JPH034783A - トレポネーマに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクローナル抗体の生産に関し、特にトレピ
ネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）細菌病原体に対して向け
られたモノクローナル抗体を連続的に生産することので
きるハイブリッド細胞株（ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌｌｉ
ｎｅｓ　）に関する。

近年、細菌細胞の免疫原決定基及び毒素類に対して特異
的なモノクローナル抗体を生産することが出来ることが
診断薬及び免疫治療薬の新らしい展望を与えている。

トレイネーマ属細菌は各種病原性病気に関わつているも
のでちる。特に重要であるトレボネーマノぐリダム（Ｔ
ｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）は梅毒の原因と
なる性的に伝染されるヒトの細菌病原体である。

数十年にも亘るこの生物を理解しようとする真撃な努力
にも拘らずトン２ネーマ　パリダムについては殆んど何
も知られていない。情報の大きな欠陥は、トレポネーマ
　・ξリダムがヒトのその他の病原体のようにｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏでは生育することのできないヒトに対する極め
て少ない細菌病原体の一つであるという事実に発生する
ものである。その結果、この生物の性質及びそれの作り
出す病気を明らかにしようと試みる研究者は実験室のウ
サギの精巣（翠丸）におい・てトレボネーマ　パリダム
を培養することに留められていた。

ヒトにおける未治療梅毒は、しばしば診断が極めて難し
い重い、慢性的且つ極めて複雑な病気である。現在の診
断器具の制限及びワクチンの不存在により、有効なペニ
シリン治療の利用可能性をもってしても梅毒は米国のみ
において毎年はぼ３５万件の推定頻度で隆盛を示してい
る。

更に、罹患率及び死亡率に関してより全世界的影響をお
そらく有するその他のトレボネーマによる病気がおる。

すなわち、２ランベジア（ｙａｗｓ）、ピンク（ｐｉｎ
ｔａ）、及びペジエル（ｂｅｊｅｌ）の原因であるトレ
ボネーマはトレボネーマ　パリダムと形態学的及び血清
学的に区別することのできないトレボネーマである。こ
れらの病気は極めて深刻に全世界的でアシ、特にいわゆ
る第三世界諸国において深刻である。これらの病気は性
的に伝染される因子であるトレボネーマ　パリダムとは
対照的に通常のヒト対ヒトの接触により伝染するものと
思われている。その結果、これらの特別の病気は伝染性
が高く、大人口に対し破壊的であり、そのため有効な抑
制を逃れている。

過去同士年間に亘るトレポネーマ　パリダム或いはその
他の非病原性トレポネーマの全細胞、抽出物或いはアジ
ュバント調剤を用いるワクチン開発の多くの試みは失敗
に終っている。一つの研究は、ガンマ−線照射で弱めら
れたトレポネーマパリダム（Ｎｉｃｈｏｌｇ）を用いた
ウサギのワクチン化の成功を報告している。ヒトに対す
る潜在的免疫化計画としてのこの接近手法には、幾つか
の主たる欠点がある。これらの欠点としては、新らたに
単離され、新らたに照射されたトレボネーマ類を多量に
調製することが非実用的であること、並びにトレポネー
マ懸濁液中に存在する汚染ウサギ蛋白質に対する被投与
者の過敏症反応に伴う欠点などが挙げられる。

梅毒及びその他の関連した病原性トレボネーマ病の研究
は細菌性伝染病のその他の領域よりもはるかに遅れ続け
ている。特にトレボネーマ　ノξリダム感染に対する体
液応答の複雑性及びそれに引続く抗原成分の純粋培９７
　（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）のために多量のトレ
デネーマ　・ξリダム細胞を得ることができないことが
ウサギ及びヒトにおいて保護免疫を引出す原因であるト
レボネーマ　ノソリダムの特異的免疫原の同定を著しく
妨げてきた。未だ同定されておらず、特性化されていな
い特異的トレポネーマ　パリダムの免疫原は、梅毒の抑
制ののための免疫学的接近手法への鍵を握るものと思わ
れる。

トレボネーマ種決定基に対して特異的なモノクローナル
抗体を生産するためのトレボネーマー感作ｎ臓或いはリ
ンパ結節細胞とプラスマ細胞の細胞株（ｐｌａｓｍａｃ
ｙｔｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）との形質細胞体細
胞融合は、過去の主たる障害を迂回する新しい革新的な
方法を提供するものである。−度、首尾よく行われるな
らば、トレボネーマ　パリダム抗原に対する実質的に無
限の単一特異性抗体の供給は常時容易に利用可能となる
。次いで、これらの単一特異性抗体を用いてトレボネー
マ免疫原の抗原成分を分析することができる。この新ら
しいハイブリドーマ細胞融合技術を使用して特異的トレ
ポネーマ免疫原を単離し、特性化することは、ワクチン
開発を通じて発病学及び梅毒、７ランベ、ノア、ピンク
及びベジエルの免疫学的抑制を理解するために必要とさ
れる材料及び洞察を与えるものと思われる。

本発明は、トレボネーマ抗原に向けられたモノクローナ
ル抗体を生産する連続ノ・イズリツド細胞株の開発を探
索するものである。選ばれた細胞株（ｃｅｌｌ　１ｉｎ
ｅｓ）は、結合部位特異性に関してトレボネーマ細菌に
よシ示される単一抗原決定基に同一である一組の単一特
異性抗体を連続的に生産することができる。

本発明によればトレボネーマ抗原、特にトレボネーマ　
パリダムに対して高度に特異的且つ均一なモノクローナ
ル抗体を作り出し分泌する連続ハイプリドーマ細胞株が
確立される。

