条件下,引物成功扩增了mecA基因,如表4所示。此实验的结果表明通过Zr(IV)-微粒-2捕获了全血中的MRSA。
表4:通过微流体模拟方案实时PCR检测用Zr(IV)-微粒-2从加标 全血样品(一式两份)中提取和分离的MRSA(mecA基因)。以一式 两份记录Ct值。
实例22:分离和检测加标狗粪的细菌DNA
可以使用样品制备方法从粪便基质中提取和分离细菌DNA。本实例中,将用耐万古霉素的屎肠球菌ATCC #700221(VRE)加标的狗粪的悬浮液预过滤,以从样品中移除不溶解的碎屑。然后,将所得洗出液中的VRE捕获到Zr(IV)-微粒-2上并在固体载体上裂解。洗涤和洗提之后,通过实时PCR比较来自Zr(IV)-微粒-2的洗出液和对照样品。
具体地讲,将VRE在血琼脂培养基上划线接种,并且在37℃下孵育20小时。通过在TEP缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH值8.0和0.2% PLURONIC L64(BASF,Mount Olive,NJ))中稀释并且使用对应于1×108CFU/mL的0.5马克法兰氏浊度标准,由新鲜生长物来制备细胞悬浮液。
通过漩涡在包含0.1% TRITON X-100的1mL 0.1M、pH值5.5的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中将十分之一(0.1)克的狗粪均质化。将十(10)微升的1×108CFU/mL VRE加标到粪便匀浆中。将加标的粪便匀浆短暂漩涡,然后通过EMPORE 6065滤板(3M公司,St.Paul,MN)过滤。
将十(10)微升20mg/mL的蛋白酶K(Qiagen,Valencia,CA)和10μL的Zr(IV)-微粒-2(10mg/mL)加入80μL过滤后的粪便匀浆。在以200rpm摇振下将微粒混合物在37℃下孵育10分钟,然后在室温下进一步孵育10分钟并同时轻微漩涡。
培养之后,用磁体分离样品。移除上清液,并且将100μL的TEP缓冲液加入该样品。将样品短暂漩涡并且再次施以磁体。移除上清液,并且将样品重新悬浮于80μL的MES缓冲液。
将十(10)微升12,500U/mL的变溶菌素(Sigma,St.Louis,MO)和10微升25mg/mL的溶菌酶(Sigma,St.Louis,MO)加入该样品。在以200rpm摇振下将样品在37℃下孵育10分钟,然后在室温下进一步孵育10分钟并同时轻微漩涡。
培养之后,用磁体分离微粒混合物,将上清液移除并丢弃。然后,用100μL TEP缓冲液将微粒洗涤两次。第二次洗涤之后,将微粒重新悬浮于100μL的20mM磷酸盐缓冲液(pH值8.5),并且在95℃下加热10分钟。然后,用磁体分离加热的微粒混合物,并且收集上清液用于如下所述的vanA实时PCR。
采用不同于上文的方案,以Zr(IV)-微粒-2单独提取并分离纯VRE培养物(无粪便或不过滤)。按照制造商说明书,还使用MagNA PureLC DNA分离试剂盒III(细菌,真菌)试剂盒(仪器和试剂得自Roche,Indianapolis,IN),通过MagNA Pure LC系统提取和分离另一种纯VRE培养物(无粪便或不过滤)。然后,在MES中将所得的MagNA Pure分离的DNA稀释为当量浓度,以便与加标粪便样品和纯培养物样品进行比较。
与耐万古霉素的屎肠球菌的vanA基因互补的引物是已知的,并且在Volkmann et al.,Journal of Microbiological Methods,2004,volume 56,page 277-286(Volkmann等人,《微生物方法杂志》2004年第56卷,第277-286页)中有所描述。正向引物序列为5′CTGTGAGGTCGGTTGTGCG 3′(序列标识号:7),反向引物序列为5′TTTGGTCCACCTCGCCA 3′(序列标识号:8)。
使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche,Indianapolis,IN)进行聚合酶链式反应(PCR)。将十四微升(14μL)的酶加入反应缓冲液的一个试管中。将酶/反应缓冲液混合物漩涡,并根据每个反应使用以下配方在LightCycler毛细管中进行PCR反应:9μL的PCR级H2O、1μL的10μM正向引物、1μL的10μM反向引物、4μL酶/反应缓冲液混合物、以及5μL样品DNA,。
将反应物置于Roche LightCycler 2.0实时PCR系统中,并对样品施以下列热循环分布:95℃下10分钟,然后按顺序执行下列三个步骤的45次循环,95℃下10秒(比降20℃/秒),50℃下10秒(比降20℃/秒),以及72℃下30秒(比降20℃/秒,采集)。
使用随Roche LightCycler 2.0实时PCR系统提供的软件来分析结果。在本实例提供的条件下,引物成功扩增了vanA基因,如表5所示。本实验的结果表明在预过滤步骤之后,Zr(IV)-微粒-2捕获了粪便中的VRF。
表5:通过过滤和使用Zr(IV)-微粒-2对从加标狗粪样品(一式四 份)中提取和分离的VRE进行实时PCR检测(vanA基因)。以一式 两份记录Ct值。
本文中引用的所有参考文献和专利公开或它们的一部分明确地以全文引用的方式并入本公开。已经对本发明涉及的示例性实施例进行了讨论,并且涉及到了本发明范围内的一些可能的变型。在不脱离本发明的范围的前提下,对本发明的这些和其他变型和修改对本领域内的技术人员来说是显而易见的,并且应当理解,本发明并不局限于上文所述的示例性实施例。因此,本发明将仅通过下文提供的实施例以及其等同形式来限定。
序列表
<110>3M创新有限公司
(3M Innovative Properties Co.)
