JPH02177898A - ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的に反応するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）（血清型ｃ　／
　ｅ　／　、ｆ　）に特異的に反応するモノクロ−ナル
抗体、および該モノクロ−ナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマに関する。

従来技術 ストレプトコッカス・ミュータンスは、う蝕（虫歯）の
主たる原因菌として注目されている。ストレプトコッカ
ス・ミュータンスは健康人の歯面から採取したプラーク
からは、その２３％からしか分離されないが、う蝕部位
からは１００％に分離されるという報告がある。また、
ストレプトコッカス・ミュータンスが存在する比率と、
う蝕の発生頻度（ＤＭＦＳ）とが比例するということも
報告されている。さらに、健康な歯面にう蝕が起こるま
での経過を時間的に追って調へると、う蝕が発生する前
にはその部位にストレプトコッカス・ミュータンスが増
加するということも知られている。

ストレプトコッカス・ミュータンスはその血清型により
ａ　％　ｈに至る８つの型に分類されているが、近年、
ＤＮＡの相同性に基づきストレプトコッカス・クリセタ
ス（ａ型）、ストレプトコッカス・タンス（ｂ型）、ス
トレプトコッカス・ミュータンス（ｃ　／　ｅ　／　ｆ
型）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（ｄ／ｇ型）、
ストレプトフッカス・ダウネアイ（ｂ型）に再分類する
ことが提唱され、承認されている。このような分類に基
づくと、ａ型およびｂ型は貿歯類および稀にヒトから分
離され、ｈ型はザルから頻繁に分離され、Ｃ／ｅ／ｆ型
のストレプトコッカス・ミュータンスはヒトから高率に
分離され、その分離率は９０％にも及ぶことが知られて
いる。さらに、この血清型分類に従った各菌種とそのう
蝕発生の様子を比較すると、ストレプトコッカス・ミュ
ータンス（ｃ／ｅ／ｆ型）は主として歯の溝部にう蝕を
発生させるのに対し、ストレプトコッカス・ソブリヌス
（ｄ／ｇ型）は平面部のう蝕をも多発させるという、種
間の差による発生部位の特異性も示されている［例えば
、教養歯科基礎医学シリーズ「臨床家のための口腔微生
物学」、鷹森健志部、株式会社書林（１９８６年）、お
よび「歯の健康と食生活」、浜田茂幸糾、第一出版株式
会社（１９８６年）を参照］。

以上のような報告から、近年の分類学的見地からいうと
、う蝕の多くはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｃ
／ｅ／ｆ型）に起因し、ストレプトコッカス・ミュータ
ンスかう蝕の発生に関与する最も重要な病原菌であると
考えられる。

このように、ヒトの主たるう蝕原因菌であるス他の口腔
内ストレプトコツカス属には反応しない、特異性の極め
て高いモノクロ−ナル抗体の作成を試み、それに成功し
た。即ち、本発明は、血清型ｃ　／　ｅ　／　ｆのスト
レプトコ・７カス・ミュータンスとは反応するが、他の
口腔内ストレプトコツカス属とは反応しないモノクロ−
ナル抗体、および該モノクロ−ナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを提供するものである。

発明の構成および効果 本発明に係るモノクロ−ナル抗体、および該抗体を産生
ずるハイブリドーマは、以下のようにして製造すること
ができる・即ち、 ）ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体を抗原とし
てマウスを免疫し、 ｉ）該マウスの抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞
とを融合させ、血清型ｃ　／　ｅ　／　ｆのストレプト
コッカス・ミュータンスとは反応するが、他の口腔内ス
トレプトコツカス属とは反応しないモノクロ−ナル抗体
を産生じているハイブリドーマを選択し、 トレプトコノカス・ミュータンス（ｃ　／　ｅ　／　ｆ
　ｆｆＤに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体を作成
することは、ヒトにおけろう蝕の診断、予防、および治
療に極めて有用であり、現在までに、いくつかその作成
か試みられている。例えば、Ｌ　ｅｈｎｅｒらはストレ
プトコッカス・ミュータンス（Ｃ型）のスヘての菌に反
応し、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｅ／ｆ型）
には弱く反応するモノクロ−ナル抗体を得ている［Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ、　４６．１．６８　（１９
８４）　：　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５５．８
］０　（１９８７）］。