本発明は、その最も広い側面において、先ず動物をトレ
ボネーマ細菌に対して免疫化して開始（ｐｒｉｍｉｎｇ
）抗原決定基に向けられた抗体を生産するリン、８球及
びそれらの分化子孫を生育させるものである。このリン
パ球を回収し、骨髄腫、プラスマ細胞或いはハイズリド
ーマ細胞と融合し、体細胞ハイブリッドを形成する。こ
の細胞ハイプリツｒを培養し、選択し、単離し、そして
組織培養において増殖させる。その後、このハイブリッ
ド細胞株は選ばれた免疫抗原に対するモノクローナル抗
体を無限に生産することができ−るようになる。

本発明によれば、トレボネーマの抗原決定基に対するモ
ノクローナル抗体を生産する連続ハイブリッド細胞株が
提供される。トレポネーマ　パリダムに特異的に向けら
れたモノクローナル抗体或いはトレボネーマ群の抗原に
特異的に向けられたモノクローナル抗体（幾つかのトレ
ボネーマ種間に交差反応する抗体）を生産する連続細胞
株が単離された。更に、有害なトレボネーマを固定化す
ることのできる補体固定モノクローナル抗体が提供され
る。

以下、本出願の時点において最良の態様を表わすものと
思われる本発明の好ましい実施態様について説明を行う
。

本発明の方法に従えば、試験動物はトレダネーマ細菌を
含有する調剤を用いた免疫化によって抗体生産のために
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて刺戟される。

本発明の好ましい実施態様においては、ウサギの精巣か
ら抽出したトレボネーマ　パリダムの接種材料を用いて
マウスを免疫化した。

或いは又、抗体を生産することのできる正常及び免疫分
化９７７２球を試験動物から単離し、培養し、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏでトレポネーマで開始し、９７７８球ハイプリ
ドーマを生産するに適した細胞を産生させることができ
る。例えば、その様なミトゲン及び／又は抗原を用いて
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺戟する方法は、ロパートソン等の
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９８０ｐｐ、　１８１−
１８５　（１９８０年）及びケラトマン等のＪ、　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９　：　２０３
−２２２　（１９８０年）に記載されており、或いはプ
レス等のＰｒｅｓｓ　ｅｔａｌ＋　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　４：　　１５５−１５９（１９
７４年）に記載されている膵臓断片培養法により説明さ
れている。

宿主動物或いはそれから培養して得られた抗体生産細胞
を免疫化する経路及び手順は一般的に抗体刺戟及び生産
の確立された通常の技術に従えばよい。本発明者等はマ
ウスを試験モデルとして使用したが、ヒトを含む任意の
補乳動物或いはそれから得られる抗体生産細胞を本発明
の方法に従って操作してヒトのハイブリッド細胞株の生
産の基礎に役立てることができることを意図している。

免疫化後、免疫リンパ細胞を骨髄腫、プラスマＭ胞或い
はハイブリドーマ細胞（以下集合的に骨髄腫細胞と称す
る）と融合し、ノ・イーブリッド細胞株を産生じ、これ
を無限に培養及び継代培養して多量のモノクローナル抗
体を生産することができる。

本発明の目的のためには、融合のために選択された免疫
リンパ細胞は、免疫化動物のリンパ結節組織或いは膵臓
組織のいずれかから取り出されたリン／七球及びそれら
の正常な分化細胞（子孫）である。本発明においては、
マウス系に関し、より濃度が高く、便利な抗体生産細胞
源を提供するので、免疫膵臓細胞を用いるのが好ましい
。

骨髄腫細胞は、融合ハイズリツＰの連続的増殖のための
基盤を提供するものである。骨髄腫細胞は、骨髄に対し
て選択性を示すプラスマ細胞から得られた腫瘍細胞であ
る。プラスマ細胞腫（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）はプ
ラスマ細胞から得られた新生物細胞である。特に、本発
明においては免疫グロブリンを分泌しないリンパ球ハイ
ブリＰ−マ細胞を用いるのが好ましい。リンパ球ノ・イ
ズリｙ　−マ細胞は、骨髄腫或いはプラスマ細胞腫と通
常の分化リン・ξ細胞との融合により産生された細胞で
ある。骨髄腫、プラスマ細胞腫及びハイブリドーマを選
択することによシ免疫グロブリン合成をなくすることが
できる。

骨髄腫及び免疫化抗体生産細胞を得るための動物の種類
は、一つの種類の細胞をもう一つの種類のものと融合す
ることができる意味において特に重要ではない。しかし
ながら、免疫化抗体生産細胞及び骨髄腫の源は同一の種
からのものであることが好ましい。

一般的に、使用される融合技術は、コーラ等（Ｋｏｈｌ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　６　：　１１１９　（１９７６））及びケネット等
（Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔａｌ、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ−ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ
　ｉｎ　Ｍｔｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ８１　：　７７−９１（１９７８）　Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｏｇ、　ＮｅｗＹｏｒｋｌ　　
の方法によるものでちる。融合は、一般的に、抗体生産
細胞の懸濁液を生育培地中の骨髄腫細胞に添加し、その
後遠沈して被レッドを形成することにより達成される。

融合ハイプリツＰは次いでトレポネーマ抗原に対して特
異的な抗体生産を行うものについてのスクリーニングが
行われる。トレボネーマ抗原決定基に対して特異的な抗
体を分泌するハイブリドーマが選択され、培養され、安
定した遺伝暗号を有する連続細胞株を確立する。この細
胞株は凍結及び液体窒素下での貯蔵などの多くの通常の
方法のうちの任意の方法で貯蔵及び保存することができ
る。凍結された細胞株は再生され無限に培養されて選ば
れた抗原決定基に対して特異的なモノクロナル抗体を合
成及び分泌を再開することができる。