<120>用于分离生物材料的组合物、方法和装置
(COMPOSITIONS,METHODS,AND DEVICES FOR ISOLATING BIOLOGICAL
MATERIALS)
<130>SCT094011-10
<150>US 60/913,812
<151>2007-04-25
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>1
cattgatcgc aacgttcaat tt 22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>2
tggtctttct gcattcctgg a 21
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>3
tggaagttag attgggatca tagcgtcat 29
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>4
tgccttacag atagcatgcc a 21
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>5
agtaagtaag caagctgcaa tgacc 25
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>6
tcatttcacg caaactgttg gccactatg 29
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>Enterococcus faecium
<400>7
ctgtgaggtc ggttgtgcg 19
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>Enterococcus faecium
<400>8
tttggtccac ctcgcca 17
Claims (26)
1.一种组合物,其包含:
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
2.一种组合物,其包含:
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
结合到至少一种所述金属离子My+的至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;并且
其中所述组合物的pH值为4.5至6.5。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物,其中My+为Zr4+或Ga3+。
4.一种分离和任选地分析来自样品材料的至少一种双链多核苷酸的方法,其包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
使所述样品材料与结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的所述多个金属离子My+接触,从而提供组合物,所述组合物包含a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸,以及b)包含所述样品材料的上清液,所述样品材料具有减少量的所述至少一种双链多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
5.一种分离和任选地分析来自样品材料的至少一种多核苷酸的方法,其包括:
提供包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
在pH值为4.5至6.5,使所述样品材料与结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的所述多个金属离子My+接触,从而提供组合物,所述组合物包含a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸,以及b)包含所述样品材料的上清液,所述样品材料具有减少量的所述至少一种多核苷酸;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
其中所述组合物的pH值为4.5至6.5。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法,其中所述样品材料包括多种细胞、病毒、或它们的组合。
7.根据权利要求4、5和6中任一项所述的方法,其中当使所述样品材料与结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的所述多个金属离子My+接触时,所述样品材料与裂解试剂接触。
8.根据权利要求6所述的方法,其中使所述样品材料与结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的所述多个金属离子My+接触,从而提供a)结合到所述固定金属支承材料的所述多种细胞、病毒、或它们的组合的至少一部分,以及b)包含所述样品材料的上清液,所述样品材料具有减少数量的细胞、病毒、或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的方法,还包括将包含具有减少数量的细胞、病毒、或它们的组合的所述样品材料的所述上清液与结合到所述固定金属支承材料的所述多种细胞、病毒、或它们的组合的所述至少一部分相分离。
10.根据权利要求9所述的方法,还包括分析结合到所述固定金属支承材料的所述细胞、病毒、或它们的组合。