発明の目的 本発明者はヒトの主たるう蝕原因菌であるストレプトコ
ンカス・ミュータンス（ｃ／ｅ／ｆ型）に反応するモノ
クロ−ナル抗体の作製を試みていたか、これまでに得ら
れたモノクロ−ナル抗体はストレプトコッカス・ミュー
タンス（ｃ　／　ｅ　／　ｆ　型）に完全に特異的なも
のではなく、他の口腔内ストレプトコッカス属の種と交
差反応を示すものであった。そこで、さらに検討を進め
、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｃ／ｅ／’ｆ型
）のみに反応し、１１１）該ハイブリドーマを適当な条
件下で培養し、該モノクロ−ナル抗体を回収する。

工程１）のマウスの免疫は、血清型ｃ、ｅ、またはｆの
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体を抗原として
マウスに投与し、一定期間経過後さらに同一の抗原でマ
ウスを処理することによって行うことができる。血清型
ｆのストレプトコッカス・ミー−タンス、例えば５Ｅ１
７株を用いるのか好ましい。通常、この菌体はＦｒｅｕ
ｎｄの完全アジュバントと混合してマウスに投与する。

また、リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁させて投与しても
よい。

免疫するマウスとしては、例えばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスを用いるのが好ましい。

工程１１）の細胞融合は、工程１）で免疫されたマウス
の抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とを用い、常
法によって行うことかできる。

抗体産生細胞としては、上記ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺細
胞が最も好ましいか、これ以外に、例えば、マウスのリ
ンパ節細胞や末梢リンパ球なとも使用することかできる
。

ミエローマ細胞トシては、マウスのミエローマ細胞株Ｓ
　Ｐ　２１０−Ａｇｌ　４が好ましいが、Ｐ３Ｎ５１−
１−ｌ−１−ＡヤＰ３−Ｘ、６３−Ａｇ８−Ｕｌなどの
細胞株も用いることかできる。

細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、ＨＶ
Ｊ法、電気融合法などを挙げることかできる。

また、得られたハイブリドーマの選択は、例えば、以下
のようにして行うことができる。即ち、ハイブリトーマ
を適当な培地で培養し、その培養液とストレプトフッカ
ス・ミュータンス（血清型ｃ、ｅ、およびｆ）およびそ
の他のストレプトコツカス属と反応させ、例えば酵素抗
体法（ＥＩＡ）によってストレプトコッカス・ミュータ
ンス（血清型ｃ、ｅ、およびｆ）とのみ反応する抗体を
産生じているハイブリトーマを選択すればよい。次いて
、選択したハイブリドーマを限界希釈法によってクロー
ニングする。

工程１１１）のモノクロ−ナル抗体の回収は、例えｕｓ
　５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）、およびストレプトコッカス
−サンダイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇ
ｕｉｓ）とは反応しない。従って、本モノクロ−ナル抗
体は、ヒトにおけろう蝕の診断、予防、および治療に極
めて有用である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか
、本発明はこれに限定されるものではない。

寒旌珂 （１）抗原の調製 ストレプトコッカス・ミュータンス血清型ｆである５Ｅ
１７株をプレイン・ハート・インフュージョン（以下、
ＢＨＩと略称する）液体培地に接種し、３７°Ｃで１８
時間培養した。培養した菌体を回収し、リン酸緩衝化生
理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）により３回遠心洗
浄してから、菌体をその２倍容量のＰＢＳに懸濁した。

この菌液を沸騰水中で２０分間処理した後、ＰＢＳで２
度洗浄した。得られた死菌体をＰＢＳに懸濁して、６６
０ｎｍの濁度が１．０になるように菌液を調製ば、工程
１１）で得られたクローンをマウスの腹腔内に移植した
後、その腹水液から常法によって行うことができるし、
大量培養装置を用いてノーイブリド−マクローンを培養
した培養液からも常法どうり回収することかできる。ま
た、回収した抗体を、硫安塩析、分子ふるい、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等によって精製してもよい。

後記実施例に示すように、本発明のモノクロ−ナル抗体
は、血清型ｃ、ｅ、およびｆのストレプトコッカス・ミ
ュータンスとは反応するが、その他の口腔内ストレプト
コツカス属、ストレプトコツｕｓ）　、ストレプトコッ
カス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｏ
ｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス０ダウネストレプ
トコツカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃし
、これを抗原液として用いた。