分泌された抗体は組織培養上澄液から通常の沈澱、イオ
ン交換、アフィニティークロマトグラフィーなどにより
回収することができる。回収された抗体は、凍結乾燥し
、余り活性を失うことなく冷蔵下に少なくとも数週間保
存することができる。以下、具体例によυ本発明の特別
の実施態様を説明するが、それらは本発明を限定するも
のではない。

Ａ、抗原の調製 トレポネーマ　ノにリダム（Ｎ１ｃｈｏｌｓ）　ヲマウ
スの感作及びう、ジオイムノアッセイ（ＲＬＡ）におけ
る抗原の源として使用した。この生物の培養は、予め受
領時にトレイネーマ　パラルイスークニクリ（Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ　ｐａｒａｌｕｉｓ−ｃｕｎｉｃｕｌｉ）感
染の臨床的及び血清学的（ＶＤＲＬ非反応性）証拠の不
存在を検査したニューシーラント白色ウサギの精巣中に
おいて行った。これらの動物は、次いで個々に１８〜２
０℃において抗生物質の無い食物及び水を自由に与えて
家内飼育した。精巣当り血清−塩水抽出媒体（０，０１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２，０，８５％（重量／容積）
　ＮａＣ１，５０％（容積／容積）熱不活性化（５６’
Ｃ，３０分間）正常ウサギ血清：］１ｍｌ中２×１０７
のトレポネーマ　・ぞリダムを精巣内に注射後、１２日
後にトレボネーマを、細かく刻んだ精巣から１８Ｏｒｐ
ｍ（Ｚ３℃）の回転振盪により鵠分間精巣当り１０ｍ１
の抽出溶媒を用いて好気的に抽出した。

大きなウサギ精巣組織残渣を、遠心分離により二回５０
０Ｘｇ下、１０分間２３”Ｃで、５０ｍ１の円錐形ポリ
プロピレン遠心分離管内においてトレポネーマ懸濁液か
ら除去した。懸濁液中のトレボネーマを次いで運動性に
対して調べ、１６＋ＯＯＯｘ　ｇにおける遠心分離によ
シ頭分間濃縮を行い、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）　（０
＝ＯＩ　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．８％　ＮａＣ
ｌＸｐＨ７，２）中に懸濁し、暗視野照明顕微鏡によシ
数を数えた。［新鮮な（ｆｒｅｓｈ）Ｊ　）レポネーマ
を単離後直ちに使用しＲＩＡプレートを構成し、それは
−７０℃で調製することができた。［熟成（ａｇｓｄ）
Ｊ　）レボネーマはＰＢＳ中のトレボネーマ　ノξリダ
ムの懸濁液を４℃で７日間貯蔵した後にＲＩＡ用のマイ
クロリットルプレートウェルに結合して調製した。

Ｔ、ファゲデニス（Ｔ、　ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ　）バ
イオタイプレイター（Ｒｅ１ｔｅｒ　）レボネーフ〕を
ＲＩＡにおいて使用してトレボネーマ群抗原に対する抗
体を固定した。これらの生物は２３”Ｃにおいて維持さ
れ、１０％　（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の加熱不活性化された
（５６℃、（資）分）滅菌ウシ血清を含有するＢＢＬチ
オグリコレート媒体１３５Ｃ（指示薬なし）中に毎月移
された。ＲＩＡに使用する細胞は、４ｍｌの無菌ウシ血
清を補給された４０　ｍｌのＢＢＬ　５ｐｉｒｏｌａｔ
ｅＢｒｏｔｈ　（各チューブ当り全容積４４　ｍｌ　）
を含有する大きなネジキャンプをつけたチューブ中にお
いて５日間間℃において培養した。５本のチューブから
の細胞を遠心分離により集め、４０ｍ１の無菌ＰＢＳ　
中において遠心分離により二度洗浄を行い、暗視野照明
顕微鏡によシ測定してｍ１当υ約１×１０８の細胞数の
細胞密度においてＰＢＳ中に懸濁した。

ウサギ抗原と交差反応したモノクローナル抗体或いはト
レボネーマ　−ξミリダム濁液（マウスの感作に用いら
れたもの）中に存在する汚染性ウサギ宿主抗原に向けら
れたモノクローナル抗体を検出するために、正常な感染
されていないＶＤＲＬ非反応性ウサギの精巣からＲｒＡ
用ウサギ精巣抗原抽出物が調製された。精巣を細かく刻
み、トン２ネーマ　・クリダムについて説明したと同様
な血清−塩水媒体中において抽出したが、遠心分離は一
度だけ７分間２５０Ｘｇにおいて行い、白濁した上澄液
を得た。このウサギ抗原調剤　ｉｏμｌをＲＩＡにおケ
ルマイクロリットルプレートウェル当り使用した。蛋白
質測定は、この調剤１０μｌが約１２０μｇ全ウサギ蛋
白質を含有し、この全蛋白質の５０％は血清−塩水抽出
媒体中の正常なウサギ血清によるものであることを示し
た。−２０’Ｇにおいて６ケ月まで貯蔵した調剤は、Ｒ
ＩＡにおいて新らたに調製した抽出物と同等に反応する
ようであった。

