KR20100017232A - 생물학적 물질을 단리하기 위한 조성물, 방법, 및 장치 - Google Patents

생물학적 물질을 단리하기 위한 조성물, 방법, 및 장치 Download PDF

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Abstract

기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+ (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하며, 미생물 및 폴리뉴클레오티드가 결합되는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하며, 샘플 물질로부터 미생물 및/또는 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 데 사용될 수 있는 조성물, 방법, 장치, 및 키트가 개시된다.
조성물, 기재, 금속 이온, 지지체 물질, 폴리뉴클레오티드, 키트

Description

생물학적 물질을 단리하기 위한 조성물, 방법, 및 장치{COMPOSITIONS, METHODS, AND DEVICES FOR ISOLATING BIOLOGICAL MATERIALS}
본 출원은 2007년 4월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/913,812호의 이득을 청구하며, 상기 가특허 출원은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
생물학적 물질, 예를 들어, 세포, 바이러스, 및 폴리뉴클레오티드를 샘플로부터 단리하는 것은 생물학적 물질을 검출하거나 분석하기 위한 방법을 적용할 때 도움이 되거나 심지어 필요할 수 있다. 일부 방법에서는, 미생물이 샘플로부터 단리되며, 미생물의 총 수를 결정하거나 미생물의 적어도 일부를 동정하기 위하여 계수적 또는 비계수적 방법들이 이용된다. 예를 들어, 표준 플레이트 카운트(Standard Plate Count), 대장균, 효모 및 곰팡이 카운트, 계수 및 선별 및 차등 도말에 있어서 생물발광 분석 및 임피던스 또는 컨덕턴스 측정, DNA 혼성화, 응집(agglutination), 및 비-계수화를 위한 효소 면역분석이 이용되었다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부의 확인은 미생물 감염의 진단, 유전자 변이의 검출, 조직 적합 검사 등을 위해 이용되어 왔다. DNA 및 RNA를 비롯한 폴리뉴클레오티드를 확인하기 위한 방법은 종종 폴리뉴클레오티드를 증폭시키거나 혼성화시키는 것을 포함한다. 증폭 방법의 예에는 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction) (PCR); 표적 폴리뉴클레오티드 증폭 방법, 예를 들어, 자기 부양 서열 복제(self-sustained sequence replication) (3SR) 및 가닥-치환 증폭(strand-displacement amplification, SDA); 표적 폴리뉴클레오티드에 부착된 시그널의 증폭에 기반한 방법, 예를 들어, "분지쇄" DNA 증폭; 프로브 DNA의 증폭에 기반한 방법, 예를 들어, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR) 및 QB 레플리카아제(replicase) 증폭(QBR); 전사-기반 방법, 예를 들어, 라이게이션 활성화 전사(ligation activated transcription, LAT), 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), 상표명 인베이더(INVADER) 하의 증폭, 및 전사-매개 증폭 (TMA); 및 다양한 다른 증폭 방법, 예를 들어, 복구 연쇄 반응(repair chain reaction) (RCR) 및 사이클링 프로브 반응(cycling probe reaction, CPR)이 포함된다. 다량의 세포 또는 기타 오염 물질, 예를 들어, 탄수화물 및 단백질이 이들 방법을 방해할 수 있기 때문에, 종종 복합 혼합물인 샘플로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는 것이 필요할 수 있다.
샘플로부터 폴리뉴클레오티드를 단리하는 방법들이 알려져 있다. 이들 중 일부는 많은 시간을 요하는 일련의 추출 및 세척 단계를 포함한다. 예를 들어, 핵산은 세제 또는 카오트로프(chaotrope)를 이용하여 생물학적 물질을 용해하고, 유기 용매로 추출하고, 에탄올로 침전시키고, 원심분리하고, 핵산을 투석함으로써, 혈액 샘플 또는 조직 샘플과 같은 샘플로부터 단리되었다.
고체 추출 또한 소정의 핵산 단리 방법에서 이용되었다. 여기서는 미세비드를 비롯한 입자, 및 막 필터의 사용이 실시되었다. 예를 들어, DNA 추출은 카오트로픽 조건 하에서 실리카 입자 상에 DNA를 흡착시켜 실시되었다. 그러나, 후속 세 척 단계는 전형적으로 에탄올 또는 아이소프로판올과 같은 유기 용매를 필요로 한다. 고농도의 염과 함께, 소정의 계면활성제 또는 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에서 소수성 표면을 이용하는 것을 포함하는, 그러한 방법의 다른 예가 보고되었다. 유기 용매 또는 고농도의 염의 사용은 미세유체 시스템에서의 핵산 증폭과 같은 후속 방법과의 조합에 있어서 추출 방법의 융통성을 제한한다. 또한, 추출 과정 동안 다수의 시약을 사용함으로써 비용이 많이 들게 되고 많은 시간을 요하게 된다. 다른 예에서는, 표면에 결합된 암모늄기를 이용하여 DNA 분자를 유인하여 결합한다. 이러한 능력을 가진 DNA 추출 키트는 예를 들어, 퀴아젠(Qiagen)(미국 캘리포니아주 발렌시아)으로부터 입수가능하다. 흡착된 DNA의 용출은 보통 높은 pH 또는 고농도의 염에서 행해지며, 이는 DNA 증폭과 같은 후속 방법을 방해할 수 있다. 민감성 감소로 이어질 수 있는, 획득한 물질의 상당한 희석, 또는 탈염 또는 중화가 필요할 수 있다.
핵산과 같은, 차폐되지 않은 퓨린 또는 피리미딘 부분 또는 기를 함유한 화합물을 분리하고/하거나 정제하기 위한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 방법이 보고되었다(미국 특허 공개 제2004/0152076A1호). 그러나, 이중 가닥 DNA는 컬럼 매트릭스에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
개선된 샘플 제조법과 미생물 검출의 중요성이 증가함에 따라, 미생물을 단리하기 위한 및/또는 온건한 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 추출하기에 충분히 간단하며 후속 방법을 방해하지 않고서 후속 방법과 함께 사용되기에 충분히 융통 성이 있거나, 또는 노동을 감소시켜 그 가치를 제공할 수 있는 물질 및 방법이 계속 필요하다.
발명의 개요
이중 가닥 DNA를 비롯한 폴리뉴클레오티드가 소정의 고정된 금속 지지체 물질을 이용하여 복합 샘플 물질로부터 단리될 수 있음이 지금에 와서야 밝혀졌다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 출원인은 지지체 물질에 결합된 소정의 금속 이온이 폴리뉴클레오티드 상의 포스페이트기와 상호작용하여 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에 결합되게 하는 것으로 여긴다. 또한, 포획된 폴리뉴클레오티드는 단기간의 온화한 가열로 그리고 폴리뉴클레오티드 포스페이트기와 경쟁하거나 이를 대체하는 저 농도의 완충액으로 방출될 수 있다. 완충액과 조합된 방출된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 증폭과 같은 하류 과정에 직접 이용될 수 있다.
고정된 금속 지지체 물질은 미생물에 비특이적으로 결합하며, 이는 그 후 식품 및 임상 샘플과 같은 복합 샘플을 비롯한 샘플 물질로부터 단리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. "비특이적으로 결합하는"이란 결합이 임의의 유형의 미생물 또는 박테리아 세포 등에 특이적이 아님을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 한 가지 박테리아 균주를 표적으로 하기보다는 오히려 샘플 내의 다른 구성요소로부터 샘플 내의 모든 박테리아가 단리될 수 있다. 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 모두, 효모 세포, 곰팡이 포자 등이 결합될 수 있다. 이어서 생성된 단리된 미생물은 미생물 로드(load) 검출과 같은 공지의 검출법에 처해질 수 있다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및 금속 이온들, My+ 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및 금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하며, pH는 4.5 내지 6.5인 조성물을 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법을 제공하며, 이 방법은
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법을 제공하며, 이 방법은
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 pH 4.5 내지 6.5에서, -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2이며; 조성물의 pH는 4.5 내지 6.5임)를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 물질을 프로세싱하는 장치를 제공하며, 이 장치는
유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위한 키트를 제공하며, 이 키트는
유체를 수용하거나 전달할 수 있는 적어도 하나의 챔버를 가진 장치;
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서 M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 및 용출 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하기 위한 키트를 제공하며, 이 키트는 샘플 물질을 프로세싱하기 위한 장치를 포함하며, 이 장치는
유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나 듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는다.
다른 실시 형태에서,
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +(여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합된, 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 실시 형태에서, 박테리아 세포를 단리하는 방법이 제공되며, 이 방법은
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온 My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계와;
박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 갖는 것으로 생각되는 샘플을 제공하는 단계와;
조성물을 샘플과 접촉시키는 단계 (여기서, 샘플로부터의 복수의 미생물 중 적어도 일부는 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합되며; M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함한다.
용어 "포함하는" 및 그 변형(예를 들어, 포함한다, 함유한다 등)은 이들 용어가 명세서 및 청구의 범위에서 나타날 때 제한적인 의미를 갖지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 관사("a", "an"), 정관사("the"), "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 그 내용이 명백히 달리 기술되지 않으면 상호 교환가능하게 사용된다.
또한 본 명세서에서, 종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들어, 7 내지 10의 pH는 7, 7.5, 8.0, 8.7, 9.3, 10, 등의 pH를 포함한다).
상기 본 발명의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현예를 설명하고자 하는 것은 아니다. 하기의 발명의 상세한 설명은 예시적인 실시 형태를 더욱 특별하게 예시한다.
도 1은 두 개의 별도의 챔버를 가지며, 고정된 금속 지지체 물질을 챔버 중 하나에 가진 본 발명에 따른 장치의 평면도.
본 발명은 샘플 물질로부터 미생물 및/또는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 데 사용될 수 있는 조성물, 방법, 장치, 및 키트를 제공한다. 선택적으로, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 미생물이 분석될 수 있다. 분석은 폴리뉴클레오티드의 존재를 탐지하고/하거나 존재하는 폴리뉴클레오티드의 양을 결정하는 것을 포함한다. 미생물의 경우에는, 분석은 미생물의 존재를 탐지하고(확인하고)/하거나 존재하는 미생물의 양을 계수하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 및 이중 가닥 핵산, 올리고뉴클레오티드, 일부가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물, 및 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 지칭하며, 선형 및 원형 형태를 포함한다. 소정의 실시 형태의 경우, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단일 또는 이중 가닥 핵산이다.
일 실시 형태에서,
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
금속 이온들, My+ 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "기재"는 고체 표면을 가진 물질을 지칭하며, 이는 예를 들어, 복수의 입자, 컬럼의 내벽, 필터, 미세적정 플레이트, 프릿, 피펫 팁, 필름, 복수의 섬유, 또는 유리 슬라이드일 수 있다. 소정의 실시 형태의 경우, 기재는 컬럼의 내벽, 필터, 미세플레이트, 미세필터 플레이트, 미세적정 플레이트, 프릿, 피펫 팁, 필름, 복수의 미소구체, 복수의 섬유, 및 유리 슬라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시 형태의 경우, 기재는 비드, 젤, 필름, 시트, 막, 입자, 섬유, 필터, 플레이트, 스트립, 튜브, 컬럼, 웰, 용기의 벽, 모세관, 피펫 팁, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 복수의 입자 또는 입자는 복수의 미세입자일 수 있으며, 이는 미소구체, 미세비드 등을 포함한다. 그러한 입자는 수지 입자, 예를 들어, 아가로스, 라텍스, 폴리스티렌, 나일론, 폴리아실아미드, 셀룰로오스, 다당류, 또는 그 조합, 또는 무기 입자, 예를 들어, 실리카, 산화알루미늄, 또는 그 조합일 수 있다. 그러한 입자는 자성 또는 비자성일 수 있다. 그러한 입자는 크기 면에서 콜로이드성일 수 있으며, 예를 들어, 약 100 ㎚ 내지 약 10 마이크로미터(μ)일 수 있다.
복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 많은 방식으로 기재에 결합될 수 있다. 예를 들어, 상기 기는 공유 결합, 이온 결합, 수소 결합, 및/또는 반 데르 발스(van der Waals) 힘에 의해 결합될 수 있다. 상기 기는 중합체성 표면을 가진 기재와 같은 기재에 직접 결합될 수 있으며, 여기서 중합체는 중합체 사슬에 공유 결합에 의해 결합된 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기를 갖는다. 이러한 성질의 중합체는 -C(O)OH 또는 -P(O)(-OH)2 치환된 비닐 단위, 예를 들어, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐포스폰산 등의 단위를 포함할 수 있다.
-C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 연결기를 통해 기재에 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 기재 상의 아미노기는 다수의 카르복시기를 가진 화합물, 예를 들어, 니트릴로트라이아세트산과 접촉하여, 하나 이상의 카르복시기(니트릴로트라이아세트산의 경우에는 두 개의 카르복시기)를 기재에 부착시키는 아미드-함유 연결기를 형성할 수 있다. 이용가능한 아미노기를 갖거나 또는 이용가능한 아미노기를 갖도록 개질될 수 있는 기재는 당업자에게 알려져 있으며 예를 들어, 아가로스-기반, 라텍스-기반, 폴리스티렌-기반, 및 실리카-기반 기재를 포함한다. -Si-OH기를 가진 유리 또는 실리카 입자와 같은 실리카-기반 기재는 공지의 아미노실란 커플링제, 예를 들어, 3-아미노프로필트라이메톡시실란으로 처리되어 이용가능한 아미노기를 제공할 수 있다. -C(O)OH 또는 -P(O)(-OH)2와 같은 작용기는 다른 공지의 실란 화합물을 이용하여 기재, 예를 실리카 표면을 가진 기재에 부착될 수 있다.
-C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 또한 정전기, 수소 결합, 배위 결합, 반 데르 발스 힘(소수성 상호작용) 또는 비오틴-아비딘 상호작용과 같은 특이적인 화학반응에 의해 기재에 결합하는 분자에 이들 기가 부착되는 조건 하에서 간접적으로 기재에 결합될 수 있다. 예를 들어, C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기를 보유한 중합체는 교호 적층 기술(Layer-by-Layer technique)을 이용하여 반대 전하를 가진 표면 상에 코팅되어 C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기를 가진 고밀도의 중합체를 구축할 수 있다.
추가의 예에 있어서, C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기를 보유한 단량체는 플라즈마 처리를 통해 중합체 표면에 그래프트될 수 있다.
복수의 카르복실기, 예를 들어, -C(O)OH 또는 -C(O)O-를 가진 기재가 알려져 있으며 구매가능하다. 예를 들어, 카르복실화된 미세입자는 다이나비즈 마이온(DYNABEADS MYONE) (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠(Invitrogen)) 및 세라-맥(SERA-MAG) (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 서모 사이언티픽(Thermo Scientific), 세라딘(Seradyn)으로 알려짐)과 같은 상표명으로 입수가능하다.
금속 이온, My +는 산 기를 예를 들어, 니트레이트 염과 같은 금속염의 용액으로서의 과량의 금속 이온과 접촉시켜 산 기에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 염화물, 과염소산염, 황산염, 인산염, 아세트산염, 아세틸아세토네이트, 브롬화물, 플루오르화물, 또는 요오드화물, 염과 같은 다른 염도 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에서,
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하며,
pH는 4.5 내지 6.5인 조성물이 제공된다.
4.5 내지 6.5의 pH 범위의 사용은 예를 들어, 생물학적 물질을 고정된 금속 지지체 물질에 결합시킴으로써 조성물을 준비할 때, 금속 이온의 선택에서 융통성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 금속 이온 Ga3+는 4.5 내지 6.5의 pH에서 박테리아 세포에 효과적으로 결합하지만, 7 내지 9의 pH에서는 세포를 방출할 수 있다. 4.5 내지 6.5 범위의 pH는 약 5.5의 pH의 0.1 M 4-모르폴린에탄설폰산(MES) 완충액을 이용하여 편리하게 제공될 수 있다. 상기 조성물들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 조성물의 pH는 5 내지 6이다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 방법을 방해하는 것을 최소화하기 위하여, 감지할 수 있는 수준의 염은 선택적으로 포함되지 않을 수도 있다. 감지할 수 있는 수준(들)이란 약 0.2 M보다 큰 수준, 그리고 더욱 바람직하게는 약 0.1 M보다 큰 수준을 말한다. 소정의 실시 형태의 경우, 염이 감지할 수 있는 수준으로 조성물에 존재할 경우, 조성물에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 이외의 것이다.
상기 조성물들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O- 기이다.
금속 이온, My +는 금속 이온이 샘플 물질에 존재하는 폴리뉴클레오티드 분자에 결합하기에 충분하게 폴리뉴클레오티드의 포스페이트 부분에 결합할 수 있도록 선택된다. 또한, 금속 이온은 낮은 시약 농도에서 그리고 온화한 조건 하에서 고정된 금속 지지체 물질로부터 폴리뉴클레오티드 분자를 효율적으로, 바람직하게는 정량적으로, 방출 또는 용출시키기 위해 세척 완충액 중의 금속-킬레이팅 시약과의 경쟁적 결합을 허용하도록 또한 선택된다. 이온 강도를 증가시키기 위하여 임의의 염을 첨가하지 않은 낮은 시약 농도는 약 0.1 M 이하, 0.05 M 이하, 또는 0.025 M 이하일 수 있다. 온화한 조건은 낮은 시약 농도, 약 7 내지 10의 pH, 약 95℃ 이하, 바람직하게는 약 65℃ 이하의 온도, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 란탄족은 하기 란탄족 금속 중 임의의 하나를 포함한다: 란타늄, 세륨, 프라세오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 튤륨, 이테르븀, 및 루테튬. 란타늄 및 세륨이 바람직한 란탄족이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 란타늄 및 세륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, M은 지르코늄이다.