（２）マウスの免疫 上記抗原液とＰｒｅｕｎｄ完全アジュバントの各々等量
を混和して乳状液（ｗａｔｅｒ　−１ｎ−ｏｉｌ状）と
した。

この乳状液をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（８週齢：
♀）に１ｍρ／匹で腹腔内投与して免疫し、その４週後
から１週毎に、０　５ＭＱの抗原液７匹で１２回反復し
て免疫を行った。免疫したマウスから血清を少量採取し
、後述の酵素抗体法（以下、ＥＩＡと略称する）により
血清中の抗体価を測定した。抗体価かエンドポイント測
定法で２０万倍以上を示したマウスにつき、前述の最終
腹腔的免疫か終了して１週間後に再び前述の抗原液０．
５ｍ（２を尾静脈中に投与し、その４日後に肺臓を摘出
して細胞融合に供した。

（３）ハイブリドーマの調製 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス由来のミエローマ細胞Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇ１４株を１０％仔牛血清（以下、Ｆｅ２
と略称する）を含むダルベツコ変法イーグル培地（以下
、ＤＭＥＭ培地と略称する）中で培養し、生存率が９０
％以上の状態で回収し、その細胞をＤＭＥＭ培地で２回
洗浄した後、再びＤＭＥＭ培地に懸濁してミエローマ細
胞浮遊液とした。この液中の生細胞密度を血球計算盤を
用いるトリパンブルー排除試験にて測定した。

免疫マウスから肺臓を摘出して、ＤＭＥＭて３回洗浄後
、これを細切して、新たな１．ＯｍρのＤＭＥＭ培地中
でピンセ、　ｌ−を用いて圧縮することにより分散させ
単個細胞浮遊液とした。結合組織や細胞凝集塊を静置し
て除き、この単個肺細胞を遠心して回収した。次いて、
この細胞を５ｍρの０８３％塩化アンモニウム溶液中に
＋ｙ、Ｈして水冷下に１０分間放置し、混入する赤血球
を破壊した。

これに５ｍ１２のＤＭＥＭ培地を加えて遠心し、得られ
た沈降細胞を８ｍ０．のＤＭＥＭ培地に懸濁して肺細胞
浮遊液とした。肺細胞浮遊液中の生存細胞数を前記のト
リパンブルー排除試験法で測定すると２５〜３．０Ｘｉ
０８個／匹てあった。各々のマウスから得られた肺細胞
浮遊液に、その生細胞数の１／１０数のミエローマを含
むミエローマ細胞一マ・コロニーヲ形成すセタ。