又、トレイネーマ　Ａリダム（Ｔ、　ｐ３１１ｉｄｕｍ
）或いはＴ、　ｐｈａｇｅｄｅｎｊｓバイオタイプＲｅ
１ｔｅｒの超音波処理懸濁液をもＲＩＡ抗原として用い
て「遮蔽された」、表面下の、或は細胞質のトレボネー
マ抗原に向けられた抗体を検出した。ＰＢＳ中ｍ１当り
ほぼ１×１０８個のトレボネーマ懸濁液を段付きマイク
ロチップ及び出力４（約４０Ｗ）に設定されたＢｒａｎ
ｓｏｎ　５ｏｎｔｆｉｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　Ｗ３５０を用
いて全部で３分間（５０％パルスで６分間）（氷上）当
り使用した。未使用懸濁液は一２０’Ｃ，で貯蔵した。

Ｂ、プラスマ細胞腫細胞株 この研究において使用された細胞株は、シュルマン等（
Ｓｅｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７
６：　２６９−２７０　（１９７８）　）によシ記載さ
れている。ＢＡＬＢ／Ｃマウス脾臓訓胞と肺臓腫細胞株
Ｘ６３／Ａｇ８間の温成分子形成から形成されたＳＰ２
／）ＩＧＬＫに由来するハイズリツｒ細胞株であるマウ
スプラスマ細胞、腫細胞株ＳＰ２１０−Ａｇ　１４　（
ＳＰ２１０）である。Ｓ　Ｐ　２１０はｘｇの重鎖或い
は軽鎖のいずれも合成せず、ｍμｇの８−アザグアニ／
／ｍ１に対して耐性を示し、ヒポキサンチン−アミノゾ
テリンーチミ・ジン（Ｉ（ＡＴ　）培地中においては死
滅する。

Ｓ　Ｐ　２１０は、高グルコースを有するＤｕｌｂｅｃ
ｃｏの変成Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）　（Ｃ；ｒａｎ
ｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌ　Ｃａｍｐ
ａｎｙ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮｅｗＹｏｒｋ
）において１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のクシ胎児血清（
Ｈｙ−Ｃ１ｏｎｅ　Ｆｅ２　；　　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ、　ユタ州、ローガン）　　、　２ｍＭグ
ルタミン及び５０単位のペニシリン／ストレプトマイシ
ン（ＧＩＢＣＯ）／ｍｌ　を補給してｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で維持される。

Ｃ，ハイブリＰ−マ生産のための免疫化手順成熟したメ
スのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（６〜８週令）をＪ
ａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（メイン州
、／ζ−９バー　バー）から購入し、トレボネーマ　・
ｅ　ＩＪ　タム抗原に対する抗体を生産する膵臓リンパ
球の源として使用した。マウスは、最初にＰＢＳ中の新
らたに調製したトレボネーマ　・ぐリダム細胞（２刈０
８個／　０．１５ｍＩ　ＰＢＳ）を用いてフロランＹ　
（Ｆｒｅｕｎｄｓ　）の完全アジュバント中において（
１：１）腹腔内に注射して（ＩＰ）免疫化した。２１１
日目４２２日目び６３３日目２×１０７個の新らたに単
離した生物（０，３ｍＩ　ＰＢＳ　；　ＩＰ　）の３回
の追加の注射を与え、最後に８４４日目０．４ｍ１ＰＢ
Ｓ中１．２×１０７個の生物（０，２ｍ１ＩＰ及び０．
２ｍｌ静脈内）の注射を行った。最終注射の３日後に膵
臓を二匹のマウスから無菌的に取出し、膵臓細胞を鉗子
でゆつくシ細かく砕いてＤＭＥＭ中に単一細胞懸濁液を
調製してハイプリドーマ細胞融合の準備を行った。これ
らの、細胞は次いでＤＭＥＭを用いて遠心分離により２
７０Ｘｇで１０分間８℃において３回洗浄した。

ハイプリｆ　−マはケネット等（Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ
ａｌ、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
−ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８
１、　　ｐｐ　　７７〜９１　　（１９７８）、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＮｅｗ　Ｙｏｒｋ）　　の基
本的方法の修正方法を用いて免疫化マウスからの膵臓細
胞をネズミのＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイプリドーマ細胞
（以下５Ｐ２１０と称する）と融合させて生産した。適
当な細胞株は、上記シュルマン等により元来示されたの
と同様に、ペンシルバニア医科大学のロジャーケネット
（Ｒｏｇｅｒ　Ｋｅｎｎｅｔｔ）から得られた。

プラスマ細胞腫細胞を対数成長期の培養液から収穫し、
２７０Ｘｇにおいて１０分間遠心分離によりペレット化
し、ＤＭＥＭ中で３回洗浄した。約１×１０７個のＳ　
Ｐ　２１０細胞及び洗浄膵臓細胞を生育可能な（ｖｉａ
ｂｌｅ）膵臓細胞７に対し、生育可能５Ｐ２１０細胞１
の比で混合し遠心分離によりペレット化した。上澄液を
除去後、０．２ｍｌの温い（３７℃）ポリエチレングリ
コール（ＤＭＦＪＭ中３５％ｗｔ／ｖｏｌ。

ＰＥＧ　１０００ＸＪ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

ニュージャー、ジー州フィリッゾスプルグ）をペレット
に添加して細胞融合を引起こした。

細胞を次いでペレット化し、ＤＭＥＭ中において洗浄し
、２５〜６０ｍ１のＤＭＥ　−Ｈｙ媒体（上記ケネット
等の７８頁参照）中にほぼ４×１０６個／ｍｌの割合で
再懸濁し、９６ウエルのマイクロリットルプレー）　（
Ｃｏａｔａｒ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、　ニューシャーシー
州、パインランド）中における５０μｍアリコートでの
制限稀釈の条件下においてプレート化した。