상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, y는 3 또는 4이다.
상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4+ 또는 Ga3 +이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 +이다.
다른 실시 형태에서, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법이 제공되며, 이 방법은
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법이 제공되며, 이 방법은
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 pH 4.5 내지 6.5에서, -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2이며; 조성물의 pH는 4.5 내지 6.5임)를 포함한다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 조성물의 pH는 5 내지 6이다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 조성물에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 이외의 것이다.
샘플 물질은 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있는 임의의 물질이다. 샘플 물질은 원료 샘플 물질 또는 프로세싱된 샘플 물질일 수 있다. 원료 샘플 물질은 예를 들어, 임상 샘플 또는 시료(혈액, 조직 등), 식품 샘플(식품, 애완 동물 먹이를 비롯한 사료, 음료, 식품 또는 사료를 위한 원료 등), 환경 샘플(물, 토양 등) 등을 포함한다. 프로세싱된 샘플 물질은 예를 들어, 원료 샘플 물질로부터 분리된 세포 또는 바이러스를 함유한 샘플, 및 세포, 바이러스로부터 단리되거나 다른 공급원으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 함유한 샘플을 포함한다. 임상 샘플 또는 시료와 같은 샘플 물질의 일부 예에는 비강, 인후, 담(sputum), 혈액, 창상, 샅, 액와, 회음부, 및 배설물 샘플이 포함된다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 핵산을 함유한 생물학적 물질을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 복수의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있으며, 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 식물 세포, 남조류를 비롯한 조류, 진균류, 박테리아, 원생동물, 효모 등을 포함할 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포 또는 그 조합이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 세포는 박테리아 세포이다.
샘플 물질이 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시키기 전에 샘플 물질에 용해 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 샘플 물질이 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 샘플 물질이 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
용해는 효소에 의해, 화학적으로, 및/또는 기계적으로 실시될 수 있다. 용해에 사용되는 효소는 예를 들어, 라이소스타핀, 라이소자임, 뮤타노라이신 또는 기타를 포함한다. 화학적 용해는 계면활성제, 알칼리, 열, 또는 기타 수단을 이용하여 실시될 수 있다. 용해에 알칼리를 이용할 경우, 중화 시약을 이용하여, 용해 후 용액 또는 혼합물을 중화시킬 수 있다. 기계적 용해는 고형 입자 또는 미세입자, 예를 들어 비드 또는 미세비드를 이용하여 혼합 또는 전단에 의해 달성될 수 있다. 초음파처리가 또한 용해에 이용될 수 있다. 용해 시약은 필요할 경우 완충된, 계면활성제 또는 세제, 예를 들어, 소듐 도데실설페이트(SDS), 리튬 라우릴설페이트 (LLS), 트리톤(TRITON) 시리즈, 트윈(TWEEN) 시리즈, 브리즈(BRIJ) 시리즈, NP 시리즈, 챕스(CHAPS), N-메틸-N-(1-옥소도데실)글리신, 나트륨염 등; 카오트로프, 예를 들어, 구아니듐 하이드로클로라이드, 구아니듐 티아시아네이트, 요오드화나트륨 등; 용해 효소, 예를 들어, 라이소자임, 라이소스타핀, 뮤타노라이신, 프로테이나아제, 프로나아제, 셀룰라아제, 또는 임의의 다른 구매가능한 용해 효소; 알칼리 용해 시약; 고형 입자, 예를 들어, 비드, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
샘플 물질이 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 대안적으로, 샘플 물질은 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉할 때 용해 시약과 접촉된다. 이 대안적 방법에서, 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+에 결합시키는 것, 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시키는 것, 및 세포, 바이러스, 또는 그 조합 유래의 폴리뉴클레오티드를 결합시키는 것을 동시에 함으로써 단계의 수를 감소시킬 수 있다. 샘플 물질이 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 샘플 물질이 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온 My +와 접촉시키는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부 및 b) 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액이 제공된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부로부터 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
고정된 금속 지지체 물질로부터 상청액을 분리하는 것은 예를 들어, 경사법, 원심분리, 피펫팅, 및/또는 이들 방법의 조합에 의해 실시될 수 있다. 지지체 물질이 자성 입자로 구성될 경우, 고정된 금속 지지체 물질은 자기장을 가함으로써 챔버 또는 용기의 벽에서 적소에 유지될 수 있다. 이어서 경사법, 피펫팅, 또는 압력차 또는 관성력을 이용하여 챔버 또는 용기 밖으로 상청액을 밀어내는 것에 의해 상청액을 제거할 수 있다.
소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질로부터 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 분석은 비색 분석, 면역분석 등과 같은 공지된 분석을 이용하여 실시할 수 있다.
용해 시약의 첨가가 포함되는 방법을 제외하고, 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부가 고정된 금속 지지체 물질에 결합되는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부에 용해 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 샘플 물질이 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 샘플 물질이 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 세포, 바이러스, 또는 그 조합은 세포이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 세포는 박테리아 세포이다. 박테리아는 그람-양성 또는 그람-음성일 수 있다. 박테리아 세포가 고정된 금속 지지체 물질에 결합되는 소정의 이들 실시 형태의 경우, 박테리아 세포는 4.5 내지 9의 pH의 결합 완충액의 존재 하에서 고정된 금속 지지체 물질에 결합된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, pH는 4.5 내지 6.5이다.
일 실시예에서, 결합 완충액은 약 0.1 M 및 약 5.5의 pH의 MES이다. 개선된 유동 및 혼합을 위해 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 플루로닉(PLURONIC) L64 (바스프(BASF)(미국 뉴저지주 마운트 올리브)로부터 입수가능한 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체) 또는 트리톤 X-100 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수가능한 폴리옥시에틸렌(10) 아이소옥틸페닐 에테르)이 포함될 수 있다. 계면활성제는 또한 박테리아 세포의 덩어리짐(clumping)을 감소시키거나 방지할 수 있다. 유사하게 이용될 수 있는 다른 완충액은 석신산, 아세트산염, 또는 시트르산염을 포함한다.
a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 분리된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 4.5 내지 9의 pH의 수성 완충 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 수성 완충 용액의 pH는 4.5 내지 6.5이다.
세척 완충액의 예에는 MES 완충액, 트리스(Tris) 완충액, HEPES 완충액, 인산염 완충액, TAPS 완충액, 및 DIPSO (3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산) 완충액이 포함된다.
고정된 금속 지지체 물질에 결합된 분리된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘(amplicon)을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. DNA를 증폭시키는 데 적용가능한 상기한 방법들과 같은 공지의 증폭 방법, 예를 들어, PCR 또는 TMA를 여기서 사용할 수 있다. 증폭은 하나 이상의 효소, 예를 들어, PCR을 위한 열안정성 DNA 폴리머라아제, 또는 TMA를 위한 RNA 폴리머라아제 및 역전사효소의 존재를 포함할 수 있다. 앰플리콘은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 앰플리콘, 미결합 앰플리콘, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질로부터 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 단계; 및 고정된 금속 지지체 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 이에 의해 복수의 앰플리콘이 제공될 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 결합되거나 분리된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 있어서, 증폭은 약 37 내지 100℃의 적어도 하나의 온도로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 가열하는 것을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 증폭은 약 94 내지 97℃ 의 온도로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 가열하는 것을 포함한다. 이 온도에서 DNA의 두 가닥는 분리되어 단일 가닥 DNA 주형을 생성한다. 증폭은 추가의 온도, 예를 들어, 약 37 내지 74℃의 온도에서 가열하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이들 온도에서, 프라이머는 DNA 주형에 어닐링할 수 있으며, 생성된 어닐링된 프라이머는 존재하는 효소에 의해 DNA 주형을 따라 연장될 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 증폭은 약 40 내지 65℃, 약 55 내지 65℃, 약 58 내지 62℃, 또는 약 60℃의 온도에서의 가열을 포함한다. 어닐링과 연장 둘 모두는 이들 온도에서 일어날 수 있다. 그러나, 사용되는 특정 효소에 대하여 온도를 최적화하기 위하여 추가의 온도가 이용될 수 있다. 예를 들어, 약 70 내지 74℃의 추가 온도를 연장에 사용할 수 있다. 공지 방법을 이용하여 이들 온도 또는 온도 범위를 통해 사이클링시켜 폴리뉴클레오티드의 증폭을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 소정의 이들 실시 형태의 경우, 결합되거나 분리된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 있어서, 증폭은 약 37 내지 44℃, 예를 들어, 약 42℃의 온도로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 가열하는 것을 포함한다. 일정하게 유지될 수 있는 이들 온도에서, RNA 폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소는 RNA 앰플리콘을 생성하여 높은 수준의 증폭으로 이어질 수 있다. 선택적으로, 증폭 전에, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 약 55 내지 100℃와 같은 더 높은 온도로 가열될 수 있다.
a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 (결합된 폴리뉴클레오티드를 가진) 분리된 고정된 금속 지지체 물질을 4.5 내지 9의 pH의 수성 완충 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 수성 완충 용액의 pH는 4.5 내지 6.5이다.
고정된 금속 지지체 물질에 결합된 분리된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘(amplicon)을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 상기한 방법들과 같은 공지의 증폭 방법, 예를 들어, PCR 또는 TMA를 여기서 사용할 수 있다. 앰플리콘은 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 앰플리콘, 미결합 앰플리콘, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질로부터 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 단계; 및 고정된 금속 지지체 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 이에 의해 복수의 앰플리콘이 제공될 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 결합되거나 분리된 폴리뉴클레오티드에 있어서, 증폭은 약 37 내지 100℃의 적어도 하나의 온도로 폴리뉴클레오티드를 가열하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인 소정의 이들 실시 형태의 경우, 증폭은 상기한 바와 같이 약 94 내지 97℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥이든지 이중 가닥이든지 간에, 증폭은 추가 온도, 예를 들어, 약 37 내지 74℃의 온도에서 가열하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이들 온도에서, 프라이머는 폴리뉴클레오티드 주형에 어닐링할 수 있으며, 생성된 어닐링된 프라이머는 존재하는 효소에 의해 폴리뉴클레오티드 주형을 따라 연장될 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 증폭은 약 40 내지 65℃, 약 55 내지 65℃, 약 58 내지 62℃, 또는 약 60℃의 온도에서의 가열을 포함한다. 어닐링과 연장 둘 모두는 이들 온도에서 일어날 수 있다. 그러나, 사용되는 특정 효소에 대하여 온도를 최적화하기 위하여 추가의 온도가 이용될 수 있다. 예를 들어, 약 70 내지 74℃의 추가 온도를 연장에 사용할 수 있다. 공지 방법을 이용하여 이들 온도 또는 온도 범위를 통해 사이클링시켜 폴리뉴클레오티드의 증폭을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 소정의 이들 실시 형태의 경우, 결합되거나 분리된 폴리뉴클레오티드에 있어서, 증폭은 약 37 내지 44℃, 예를 들어, 약 42℃의 온도로 폴리뉴클레오티드를 가열하는 것을 포함한다. 일정하게 유지될 수 있는 이들 온도에서, RNA 폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소는 RNA 앰플리콘을 생성하여 높은 수준의 증폭으로 이어질 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 증폭 전에 약 55 내지 100℃, 예를 들어, 약 60℃와 같은 온도로 가열될 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다.
고정된 금속 지지체 물질에 결합된 폴리뉴클레오티드 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘을 제공하는 단계를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질로부터 앰플리콘을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 고정된 금속 지지체 물질의 양이 높은 비율의 앰플리콘에 결합하기에 충분한 경우에는, 본 방법은 고정된 금속 지지체 물질로부터, 앰플리콘 및 선택적으로 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 방출 및 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 앰플리콘 및 선택적으로 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 방출은 7 내지 10의 pH에서 실시된다.
앰플리콘 및 폴리뉴클레오티드의 방출 또는 용출은 용출 시약을 이용하여 실시될 수 있다. 적합한 용출 시약의 예에는 TES 완충액, DIPSO 완충액, TEA 완충액, 트리스 완충액, 인산염 완충액, 파이로인산염 완충액, HEPES 완충액, POPSO 완충액, 트리신 완충액, 바이신 완충액, TAPS 완충액, 수산화암모늄 및 수산화나트륨이 포함된다. 앰플리콘 및/또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 방출은 인산염 완충액, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (트리스) 완충액, 및 수산화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 용출 시약으로 실시된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 용출 시약은 인산염 완충액 또는 트리스-EDTA 완충액이다.
적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는 상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
프로브는 형광 발광에 의해 그리고 그에 의해 검출가능한 시그널을 생성함에 의해 증폭 생성물(앰플리콘)을 검출하기 위해 사용될 수 있으며, 그 강도는 형광 발광 프로브 분자의 수에 의존한다. 프로브 분자는 형광 발광 기와 켄칭(quenching) 기를 가진 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 프로브는 앰플리콘에의 결합시에 또는 앰플리콘에 결합된 프로브의 핵산 증폭 효소 절단 시에 켄칭 기와 형광 발광 기의 분리 또는 탈커플링(decoupling)이 일어날 때 형광 발광될 수 있다. 대안적으로, 앰플리콘에 결합된 프로브는 적절한 파장의 광에 노출될 때 형광 발광될 수 있다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O- 기이다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, y는 3 또는 4이다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 + 또는 Ga3 +이다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 +이다.
상기 방법들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 미세유체 장치 내에서 실시된다.
다른 실시 형태에서, 샘플 물질을 프로세싱하는 장치가 제공되며, 이 장치는
유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는다.
샘플 물질을 프로세싱하기 위한 장치는 샘플 준비, 핵산 증폭, 및/또는 검출을 위한 장소 또는 장소들 및 조건을 제공할 수 있다. 샘플 물질은 하나 또는 복수의 챔버에 위치될 수 있다. 장치는 하나 이상의 챔버의 균일하고 정확한 온도 제어를 제공할 수 있다. 장치는 예를 들어, 샘플 준비가 하나 이상의 챔버에서 발생할 수 있고, 핵산 증폭과 검출이 하나 이상의 다른 챔버에서 발생할 수 있도록, 챔버들 사이에 채널을 제공할 수 있다. 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치를 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치는 미세유체 장치이다. 미세유체 장치의 일부 예는 미국 특허 출원 공개 제2002/0064885호 (베딩햄(Bedingham) 등); 제2002/0048533호 (베딩햄 등); 제2002/0047003호 (베딩햄 등); 및 제2003/138779호 (파타사라티(Parthasarathy) 등); 미국 특허 제6,627,159호; 제6,720,187호; 제6,734,401호; 제6,814,935호; 제6,987,253호; 제7,026,168호, 및 제7,164,107호; 및 국제특허 공개 WO 2005/061084 A1호 (베딩햄 등)에 개시된다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 한 가지 예시적인 장치는 도 1에 도시된 미세유체 장치이다. 장치(10)는 도 1에 예시된 바와 같이 원형 디스크의 형상일 수 있지만, 다른 형상이 사용될 수 있다. 바람직한 형상은 회전될 수 있는 형상이다. 도 1의 장치(10)는 제1 챔버(100) 및 채널(300)을 통해 제1 챔버(100)와 유체 연통할 수 있는 제2 챔버(200)를 포함한다. 챔버(100, 200)의 형상은 도 1에 예시된 바와 같이 원형일 수 있지만, 다른 형상, 예를 들어, 타원형, 눈물방울형(tear-drop), 삼각형, 및 많은 다른 형상이 사용될 수 있다. 도 1은 챔버(100)와 챔버(200)의 하나의 조합을 예시하지만, 복수의 그러한 조합이 장치(10)에 포함될 수 있고 복수의 샘플을 이와 동시에 프로세싱하는 것이 바람직할 수도 있음이 이해되어야 한다.
도 1에 예시된 장치(10)는 챔버(100) 내에 고정된 금속 지지체 물질(50)을 포함한다. 고정된 금속 지지체 물질(50)은 작은 원으로 도 1에 예시된, 미세입자(미소구체, 미세비드 등), 수지 입자 등과 같은 복수의 자성 또는 비자성 입자일 수 있다. 대안적으로, 고정된 금속 지지체 물질은 상기한 바와 같이 이용되는 기재에 따라, 필터, 프릿, 필름, 복수의 섬유, 유리 슬라이드 등의 형태일 수 있다. 다른 대안에서는, 고정된 금속 지지체 물질은 챔버(100)의 내벽일 수 있다.
세포 또는 바이러스에의 결합, 용해, 세포 또는 바이러스 유래의 파편의 분해, 폴리뉴클레오티드 결합, 세척 등과 같은 샘플 준비는 챔버(100) 내의 물질을 채널(300)을 통해 챔버(200)로 이동시키기 전에 챔버(100)에서 실시되어야 한다. 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에의 결합에 의해 샘플 물질로부터 분리된 후, 고정된 금속 지지체 물질을 챔버(200)로 이동시킬 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드를 고정된 금속 지지체 물질로부터 용출시키고 생성된 용출물을 챔버(200)로 이동시킬 수 있다. 채널(300)은 챔버(100) 내의 유체 및/또는 고정된 금속 지지체 물질이 챔버(200) 내로 이동하기 위한 경로를 제공할 수 있다. 이것은 예를 들어, 유체 및/또는 입자 형태의 고정된 금속 지지체 물질에 충분한 관성력(g-force)을 가하여 당해 물질이 채널(300)을 통해 챔버(200) 내로 강제로 가게 함으로써 실시될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 챔버(200) 내의 압력을 감소시킴으로써, 챔버(100) 내의 압력을 증가시킴으로써, 또는 이들 둘 모두에 의해, 채널(300)에 압력 차이를 가하고, 그럼으로써 챔버(100) 내의 물질이 채널(300)을 통해 챔버(200) 내로 이동하도록 할 수 있다. 챔버(100) 또는 채널(300)은 선택적인 밸브(150)를 구비할 수 있다. 밸브(150)는 충분한 관성력에의 노출, 용융, 기화 등에 의해 개방되도록 제작될 수 있다. 예를 들어, 밸브는 개구가 레이저 제거, 집중된 광학적 가열, 또는 유사한 수단을 통해 형성될 수 있는 격벽 형태로 제작될 수 있다. 그러한 밸브는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0126312 A1호 (베딩햄 등) 및 제2005/0142571 A1호 (파타사라티 등)에 개시된다.
도 1에 도시되지 않지만, 챔버(100, 200) 및 채널(300)은 다른 챔버, 채널, 저장부, 및/또는 기타와 유체 연통할 수 있다. 이들은 필요에 따라 챔버(100 또는 200)에 또는 챔버로부터 다양한 시약, 샘플 물질(들), 또는 샘플 물질의 성분(들)을 공급하거나 제거하는 것을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 물질, 용해 시약, 분해 시약, 세척 완충액, 결합 완충액, 용출 완충액, 및/또는 기타는 챔버(100)에 공급되고/되거나 챔버(100)로부터 제거될 수 있으며, 프라이머, 뉴클레오티드 트라이포스페이트, 증폭 효소, 프로브, 완충액, 및/또는 기타는 챔버(200)에 공급될 수 있다. 개별 시약 또는 시약들의 조합은 장치(10)에 포함되든지 본 명세서에 개시된 장치의 임의의 실시 형태에 포함되든지 간에, 상이한 챔버 내에 두어져서, 후속적으로 필요에 따라 시약이 샘플 물질 또는 샘플 물질의 성분과 접촉되도록 할 수 있다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 제1 챔버는 추가로 용해 시약을 함유한다. 용해 시약은 상기한 용해 시약들 중 임의의 하나 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 세포가 고정된 금속 지지체 물질에 결합된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 세포는 박테리아 세포이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에 결합된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이다.
적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 제1 챔버는 추가로 pH가 4.5 내지 6.5인 상청액을 함유한다. 이들 실시 형태의 소정의 경우, 상청액의 pH는 5 내지 6이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 상청액에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 이외의 것이다.
적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 제1 챔버는 추가로 pH가 4.5 내지 9인 상청액을 함유한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 상청액의 pH는 5.5 내지 8.0이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O-기이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, y는 3 또는 4이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 + 또는 Ga3 +이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 +이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 장치는 미세유체 장치이다.
샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 장치의 적어도 하나의 챔버는 핵산 조작 기술의 적어도 한 단계에서 사용될 수 있는 적어도 하나의 추가 시약을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 추가 시약은 샘플 준비 단계, 핵산 증폭 단계, 및/또는 핵산을 검출하거나 분석하기 위한 과정에서의 검출 단계에서 사용될 수 있다. 샘플 준비는 예를 들어, 핵산을 함유한 생물학적 물질의 포획, 핵산을 함유한 생물학적 물질의 세척, 핵산을 함유한 생물학적 물질, 예를 들어, 세포 또는 바이러스의 용해, 세포 파편의 분해, 생물학적 샘플로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 단리, 포획 또는 분리, 및/또는 핵산의 용출을 포함할 수 있다. 핵산 증폭은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부의 상보성 폴리뉴클레오티드를 검출에 충분한 수로 생성하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 예를 들어, 관찰하는 것, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 존재 및/또는 양을 나타내는 형광을 검출하는 것을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 장치의 적어도 하나의 챔버는 핵산 증폭 효소, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 뉴클레오티드 트라이포스페이트, 완충액, 염, 계면활성제, 염료, 핵산 대조군, 환원제, 소 혈청 알부민, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 시약을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 장치의 적어도 하나의 챔버는 핵산 증폭 효소, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 뉴클레오티드 트라이포스페이트, 완충액, 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 시약을 포함한다.
"핵산 증폭 효소"는 존재하는 DNA 또는 RNA 주형으로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 생성을 촉매할 수 있는 효소를 말한다. 소정의 실시 형태의 경우, 핵산 증폭 효소는 핵산 또는 핵산의 일부를 증폭시키는 과정에 사용될 수 있는 효소이다. 소정의 실시 형태의 경우, 핵산 증폭 효소는 DNA 및/또는 RNA 폴리머라아제 및 역전사효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시 형태의 경우, DNA 폴리머라아제는 Taq DNA 폴리머라아제, Tfl DNA 폴리머라아제, Tth DNA 폴리머라아제, Tli DNA 폴리머라아제, 및 Pfu DNA 폴리머라아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 역전사효소는 RNase H가 없는, AMV 역전사효소, M-MLV 역전사효소, 및 M-MLV 역전사효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. M-MLV 및 AMV와 같은 레트로바이러스 역전사효소는 RNase H 활성뿐만 아니라, RNA-유도된 DNA 폴리머라아제 활성, DNA 유도된 폴리머라아제 활성도 보유한다. 소정의 실시 형태의 경우, 핵산 증폭 효소는 DNA 폴리머라아제 또는 RNA 폴리머라아제이다. 소정의 실시 형태의 경우, 핵산 증폭 효소는 Taq DNA 폴리머라아제이다. 소정의 실시 형태의 경우, 핵산 증폭 효소는 T7 RNA 폴리머라아제이다.
"올리고뉴클레오티드"는 프라이머, 종결 올리고뉴클레오티드, 연장(extender) 올리고뉴클레오티드, 또는 프로모터 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 소정의 실시 형태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 프라이머이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 이루어지며, 이는 증폭될 핵산의 영역(표적 서열)을 결정한다. 적절한 조건 하에서, 프라이머 내의 염기는 관심있는 영역 내의 상보성 염기에 결합하며, 이어서 핵산 증폭 효소가 표적 서열에 의해 결정되는 바와 같이 프라이머를 연장한다. 많은 프라이머가 알려져 있고 구매가능하며, 다른 것들은 공지 방법을 이용하여 설계되어 제조될 수 있다.
프로브는 형광 발광에 의해 그리고 그에 의해 검출가능한 시그널을 생성함에 의해 증폭 생성물(앰플리콘)의 검출을 허용하며, 그 강도는 형광 발광 프로브 분자의 수에 의존한다. 프로브 분자는 켄칭 기와 커플링된 형광 발광 기 및 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 프로브는 앰플리콘에의 결합시에 또는 앰플리콘에 결합된 프로브의 핵산 증폭 효소 절단 시에 켄칭 기와 형광 발광 기의 분리 또는 탈커플링이 일어날 때 형광 발광될 수 있다. 대안적으로, 앰플리콘에 결합된 프로브는 적절한 파장의 광에 노출될 때 형광 발광될 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 프로브는 탁맨(TAQMAN) 프로브 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), 분자 비콘(molecular beacon), 스콜피온스(SCORPIONS) 프로브 (영국 햄프셔 소재의 유로젠텍 리미티드(Eurogentec Ltd.)), SYBR 그린(GREEN) (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠(Invitrogen)), 프렛(FRET) 혼성화 프로브 (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences)), 콴티텍트(Quantitect) 프로브 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen)), 및 분자 토치(torch)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
필요에 따라 리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트를 비롯한 뉴클레오티드 트라이포스페이트(NTP)는 핵산 증폭 효소에 의해 존재하는 DNA 또는 RNA 주형으로부터 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 생성함에 있어서 사용된다. 예를 들어, DNA를 증폭할 때, dNTP(데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트) 세트가 사용되며, 여기에는 전형적으로 dATP(2'-데옥시아데노신 5'-트라이포스페이트), dCTP(2'-데옥시시토딘 5'-트라이포스페이트), dGTP(2'-데옥시구아노신 5'-트라이포스페이트), 및 dTTP(2'-데옥시티미딘 5'-트라이포스페이트)가 포함된다.
완충액은 반응 매질의 pH를 조절하기 위해 사용된다. 매우 다양한 완충액이 알려져 있으며 구매가능하다. 예를 들어, 모르폴린 완충액, 예를 들어, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)이 약 5.0 내지 6.5의 유효 pH 범위를 제공하는 데 적합할 수 있으며, 이미다졸 완충액은 약 6.2 내지 7.8의 유효 pH 범위를 제공하는 데 적합할 수 있으며, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (트리스(TRIS)) 완충액 및 소정의 피페라진 완충액, 예를 들어, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES) 은 약 7.0 내지 9.0의 유효 pH 범위를 제공하는 데 적합할 수 있다. 완충액은 폴리머라아제와 같은 핵산 증폭 효소의 활성과 충실도(fidelity)에 영향을 줄 수 있다. 소정의 실시 형태의 경우, 완충액은 7.5 내지 8.5 범위에서 pH를 조절할 수 있는 적어도 하나의 완충액으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 완충액은 트리스-기반 완충액이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 완충액은 트리스-EDTA, 트리스 완충된 염수, 트리스 아세테이트-EDTA, 및 트리스 보레이트-EDTA 중 적어도 하나로 이루어진 군으로부터 선택된다. 계면활성제 및 세제, 예를 들어, CHAPS 또는 후술된 계면활성제와 같은 다른 물질이 이들 완충액에 포함될 수 있다. 완충액에는 RNase 및 DNase가 없을 수 있다.
염은 핵산 증폭 효소의 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 유리 마그네슘 이온은 Taq DNA 폴리머라아제와 같은 소정의 폴리머라아제가 활성을 갖게 되는 데 필요하다. 다른 실시예에서는, 망간 이온의 존재 하에서, Tfl DNA 폴리머라아제와 Tth DNA 폴리머라아제는 주형으로 RNA를 이용하여, 뉴클레오티드를 DNA로 중합하는 것을 촉매할 수 있다. 추가 예에서는, 염화칼륨과 같은 소정의 염의 존재는 Taq DNA 폴리머라아제와 같은 소정의 폴리머라아제의 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 염은 마그네슘, 망간, 아연, 나트륨 및 칼륨 염 중 적어도 하나로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 염은 염화마그네슘, 염화망간, 황산아연, 아세트산아연, 염화나트륨 및 염화칼륨 중 적어도 하나이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 염은 염화마그네슘이다.
계면활성제는 세포의 용해 또는 덩어리 분리(de-clumping), 혼합의 개선, 예를 들어, 미세유체 장치와 같은 장치에서의 유체 유동의 향상을 위해 포함될 수 있다. 계면활성제는 비이온성, 예를 들어, 상표명 플루로닉으로 입수가능한 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드) 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 상표명 트윈 20으로 입수가능한 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 상표명 트리톤 X-100으로 입수가능한 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜; 음이온성, 예를 들어, 리튬 라우릴 설페이트, N-라우로일살코신 소듐염, 및 소듐 도데실 설페이트; 양이온성, 예를 들어, 알킬 피리디늄 및 4차 암모늄염; 쯔비터이온성, 예를 들어, (베타인 패밀리의 계면활성제에서) N-(C10-C16 알킬)-N,N-다이메틸글리신 베타인; 및/또는 플루오로계면활성제, 예를 들어, 플루오라드(FLUORAD)-FS 300 (미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠(3M)) 및 조닐(ZONYL) (미국 델라웨어주 윌밍톤 소재의 듀폰 디 네모아 컴퍼니(Dupont de Nemours Co.))일 수 있다.
염료는 시약층에 또는 시약층과 접촉하는 유체에 색 또는 형광을 부여하기 위하여 시약층에 포함될 수 있다. 색 또는 형광은 시약층이 시약층과 접촉하는 유체에 용해되거나, 분산되거나 현탁되었음을 입증하는 시각적 증거, 또는 검출가능한 흡광 또는 발광을 제공할 수 있다. 소정의 실시 형태의 경우, 염료는 형광 염료, 예를 들어, 플루오레세인, 시아닌(Cy3 및 Cy5를 포함함), 텍사스 레드(Texas Red), 록스(ROX), 팸(FAM), 조(JOE), SYBR 그린, 올리그린(OliGreen), 및 헥스(HEX)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 형광 염료 외에, 자외선/가시선 염료, 예를 들어, 다이클로로페놀, 인도페놀, 사프라닌, 크리스탈 바이올렛, 및 구매가능한 식품 착색제가 또한 이용될 수 있다.
핵산 대조군은 샘플 제제 또는 증폭 또는 검출 시약 중 어느 하나와 함께 건조되는 공지된 양의 핵산 또는 핵산 함유 물질이다. 이 내부 대조군은 샘플 물질 또는 시료에 의한 저해뿐만 아니라 시약 완전성도 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 선형화된 플라스미드 DNA 대조군이 전형적으로 핵산 내부 대조군으로 사용된다.
환원제는 예를 들어, 샘플 물질 또는 시료에 존재할 수 있는 단백질 내의 다이설파이드 결합을 환원시킬 수 있고, 그럼으로써 샘플 물질의 점도를 감소시키고 유동 및 혼합 특징을 개선시킨다. 소정의 실시 형태의 경우, 환원제는 바람직하게는 적어도 하나의 티올기를 함유한다. 환원제의 예에는 N-아세틸-L-시스테인, 다이티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 및 2-메르캅토에틸아민이 포함된다.
소 혈청 알부민은 핵산 증폭 동안 효소를 안정화시키기 위해 사용될 수 있으며; 다이메틸 설폭사이드(DMSO)는 DNA 주형에서 2차 구조의 형성을 저해하기 위해 사용될 수 있으며; 글리세롤은 증폭 과정을 개선할 수 있으며, 방부제로 사용될 수 있으며, 폴리머라아제와 같은 효소를 안정화시킬 수 있으며; 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 및 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N'N'-테트라아세트산(EGTA)은 금속 이온 킬레이팅제로 사용될 수 있으며 또한 반응을 손상시킬 수 있는 금속-결합 효소(RNase)를 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위한 키트가 제공되며, 이 키트는
유체를 수용하거나 전달할 수 있는 적어도 하나의 챔버를 가진 장치;
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서 M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 및 용출 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함한다. 이 키트의 소정의 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 챔버는 고정된 금속 지지체 물질을 함유한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 고정된 금속 지지체 물질 기재는 컬럼의 내벽, 필터, 미세플레이트, 미세필터 플레이트, 미세적정 플레이트, 프릿, 피펫 팁, 필름, 복수의 미소구체, 복수의 섬유, 및 유리 슬라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하기 위한 키트가 제공되며, 이 키트는 샘플 물질을 프로세싱하기 위한 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 하나를 포함하며, 이 장치는
유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는다.
소정의 이들 실시 형태의 경우, 키트는 용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 용출 완충액, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시약을 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 제1 챔버는 용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 용출 완충액, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시약 적어도 하나를 함유한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이다.
상기 조성물, 방법, 장치, 또는 키트 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 고정된 금속 지지체 물질 기재는 복수의 미소구체이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 미소구체는 자성이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 미소구체의 직경은 0.1 내지 10 마이크로미터(μ)이다.
샘플 물질을 포함하는 상기 방법, 장치 또는 키트 실시 형태들 중 임의의 하나를 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 식품 샘플, 비강 샘플, 인후 샘플, 담 샘플, 혈액 샘플, 창상 샘플, 샅 샘플, 액와 샘플, 회음부 샘플, 및 배설물 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 비강 샘플, 배설물 샘플, 또는 혈액 샘플이다. 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 배설물 샘플이다. 소정의 실시 형태의 경우, 샘플 물질은 혈액 샘플이다.
다른 실시 형태에서, 미생물 결합 조성물이 제공되며, 이 조성물은 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합된, 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 포함하며; 여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2이다.
다른 실시 형태에서는, 미생물을 단리하는 방법이 제공되며, 이 방법은 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온 My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 가진 것으로 생각되는 샘플을 제공하는 단계; 및 조성물을 샘플과 접촉시키는 단계 (여기서, 샘플로부터의 복수의 미생물 중 적어도 일부는 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합되며; M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함한다.
미생물을 단리하는 상기 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은 샘플로부터의 복수의 미생물의 적어도 일부가 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합된 후에 샘플의 나머지로부터 고정된 금속 지지체 물질을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 본 방법은 복수의 미생물 중 적어도 일부를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 검출은 생물발광(bioluminescence)에 의한 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검출, 폴리다이아세틸렌(PDA) 비색 검출, 핵산 검출, 면역학적 검출, 성장 기반 검출, 현미경에 의한 시각적 검출, 자기 저항, 및 표면 음파 검출로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 방법에 의해 실시된다.
ATP 검출은 미생물 로드의 비특이적 지시자로서 사용될 수 있다. (세포외 ATP와 같은 방해 성분을 함유할 수 있는) 샘플의 나머지로부터 비특이적으로 결합된 미생물을 가진 고체 지지체를 분리한 후, 미생물을 용해시키고 루시페린 및 루시퍼라아제와 접촉시킨다. 이어서, 그 강도가 포획된 미생물의 수에 비례하는 얻어진 생물발광은 예를 들어, 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정된다.