（４）酵素抗体法（Ｅ　Ｉ　Ａ）による抗体価の測定ス
トレプトコッカス・ミュータンス　５Ｅ１７株をＢＨＩ
液体培地に接種し、３７°Ｃて１８時間培養した後、Ｐ
ＢＳて３回遠心洗浄して菌体を得た。これをＰＢＳに再
ひ懸濁して６６０ｎｍの濁度が０６となるよう調整し、
この菌液をＮ　ｕｎｃ社製９６穴イム／プレートＩＩに
５０μり／穴となるよう分注し、３７°Ｃにて一夜乾固
させて抗原固定化プレートとした。このプレートに１％
牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ、−ＰＢ
Ｓと略称する）を３００μＱ／穴で分注し、３７°Ｃて
３０分間放置することにより非特異的吸着効果を低減さ
ぜた。ＢＳＡ−Ｐ、ＢＳをＰＢＳて洗浄後、ノ＼イブリ
ト−マ培養」１清、希釈した腹水」１清、あるいは希釈
した抗５Ｅ１７株−マウス抗血清を５０μＱ／穴で分注
し、３７°Ｃで１時間反応させた。これをＰＢＳで洗浄
後、西洋ワサビペルオキ／ダーセで標識化した抗マウス
（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）−ヤキｒｇｃ（１’）ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ希釈液を５０μｃＶ、／穴で分注し、浮遊液を混和し
、全細胞を遠心して回収した。」１清を除き、細胞を室
温に戻してから、］、ｍｆ２の５０％ポリエチレングリ
コール（ＤＭＥＭ培地中）（以下、ＰＥＧと略称する）
を１〜２分かけて徐々に添加して細胞と混和した。次に
］、Ｏｍ（２のＤＭＥＭ培地を５分間に渡って徐々に加
え、ＰＥＧを希釈した後、遠心して細胞を回収した。得
られた融合細胞に、１０ｍｆ２の２０％ＦＣ３、］、Ｏ
ＯμＭヒポキサンチン、１６μＭチミジンを含むＤＭＥ
Ｍ培地（以下、ＨＴ培地と略称する）を加えて遠心腰洗
浄した。この細胞を新たなＨＴ培地中に２．５×１０６
胛細胞／ｍａとなるよう懸濁して、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製
９６穴カルチャープレー１・に］、　ＯＯμ（２／穴と
なるように分注した。３７°Ｃ１５％ＣＯ２の存在下で
６時間培養した後、各人に１００μρの８００ｎＭアミ
ノプテリンを含むＨＴ培地を加え、培養液を４００ｎＭ
アミノプテリンを含むＨＴ培地（以下、ＨＡ　Ｔ選択培
地と略称する）とした。その後、このＨＡ、　Ｔ選択培
地中で１０〜１４日間、５％Ｃｏ、存在下に３７°Ｃて
培養し、ハイフリド３７°Ｃて３０分間反応させた。こ
れをＰＢＳて洗浄後、２．２’−アンノー７−［３−エ
チルーヘンソチアゾリンー（６）−スルホン酸］と過酸
化水素を含む基質液（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ　ａｎｄ　Ｐ
ｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＱ
／穴で分注して、生しる発色の強度を４１．４　ｎｍに
おいて分光光度計て測定した。

抗体結合量と吸光度が比例関係を持つ時間域において得
られた結果を比較して抗体価の指標とした。

モノクロ−ナル抗体の菌種あるいは血清型特異性を判定
するため、上記の５Ｅ１７株以外に下記の菌株も抗原と
して用いた。即ち、ミュータンス群連鎖球菌として、 ストレプトコッカス・クリセタス　＋−ｒｓ１株、Ｅ　
４．９株、８３６株 ストレゾ１ヘコツカス・タンス　ＦＡ］株、ＢＨＴ株、
ＫＡＹＩ株 ストレプトコッカス・ミュータンス°ｌｎｇｂｒｉｔｔ
株、ＭＴ６Ｒ株、ＬＭ７株、２４株、ＭＴ７０３Ｒ株、
０Ｍ７１７５株、ＭＴ５５７株 ストレプトコッカス・ソブリヌス　ＯＭＺ　ｌ　７６株
、ＭＴ６］５Ｒ株、８１３株、０Ｍ２６５株、６７１５
株、ＫＩＲ株 ストレプトコッカス・タウ不アイ　ＭＰ　２５株、ＢＦ
ｅｌ　２株、Ｍ　４．−４．９株ニス［−レプトコノノ
Ｊス・フィラス　８　Ｓ　１．　＋Ｌ　ＨＤ３株 ならびに、他の口腔内連鎖球菌として、ストレフｌ−コ
ツカス・ミテイス　ＡＴＣＣ９８１１株、ＡＴＣＣ１，
５９０９株、ＡＴＣＣ１，５９１０株、ＡＴＣＣ］、５
９１．３株 ストレプトコノノＪス・サリバリウス：ＨＨＴ株、ｊ（
Ｔ　９　Ｒ株 ストレプトコッカス・サンダイス　ＭＴ株、Ｓ１゛６株
、ＡＴＣＣ１０５５６株、ＡＴＣＣ１０５５７株である
。

（５）ストレプトコッカス・ミュータンス血ｌ青型ｃ、
ｅ、およびｆに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体を
産生するノーイブｌ）　ｌ・−マのクローニング コロニーを形成した培養穴から５０μＱずつ」−上、血
清型ｅ）；５Ｅ１７株、０Ｍ２１．７５株、ＭＴ５５７
株（以上、血清型ｆ）のみに反応する抗体を分泌するハ
イブリトーマを、ストレプトコッカス・ミュータンス（
血清型Ｃ，，ｅ、、ｆ）に特異的なモノクロ−ナル抗体
を分泌するマウスハイブリトーマｆ８９株として樹立し
た（第１図）。