この融合方法はＳ　Ｐ　２１０−膵臓細胞混合物、ＰＥ
Ｇ及びＤＭＥＭが全て細胞融合過程において３７℃に保
たれた点において上記ケネット等の方法と異る。

この細胞ベレットをガラス棒でゆるめて細胞のゆるやか
な混合を確実に行い、細胞はＰＥＧ中において３７℃で
３分間残存し、８°Ｃにおいて約５分間（遠心分離間）
残存する。

リトルフィールド等（・Ｌｔｔｔｌｅｆｉｅｌｄ等。

５ｃｉｅｎｃｅ　１４５：　７０９〜７１０　（１９６
４）　］に記載されるような培地中の二倍濃度のＩ（Ａ
Ｔ選択成分を２日目に各ウェル５０μｌに添加した後、
４日目にｌＯＯμｌのＨＡＴ−ＭＥＤ　Ｉ　ＵＭを添加
した。）＼イプリツｒは６〜１０日後に観察することが
できた。生育細胞を含有したウェルをもう一つの９６ウ
エルの板に分割し、生育を行い維持するために２４℃石
ルの組織培養プレート（Ｃｏ５ｔａｒ　Ｐｌａｓｔｉｃ
ｓ）中に移した。培養上澄液を取出して抗−トレボネー
マ　パリダム反応性のスクリーニング検定及びモノクロ
ーナルイソタイプの決定において使用した。

Ｅ、モノクローナル抗体の特性化 トレボネーマ　パリダムに対するモノクローナル抗体を
分泌するノ・イズリＰ−マのＲＩＡスクリーニング分析 Ｃｏｏｋｅの９６ウエルのマイクロリットルプレート（
Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔ）ζ
−ジニア州、アレクサンＰリア）の各ウェルにＰＢＳ中
ｍ１当り１×１０８個／ｍｌの等測量或いは前記ウサギ
精巣抽出物を含有するＴ、ｐａｌｌｉｄｕｍ或いはＴ、
　ｐｈａｇｅｄｅｎｉ　ｓ・々イオタイブＲａ１ｔｅｒ
の懸濁液或いは超音波処理物の１０μｌを添加した。４
℃において一晩インキユベートして乾固し、ウェルを各
々０．２ｍｌずつの０．２％のナトリウムアジＰを含有
するＰＢＳで３回洗浄して非付着抗原を除去した。トレ
ポネー−マ及びウサギ精巣組織抗原の塩化ポリビニルそ
の他のプラスチックに対する強い親和性のために、これ
らの抗原のマイクロリットルプレートウェルに対する結
合を促進するために固定剤を使用する必要はなかった。

しかしながら、必要に応じて各ウェルに１０チエタノー
ルを加μｌ添加した後３７°Ｃにおいて蒸発させること
を固定のために利用することができる。ウェルを次いで
０．２ｍｌのＰＢＳ　＋１％　ｗｔ／ｖｏｌウシ血清ア
ルブミンで４℃において一晩予備被覆し、０．２ｍｌの
ＰＢＳ＋ア・クドで３度洗浄した。プレートは調製した
即日或いは一日後に使用した。

ＲＩＡテストのために、０．０５ｍ１の４日経たノ・イ
ブリＰ−マクローン上澄液を各抗原調剤を含有する各々
のウェルに添加した。２３’Ｃにおいて３時間後、ウェ
ルを０．２ｍｌ　ＰＢＳ＋アジドで３回洗浄後、ウェル
毎に０．１ｍＩ　ＰＢＳ＋アジＹ＋ｚ％（ｖｏｌ／ｖａ
ｔ）ウマ血清中のアフィニティ精製した１２５ニー標識
化ウサギの抗−マウスＩＣ（比活性２．０×１０　　Ｃ
ＰＭ／μｇ）及びＩｇＭ（比活性３．７Ｘ１０６ＣＰＭ
／μｇ）の混合物２．６ｘｌＯ５ＣｐＭを添加した。こ
の測定の結合は４℃において一昼夜行った。ウェルを次
いでＰＢＳ及び水道水で十分に洗浄した。プレートの乾
燥及び個々のウェルの切断に引続いて各ウェルをＮｕｃ
ｌｅａｒ　Ｃｈｉｃａｇｏ　１１８５型ガンマカウンタ
ーを用いて０．４分間カウントを行った。

ＲＩＡにおいて陽性のコントロールとして使用された抗
血清は、１）細胞融合において肺臓リン・ξ球の源とし
て使用されたマウスから集められたマウスの抗−トレボ
ネーマ　パリダム血清及び２　）　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｅ
マウスをウサギ精巣抽出物調剤で免疫化して製造された
マウスの抗−ウサギ精巣抽出物を含むものであった。マ
ウスの抗−ウサギ精巣抽出物血清はマウスを１日月に腹
腔注射により免疫化しく　０．２ｓ　ｍｌ精巣抽出物＋
０．２５　ｍｌｌフロランド完全ア・シュパント）及び
０．３　ｍｌの抽出物を凹日月、及び５１日目に投与後
７２日目に血清を集めて得られた。

全部で３９のバイブｌ）　）１１−マ細胞株がＲＩＡに
よりトレボネーマ　ノξリダム抗原と反応した七ツクロ
ーナル抗体の分泌体として同定された。ＲＩＡにおける
反応性は０．４分当りの１２５１カウント数が６００を
超える場合が陽性とされた（背景カウント数は通常２０
０〜３００のオーダーであった）。これに基づき、抗−
トレボネーマ　・ξリダム　ノ・イブリドーマから生ず
るモノクローナル抗体は三つの主たる範噴に分類するこ
とができた。一つのモノクローナル抗体はトレボネーマ
　・にリダム抗原に対して特異的なものである。これら
の中にはトレボネーマ　パリダム固定化試験において有
害なトレイネーマ　パリダム生物を固定化することもで
きるモノクローナル抗体もあった。もう一つの群のモノ
クローナル抗体は、トレボネーマ　パリダム（Ｔ。

ｐａｌ　ｌｉｄｕｍ　）及びＴ、　ｐｈａｇｅｄｅｌ’
ｌｉｓバイオタイプＲｅ　ｉ　ｔ　ｅ　ｒ抗原の両者と
反応し、従って明らかにトレボネーマ群抗原に対して向
けられたものであった。モノクローナル抗体の第三の群
はトレポネーマ抗原及びウサギ宿主精巣組織抗原の両者
を結合することが出来、従ってＲＩＡにおいて試験され
た全ての抗原と交差反応性の高いものであった。

表１は抗−トレボネーマ　・ξリダム　ハイブリッドを
スクリーニングするために使用されだＲＩＡ処方の一例
を示す。示されたデータは行われた数個の典型的ＲＩＡ
試験からの一つのものであム　トレボネーマ　・ぐリダ
ムに対して特異的にモノクローナル抗体を生産する大多
数のクローンに特徴的な結果を表わすものである。表１
に示されるようなりローンから得られたモノクローナル
抗体は、元のま＼のトレボネーマとは余りよく反応しな
かった。

しかしながら、それらはトレボネーマ　ノξリダムの超
音波処理された抗原には選択的に結合するようであ）、
それら１ｌ−ｉ細胞内戚いは遮蔽抗原のいずれかに対し
て向けられることができることを暗示タイプＲｅ１ｔｅ
ｒ抗原調剤及びウサギ精巣組織抗原と交差反応としない
ことにより示された。これらのモノクローナル抗体はマ
ウスのＩＣ及びＩＭりｇ　　　　　　　ｇ ラスのものであり、ＴＰＩ試験においてトレイネーマ　
／ｅリダムに対しては反応性を示さなかった。

ＲＩＡにおいて陽性コントロールとして使用したポリク
ローナル抗血清調剤（マウスの抗−トレポネ−’？　　
パリダム及びマウスの抗−ウサギ精巣組織）は試験した
全ての抗原に対して強く陽性であった。

これは、マウスの抗−トレポネーマ　・ξリダム抗体が
、トレボネーマ群抗原（Ｔ、　ｉ＋ｈａｇｅｄｅｎｉｓ
　バイオタイプＲｅ　ｉ　ｔ　ｅ　ｒの抗原と交差反応
する）並びに汚染性ウサギ宿主抗原の両者を含有するト
レボネーマ　・そりダム懸濁液で感作されたマウスから
誘導されたものであるから当然予想されるものであった
。同様に、マウスの抗−ウサギ精巣抗体も又、ウサギ宿
主組織′及びトレボネーマの両者に共通の抗原の存在に
よυトレボネーマ抗原と反応した。

したウサギの抗−マウス重鎖特異試薬を添加してプレー
トに結合した抗体のインタイープを同定した。

マウス抗体のイソタイプは固相ＲＩＡにより同定された
。Ｃｏｏｋｅのマイクロリットルプレートをヤギの抗−
マウスイムノグロブリンで被覆した。培養上澄液を次い
で添加し、３７℃で３時間インキユヘートした。ヨウ素
標識され、アフイニテイ精製トレポネーマ　・？リダム
のおそらく表面決定基と思われるものに対してより大き
な親和性を有するモノクローナル抗体を生産するように
思われたトレポネーマ　パリダムに対して特異的な抗体
を分泌する４種のバイブ＋）　ｂ％−マ細胞株も又単離
された。これらのクローンからのモノクローナル抗体は
、元のままの「熟成した」トレボネーマ及びトレボネー
マ　パリダムの音波処理物の両者と比較的高い反応性を
有したが、おそらく一つの例外、クローン７Ｄ７、を除
いては新たに単離されたトレボネーマとは反応性を有し
なかった。これらのモノクロルナル抗体についてはその
他のトレポネーマ或いはウサギ抗原との交差反応は殆ん
ど或いは全く見られなかった。それらのトレポネーマ　
パリダムの可能性のある表面成分に対する見かけ上の特
異性の増大にも拘らず、これらのモノクローナル抗体は
ＴＰＩ試験においても非反応性であった。

表３は、ＴＰＩ試験においての、トレポネーマパリダム
に対して反応することのできるモノクローナル抗体を生
産する抗−トレポネーマ　パリダムハイズリど−マ細胞
株を示すＲＩＡデータを表わすものである。これらのク
ローンは補体を固定することのできるマウスイソタイプ
の抗体を分泌した。

これらの抗体は、しかしながら、新たに単離した元のま
＼のトレボネーマ或いは「熟成した」元のま＼トレボネ
ーマのいずれとも余シよく反応しなかった。この観察は
反応性ＴＰＩ試験データに鑑みて驚くべきことであった
。

トレボネーマ属の構成員間に存在することが知られてい
る数多くの抗原的類似性によりトレボネーマ　ノξリダ
ム及びＴ、　ｐｈａｇｅｄｅｎ　ｉｓバイオタイプＲｅ
１ｔｅｒ抗原決定基の両者と交差反応するモノクローナ
ル抗体を生産するハイズリドーマ細胞株が産生されるこ
とは予想されないことではなかった。

しかしながら、単離された３９の抗−トレボネーマ　パ
リダム　ハイブリドーマのうち僅かに３個がこの特性を
有するに過ぎなかった（表４）。

ＲＩＡにおいて使用された全トレボネーマ及びウサギ精
巣抗原と交差反応することの見出されたモノクロナル抗
体を生産する種類のノ・イプリＰ−マ細胞株も又単離さ
れた。使用された制限稀釈法及び各細胞株当り１個のみ
の抗体イソタイプが見られた（クローン１２Ｈ４を除く
）という事実によｐｌこれらのハイズリドーマ細胞株が
培養液中で一緒に成長している１より多くのノ・イプリ
Ｐ−マクローンを表わすものとは思われない。興味深い
ことに、これらの高度に交差反応性の抗体の全てはＩｇ
Ｍクラスの抗体であることである。

トレボネーマ　ノξリダム固定化（ＴＰ　Ｉ　）試験に
かけるモノクローナル抗体 マウスの抗−トレボネーマ　・ぞリダム血清、マウスの
抗−ウサギ精巣抽出血清及びモノクローナル坑体分泌抗
−トレボネーマ　パリダム　ハイズリドーマについて、
それらのトレボネーマ　パリダニ固定化（ＴＰＩ）試験
における有害トレポネーマξリダム（Ｎｉｃｈｏｌｇ）
を固定化する能力の試験をうつた。とのＴＰＩ検定は僅
かな修正を施して梅毒試験マニュアル（Ｃｅｎｔｅｒ　
ｆｏｒ　Ｄ４ｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ。

二９６４＋　　Ｄｅｐｔ、　　ｏｆ　　Ｈｅａｌｔｈ　
＋　　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄＶｅｌｆａｒｅ＋
　　Ｐｕｂｌｉｃ　　Ｈｅａｌｔｈ　　５ｅｒｖｊｃｅ
、Ｎ、Ｃ，Ｄ。

：、ジョーシア州、アトランタ）の記載に従ってうつた
。ハイブリＰ−マクローン上澄液中にベニノリンが存在
したために試験操作においてペニシｊナーゼを含有させ
た。トレボネーマ　パリダムま培地中に使用された濃度
においてはストレプトマイシンには感応しなかったので
ノ・イズリＰ−マフローン上澄液からのストレプトマイ
シンの除去ま必要でなかった。

下記の・・イブリドーマはトレボネーマ　パリダム特異
性およびＴＰＩ−反応性を示した：Ｇ５ Ｈ７ Ａ７ ３Ｃ６ ３Ｃ８ ３Ｇ１０ ＩｇＭ ＩｇＧ２ｂ ＩｇＭ ｇＧ２ａ ＩｇＧ２ｂ ｇＧ２ａ トレボネーマ　パリダム抗体に対する ＭＨＡ−ＴＰ試験（Ｓｅ、ｒａ−Ｔｅｋ　トレポネーマ
抗体試験、Ａｍｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｍｉｌｅｓ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ　、　）を製造者によって記載される方法によっ
て行った。すなわち、抗−トレボネーマ　ノξリダムの
吸収稀釈液（１：２０稀釈率）と混合し、室温において
加分間インキュベートさせた。各モノクローナル抗体調
剤について吸収されたモノクローナル抗体混合物の５μ
ｌずつのアリコートを次いで９６ウエルマイクロリツタ
ープレートの二重ウェルに添加した。各クローン試料に
ついて７５μｍの感作したヒラ、ジ赤血球を１組のウェ
ルに添加し、７５μｌの未感作ヒツジ赤血球を陰性コン
トロールとしてのもう一つの二重ウェルに添加した。

反応性クローンは８Ｇ２及び１１Ｅ３であった。その他
の全ての試験されたハイブリジ−マクローン上澄液は非
反応性でおった。

より大きな程度の抗−トレボネーマ　・ξリダム特異性
はＩｇＭを分泌するクローンと対比してＩｇＧ分泌クロ
ーンによシ示されるようであった。表６は全てのネズミ
の抗−トレボネーマ　ノにリダムモノクローナル抗体の
イソタイプ、それらの特異性及びその研究におけるそれ
らの単離頻度をまとめて示す。トレボネーマ　ノξリダ
ム抗原に対してのみ反応した単離されたハイプリ）１１
−マの大多数（３１クローンのうちＵ）は同様の性質の
７個のＩｇＭクローンと対比してＩｇＧサブクラスのも
のであった。Ｔ、　ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ　／’イオタ
イブＲｅ１ｔｅｒ或いはウサギ精巣抗原のいずれとも一
交差反応した全部で８個のクローンの中においてこれら
の７個はＩｇＭ生成体であった。

表６ ３９個の抗−トレボネーマ　・ぐリダ１　バイブリドＩ
ｇＭ　　　　　憔） Ｉ　ｇＧ３　　　　　　２ Ｉ−ｇＧｌ　　　　１１（４） ＩｇＧ２ｂ　　　　３（２） 工ｇＧ２ａ　　　　７（２）、（４） ＩｇＧ１　、ＩｇＧ２ｂ（３）　　１ 計 ３１　　　　　　３　　　　　　　５　　　　　３９（
１）省略記号は表１と同じ。

（２）これらのクローンの二つはＴＰＩテストで反応性
でおった。

（３）クローン１９３９−１２Ｈ４（二重生成体）。

（４）　　これらのクローンの一つは１ｖｉＨＡ−ＴＰ
試験において反応性であったがＴＰＩ試験では反応性で
はなかった。

ここにおいて３Ｇ５　（ＴＰＩ−反応性）及び８Ｇ２（
ＭＨＡ−ＴＰ−反応性）で同定されるハイブリッド細胞
株はそれぞれＡＴＣＣ番号ＨＢ８１３３及びＨＢ８１３
４でＡＴＣＣに寄託されている。