11.根据权利要求8或权利要求9所述的方法,还包括将裂解试剂加入结合到所述固定金属支承材料的所述多种细胞、病毒、或它们的组合的所述至少一部分。
12.根据各自从属于权利要求4的权利要求7或权利要求11所述的方法,还包括裂解所述细胞、病毒、或它们的组合从而提供组合物,所述组合物包含a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸,以及b)包含所述样品材料的所述上清液,所述样品材料具有减少量的所述至少一种双链多核苷酸。
13.根据各自从属于权利要求5的权利要求7或权利要求11所述的方法,还包括裂解所述细胞、病毒、或它们的组合从而提供组合物,所述组合物包含a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸,以及b)包含所述样品材料的所述上清液,所述样品材料具有减少量的所述至少一种多核苷酸。
14.根据权利要求4或权利要求12所述的方法,还包括将a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸与b)包含所述样品材料的所述上清液相分离,所述样品材料具有减少量的所述至少一种双链多核苷酸。
15.根据权利要求5或权利要求13所述的方法,还包括将a)结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸与b)包含所述样品材料的所述上清液相分离,所述样品材料具有减少量的所述至少一种多核苷酸。
16.根据权利要求14所述的方法,还包括扩增结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种双链多核苷酸,从而提供多种扩增子。
17.根据权利要求31所述的方法,还包括扩增结合到所述固定金属支承材料的所述至少一种多核苷酸,从而提供多种扩增子。
18.一种用于处理样品材料的装置,所述装置具有:
至少一个能够容纳或引导流体的第一腔室,其中所述至少一个第一腔室容纳包含固定金属支承材料的组合物,所述固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
至少一个第二腔室,所述第二腔室与所述第一腔室分开并能够接收和容纳来自所述至少一个第一腔室的所述流体、所述固定金属支承材料、或它们两者;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
19.一种用于从样品材料中分离至少一种多核苷酸的试剂盒,所述试剂盒包括:
具有至少一个能够容纳或引导流体的腔室的装置;
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2;以及
至少一种选自由裂解试剂、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、以及洗脱缓冲液组成的组的试剂。
20.一种组合物,包含:
包括基底的固定金属支承材料,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;以及
多种微生物,所述多种微生物选自由细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合组成的组,并且非特异性地结合到所述固定金属支承材料上;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
21.一种分离微生物的方法,包括:
提供包含固定金属支承材料的组合物,所述固定金属支承材料包括基底,所述基底具有多个结合到所述基底的-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团,以及结合到所述-C(O)O-或-P(O)(-OH)2-x(-O-)x基团的多个金属离子My+;
提供可能具有选自由下列组成的组的多种微生物的样品:细菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、病毒、以及它们的组合;以及
使所述组合物与所述样品接触;其中来自所述样品的所述多种微生物的至少一部分非特异性地结合到所述固定金属支承材料上;
其中M选自由锆、镓、铁、铝、钪、钛、钒、钇、以及镧系元素组成的组;y为3至6的整数;并且x为1或2。
22.根据权利要求21所述的方法,还包括在来自所述样品的所述多种微生物的所述至少一部分非特异性地结合到所述固定金属支承材料之后,从剩余的所述样品中分离所述固定金属支承材料。
23.根据权利要求22所述的方法,还包括检测所述多种微生物的所述至少一部分。
24.根据权利要求23所述的方法,其中通过选自由三磷酸腺苷(ATP)生物发光检测法、聚二乙炔(PDA)比色检测法、核酸检测法、免疫学检测法、基于生长的检测法、显微镜目测法、磁阻法、以及表面声波检测法组成的组的检测方法来进行检测。
25.根据权利要求20所述的组合物或根据权利要求21至24中任一项所述的方法,其中所述微生物选自由芽孢杆菌、博德特氏杆菌、疏螺旋体、弯曲杆菌、梭状芽胞杆菌、棒状杆菌、肠杆菌、肠球菌、埃希氏杆菌、螺杆菌、军团菌、李斯特氏菌、分枝杆菌、奈瑟氏球菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌、耶尔森氏菌、念珠菌、青霉菌、曲霉菌、枝孢菌、镰刀菌、以及它们的组合组成的组。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法,其中所述样品选自由临床样品、食物样品、以及环境样品组成的组。
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