PDA 비색 검출은 비색 센서를 미생물과 접촉시켜 특정 미생물 또는 미생물의 스펙트럼을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 비색 센서는 리셉터 및 다이아세틸렌 화합물 또는 폴리다이아세틸렌을 포함하는 중합된 조성물을 포함한다. 미생물이 리셉터에 의해 결합되면, 센서에 가해진 생성된 형태적 변화가 측정가능한 색 변화를 야기한다. 색 변화는 예를 들어, 시각적으로 또는 비색계를 이용하여 측정될 수 있다. 리셉터에 결합할 수 있는 프로브를 이용하여 미생물을 간접적으로 검출하는 것 또한 이용할 수 있다. 그러한 비색 센서를 이용하는 PDA 비색 검출은 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2006/0134796A1호, 국제특허 공개 WO 2004/057331A1호 및 WO 2007/016633A1호 및 양수인의 공계류중인 미국 특허 출원 제60/989298호에 개시된다.
DNA와 RNA를 비롯한 핵산의 검출 방법은 종종 포획된 미생물이 용해되어 검출에 이용가능한 세포 핵산을 제조한 후 상기한 바와 같이 핵산을 증폭하거나 혼성화하는 것을 포함한다.
면역학적 검출은 박테리아 표면에서 마커로서 작용하는, 단백질, 프로테오글리칸, 또는 항원 활성을 가진 기타 물질과 같은 생물학적 분자의 검출을 포함한다. 항원 물질의 검출은 전형적으로 항체, 파지 디스플레이와 같은 과정으로부터 선별된 폴리펩티드, 또는 스크리닝 과정으로부터의 압타머(aptamer)에 의해서이다. 면역학적 검출 방법은 알려져 있으며, 그 예에는 면역침전 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)이 포함된다. 항체 결합은 형광 염료, 양자점(quantum dot), 또는 화학발광 또는 색변화를 생성할 수 있는 효소로 1차 또는 2차 항체를 표식시킴에 의한 것을 비롯한 몇몇 방식으로 검출될 수 있다. 결합 이벤트를 검출하고 정량화하기 위해 플레이트 판독기 및 측방 유동 장치가 이용되어 왔다.
성장 기반 검출 방법은 잘 알려져 있으며 일반적으로 미생물을 도말하고, 특정 조건 하에서 미생물을 배양하여 미생물의 수를 증가시키고, 미생물을 계수하는 것을 포함한다. 페트리필름(PETRIFILM) 호기성 균류 카운트 플레이트(Aerobic Count Plate) (미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니)를 이 목적을 위해 사용할 수 있다.
자기 저항 검출은 자성 입자에 의해 생성된 자기장의 검출에 의해 실시된다.
예를 들어, 국제특허 공개 WO 2005/071416호에 개시된 표면 음파 검출이 또한 미생물 검출을 위해 알려져 있다. 예를 들어, 벌크 음파-임피던스 센서는 고체 배지의 표면상의 미생물의 성장과 수를 검출하기 위해 이용되었다. 이 방법에 의해 검출될 수 있는 미생물의 농도 범위는 3.4 × 102 내지 6.7 × 106개의 세포/㎖이었다. 문헌[Le Deng et al., J. Microbiological Methods, Vol. 26, Iss. 10-2, 197-203 (1997)]을 참조한다. 상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, M은 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, y는 3 또는 4이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, My +는 Zr4 +, Ga3 +, 또는 Fe3 +이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, My +은 Zr4+ 또는 Ga3+이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, My+는 Zr4+이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O- 기이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 복수의 미생물은 둘 이상의 상이한 유형의 박테리아, 효모, 곰팡이, 또는 그 조합을 포함한다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 복수의 미생물은 둘 이상의 상이한 유형의 박테리아를 포함한다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 미생물은 바실러스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 코르니에박테리아(Cornyebacteria), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 비브리오(Vibrio), 예르시니아(Yersinia), 칸디다(Candida), 페니실륨(Penicillium), 아스페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium), 푸사리움(Fusarium), 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 박테리아만을 포함하는 상기 실시 형태를 지칭함에 있어서, 칸디다, 페니실륨, 아스페르길루스, 클라도스포리움, 및 푸사리움은 포함되지 않는다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 미생물은 살모넬라, 이.콜리, 캄필로박터, 리스테리아, 또는 그 조합을 포함한다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 고정된 금속 지지체 물질의 기재는 비드, 젤, 필름, 시트, 막, 입자, 섬유, 필터, 플레이트, 스트립, 튜브, 컬럼, 웰, 용기의 벽, 모세관, 피펫 팁, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 기재는 자성 입자이다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 자성 입자의 직경은 약 0.02 내지 약 5 마이크로미터이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 조성물의 pH는 4.5 내지 6.5이다. 미생물은 이 pH 범위에서 고정된 금속 지지체 물질에 효율적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 소정의 실시 형태의 경우, pH는 바람직하게는 5 내지 6 또는 약 5.5이다.
일부 검출 방법의 경우, 지지체 물질 없이 검출을 실시하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, PDA 센서는 자성 입자의 존재에 의해 강하게 영향을 받는다. 상기의 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 본 방법은, pH를 8 내지 10으로, 그리고 일부 실시 형태에서는 약 9로 상승시켜 고정된 금속 지지체 물질로부터 미생물을 방출하는 단계를 추가로 포함한다.
M이 지르코늄일 때, 효과적인 미생물 결합은 보다 넓은 pH 범위, 예를 들어, 약 4.5 내지 약 9의 범위에 걸쳐 실시될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 지르코늄은 다른 선택된 금속 이온보다 높은 pH 값에서 더 효과적이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, M은 지르코늄이며, 조성물의 pH는 4.5 내지 9이다.
상기의 미생물 결합 조성물 및 미생물 단리 방법을 비롯한 소정의 실시 형태의 경우, 샘플은 임상 샘플, 식품 샘플, 및 환경 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 샘플은 원료 샘플 또는 이전에 프로세싱된 샘플일 수 있다. 소정의 이들 실시 형태의 경우, 샘플은 식품 샘플이다.
실시 형태의 목록
하기는 상기한 실시 형태들 중 일부의 목록이며, 여기서 "emb"는 "실시 형태"를 의미하며 "embs"는 "실시 형태들"을 의미한다.
1.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는 조성물.
2.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하며,
pH는 4.5 내지 6.5인 조성물.
3. 조성물에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 이외의 것인 실시 형태 2의 조성물.
4. 조성물의 pH가 5 내지 6인 실시 형태 2 또는 실시 형태 3의 조성물.
5. 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O- 기인 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 하나의 조성물.
6. M이 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 조성물.
7. y는 3 또는 4인 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 조성물.
8. My +가 Zr4 + 또는 Ga3 +인 실시 형태 1 내지 실시 형태 7 중 어느 하나의 조성물.
9.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법.
10.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
샘플 물질을 pH 4.5 내지 6.5에서, -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2이며; 조성물의 pH는 4.5 내지 6.5임)를 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법.
11. 조성물에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 외의 다른 것인 실시 형태 10의 방법.
12. 조성물의 pH가 5 내지 6인 실시 형태 10 또는 실시 형태 11의 방법.
13. 샘플 물질이 핵산을 함유한 생물학적 물질을 포함하는 실시 형태 9 내지 실시 형태 12 중 어느 하나의 방법.
14. 샘플 물질이 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 실시 형태 13의 방법.
15. 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시키기 전에 샘플 물질에 용해 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 14의 방법.
16. 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시킬 때 샘플 물질이 용해 시약과 접촉되는 실시 형태 14의 방법.
17. 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+와 접촉시키는 단계는 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부 및 b) 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 제공하는 실시 형태 14의 방법.
18. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부로부터 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 17의 방법.
19. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 18의 방법.
20. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 19의 방법.
21. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 19의 방법.
22. 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 21의 방법.
23. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부에 용해 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 17 또는 실시 형태 18의 방법.
24. 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 각각 실시 형태 9에 종속하는 실시 형태 16 또는 실시 형태 23의 방법.
25. 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 각각 실시 형태 10, 실시 형태 11, 및 실시 형태 12 중 어느 하나에 종속하는 실시 형태 16 또는 실시 형태 23의 방법.
26. 세포, 바이러스, 또는 그 조합이 세포인 실시 형태 14 내지 실시 형태 25 중 어느 하나의 방법.
27. 세포가 박테리아 세포인 실시 형태 26의 방법.
28. 박테리아 세포가 4.5 내지 9의 pH의 결합 완충액의 존재 하에서 고정된 금속 지지체 물질에 결합되는, 실시 형태 17에 종속하는 실시 형태 27의 방법.
29. pH가 4.5 내지 6.5인 실시 형태 28의 방법.
30. b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 24에 종속하는 실시 형태 9, 실시 형태 24, 및 실시 형태 26 및 실시 형태 27 중 어느 하나의 방법.
31. b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 19에 종속하는 실시 형태 10, 실시 형태 11, 실시 형태 12, 실시 형태 25, 및 실시 형태 26 및 실시 형태 27 중 어느 하나의 방법.
32. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 분리된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 4.5 내지 9의 pH의 수성 완충 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 30의 방법.
33. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 분리된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 4.5 내지 6.5의 pH의 수성 완충 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 31의 방법.
34. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 30 또는 실시 형태 32의 방법.
35. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 94 내지 97℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 34의 방법.
36. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 34 또는 실시 형태 35의 방법.
37. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 37 내지 44℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 34의 방법.
38. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭 전에 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 37의 방법.
39. 고정된 금속 지지체 물질로부터 앰플리콘을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 34 내지 38중 어느 하나의 방법.
40. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 31 또는 실시 형태 33의 방법.
41. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 94 내지 97℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 40의 방법.
42. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드인 실시 형태 40의 방법.
43. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 41 또는 실시 형태 42의 방법.
44. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 37 내지 44℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 40 또는 실시 형태 42의 방법.
45. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭 전에 약 60℃의 온도로 가열하는 실시 형태 44의 방법.
46. 고정된 금속 지지체 물질로부터 앰플리콘을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 40 내지 실시 형태 45 중 어느 하나의 방법.
47. 고정된 금속 지지체 물질로부터 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 단계; 및
고정된 금속 지지체 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 30 또는 실시 형태 32의 방법.
48. 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 추가로 포함하는 실시 형태 47의 방법.
49. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 94 내지 97℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 48의 방법.
50. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 49의 방법.
51. 증폭은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 약 37 내지 44℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 48의 방법.
52. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭 전에 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 51의 방법.
53. 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 39, 및 실시 형태 48 내지 실시 형태 52 중 어느 하나의 방법.
54. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 고정된 금속 지지체 물질로부터 방출하는 단계; 및
고정된 금속 지지체 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 31 또는 실시 형태 33의 방법.
55. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 방출은 7 내지 10의 pH에서 실시되는 실시 형태 54의 방법.
56. 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 방출은 인산염 완충액, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액, 및 수산화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 용출 시약으로 실시되는 실시 형태 54 또는 실시 형태 55의 방법.
57. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 54, 실시 형태 55 및 실시 형태 56 중 어느 하나의 방법.
58. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 94 내지 97℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 57의 방법.
59. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드인 실시 형태 57의 방법.
60. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 58 또는 실시 형태 59의 방법.
61. 증폭은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 약 37 내지 44℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 실시 형태 57 또는 실시 형태 59의 방법.
62. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭 전에 약 60℃의 온도로 가열하는 실시 형태 61의 방법.
63. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 46, 및 실시 형태 57 내지 실시 형태 62 중 어느 하나의 방법.
64. 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O- 기인 실시 형태 9 내지 실시 형태 63 중 어느 하나의 방법.
65. M이 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 9 내지 실시 형태 64 중 어느 하나의 방법.
66. y는 3 또는 4인 실시 형태 9 내지 실시 형태 65 중 어느 하나의 방법.
67. My +가 Zr4 + 또는 Ga3 +인 실시 형태 9 내지 실시 형태 66 중 어느 하나의 방법.
68. My +가 Zr4 +인 실시 형태 9 내지 실시 형태 67 중 어느 하나의 방법.
69. 방법이 미세유체 장치 내에서 실시되는 실시 형태 9 내지 실시 형태 68 중 어느 하나의 방법.
70.
유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는, 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치.
71. 적어도 하나의 제1 챔버는 용해 시약을 추가로 함유하는 실시 형태 70의 장치.
72. 복수의 세포가 고정된 금속 지지체 물질에 결합되는 실시 형태 70 또는 실시 형태 71의 장치.
73. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 고정된 금속 지지체 물질에 결합되는 실시 형태 70 내지 실시 형태 72 중 어느 하나의 장치.
74. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드인 실시 형태 73의 장치.
75. 제1 챔버가 4.5 내지 6.5의 pH를 갖는 상청액을 추가로 함유하는 실시 형태 73의 장치.
76. 상청액의 pH가 5 내지 6인 실시 형태 75의 장치.
77. 제1 챔버가 4.5 내지 9의 pH를 갖는 상청액을 추가로 함유하는 실시 형태 74의 장치.
78. 상청액의 pH가 5.5 내지 8.0인 실시 형태 77의 장치.
79. 상청액에 감지할 수 있는 수준으로 포함된 임의의 염은 무기 염 또는 1 내지 4개 탄소 원자-함유 염 이외의 것인 실시 형태 75 또는 실시 형태 76의 장치.
80. 복수의
-C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O-기인 실시 형태 70 내지 실시 형태 79 중 어느 하나의 장치.
81. M이 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 70 내지 실시 형태 80 중 어느 하나의 장치.
82. y는 3 또는 4인 실시 형태 70 내지 실시 형태 81 중 어느 하나의 장치.
83. My +가 Zr4 + 또는 Ga3 +인 실시 형태 70 내지 실시 형태 82 중 어느 하나의 장치.
84. My +가 Zr4 +인 실시 형태 70 내지 실시 형태 83 중 어느 하나의 장치.
85. 장치가 미세유체 장치인 실시 형태 70 내지 실시 형태 84 중 어느 하나의 장치.
86.
유체를 수용하거나 전달할 수 있는 적어도 하나의 챔버를 가진 장치;
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서 M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 및 용출 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위한 키트.
87. 적어도 하나의 챔버는 고정된 금속 지지체 물질을 함유하는 실시 형태 86의 키트.
88. 적어도 하나의 챔버는 컬럼인 실시 형태 86 또는 실시 형태 87의 키트.
89. 적어도 하나의 챔버는 미세유체 장치 내에 있는 실시 형태 86 또는 실시 형태 87의 키트.
90. 고정된 금속 지지체 물질 기재는 컬럼의 내벽, 필터, 미세플레이트, 미세필터 플레이트, 미세적정 플레이트, 프릿, 피펫 팁, 필름, 복수의 미소구체, 복수의 섬유, 및 유리 슬라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 86 또는 실시 형태 87의 키트.
91. 실시 형태 70 내지 실시 형태 85 중 어느 하나의 장치를 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하기 위한 키트.
92. 용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 용출 완충액, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시약을 추가로 포함하는 실시 형태 91의 키트.
93. 적어도 하나의 제1 챔버는 용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 용출 완충액, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 함유하는 실시 형태 92의 키트.
94. 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드인 실시 형태 86 내지 실시 형태 93 중 어느 하나의 키트.
95. 고정된 금속 지지체 물질 기재가 복수의 미세입자인, 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시 형태 9 내지 실시 형태 69 중 어느 하나의 방법, 또는 실시 형태 70 내지 실시 형태 85 중 어느 하나의 장치, 또는 실시 형태 86 내지 실시 형태 94 중 어느 하나의 키트.
96. 미세입자가 자성인 실시 형태 95의 조성물, 실시 형태 95의 방법, 또는 실시 형태 95의 장치, 또는 실시 형태 95의 키트.
97. 미세입자의 직경이 0.1 내지 10 마이크로미터인 실시 형태 95 및 실시 형태 96 중 어느 하나의 조성물, 실시 형태 95 및 실시 형태 96 중 어느 하나의 방법, 또는 실시 형태 95 및 실시 형태 96 중 어느 하나의 장치, 또는 실시 형태 95 및 실시 형태 96 중 어느 하나의 키트.
98. 샘플 물질이 식품 샘플, 비강 샘플, 인후 샘플, 담 샘플, 혈액 샘플, 상처 샘플, 샅 샘플, 액와 샘플, 회음부 샘플, 및 배설물 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 9 내지 실시 형태 69 및 실시 형태 95 내지 실시 형태 97 중 어느 하나의 방법, 또는 실시 형태 70 내지 실시 형태 85 및 실시 형태 95 내지 실시 형태 97 중 어느 하나의 장치, 또는 실시 형태 86 내지 실시 형태 94 및 실시 형태 95 내지 실시 형태 97 중 어느 하나의 키트.
99.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합된, 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 포함하는 조성물.
100.
기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온 My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 갖는 것으로 생각되는 샘플을 제공하는 단계; 및
조성물을 샘플과 접촉시키는 단계 (여기서, 샘플로부터의 복수의 미생물 중 적어도 일부는 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합되며; M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는, 미생물을 단리하는 방법.
101. 샘플로부터의 복수의 미생물의 적어도 일부가 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합하게 된 후에 샘플의 나머지로부터 고정된 금속 지지체 물질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 100의 방법.
102. 복수의 미생물 중 적어도 일부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 101의 방법.
103. 검출은 생물발광에 의한 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검출, 폴리다이아세틸렌(PDA) 비색 검출, 핵산 검출, 면역학적 검출, 성장 기반 검출, 현미경에 의한 시각적 검출, 자기 저항, 및 표면 음파 검출로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 방법에 의해 실시되는 실시 형태 102의 방법.
104. M이 지르코늄, 갈륨, 및 철로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 99의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 103 중 어느 하나의 방법.
105. y는 3 또는 4인 실시 형태 99 또는 실시 형태 104의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 104 중 어느 하나의 방법.
106. My +는 Zr4 +, Ga3 +, 또는 Fe3 +인 실시 형태 99, 실시 형태 104 또는 실시 형태 105 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 105 중 어느 하나의 방법.
107. 복수의 -C(O)O- 또는
-P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기는 복수의 -C(O)O-기인 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 106 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 106 중 어느 하나의 방법.
108. 복수의 미생물은 둘 이상의 상이한 유형의 박테리아, 효모, 곰팡이, 또는 그 조합을 포함하는 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 107 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 107 중 어느 하나의 방법.
109. 미생물은 바실러스, 보르데텔라, 보렐리아, 캄필로박터, 클로스트리듐, 코르니에박테리아, 엔테로박터, 엔테로코커스, 에스케리키아, 헬리코박터, 레지오넬라, 리스테리아, 마이코박테리움, 나이세리아, 슈도모나스, 살모넬라, 쉬겔라, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 비브리오, 예르시니아, 칸디다, 페니실륨, 아스페르길루스, 클라도스포리움, 푸사리움, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 108 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 108 중 어느 하나의 방법.
110. 미생물은 살모넬라, 이.콜리, 캄필로박터, 리스테리아, 또는 그 조합을 포함하는 실시 형태 109의 조성물 또는 실시 형태 109의 방법.
111. 기재는 비드, 젤, 필름, 시트, 막, 입자, 섬유, 필터, 플레이트, 스트립, 튜브, 컬럼, 웰, 용기의 벽, 모세관, 피펫 팁, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 110 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 110 중 어느 하나의 방법.
112. 기재는 자성 입자인 실시 형태 111의 조성물 또는 실시 형태 111의 방법.
113. 자성 입자의 직경은 약 0.02 내지 약 5 마이크로미터인 실시 형태 112의 조성물 또는 실시 형태 112의 방법.114. 조성물의 pH가 4.5 내지 6.5인 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 113 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 113 중 어느 하나의 방법.
115. pH를 8 내지 10으로 상승시켜 고정된 금속 지지체 물질로부터 미생물을 방출하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 100 내지 실시 형태 114 중 어느 하나의 방법.
116. M이 지르코늄이며 조성물의 pH가 4.5 내지 9인 실시 형태 99 및 실시 형태 104 내지 실시 형태 113 중 어느 하나의 조성물 또는 실시 형태 100 내지 실시 형태 113 중 어느 하나의 방법.
117. 샘플은 임상 샘플, 식품 샘플, 및 환경 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 100 내지 실시 형태 116 중 어느 하나의 방법.
본 발명의 목적 및 이점은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예에 인용된 특정 물질 및 그 양뿐만 아니라 기타 조건이나 상세 사항은 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 금속 이온 매개 자성 미세입자의 준비
고정된 금속 지지체 물질로 사용하기 위한 금속 이온 매개 자성 미세입자를 표면 카르복실산기를 가지며 직경이 약 1 μ인 자성 입자 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠으로부터의 다이나비즈 마이온 카르복실산, 또는 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 세라딘으로 알려진 서모 사이언티픽으로부터의 세라 -맥 자성 입자)로부터 준비하였다. 카르복실화된 자성 미세입자를 튜브 내에 두고, 자석을 이용하여 이들을 튜브 벽으로 끌어당기고 흡인에 의해 액체를 제거하고 액체 부피를 세척 용액으로 대체하고, 자기장으로부터 튜브를 제거하고, 튜브를 교반하여 미세입자를 재현탁시켜 세척하였다.
금속 이온 처리 전에, 자성 미세입자를 0.1 M MES 완충액(pH 5.5) (0.1% 트리톤 X-100 함유함)으로 두 번 세척하고 이어서 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 세척 단계 후, 자성 미세입자 1 밀리그램 당 0.01 M HCl 용액 중의 0.1 M 질산갈륨(III), 또는 질산제2철 또는 질산지르코늄 (IV) 0.2 mL를 자성 미세입자 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 진탕시키고, 그 후 상기 MES 완충액으로 세척하여 여분의 금속 이온을 제거하였다. 생성된 금속 이온 매개 자성 미세입자 (Ga(III)-미세입자-1, Fe(III)-미세입자-1, Zr(IV)-미세입자-1, Ga(III)-미세입자-2, Fe(III)-미세입자-2, Zr(IV)-미세입자-2)를 MES 완충액에 재현탁시키고, MES 완충액에서 4℃에서 보관하였다. 다이나비즈 마이온 카르복실산을 이용하여 미세입자-1을 준비하고, 세라-맥 자성 입자를 이용하여 미세입자-2를 준비하였다.
실시예 2: DNA 포획 및 방출에 있어서 금속 이온의 비교
이 실험에서는, 실시예 1로부터의 40 ㎍의 Ga(III)-미세입자-1 및 40 ㎍의 Fe(III)-미세입자-1을 별도 실험에서 사용하여 pH 5.5의 MES 완충액 중의 105 cfu와 등가의 MRSA DNA (약 1.8 ng)에 결합시켰다. 상청액을 SN0로 표기하였다. 이어서 미세입자를 MES 완충액으로 두 번 세척하고 각 상청액(각각 SN1과 SN2로 표기함)을 수집하였다. 결합된 DNA를 용출시키기 위하여, 미세입자를 20 mM 인산나트륨 완충액 (PO4, pH 8.5)에 재현탁시키고 5분 동안 95℃로 가열하였다. 상청액 (SN3로 표기함)을 mecA-FAM RT-PCR 분석을 위해 수집하였다.
각 샘플(SN3) 5 마이크로리터를 하기의 최적 농도의 프라이머, 프로브 및 효소와, 열 사이클을 이용하여 mecA 유전자의 실시간 PCR 증폭에 처하였다. 하기에 열거된 모든 프라이머 및 프로브의 서열은 5'→3' 배향으로 주어지며, 이는 알려져 있고 문헌 [Francois, P., et al., Journal of Clinical Microbiology, 2003, volume 41, 254-260]에 개시된다. 전방향 mecA 프라이머는 CATTGATCGCAACGTTCAATTT (서열 번호 1)였다. mecA 역방향 프라이머는 TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA (서열 번호 2)였다. mecA 프로브 서열, TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT (서열 번호 3)는 각각 5'- 및 3'- 위치에서 6-카르복시플루오레세인(FAM) 및 IBFQ(아이오와 블랙 에프큐(IOWA BLACK FQ), 미국 아이오와주 코르니빌 소재의 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies))로 이중 표식시켰다. PCR 증폭은 5 L의 샘플과 5 L의 하기 혼합물을 함유한 총 10 L 부피에서 실시하였다: 두 가지 프라이머 (각각 10 M 0.5 L), 프로브 (2 M 1 L), MgCl2 (25 mM 2 L) 및 라이트사이클러 DNA 마스터 혼성화 프로브(LightCycler DNA Master Hybridization Probes) (1 L의 10x, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐). 증폭은 하기 프로토콜을 이용하여 라이트사이클러 2.0 실시간 PCR 시스템(로쉐)에서 실시하였다: 95℃, 30초 (변성); 95℃, 0초 (20℃/s의 기울기), 60℃, 20초 (20℃/s의 기울기, 단일 획득)의 45회의 PCR 사이클.
대조 샘플은 각각 MES와 인산염 완충액에 현탁된 DNA(결합 실험에 사용된 양과 등가)로 이루어졌다. 대조 DNA 샘플은 금속 이온 매개 미세입자와 반응하지 않았다.
표 1은 mecA PCR 분석 데이터를 보여준다. SN0, SN1, 및 SN2 샘플에서 (대조 샘플에 비하여) 높은 사이클 역치(Ct) 값은 DNA의 정량적 포획을 나타낸다. SN3 샘플에서 (대조 샘플에 비하여) 유사한 Ct 값은 포획된 DNA의 정량적 방출을 나타낸다.
Figure 112009071625251-PCT00001
실시예 3: 피코그린 분석에 의해 정량화된 DNA 결합 및 용출 효율
피코그린(PicoGreen)은 용액 중의 ds DNA를 정량하는 일반적 방법이다 (문헌[Nakagawa, et al., Biotech & Bioeng. 2006, 94(5), 862-868]). 포획 및 방출 효율을 입증하기 위한 모델로서 λDNA를 선택하였다. 피코그린 분석 키트(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠)로부터의 λDNA를 1x TE 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)에서 8 ㎍/mL로부터 0.25 ㎍/mL로 2배 희석시켰다. 100 μL의 각 DNA 용액을 400 ㎍의 Ga(III) 미세입자-2를 함유한 100 μL의 0.1 M MES 완충액 (pH 5.5)에 첨가하고 이어서 10분 동안 잘 혼합하였다. 이어서 미세입자를 MES 완충액으로 두 번 세척하였다. 100 ㎕의 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 8.5)을 첨가하고 현탁액을 5분 동안 65℃에서 가열하여 미세입자로부터 DNA를 방출시켰다.
다른 실험에서는, DNA를 먼저 5분 동안 95℃에서 변성시키고 즉시 얼음에 두어 단일 가닥 DNA를 생성하였다. 단일 가닥 DNA를 10분 동안 0℃에서 MES 중의 400 ㎍의 Ga(III)- 미세입자-2와 혼합하였다. 미세입자를 MES로 두 번 세척한 후, 100 μL의 20 mM PO4 완충액을 미세입자에 첨가하고 현탁액을 5분 동안 65℃에서 가열하여 미세입자로부터 DNA를 방출시켰다. 단리된 인산염 상청액 (SN3)을 다시 DNA 어닐링을 위해 1시간 동안 65℃에서 인큐베이션하였다. 재형성된 dsDNA를 피코그린 분석에 의해 정량하였다.
표 2는 DNA 결합 및 방출 데이터를 보여준다. 400 ㎍의 Ga(III)-미세입자-2는 약 94-99% 포획 효율로 약 800 ng의 ssDNA 또는 dsDNA에 흡착할 수 있다. 표 2에서 (좌측으로부터) 두 번째 및 네 번째 컬럼은 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 둘 모두가 미세입자로부터 매우 효율적으로 용출됨을 입증한다.
Figure 112009071625251-PCT00002
실시예 4: DNA 방출에 대한 용출 완충액의 영향
실시예 2에 개시된 Ga(III)-미세입자-1을 이용하여 MES 완충액 또는 트리스 (10 mM, pH 8.5)에서 DNA 결합 실험을 실시하였다. DNA 결합 과정 후, Ga(III)-미세입자/DNA 복합체를 MES 완충액 (0.1 M, pH 5.5), 트리스 완충액 (10 mM, pH 8.5), 또는 TAE 완충액 (40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA, pH 8.5) 중 어느 하나로 두 번 세척하고 트리스, TAE, 또는 PO4 완충액 (20 mM 인산나트륨, pH 8.5)으로 용출시켰다. 일부 경우에, 용출 절차는 5분 동안 95℃에서 현탁액을 가열하는 것을 포함하였다. 다른 경우에는, 현탁액을 5분 동안 실온에서 유지하여 미세입자로부터 DNA를 용출시켰다.
용출된 DNA를 함유한 상청액 (SN3)을 실시예 2에 개시된 바와 같이 mecA RT-PCR 분석에 이용하였다. 대조 샘플은 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조하였다.
표 3에 나타낸 생성된 PCR 분석 데이터는 가열 및 용출 완충액의 조성 둘 모두가 비드로부터의 DNA 방출의 효율에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. 가열은 용출 완충액으로서 물이 이용되었을 때를 제외하고는, 비드로부터 DNA의 용출을 증가시켰다. 트리스 및 트리스-아세테이트 완충액 둘 모두 열의 존재 하에서 DNA의 완전한 용출을 야기하였다. 보다 높은 Ct 값에 상응하여, 상대적으로 더 적은 양의 DNA 방출이 실온에서 관찰되었다. 인산염 완충액은 효과적인 DNA 용출을 제공하였으며 열과 조합될 때 더욱 더 효과적이었다.
Figure 112009071625251-PCT00003
실시예 5: DNA 포획 및 방출을 위한 인큐베이션 시간
DNA 포획 및 방출을 위한 인큐베이션 시간은 미세유체 응용과 같은 소정의 과정에서는 중요한 파라미터일 수 있다. 1.8 ng의 DNA (약 105 cfu MRSA에 대하여 등가)를 1 내지 10분 범위의 다양한 시간 동안 실시예 2의 절차에 따라 Ga(III)-미세입자-1과 인큐베이션하였다. 미세입자를 MES 세척 완충액으로 세척한 후, 인산염 완충액 (PO4)을 1 내지 10분 범위의 다양한 시간 동안 95℃에서 결합 DNA를 용출시키기 위하여 첨가하였다. 상청액을 실시예 2에 따라 mecA RT-PCR 분석에 의해 분석하였다.
표 4는 PCR 분석에 있어서 Ct 값을 보여준다. 결과는 1 내지 10분 동안 결합시키고 10분 동안 용출시킨 샘플들에 있어서 Ct의 차이가 없음을 보여주었다. 부가적으로, 데이터는 10분 동안 결합시킨 샘플의 경우 DNA가 95℃에서 인산염 완충액에서 1분 이내에 정량적으로 용출되었음을 나타낸다.
Figure 112009071625251-PCT00004
실시예 6: Ga(III)-미세입자-1 및 미처리 다이나비즈 마이온을 이용한 MRSA DNA 희석 시리즈
임상 샘플 로드 내의 DNA의 양이 매우 가변적일 수 있으므로, 넓은 범위의 DNA 농도에 걸친 포획과 용출이 유용할 수 있다. 이 실험에서는, MRSA DNA의 연속적인 희석물을 Ga(III)-미세입자-1 및 미처리 다이나비즈 마이온 카르복실산 자성 입자("대조군"으로 표시됨)에 결합시켰다. 구체적으로, MRSA DNA를 5 × 106 cfu/mL의 게놈 카피/mL(gc/mL)의 등량으로부터 5 × 103 cfu/mL까지 1x TEP 완충액 (10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.5, 및 0.2% 플루로닉 L64 (미국 뉴저지주 마운트올리브 소재의 바스프))에서 10배씩 연속 희석시켰다. 이어서 각각의 MRSA DNA 희석물 10 μL를 60 ㎍ Ga(III)-미세입자를 함유한 90 μL의 100 mM MES 완충액 (pH 5.5)에 첨가하였다. 15분 동안 부드러운 와동 후, 실시예 2에 개시된 바와 같이 미세입자 현탁액을 세척하고 상청액을 회수하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL의 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)에 재현탁시키고 10분 동안 95℃에서 가열하였다. 가열된 미세입자 혼합물을 즉시 분리하고 최종 상청액 (SN3)을 실시예 2에 개시된 mecA-FAM 분석을 이용한 RT-PCR 분석을 위해 수집하였다.
표 5는 mecA-FAM PCR 분석 데이터를 보여준다. Ga(III)-미세입자로부터 용출된 DNA(SN3)의 전량은 (인산염 중) DNA 대조 샘플과 유사한 Ct 값을 나타내며, 이는, 이들 조건 하에서 MRSA-특이적 DNA의 정량적 결합 및 방출을 나타내는 것이다. 모든 SN0 ("미결합 DNA") 상청액은 주로 음의 Ct 값을 나타내며, 이는 Ga(III)-미세입자가 이들 실험에서 시험된 DNA 농도 범위에 걸쳐 결합하고 용출하는 능력을 나타내는 것이다. 부가적으로, 미처리 미소구체로부터 용출된 DNA(SN3)의 전량은 주로 음의 값(30 이상의 Ct 값)을 나타낸 반면, SN0 상청액은 DNA 대조 (인산염) 샘플과 유사한 Ct 값을 나타내며, 이는 극히 적은 DNA가 Ga(III) 이온으로 전처리되지 않은 카르복실화된 미세입자에 결합하였음을 나타내는 것이다.
Figure 112009071625251-PCT00005
실시예 7: MRSE DNA의 존재 하에서 MSSA DNA 검출
특히 표적 종에 대해 높은 DNA 상동성을 가진 다른 종의 존재 하에서, 복합 샘플로부터 희귀 종을 동정하는 능력이 유용할 수 있다. 이 실험에서는, 메티실린-민감성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (MSSA)를 메티실린-내성 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) MRSE의 존재 하에서 분석하였다. 105 cfu 등량의 MSSA DNA를 일정량의 MRSE DNA (105 cfu와 등가인 DNA)의 존재 하에서 10배만큼 희석하였다. DNA 혼합물을 MES 중의 40 ㎍ Ga(III)-미세입자-1과 함께 인큐베이션하고 MES로 두 번 세척한 후, 결합된 DNA를 실시예 6에서와 같이 방출시키고, 인산염 완충액 용출물을 RT-PCR 분석하였다. SAfemA PCR을 실시하여 MSSA에 존재하는 SAfemA 유전자를 검출하였다. SAfemA PCR 분석을 실시하는 절차는 하기의 최적 농도의 프라이머, 프로브 및 효소, 및 열적 사이클을 이용하여 실시하였다. 하기에 열거된 모든 프라이머 및 프로브의 서열은 5'→3' 배향으로 주어지며 이는 알려져 있다. (문헌[Francois, P., et al., Journal of Clinical Microbiology, 2003, volume 41, 254-260]을 참조.) 전방향 SAfemA 프라이머는 TGCCTTACAGATAGCATGCCA (서열 번호 4)였다. SAfemA 역방향 프라이머는 AGTAAGTAAGCAAGCTGCAATGACC (서열 번호 5)였다. SAfemA 프로브 서열 TCATTTCACGCAAACTGTTGGCCACTATG (서열 번호 6)는 각각 5'- 및 3'- 위치에서 플루오레세인(FAM)과 IBFQ로 이중 표식시켰다. PCR 증폭은 5 L의 샘플과 두 프라이머의 혼합물 5 L (각각 10 M 0.5 L), 프로브 (2 M 1 L), MgCl2 (25 mM 2 L) 및 라이트사이클러 DNA 마스터 혼성화 프로브 (1 L의 10 x, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐)를 함유한 총 부피 10 L에서 실시하였다. 증폭은 하기와 같이 라이트사이클러 2.0(로쉐)에서 실시하였다 : 95℃, 30초 (변성); 95℃, 0초, 60℃, 20초의 45 사이클. 실시예 2에 개시된 mecA PCR 분석을 이용하여 MRSE 내의 mecA 유전자를 검출하였다.
표 6은 둘 모두의 분석에 있어서 Ct 값을 보여준다. 데이터는 약 5 cfu MSSA가 5×103 cfu의 MRSE/반응물의 존재 하에서 검출될 수 있음을 나타낸다 (100 μL SN3 상청액 중 5 μL를 PCR 반응에 사용하였음). 이들 실험에서 검출된 분석물/간섭 종의 최고 비(즉, MSSA:MRSE)는 약 1:1000이었다. 미세입자로부터 용출된 DNA의 Ct 값은 대조 DNA 혼합물(미세입자 없음)로부터의 Ct 값에 일관되게 매치하였다. 각 샘플 내의 MRSE의 일관된 양의 존재는 mecA 분석으로부터의 상대적으로 일정한 Ct 값에 의해 입증되었다.
Figure 112009071625251-PCT00006
실시예 8: 내부 대조 플라스미드 DNA의 검출
유전자 분석에서, 내부 대조군 (internal control, IC) 시험은 적절한 샘플 취급 및 기능 분석 시약, 미세유체 전달, 및 계측장비를 확인하기 위해 일반적으로 이용된다. Ga(III)-미세입자는 시약으로 간주되므로, Ga(III)-미세입자는 전형적으로 공유 결합에 의해 폐쇄된 원형 플라스미드 DNA인 IC DNA를 포획하고 방출하는 것이 유용할 수 있다. 이 실험에서는, SAfemA RT-PCR 분석에서 사용된 랜덤화된 SAfemA 프로브 서열을 이용하여 SAfemA 앰플리콘을 클로닝함으로써 제조된 IC 플라스미드 DNA를 1X TEP 완충액에서 106 gc/mL로부터 103 gc/mL까지 10배만큼 연속 희석하였다. 각각의 IC 플라스미드 DNA 희석물 10 μL를 60 ㎍ Ga(III)-미세입자-1을 함유한 90 μL의 100 mM MES 완충액 (pH 5.5)에 첨가하였다. 15분 동안 부드러운 와동 후, 미세입자를 세척하고 상청액을 실시예 2에 개시된 바와 같이 수집하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)에 재현탁시키고 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 가열된 미세입자 혼합물을 즉시 분리하고 SN3 상청액을 수집하였다. 모든 상청액을 실시예 2에 개시된 동일한 PCR 프로토콜을 이용하여 분석하였다.
실시예 7에 개시된 SAfemA를 위한 동일한 프라이머 및 내부 대조 DNA를 위한 각각 5'- 및 3'- 위치에서 FAM과 IBFQ로 이중-표식된 랜덤화된 프로브 서열 (TCATTTCACGCAAACTGTTGGCCACTATG) (서열 번호 6)을 PCR 증폭을 위해 사용하였다. 표 7은 IC-SAfemA PCR 분석 데이터를 보여준다. Ga(III)-미세입자로부터 용출된 샘플 (SN3)은 DNA 대조 샘플과 유사한 Ct 값을 나타내며, 이는 이들 절차에서 Ga(III)-미세입자를 이용하여 SAfemA IC 플라스미드 DNA에 결합하고 용출하는 능력을 나타내는 것이다.
Figure 112009071625251-PCT00007
실시예 9: MRSA 추출 및 Ga(III)-미세입자에의 후속 결합
이 실험에서는, 두 가지 추출 방법을 이용하여 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 균주 #BAA-43 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션; 미국 버지니아주 마나사스) (MRSA)로부터 DNA를 추출하였다: 라이소스타핀/프로테이나제 K 방법 또는 라이소스타핀-단독의 방법. 이들 절차로부터 방출된 DNA를 후속적으로 Ga(III)-미세입자-1에 결합시키고 이로부터 회수하였다. 이 실험을 위한 대조군은 Ga(III)-미세입자-1에의 후속 결합 없이 라이소스타핀/프로테이나제 K 방법을 이용하여 MRSA로부터 추출된 DNA로 이루어졌다.
MRSA를 37℃에서 트립티카아제 소이 액체 배지/0.2% 플루로닉 L64(TSBP)에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서 2.3 × 107 cfu/mL로부터 2.3 × 103 cfu/mL까지 10배만큼씩 연속 희석시켰다.
라이소스타핀/프로테이나제 K 방법의 경우, 66.7 μL의 각 MRSA 희석물을 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 알드리치)으로 처리하고 5분 동안 실온에서 유지한 후, 6.7 μL의 20 ㎎/mL 프로테이나제 K를 첨가하고 혼합물을 10분 동안 65℃에서 인큐베이션하고 10분 동안 98℃에서 인큐베이션하였다. 라이소스타핀-단독 방법의 경우, 66.7 μL의 각 MRSA 희석물을 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀과 혼합하고 5분 동안 실온에서 유지하였다. 이들 절차로부터 방출된 DNA를 이어서 60 ㎍ Ga(III)-미세입자-1 (실시예 1에 개시된 바와 같이 제조됨)을 함유한 100 mM MES 완충액 (pH 5.5) 6 μL와 혼합하였다.
대조 방법의 경우, 66.7 μL의 각 MRSA 희석물을, Ga(III)-미세입자-1에의 후속 결합 없이, 앞서 개시된 라이소스타핀/프로테이나제 K 방법으로 처리하였다.
5분 동안 부드러운 와동 후, 미세입자 혼합물을 분리하고 상청액(SN0)을 제거하여 버렸다. 이어서 미세입자를 100 μL TEP 완충액으로 두 번 세척하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)에 재현탁시키고 5분 동안 95℃에서 가열하였으며, 상청액(SN3)을 상기한 mecA-FAM 분석을 이용한 RT-PCR 분석을 위해 수집하였다.
표 8은 mecA-FAM PCR 분석 데이터를 보여준다. 추출 방법으로부터의 대조군 DNA 샘플은 불규칙적인 용량 응답 Ct 경향을 나타냈다(각각의 1:10 희석에 대해 예상된 약 3.32 Ct의 변화가 관찰되지 않았다). 대조 DNA 샘플과 비교할 때, 라이소스타핀/프로테이나제 K 방법으로부터의 DNA와 반응한 미세입자로부터 용출된 샘플(SN3)은 개선된, 보다 일관된 용량 응답 Ct 경향을 나타냈다(각 1:10 희석에 대해 예상된 약 3.32 Ct의 변화가 관찰되었다). 반면, 라이소스타핀-단독 방법으로부터의 DNA와 반응한 미세입자로부터 용출된 샘플(SN3)은 변화된, 불규칙적인 용량 응답 Ct 경향을 나타냈다(각 1:10 희석에 대해 예상된 약 3.32 Ct의 변화가 관찰되지 않았으며, 각 1:10 희석 점에 대한 Ct 값은 예상 값으로부터 변화된다).
Figure 112009071625251-PCT00008
실시예 10: 라이소스타핀을 이용한 동시적 MRSA 추출 및 Ga(III)-미세입자에의 결합
단일 미세유체 챔버에서 주입 샘플의 추출과 Ga(III)-미세입자에의 결합을 동시에 하는 것이 유용할 수 있다. 이 실험에서는, DNA를, 후속 프로테이나제 K 처리가 있거나 없이, 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA) ATCC BAA-43으로부터 추출하고 이와 동시에 Ga(III)-미세입자-1에 결합시켰다. 이들 동시적 추출 및 결합 방법을 실시예 9에 개시된, 라이소스타핀/프로테이나제 K 추출, 및 이어서 Ga(III)-미세입자-1에의 결합의 대조 방법과 비교하였다.
MRSA를 실시예 9에 개시된 바와 같이 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서 1.4 × 106 cfu/mL로부터 1.4 × 102 cfu/mL까지 10배만큼씩 연속 희석시켰다.
대조 방법의 경우, 66.7 μL의 각 MRSA 희석물을 라이소스타핀/프로테이나제 K 방법으로 처리하였으며, 이때 Ga(III)-미세입자-1에 후속적으로 결합시켰는데, 이는 실시예 9에 개시된 바와 같다. 순차적인 용해/DNA 결합/분해 방법의 경우, 66.7 μL의 각 MRSA 희석물을 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀과 혼합하고, 5분 동안 실온에서 유지하고, 60 ㎍ Ga(III)-미세입자-1(실시예 1에 개시된 바와 같이 준비함)을 함유한 6 μL의 100 mM MES 완충액 (pH 5.5)과 혼합하고, 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하고, 6.7 μL 프로테이나제 K와 혼합하고, 10분 동안 65℃에서 인큐베이션하고 이어서 10분 동안 98℃에서 인큐베이션하였다. 동시적 용해 및 DNA 결합 방법의 경우, 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀을 60 ㎍ Ga(III)-미세입자-1을 함유한 6 μL의 100 mM MES 완충액 (pH 5.5)과 혼합하고 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하였다. 이어서 이 혼합물을 66.7 μL의 각 MRSA 희석물에 첨가하고 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하였다.
5분 동안 부드러운 와동 후, 미세입자 혼합물을 두 번 세척하고, DNA를 인산염 완충액으로 용출시키고, 최종 상청액(SN3)을 실시예 9의 방법에 따라 수집하였다. 이어서 모든 샘플을 실시예 2에 개시된 바와 같이, mecA-FAM 분석을 이용하여, RT-PCR에 의해 증폭시키고 정량화하였다.
표 9는 mecA-FAM PCR 분석 데이터를 나타낸다. 동시적 용해 및 DNA 결합의 샘플로부터 용출된 샘플(SN3)은 순차적인 추출/DNA 결합 샘플과 유사한 Ct 결과를 나타내며, 이는 박테리아의 용해 및 미세입자에의 결합이 한 단계에서 완료될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 동시적 용해 및 DNA 결합의 샘플로부터 용출된 샘플 (SN3)은 순차적인 용해/DNA 결합/분해 샘플과 유사한 Ct 결과를 나타내며, 이는 프로테이나제 K가 라이소스타핀을 이용한 추출 및 Ga(III)-미세입자-1에의 결합에 필요하지 않음을 나타내는 것이다.
Figure 112009071625251-PCT00009
실시예 11: MRSA 배양, Ga(III)-미세입자 대 매그나 퓨어(MagNA Pure)
이 실험에서는, Ga(III)-미세입자-2를 이용한 동시적 MRSA 용해 및 MRSA DNA 결합을, MRSA 순수 배양물로부터의 핵산 단리를 위한 매그나 퓨어(MagNA Pure) LC DNA 단리 키트 III(박테리아, 진균류) 키트(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)로부터 입수된 장비 및 시약)를 이용하는 로쉐 매그나 퓨어 LC 시스템과 직접 비교하였다. MRSA (ATCC #BAA-43)를 실시예 9에 개시된 바와 같이 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서 1.3 × 107 cfu/mL로부터 1.3 × 102 cfu/mL까지 10배만큼씩 연속 희석시켰다.
매그나 퓨어 샘플의 경우, 박테리아로부터의 DNA 회수를 향상시키기 위하여 하기의 추가 단계를 부가한 것을 제외하고는 DNA 정제를 위한 제조업자의 설명서를 따랐다: 80 μL의 각 MRSA 희석물을 20 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀과 혼합하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 제조업자의 설명서에 따라 100 μL 샘플을 130 μL 박테리아 용해 완충액 및 20 μL의 프로테이나제 K (키트에 공급됨)와 250 μL 총 주입 부피로 결합시키고, DNA 추출의 완료 후 100 μL 용출 부피로 용출시켰다.
동시적 용해 및 DNA 결합의 샘플의 경우, 80 μL의 각 MRSA 희석물을 실시예 10에서처럼, 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀과 사전 혼합된 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2를 함유한 10 μL의 100 mM MES 완충액 (pH 5.5)과 혼합하였다. 5분 동안 부드러운 와동 후, 미세입자 혼합물을 두 번 세척하고, DNA를 인산염 완충액으로 용출시키고, 최종 상청액(SN3)을 실시예 9의 방법에 따라 수집하였다. 이어서 모든 샘플을 실시예 2에 개시된 바와 같이, mecA-FAM 분석을 이용하여, RT-PCR에 의해 증폭시키고 정량화하였다.
표 10은 mecA-FAM PCR 분석 데이터를 제공한다. 동시적 용해 및 DNA 결합의 샘플로부터 용출된 샘플 (SN3)은 매그나 퓨어 샘플보다 일관되게 더 낮은 Ct 결과를 나타내며, 이는 동시적 용해 및 결합 방법이 변형된-매그나 퓨어 방법보다 더 효율적으로 DNA를 포획하고/하거나 방출함을 나타내는 것이다.
Figure 112009071625251-PCT00010
실시예 12: Ga ( III )-미세입자 대 매그나 퓨어를 이용한, 비강 스왑( swab ) 임상 샘플로부터의 아우레우스( SA )의 추출 및 검출
스왑 임상 샘플의 경우, 예를 들어, 포획 및 용출 동안 비강 점액 중의 PCR 저해제를 극복하는 것이 유용할 수 있다. 이 실험에서는, 실시예 10의 동시적 용해 및 DNA 결합 절차를 이용하여, 미생물학적 배양 방법에 의해 입증된 두 명의 상이한 환자로부터의 공지의 SA-양성 스왑 샘플을 포획하고 용출하였다.
두 환자를 에스.아우레우스 연구를 위해 선택하였다. 일반적인 스왑으로 콧구멍으로부터 시료를 수집하고 연구 전에 -80℃에서 보관하였다(각 환자에 있어서 두 스왑을 1-1, 1-5 및 2-1, 2-5로 칭하였다). 배양 연구는 이들 두 환자가 에스.아우레우스 양성임을 나타냈다. 각각의 비강 스왑 샘플을 먼저 60초 동안 와동하여 410 L TEP 용액에 의해 용출시켰다. 각 시험을 위하여, 80 L의 스왑 용출물을 TEP 중에 100 g의 Ga(III)-미세입자-2 및 9 g의 라이소스타핀을 함유한 액체 160 L와 조합하였다. 혼합물을 때때로 부드럽게 진탕시키면서 5분 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 자기적으로 분리시켰다. 상청액을 버리고 나머지 미세입자를 100 L TEP로 두 번 세척하였다. 마지막으로, 미세입자를 100 L의 20 mM 인산염 완충액 (pH 8.5)에 재현탁시키고 10분 동안 97℃에서 가열하였다. 생성된 상청액을 자기적으로 분리하여 PCR 분석에 사용하였다.
대조 매그나 퓨어 샘플의 경우, 배양 MRSA 샘플을 80 L TEP에서 148,000 cfu로부터 148 cfu까지 10배씩 희석시켰다. 각 MRSA 샘플에, 5 ng의 라이소스타핀을 첨가하고 부드러운 혼합 후 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 130 L의 박테리아 용해 완충액(매그나 퓨어 LC DNA 분리 키트 III) 및 20 L의 프로테이나제 K (동일 키트에 공급됨)를 부드럽게 혼합하면서 샘플에 첨가하고, 이어서 10분 동안 95℃에서 인큐베이션하였다. DNA 추출은 로쉐의 매그나 퓨어 LC 장비의 제조업자 설명서에 따라 완료하였다.
SA-femA qPCR 분석은 실시예 7에서와 같이 완료하였다.
표 11에서는, 이 실험에서 얻은 데이터에 의하면 Ga (III)-미세입자-2 및 매그나 퓨어 방법 둘 모두로부터 얻은 Ct 값이 매우 가까움이 나타났다. 이들 두 환자 샘플로부터 유의한 저해 효과가 관찰되지 않았다. MRSA의 기준 수에 따르면, 각 스왑은 대략 약 1.4×105 cfu의 에스. 아우레우스를 함유한다.
Figure 112009071625251-PCT00011
실시예 13: Ga(III)-미세입자 및 Zr(IV)-미세입자 상에의 MRSA 결합
이 실험에서는, 1 mL 반응 부피를 이용하여 TEP 또는 100 mM MES (pH 5.5) / 0.2 % 플루로닉 L64 (MESP) 완충액 중의 Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2 상에 MRSA를 포획하였다. Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2를 실시예 1에서와 같이 준비하였다.
MRSA를 실시예 9에 개시된 바와 같이 TSBP 액체 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서, 각각 약 1.5×103 cfu/mL 및 1.5×102 cfu/mL의 최종 농도로 10배만큼씩 연속 희석시켰다. TEP 및 MESP 샘플의 경우, 10 μL의 각 MRSA 희석물을 각각 990 μL TEP 또는 MESP 완충액으로 추가로 희석시켰다. MRSA 포획을 위해, 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2를 함유한 10 μL MES 완충액을 각각 각 샘플에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 와동하였다. 미세입자 혼합물을 분리하고, 두 번 세척하고, 재현탁하고, 각 용액의 적절한 부피를 혈액 한천 플레이트 상에 도말하고, 18시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고, 그 후 콜로니를 계수함으로써 각 현탁액 내의 MRSA를 정량화하였다.
표 12는 생성된 플레이트 카운트 데이터를 보여준다. Ga(III)-미세입자-2 및 Zr(IV)-미세입자-2 둘 모두 상에서의 박테리아 포획은 낮은 pH (MES) 완충액 조건에서 개선되었다. 구체적으로, Ga(III)-미세입자-2는 TEP 완충액에서 무시할만한 박테리아 포획을 나타내지만, MES 완충액에서는 99% 박테리아 포획을 나타낸다. 그리고 Zr(IV)-미세입자-2는 TEP 완충액에서 89% 박테리아 포획을 나타내지만, MES 완충액에서는 100% 박테리아 포획을 나타낸다.
Figure 112009071625251-PCT00012
실시예 14: Ga(III)-미세입자 및 Zr(IV)-미세입자 상에의 MRSA 결합, 용해, 및 DNA 포획
이 실험에서는, MRSA를 Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2 상에 포획시키고, 효소를 이용하여 (미세입자 상에서) 용해시켜 박테리아 DNA를 방출시키고, DNA를 동일한 미세입자 상에 재포획시켰다. 이어서, DNA를 실시예 2에 개시된 mecA-FAM RT-PCR 절차에 의한 정량화를 위해 미세입자로부터 용출시켰다.
MRSA를 하룻밤 성장시키고 실시예 11에서와 같이 TEP 완충액에서 2.0×107 cfu/mL로부터 2.0×103 cfu/mL까지 10배만큼씩 연속 희석시켰다. 각 MRSA 희석물의 분액 (10 μL)을 990 μL MESP 완충액으로 더 희석하고 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2 미세입자를 함유한 10 μL의 MES 완충액과 혼합하고 실온에서 5분 동안 부드럽게 와동하고 실시예 13에서와 같이 세척하였다. 이어서, 26.7 μL의 250 ㎍/mL 라이소스타핀을 첨가하고 혼합물을 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하였다. 이 방법을 순차적 방법으로 칭한다.
대조 샘플의 경우, MRSA를 Ga(III)-미세입자-2 상에서 용해시키고 방출된 DNA를 결합시키는 것을 동시에 하였다 (동시적 방법). 라이소스타핀, 250 ㎍/mL 26.7 μL를 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2 미세입자를 함유한 MES 완충액 10 μL와 혼합하고 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하였다. 이어서 이 혼합물을 90 μL TEP 완충액으로 추가로 희석된 각 MRSA 희석물 10 μL에 첨가하고 5분 동안 실온에서 부드럽게 와동하였다.
5분 동안 부드러운 와동 후, 두 방법 모두를 위한 미세입자 혼합물을 분리하고 상청액(SN0)을 제거하여 버렸다. 이어서 미세입자를 실시예 13에 개시된 바와 같이, 100 μL TEP 완충액으로 두 번 세척하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL 인산염 완충액에 재현탁시키고, 10분 동안 95℃에서 가열하고, 분리하고, 이어서 상청액(SN3)을 실시예 2에 개시된 바와 같이, mecA-FAM RT-PCR 분석을 위해 수집하였다.
표 13은 mecA-FAM RT-PCR 정량 분석 데이터를 보여준다. 순차적 방법의 샘플로부터의 용출물은 동시적 방법의 샘플과 유사한 Ct 결과를 나타내며, 이는 박테리아가 순차적으로 미세입자에 포획되고 이어서 용해되며 이어서 방출된 DNA가 동일한 미세입자 상에 재포획됨을 나타내는 것이다. 또한, Zr(IV)-미세입자-2를 이용한 순차적 방법의 샘플로부터의 용출물은 Ga(III)-미세입자-2를 이용한 순차적 방법의 샘플보다 약간 낮은 Ct 결과를 일관되게 나타내며, 이는 Zr(IV)-미세입자가 더 효과적으로 박테리아 및/또는 DNA를 포획할 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure 112009071625251-PCT00013
실시예 15: Ga(III)-미세입자 상에의 MRSA 결합
이 실험에서는, MRSA (ATCC BAA-43)를 TEP 중의 Ga(III)-미세입자 상에 포획시켰다. Ga(III)-미세입자-2를 실시예 1에서와 같이 준비하였다.
MRSA를 실시예 9에 개시된 바와 같이 TSBP 액체 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서, 각각 약 1.5×103 cfu/mL 및 1.5×102 cfu/mL의 최종 농도로 10배만큼씩 연속 희석시켰다. MRSA 포획을 위해, 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2를 함유한 10 μL MES 완충액을 각각 각 MRSA 희석물 10 mL에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 와동하였다. 미세입자 혼합물을 분리하고, 상청액을 제거하였다(SN0). 미세입자를 100 μL TEP 완충액으로 두 번 세척하고, 분리하고, 상청액을 제거하였다 (SN1 및 SN2). 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL의 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)(PB 완충액)에 재현탁시켰다. 각 용액의 적절한 부피를 혈액 한천 플레이트 상에 도말하고, 18 시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고, 이어서 콜로니를 계수함으로써 포획된 MRSA 및 각 상청액 내의 MRSA를 정량화하였다.
표 14는 얻어진 플레이트 카운트 데이터를 보여준다. 대략적으로 Ga(III)-미세입자-2는 1.5 × 103 cfu에서 26% 박테리아 및 1.5 × 102 cfu에서 30% 박테리아를 포획하였다.
Figure 112009071625251-PCT00014
실시예 16: Ga(III)-미세입자 및 Zr(IV)-미세입자 상에의 MRSA 결합
이 실험에서는, 1 mL 반응 부피를 이용하여 TEP 및10 mM 트리스-HCl (pH 8.5) / 0.2 % 플루로닉 L64 (TP) 완충액 중의 Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2 상에 MRSA를 포획하였다. Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2를 실시예 1에서와 같이 준비하였다.
MRSA를 실시예 9에 개시된 바와 같이 TSBP 액체 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서 1.5×103 cfu/mL 및 TP 완충액에서 2.3×103 cfu/mL의 최종 농도로 10배만큼씩 연속 희석시켰다. MRSA 포획을 위해, 100 ㎍ Ga(III)-미세입자-2 또는 Zr(IV)-미세입자-2를 함유한 10 μL MES 완충액을 각각 각 MRSA 희석물 1 mL에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 와동하였다. 미세입자 혼합물을 분리하고, 상청액을 제거하였다(SN0). 미세입자를 100 μL TEP 또는 TP 완충액으로 각각 두 번 세척하고, 와동하고, 분리하고, 상청액을 제거하였다 (SN1 및 SN2). 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL의 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)(PB 완충액)에 재현탁시켰다. 각 용액의 적절한 부피를 혈액 한천 플레이트 상에 도말하고, 18 시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고, 이어서 콜로니를 계수함으로써 포획된 MRSA 및 각 상청액 내의 MRSA를 정량화하였다.
표 15는 얻어진 플레이트 카운트 데이터를 보여준다. Ga(III)-미세입자-2 및 Zr(IV)-미세입자-2 둘 모두 TEP 완충액에서 보다 효율적으로 박테리아를 포획하였다.
Figure 112009071625251-PCT00015
실시예 17: Ga(III)-미세입자 상에의 MRSA 결합 및 미세입자로부터의 방출
이 실험에서는, MRSA (ATCC BAA-43)를 1 mL 반응 부피를 이용하여 MESP 완충액 중의 Ga(III)-미세입자-2 상에 포획시키고 이어서 높은 pH 및/또는 경쟁적 시약 완충액을 이용하여 비드로부터 방출시켰다. Ga(III)-미세입자-2를 실시예 1에서와 같이 준비하였다.
MRSA를 실시예 9에 개시된 바와 같이 TSBP 액체 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서 하룻밤 배양물을 TEP 완충액에서, 약 2.04×104 cfu/mL의 최종 농도로 10배만큼씩 연속 희석시켰다. MRSA 포획을 위해, 10 μL 의 MRSA 희석물을 990 μL 100 mM MES (pH 5.5)/0.2% 플루로닉 L64 (MESP) 완충액 및 100 ㎍ Ga(III)-미세입자를 함유한 10 μL MES 완충액과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 와동하였다. 미세입자 혼합물을 분리하고, 상청액을 제거하였다. 미세입자를 100 μL MESP 완충액으로 두 번 세척하고, 와동하고, 분리하고, 상청액을 제거하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 와동에 의해 100 μL의 100 mM 인산염 완충액 (pH 7.0)/ 0.2% 플루로닉 L64, 100 μL의 100 mM 인산염 완충액 (pH 9.5)/ 0.2% 플루로닉 L64, 100 μL의 10 mM 트리스-HCl(pH 9.5)/ 0.2% 플루로닉 L64, 또는 100 μL의 10 mM EDTA (pH 8.0)/ 0.2% 플루로닉 L64에 재현탁시켰다. 미세입자 상의 포획된 MRSA를 개산하기 위하여, 적절한 부피의 미세입자 혼합물을 혈액 한천 플레이트 상에 도말하였다. 미세입자로부터 방출된 MRSA를 개산하기 위하여, 미세입자 혼합물을 분리하고, 각 상청액의 적절한 부피를 혈액 한천 플레이트 상에 도말하고, 18시간 동안 37℃에서 플레이트를 인큐베이션하고, 그 후 콜로니를 계수하여 상청액 (SN3)을 정량화하였다.
표 16은 얻어진 플레이트 카운트 데이터를 보여준다. 10 mM EDTA (pH 8.0)/ 0.2% 플루로닉 L64는 Ga(III)-미세입자-2로부터 최상의 MRSA 방출을 나타냈으며, 이것은 미세입자로부터 24.6% MRSA를 상청액(SN3) 내로 방출하였다.
Figure 112009071625251-PCT00016
실시예 18: Fe(III)-미세입자 및 Zr(IV)-미세입자에 의한 효모 세포의 포획
칸디다 알비칸스(Candida albicans) (ATCC MYA-2876)의 단리된 콜로니를 10 mL 디프코(Difco) 사보라우드(Sabouraud) 덱스트로스 액체 배지 (미국 메릴랜드주 스파크스 소재의 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)) 내에 접종하고 18-20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 약 5×107 cfu/mL의 이 하룻밤 배양물을 살균 버터필드(Butterfield's) 완충 용액 (pH 7.2 ㅁ 0.2; 제1인산칼륨 완충 용액; 브이더블유알(VWR) 카탈로그 번호 83008-093, 미국 펜실베이니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알)에 희석하여 100 cfu/mL 희석물을 얻었다. 콜로니 형성 단위(cfu)는 살아있는/생존가능한 효모의 단위이다.
(저온살균된) 사과 주스를 지역 식료품점(미국 세인트폴 소재의 컵 푸즈(Cub Foods))에서 구매하였다. 11 mL 부피의 사과 주스를 살균 250 mL 유리병(미국 펜실베이니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알)에 첨가하였다. 99 mL 부피의 살균 버터필드 완충 용액을 사과 주스에 첨가하였다. 내용물을 1분 동안 휘저어 혼합하였다. 상기 하룻밤 배양물을 이용하여, 희석된 사과 주스 샘플에 칸디다를 스파이크하여 50 cfu/mL의 최종 농도를 얻었다. 칸디다를 스파이크한 사과 주스 샘플 (1.0 mL)을 100 마이크로그램의 Ga(III)-미세입자-2, Fe(III)-미세입자-2, Zr(IV)-미세입자-2, 및 대조 세라-맥 자성 입자(금속 이온이 없는 입자)를 각각 함유한 표식된 살균 5 mL 폴리프로필렌 튜브(팔콘(Falcon), 미국 뉴저지주 소재의 벡톤 딕킨슨)에 첨가하고, 30초 동안 서모라인 맥시믹스 플러스(THERMOLYNE MAXIMIX PLUS) 와동 믹서(미국 아이오와주 소재의 반스테드 인터내셔날(Barnstead International))에서 혼합하였다. 뚜껑을 닫은 튜브를 서모라인 배리 믹스(VARI MIX) 진탕기 플랫폼(미국 아이오와주 소재의 반스테드 인터내셔널)에서 20분 동안 실온(25℃)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 자성 홀더(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 다이날(Dynal))를 이용하여 10분 동안 샘플로부터 비드를 분리하였다. 어떤 자성 비드도 없는, 1.0 mL의 50 cfu/mL 칸디다를 함유한 대조 튜브를 유사하게 처리하였다. 상청액(1 mL)을 제거하여 제조업자의 설명서에 따라 페트리필름(PETRIFILM) 효모 및 곰팡이 카운트 플레이트(미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니로부터의 건조한 재수화가능한 배양 배지) 상에 도말하고 5일 동안 인큐베이션하였다. 분리된 자성 비드를 자성 스탠드로부터 제거하고, 제조업자의 설명서에 따라 1 mL 살균 버터필드 완충액에 재현탁시키고 페트리필름 효모 및 곰팡이 카운트 플레이트(미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니로부터의 건조한 재수화가능한 배양 배지) 상에 도말하고 5일 동안 인큐베이션하였다. 단리된 효모 콜로니를 수동으로 계수하고, 도말된 자성 비드로부터의 콜로니의 수를 도말된 미처리 대조군의 콜로니 수로 나누고 100을 곱하여 포획 %를 계산하였다.
CFU = 콜로니 형성 단위는 살아있는/생존가능한 효모의 단위이다.
Fe(III)-미세입자-2 및 Zr(IV)-미세입자-2는 각각 샘플로부터의 씨.알비칸스 세포 67%와 81%(표준 편차 < 10%)에 결합하여 농축시켰다. 대조 입자는 사과 주스 샘플로부터 33% (표준 편차 <10 %) 씨.알비칸스 세포에 결합하여 농축시켰다.
실시예 19: Ga ( III )-미세입자, Fe ( III )-미세입자, Zr ( IV )-미세입자에 의한 곰팡이 세포의 포획
아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) (ATCC 16404)의 포자 포획에 대한 것임을 제외하고는 실시예 18에 개시된 바와 같이 Ga(III)-미세입자-2, Fe(III)-미세입자-2, Zr(IV)-미세입자-2, 및 금속 이온이 없는 상응하는 미세입자 (각각 25 μg)를 별도로 시험하였다. 약 1 × 108 포자/mL의 농도의 포자 원액을 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)로부터 입수하였다. 결과가 하기 표 17에 나타나 있다.
Figure 112009071625251-PCT00017
데이터는 두 가지 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 20: Ga ( III )-미세입자, Fe ( III )-미세입자 및 Zr ( IV )-미세입자에 의한, 식품 샘플로부터의 살모넬라의 포획
식품 샘플을 지역 식료품점(미국 세인트폴 소재의 컵 푸즈)에서 구매하였다. 식품 샘플(슬라이스 햄/바나나 퓨레/사과 주스) (11 g)을 살균 접시에서 칭량하고 살균 스토마허(STOMACHER) 폴리에틸렌 필터 백(영국 노르포크 소재의 시워드 코포레이션(Seward Corp))에 첨가하였다. 이어서 각 식품 샘플에 99 mL의 버터필드 완충 용액을 첨가하였다. 생성된 샘플을 스토마허 400 서큘레이터(Circulator), 실험실용 블렌더(시워드 코포레이션)에서 2분 사이클 동안 블렌딩하였다. 블렌딩된 샘플을 살균 50 mL 원심분리 튜브(BD 팔콘, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨슨)에 수집하고 5분 동안 2000 회전/분(rpm)에서 원심분리하여 큰 파편을 제거하였다. 생성된 상청액을 추가 시험을 위한 샘플로서 사용하였다.
박테리아 희석물을 용액(pH 7.2 ± 0.2; 제1인산칼륨 완충 용액 (브이더블유알 카탈로그 번호 83008-093, 미국 펜실베이니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알)) 중에 제조하였다 . 블렌딩된 식품 샘플에 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 아종 엔테리카 세로바르 티피뮤리움(enterica serovar Typhimurium) (ATCC 35987)의 18-20시간의 하룻밤 배양물 (약 1×109 CFU/mL)로부터의 희석물을 이용하여 1.6-2.6×102 CFU/mL 농도로 박테리아 배양물을 스파이크하였다. Ga(III)-미세입자-2, Fe(III)-미세입자-2, 및 Zr(IV)-미세입자-2를 1 mL의 스파이크된 상청액을 함유한 별도의 살균 5 ㎖ 폴리프로필렌 튜브(팔콘, 미국 뉴저지주 소재의 벡톤 딕킨슨)에 첨가하였다. 금속 이온 코팅된 자성 입자를 100 ㎍/mL의 농도에서 시험하였다. 튜브 뚜껑을 닫고, 내용물을 서모라인 맥시믹스 플러스 와동 믹서(미국 아이오와주 소재의 반스테드 인터내셔널)에서 혼합하고, 15분 동안 실온 (25℃)에서 인큐베이션하였다. 뚜껑을 닫은 튜브를 서모라인 배리 믹스(VARI MIX) 진탕기 플랫폼(미국 아이오와주 소재의 반스테드 인터내셔널)에서 20분 동안 실온(25℃)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 자석(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 다이날)을 이용하여 10분 동안 자성 입자를 분리하였다. 금속 이온이 없는 100 ㎍/mL의 비개질 자성 입자(미국 인디애나주 인디애나폴리스로부터의 1 마이크로미터 직경 세라딘 카르복실산)를 함유한 대조 튜브를 유사하게 처리하였다. 상청액 (1 mL)을 제거하여 제조업자의 설명서에 따라 페트리필름 호기성 균류 카운트 플레이트(미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니) 상에 도말하였다. 분리된 자성 입자를 1 mL 버터필드 완충액에 재현탁시키고 페트리필름 호기성 균류 카운트 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 48시간 인큐베이션 후, 페트리필름 플레이트 판독기(미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니)를 이용하여 박테리아 콜로니를 정량화하였다. 포획 %는 (도말된 입자로부터의 콜로니의 수/도말된 미처리 대조군에서의 콜로니의 수) × 100으로 계산하였다. 결과가 하기 표 18에 나타나 있다.
Figure 112009071625251-PCT00018
각 값은 시험한 2가지 샘플에 기초하며, 모든 샘플에 있어서 표준 편차는 10% 미만이었다.
실시예 21: 스파이크된 사람 전혈로부터의 박테리아 DNA의 추출 및 검출
전혈 매트릭스로부터 박테리아 DNA를 추출하고 단리하기 위한 샘플 준비 방법이 유용할 수 있다. 이 실시예에서는, 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스 ATCC #BAA-43 (MRSA)로 스파이크된 사람 전혈의 현탁액을 Zr(IV)-미세입자-2 상에서 용해시키고 이와 동시에 포획시켰다. 세척 및 용출 후, Zr(IV)-미세입자-2로부터의 용출물을 실시간 PCR을 통해 대조 샘플과 비교하였다.
구체적으로, MRSA를 비-선발성의 트립신 처리 소이 한천(TSA) 배지에 스트리킹하고 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 현탁액은 1×108 CFU/mL에 상응하는 0.5 맥팔랜드(McFarland) 표준물을 이용하여 TEP 완충액 (10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 및 0.2% 플루로닉 L64 (미국 뉴저지주 마운트올리브 소재의 바스프)) 중에 희석하여 신선한 성장액으로부터 제조하였다. 연속 희석물을 제조하여 박테리아 세포의 상이한 농도를 얻었다.
적절한 박테리아 희석물 일백 (100) μL을 사람 전혈 900 μL 분액에 첨가하여 1 × 102 CFU/mL 농도를 성취하였다. 스파이크된 전혈 이백오십 (250) μL 분액을 추가 프로세싱을 위해 분리하였다. 십 (10) μL의 Zr(IV)-미세입자-2 (10㎎/mL) 및 40 μL의 라이소스타핀 (250 μg/mL, 시그마)을 스파이크된 전혈의 각 분액에 첨가하였다. 비드 혼합물을 부드럽게 와동하면서 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 미세입자 혼합물을 자석으로 분리하고 290 μL의 각 상청액을 제거하여 버렸다 (남은 부피 10 μL ). 이어서 미세입자를 90 μL TEP 완충액으로 세 번 세척하였다 (남은 부피 10 μL로 계속함). 세 번째 세척 후, 10 μL의 20 ㎎/mL 프로테이나제 K (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)) 및 80 μL의 20 mM 인산염(pH 8.5) 완충액을 각 샘플에 첨가하였다(100μL 총부피). 혼합물을 10분 동안 65℃에서 인큐베이션하고 이어서 10분 동안 95℃에서 가열하였다. 이어서, 가열된 미세입자 혼합물을 자석으로 분리하고 각 상청액을 후술하는 mecA 실시간 PCR을 위해 수집하였다.
별도로, 순수한 MRSA 배양물(전혈 없음)을 상기의 것을 따르는 프로토콜을 이용하여 Zr(IV)-미세입자-2로 추출하고 단리하였다.
각 샘플(SN3)을 하기의 최적 농도의 프라이머, 프로브 및 효소 및 열 사이클 프로토콜을 이용하여 mecA 유전자의 실시간 PCR 증폭에 처하였다. 하기에 열거된 모든 프라이머 및 프로브의 서열은 5'→3' 배향으로 주어지며, 이는 알려져 있고 문헌 [Francois, P., et al., Journal of Clinical Microbiology, 2003, volume 41, 254-260]에 개시된다. 전방향 mecA 프라이머는 CATTGATCGCAACGTTCAATTT (서열 번호 1)였다. mecA 역방향 프라이머는 TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA (서열 번호 2)였다. mecA 프로브 서열, TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT (서열 번호 3)는 각각 5'- 및 3'- 위치에서 6-카르복시플루오레세인(FAM) 및 IBFQ(아이오와 블랙 에프큐, 미국 아이오와주 코랄빌 소재의 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스)로 이중 표식시켰다. PCR 증폭은 5 L의 샘플과 5 L의 하기 혼합물을 함유한 총 10 L 부피로 실시하였다: 두 가지 프라이머 (각각 10 M 0.5 L), 프로브 (2 M 1 L), MgCl2 (25 mM 2 L) 및 라이트사이클러 DNA 마스터 혼성화 프로브 (10x 1 L, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐). 증폭은 하기 프로토콜을 이용하여 라이트사이클러 2.0 실시간 PCR 시스템(로쉐)에서 실시하였다: 95℃, 30초 (변성); 95℃, 0초(20℃/s의 기울기), 60℃, 20초 (20℃/s의 기울기, 단일 획득)의 45회의 PCR 사이클.
로쉐 라이트사이클러 2.0 실시간 PCR 시스템에 제공된 소프트웨어를 이용하여 결과를 분석하였다. 프라이머는 표 4에 나타낸 바와 같이 이 실시예에서 제시된 조건 하에서 mecA 유전자를 성공적으로 증폭시켰다. 이 실험의 결과는 전혈 내의 MRSA가 Zr(IV)-미세입자-2에 의해 포획됨을 나타낸다.
[표 4]
미세유체 모방 프로토콜로 Zr(IV)-미세입자-2를 이용하여, 스파이크된 전혈 샘플(이중)로부터 추출되고 단리된 MRSA의 실시간 PCR 검출(mecA 유전자) Ct 값을 이중으로 보고한다.
Figure 112009071625251-PCT00019
실시예 22: 스파이크된 갯과 동물 배설물로부터의 박테리아 DNA의 단리 및 검출
배설물 매트릭스로부터 박테리아 DNA를 추출하고 단리하기 위한 샘플 준비 방법이 유용할 수 있다. 이 실시예에서는, 반코마이신-내성 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) ATCC #700221 (VRE)로 스파이크된 갯과 동물 배설물의 현탁액을 사전 여과하여 샘플로부터 불용성 파편을 제거하였다. 이어서, 생성된 용출물 내의 VRE를 Zr(IV)-미세입자-2 상에 포획하고 고체 지지체 상에서 용해시켰다. 세척 및 용출 후, Zr(IV)-미세입자-2로부터의 용출물을 실시간 PCR을 통해 대조 샘플과 비교하였다.
구체적으로, VRE를 혈액 한천 배지 상에 스트리킹하고 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 현탁액은 1×108 CFU/mL에 상응하는 0.5 맥팔랜드 표준물을 이용하여 TEP 완충액 (10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 및 0.2% 플루로닉 L64 (미국 뉴저지주 마운트올리브 소재의 바스프)) 중에 희석하여 신선한 성장액으로부터 제조하였다.
1/10 (0.1) g의 갯과 동물 배설물을 0.1% 트리톤 X-100(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치)을 함유한 1 mL의 0.1 M 4-모르폴린에탄설폰산(pH 5.5) (MES) 완충액 중에 와동에 의해 균질화시켰다. 십 (10) μL의 1 × 108 CFU/mL VRE를 배설물 균질물 내에 스파이크하였다. 스파이크된 배설물 균질물을 잠시 와동하고 이어서 엠포어(EMPORE) 6065 필터 플레이트 (미국 미네소타주 세인트폴 소재의 쓰리엠)를 통해 여과하였다.
십 (10) μL의 20 ㎎/mL 프로테이나제 K (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠) 및 10 μL의 Zr(IV)-미세입자-2 (10㎎/mL)를 여과된 배설물 균질물 80 μL에 첨가하였다. 미세입자 혼합물을 200 rpm으로 진탕하면서 10분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 부드럽게 와동하면서 10분 동안 실온에서 추가로 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 자석을 이용하여 샘플을 분리하였다. 상청액을 제거하고 100 μL의 TEP 완충액을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 잠시 와동하고 자석에 재적용하였다. 상청액을 제거하고 80 μL의 MES 완충액에 샘플을 재현탁시켰다.
십 (10) μL의 12,500 U/mL 뮤타노라이신(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마) 및 10 μL의 25 ㎎/mL 라이소자임(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 200 rpm으로 진탕하면서 10분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 부드럽게 와동하면서 10분 동안 실온에서 추가로 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 미세입자 혼합물을 자석으로 분리하고 상청액을 제거하여 버렸다. 이어서 미세입자를 100 μL TEP 완충액으로 두 번 세척하였다. 두 번째 세척 후, 미세입자를 100 μL의 20 mM 인산염 완충액 (pH = 8.5)에 재현탁시키고 10분 동안 95℃에서 가열하였다. 이어서, 가열된 미세입자 혼합물을 자석으로 분리하고 상청액을 후술하는 vanA 실시간 PCR을 위해 수집하였다.
별도로, 순수한 VRE 배양물(배설물 또는 여과 없음)을 상기의 것을 따르는 프로토콜을 이용하여 Zr(IV)-미세입자-2로 추출하고 단리하였다. 다른 순수한 VRE 배양물(배설물 또는 여과 없음)을 또한 제조업자의 설명서에 따라 매그나 퓨어 LC DNA 분리 키트 III(박테리아, 진균류) 키트(장비 및 시약은 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐로부터 입수함)를 이용하여 매그나 퓨어 LC 시스템으로 추출하고 단리하였다. 이어서, 생성된 매그나 퓨어 단리된 DNA를 스파이크된 배설물 및 순수 배양 샘플과의 비교를 위해 등가의 농도로 MES 중에 희석하였다.
반코마이신-내성 엔테로코커스 파에시움의 vanA 유전자에 상보적인 프라이머는 알려져 있으며 문헌[Volkmann et al., Journal of Microbiological Methods, 2004, volume 56, page 277-286]에 개시된다. 전방향 프라이머 서열은 5' CTGTGAGGTCGGTTGTGCG 3' (서열 번호 7)이며 역방향 프라이머 서열은 5' TTTGGTCCACCTCGCCA 3' (서열 번호 8)이다.
라이트사이클러 패스트스타트(FastStart) DNA 마스터 SYBR 그린 키트 (미국 인디애나주 인디애나폴리스소재의 로쉐)를 이용하여 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 실시하였다. 십사 마이크로리터 (14 μL)의 효소를 반응 완충액의 한 튜브에 첨가하였다. 효소/반응 완충액 혼합물을 와동하고 반응마다 하기 레시피를 이용하여 라이트사이클러 모세관에서 PCR 반응물을 생성하였다: 9 μL의 PCR-등급 H2O, 1 μL의 10 μM 전방향 프라이머, 1 μL의 10 μM 역방향 프라이머, 4 μL의 효소/반응 완충액 믹스, 및 5 μL의 샘플 DNA.
반응물을 로쉐 라이트사이클러 2.0 실시간 PCR 시스템 내에 두고 하기의 열사이클 프로파일을 샘플에 적용시켰다: 95℃, 10분, 이어서 순서대로 95℃, 10초 (20℃/s의 기울기), 50℃, 10초 (20℃/s의 기울기) 및 72℃, 30초 (20℃/s의 기울기, 획득)의 3개의 단계의 45 사이클.
로쉐 라이트사이클러 2.0 실시간 PCR 시스템에 제공된 소프트웨어를 이용하여 결과를 분석하였다. 프라이머는 표 5에 나타낸 바와 같이 이 실시예에서 제시된 조건 하에서 vanA 유전자를 성공적으로 증폭시켰다. 이 실험의 결과는 배설물 내의 VRE가 사전 여과 단계 후 Zr(IV)-미세입자-2에 의해 포획됨을 나타낸다.
[표 5]
여과 및 Zr(IV)-미세입자-2를 이용하여, 스파이크된 갯과 동물 배설물 샘플(사중)로부터 추출되고 단리된 VRE의 실시간 PCR 검출(vanA 유전자). Ct 값을 이중으로 보고한다.
Figure 112009071625251-PCT00020
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌 및 간행물 또는 그 일부는 전체적으로 본 발명에 참고되어 본 명세서에 명백하게 포함된다. 본 발명의 예시적인 실시 형태가 논의되어 있으며, 본 발명의 범주 이내의 일부 가능한 변경이 참조되었다. 본 발명의 이들 및 다른 변화 및 변경은 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백하게 될 것이며, 본 발명이 본 명세서에 기술된 예시적인 실시 형태들로 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 하기에 제공된 실시 형태들 및 그 등가물에 의해서만 한정되어야 한다.
<110> 3M Innovative Properties Co. Xia, Wensheng Holt, Paul N Parthasarathy, Ranjani V Kshirsagar, Manjiri <120> COMPOSITIONS, METHODS, AND DEVICES FOR ISOLATING BIOLOGICAL MATERIALS <130> 62809WO003 <150> US 60/913,812 <151> 2007-04-25 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 cattgatcgc aacgttcaat tt 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 2 tggtctttct gcattcctgg a 21 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 3 tggaagttag attgggatca tagcgtcat 29 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 4 tgccttacag atagcatgcc a 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 5 agtaagtaag caagctgcaa tgacc 25 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 6 tcatttcacg caaactgttg gccactatg 29 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Enterococcus faecium <400> 7 ctgtgaggtc ggttgtgcg 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Enterococcus faecium <400> 8 tttggtccac ctcgcca 17

Claims (26)

  1. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
    금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는 조성물.
  2. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
    금속 이온들, My + 중 적어도 하나에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하며,
    pH는 4.5 내지 6.5인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, My +가 Zr4 + 또는 Ga3 +인 조성물.
  4. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
    샘플 물질을, -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법.
  5. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 제공하는 단계; 및
    샘플 물질을, pH 4.5 내지 6.5에서, -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시켜, a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2이며; 조성물의 pH는 4.5 내지 6.5임)를 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하고 선택적으로 분석하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 샘플 물질이 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 포함하는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시킬 때 샘플 물질을 용해 시약과 접촉시키는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 샘플 물질을 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +와 접촉시키는 단계는 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부 및 b) 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부로부터 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 수가 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 복수의 세포, 바이러스, 또는 그 조합의 적어도 일부에 용해 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 각각 제4항을 인용하는 제7항 또는 제11항에 있어서, 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 각각 제5항을 인용하는 제7항 또는 제11항에 있어서, 세포, 바이러스, 또는 그 조합을 용해시켜 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제4항 또는 제12항에 있어서, b) 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제5항 또는 제13항에 있어서, b) 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 양이 감소된 샘플 물질을 포함하는 상청액으로부터 a) 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘(amplicon)을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제31항에 있어서, 고정된 금속 지지체 물질에 결합된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 유체를 수용하거나 전달할 수 있으며, 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My+ (여기서, M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 함유하는 적어도 하나의 제1 챔버; 및
    제1 챔버와 분리되어 있으며, 적어도 하나의 제1 챔버로부터 유체, 고정된 금속 지지체 물질, 또는 이들 둘 모두를 수령하여 수용할 수 있는 적어도 하나의 제2 챔버를 갖는, 샘플 물질의 프로세싱을 위한 장치.
  19. 유체를 수용하거나 전달할 수 있는 적어도 하나의 챔버를 가진 장치;
    기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서 M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
    용해 시약, 용해 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액, 및 용출 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함하는, 샘플 물질로부터 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 분리하는 키트.
  20. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My + (여기서 M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질; 및
    고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합된, 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 포함하는 조성물.
  21. 기재에 결합된 복수의 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기 및 -C(O)O- 또는 -P(O)(-OH)2-x(-O-)x 기에 결합된 복수의 금속 이온, My +를 갖는 기재를 포함하는 고정된 금속 지지체 물질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 바이러스, 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 미생물을 갖는 것으로 생각되는 샘플을 제공하는 단계; 및
    조성물을 샘플과 접촉시키는 단계 (여기서, 샘플로부터의 복수의 미생물 중 적어도 일부는 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합되며;
    M은 지르코늄, 갈륨, 철, 알루미늄, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 이트륨, 및 란탄족으로 이루어진 군으로부터 선택되며; y는 3 내지 6의 정수이며; x는 1 또는 2임)를 포함하는, 미생물을 단리하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 샘플로부터의 복수의 미생물의 적어도 일부가 고정된 금속 지지체 물질에 비특이적으로 결합하게 된 후에 샘플의 나머지로부터 고정된 금속 지지체 물질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 복수의 미생물 중 적어도 일부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 검출은 생물발광에 의한 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 검출, 폴리다이아세틸렌(PDA) 비색 검출, 핵산 검출, 면역학적 검출, 성장 기반 검출, 현미경에 의한 시각적 검출, 자기 저항, 및 표면 음파 검출로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 방법에 의해 실시되는 방법.
  25. 제20항 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 바실러스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 코르니에박테리아(Cornyebacteria), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 비브리오(Vibrio), 예르시니아(Yersinia), 칸디다(Candida), 페니실륨(Penicillium), 아스페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium), 푸사리움(Fusarium), 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물 또는 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 임상 샘플, 식품 샘플, 및 환경 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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