Ｆ・用途・ 本発明において説明されるハイブリドーマ細胞株及びそ
れから生産されるモノクローナル抗体はトレボネーマ細
菌特にトレポネーマ　パリダムにより提供される特別の
免疫抗原的成分の精製及び特性化に有用である。更に、
あるハイブリドーマ株から生産されるモノクローナル抗
体は抗原的認識において均一であわ、それにより引続く
トレボネーマ抗原の７フイニテイクロマトグラフイに基
づくｎ製に有用である。

この抗−トレボネーマ　パリダム　モノクローナル抗体
は１以上の多くの方法で新もたな診断試験の開発に潜在
的に使用することができる。直接及び間接の免疫検定を
含む各種の手法を利用することができる。一般的免疫検
定種剤の変容としてはラジオイムノアッセイ（直接又は
間接）、螢光抗体技術（直接又は間接）、酵素−結合免
疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、溶血検定の阻害、凝集試験
の阻害、凝集反応（抗体−仲介リガント）及び／又は補
体消費試験などが挙げられる。その様な系に１以上の抗
−トレボネーマ　ノぐリダム　モノクローナル抗体を使
用することはモノク叶ナル抗体がトレボネーマ　・ξリ
ダムに特異的であシ極めて感応性タイプの免疫検定にお
いて使用することができるという事実によシ初期の一次
梅毒の診断に重要な新規な有用な試験を潜在的に構成す
るものと思われる。

その様な感度のよい検定法はトレボネーマ　・ξリダム
細胞或いは先天的梅毒病巣或いは神経梅毒の脳を髄液に
おける抗原の検出によシ先天的梅毒或いは神経梅毒の診
断に有用であり得る。

更に、このモノクローナル抗体は現在極めて高価で且つ
非効率的方法によって行われているウサギ組織からのト
レポネーマ　、６リダム細胞を単離精製するために使用
することのできる新らたなアフイニテイ精製試薬を潜在
的に提供するものである。

モノクローナル抗体アフイニテイカラムクロマトグラフ
イを使用することによりアフイニテイ精裂されたトレポ
ネーマ　・ぞリダム細胞を調製し、現存する梅毒の血清
診断試験における診断抗原として使用することができる
。その様なアフイニティ精製されたトレボネーマ細胞は
又この材料が通常調製されていたトレボネーマ　パリダ
ム細胞よりはるかに「より清浄」　（即ち、汚染性ウサ
ギ組織ぐずがない）なので既存の試験の感度も上昇させ
る。

又、血清診断試験における抗原として全トレボネーマ　
パリダム細胞の代りに、モノクローナル抗体は、試験抗
原として全トレボネーマ細胞に代シに使用することので
きるトレボネーマ　パリダム細胞の新らたに規定された
抗原成分をアフイニテイ精製する能力を有し得るもので
ある。その結果、このモノクローナル抗体は最終的にこ
の生物の新らたな抗原成分を同定する能力並びに分別さ
れたトレポネーマ　パリダム細胞からそれらをｒｌ製す
る能力の両者を有するものである。

究極的には、アフイニテイ精製されたトレポネーマ　パ
リダム抗原成分は梅毒用ワクチンの開発に使用し得るも
のである。その様なワクチンの候補者となるのは米国人
口の僅かに限られた部分にすぎないと思われるが（即ち
ゲイ人口、移民労働者、内部都市住民）、その様なワク
チンが有効であり得るその他の重要なトレボネーマ病が
存在する。即チ、フランベジア、ピンク、及ヒぺ）　Ｘ
　−ルを引き起こすトレイネーマはトレボネ＋−マ　パ
リダムとは形態学的及び血清学的には区別できないトレ
デネーマである。７ランベジア、ピンク、及ヒヘジエー
ル生物のトレポネーマ　・ξリタムトの免疫学的類似性
故に梅毒に対して開発されたワクチンはこれらの風土的
トレポネーマ病に対しても同様に有効であり得る。かよ
うに、免疫原であるトレボネーマ　パリダムの７フイニ
テイ精製抗原（免疫原）を調製する能力は一般的なトレ
ボネーマ病ワクチンへの極めて広い応用を有し得るもの
である。以上、本発明は説明及び例示を目的としてＷ別
の実施態様に向けられてきた。しかしながら、当業者に
は説明された実施態様の製造方法及び実施方法において
多くの修正及び変化を発明の趣旨を離れることなく行う
ことができることが明らかであろう。

前記特許請求範囲内でのちらゆ る等測的な修正及び変様は本発明の範囲に含まれるもの
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、熟成、又は超音波処理したトレポネーマパリダムの
   決定基に対して反応性であって、元のままの、新たに単
   離されたトレポネーマパリダム、トレポネーマファゲデ
   ニス抗原及びウサギ精巣抽出物とは非反応性であるモノ
   クローナル抗体を産生するハイブリドーマ。２、ハイブ
   リドーマの成長を維持するのに適した培地と共に存在す
   る、特許請求の範囲の第１項記載のハイブリドーマ。 ３、分化したリンパ球様細胞が骨髄腫細胞に融合された
   細胞ハイブリッドである、特許請求の範囲第１項記載の
   ハイブリドーマ。 ４、骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞或いはプラスマ細
   胞腫細胞である、特許請求の範囲第３項記載のハイブリ
   ドーマ。 ５、分化したリンパ球様細胞が免疫脾臓細胞或いはリン
   パ節細胞である、特許請求の範囲第３項記載のハイブリ
   ドーマ。 ６、ＢＡＬＢ／ｃマウス免疫脾臓細胞が ＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞に融合された細胞ハイブ
   リッドである、特許請求の範囲第１項記載のハイブリド
   ーマ。 ７、ハイブリドーマＡＴＣＣ寄託物 ＨＢ８１３３又はＨＢ８１３４からクーロン化されたハ
   イブリドーマ。