このマウスハイブリトーマｆ８９株（このハイブリドー
マクローンか産生ずるモノクロ−ナル抗体はＭＡｂｆ８
９と命名）は、微工研閑寄第１０４６４号（ＦＥＲＭ　
Ｐ−１０４６４）として寄託されている。

（６）モノクロ−ナル抗体ＭＡｂｆ８９の免疫グロブリ
ンクラスの同定 マウスハイブリドーマｆ８９の培養」１清を分取し、サ
ンドイッチＥＩＡ法を原理とするマウスモノクロ−ナル
抗体アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａ＋Ｊｔ製
）を用いて樹立ハイブリドーマクローンにより産生され
るモノクロ−ナル抗体ＭＡｂｆ８９のアイソタイピング
を行った。同キットはマウスＩｇＡ、ＩｇＭ、、ＩｇＧ
＋、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２＋、、ｒｇ清を分取し、Ｓ　
Ｅ　１．７株を抗原として上記（４）に示したＥ／ＩＡ
にて抗Ｓ　Ｅ　１．７株抗体の有無を検討した。ＥｊＡ
陽性の培養穴中のコロニーを２４穴カルチヤープレート
（Ｎｕｎｃ社製）に移して培養を続けた後、各々につい
てＨＴ培地中に１０細胞／ｍ１２となるよう希釈分散し
、９６穴カルチヤープレートに＋−００μρ／穴となる
ように分注した。５％Ｃ○２の存在下、３７°Ｃて１０
〜１４日間インキユヘートした後、コロニー形成穴の培
養上清を５０μＱ分取して、再びＳ　Ｅ　１．７株を抗
原として上記（４）のＥＩＡを行ない抗５Ｅ１７株抗体
の有無を調へた。ＥＩＡ陽性で単一コロニーを生じた培
養穴から、そのコロニーを２４穴ノＪルチヤーフレート
に移して培養し、上記と同様の限界希釈法によって再度
２回クローニングを行った。上記（４）に示した全ての
菌株を抗原に用いて、最終クローニングの培養上清中に
含まれているモノクロ−ナル抗体の抗原特異性を調へた
。ストレプトコッカス・ミュータンス　ｌｎｇｂｒｉｔ
ｔ株、ＭＴ６Ｒ株（以上、血清型ｃ）；ＬＭ７株、２４
株、ＭＴ７０３Ｒ株（以Ｇ３、およびに、λ鎖を同定す
る。これによると、モノクロ−ナル抗体ＭＡｂｆ８９の
クラスは１ｇＧ２゜であり、そのＬ鎖はに型であった。

（７）マウス腹水中での抗体産生 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウス（８〜１０週齢）に０．
５ｍＱのブリスタン（２，６，］、　ｏ、　１４−テト
ラメチルベンタテカン）７匹を腹腔内投与した。その１
０日後に、あらかしめ１０％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ培地
で培養しておいたハイブリトーマｆ８９を２．０×１０
７／匹として同マウスの腹腔内に接種した。

接種して１０〜２０日後、マウスか死亡する直前に、腹
水を採取し、遠心して腹水上清を得た。Ｉｎｇｂｒｉｔ
ｔ株を抗原とし、上記（４）に示したＥＩＡにより、得
られた腹水上清の抗体価を調へた。同時にハイブリドー
マｆ８９の培養上清、およびそれを硫安分画して１０倍
濃縮したものについても同様に抗体価測定を行い、これ
らを比較した（第２図）。得られた腹水上清は培養上清
の約２６０倍、濃縮培養上？青の約３０倍の抗体価を持
ち、ＭＡｂｆ８９の大量精製材料として適することか判
明し

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクロ−ナル抗体ＭＡｂｆ８９と種々の菌
株との反応性を調べた結果を示すグラフであり、第２図
は、ハイブリドーマｆ８９をマウス腹腔内に投与して得
た腹水液、ハイブリドーマｆ８９の培養上清、およびそ
れを１０倍濃縮したものについて、抗体価を測定した結
果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトコッカス・ミュータンス（血清型ｃ／ｅ
   ／ｆ）に特異的に反応するモノクロ−ナル抗体。 ２、請求項１記載のモノクロ−ナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマ。