JPS61502798A - 抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体の製造方法 発明の分野 本発明は、抗体およびその製造方法、特に、モノクローナル抗体の製造方法に関 する。

発明の背景 モノクローナル抗体は、疾病の診断および治療において非常に有用である。これ は、リンパ球を骨髄腫細胞等の不死細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞 をスクリーンし、クローンすることからなる、一般的ミルシュタイン技法により 産生される。マウスおよびラットのモノクローナル抗体の産生について、多くの 研究がなされているが、ヒトモノクローナル抗体も研究されている。

例えば、リンパ芽球腫細胞等、様々な種類の不死細胞があるが、例えばエプスタ イン−パールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　、以下「ＥＢ ｖ」と称する〕ニヨリ惹起された増殖細胞をコントロールするのが容易でない場 合、骨髄腫細胞が一般的に好まれる。ＥＢｖは、腫瘍と関連性がある。

ＥＢｖは都合よく「マイトジェン」、即ち、細胞の増殖をひきおこす物質として 分類され得る種々の物質の一例である。ＥＢｖは、ヒトＩ’３１Ｊンパ球を形質 転換し、不死化させることが知られている。形質転換中は、穐々の形質転換され たリンパ球のうち、どのクローンが抗抗体を産生じているかを知ることは不可能 なので、クローンを選択することは不可能である。抗体の産生は約６週間後に終 了する。

先行技術 最近、英国特許出願第２１２７４３４号（こ開示の如く、ドロシー・クローフォ ード（Ｄｏｒｏｔｈｙ　Ｃｒｏｗｆｏｒｄ）は、ＥＢｖを用し）てヒｌ−Ｂ　Ｉ Ｊンバ球を形質転換し、ＩｇＧ抗ＲｈＤ　モノクローナル抗体を産生し得るリン パ芽球前セルラインを得た。この方法では、まず患者２Ｄ抗体で免疫性を付与し 、特定の１３１Ｊンパ球を単離し、ロゼツト形成し、単離した細胞をＥＢｖで感 染させ、制限的金沢によりクローンする。

クローフォードの方法は、抗り産生細胞を選択し、次いてこれを感染させて増殖 を誘起することからなる。

該方法は、ロゼツト形成技術による抗り産生細胞の分離に依存し、従って、該抗 体は、その成熟段階に応じで、ロゼツト化細胞により産生されるが、Ｂリンパ球 は、抗体と結合することができないか、または抗体−抗原複合体を放出する。、 この方法では、′丁リンパ球がＥＢｖ感染ＲＩＪンパ球の細胞毒性を誘起するの を避けるために、初期ロゼツト化段階で、Ｔ　ＩＪンバ球を除去することが必要 である。感染後、特異的選択（ロゼツト化による）リンパ球から生じる多くのか かるクローンから、増殖細胞の単一のクローンを単離する。

発明の記載 本発明に従ったヒトモノクローナル抗体の製造方法は、ヒト１３１Ｊメンバをマ イトジェンで刺激し、抗体産生増殖細胞のクローンを単離し、選択することから なる。

発明の詳細 な説明の方法は、クローフォードの方法よりも簡単で、融通性がある。特に、こ の新規方法は、Ｒｈ　Ｄ　型抗体に対する抗体の産生に限定されない。マイトジ ェンを選択前に用いるので、選択は、種々のヒト細胞または他の物質に対する抗 原に対する特定の抗体を見出すのに用いることができる。一般的方法により、種 々の抗体を見出すことができる。選択は、制限的または進行性希釈イこより行な ってもよい。

ヒト細胞に関する抗原の例としては、血液型（例えば、Ａ、Ｂ、Ｏ，ＲｈＤ、ｄ 、Ｅ、ｅ、ＣまたはＣ１またはＰ）抗原、多形性抗原、自己抗体惹起抗原、組織 特異性抗原、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍胎児抗原および細胞型特異抗原 が挙げられる。ヒトを含めた種々の生体、例えば細胞または体液中から、他の生 ・吻学的物質が得られる。該物質は、前記の如く、悪性細胞上、または正常細胞 上に存在する（組織特異性であってもよい〕。体液から得られる物質は、タンパ ク質、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、ステロイドまたはペプチド、 あるいは、この段落の初めに記載したいかなる種類のものであってもよく、ホル モン、神経ペプチド、補体成分およびフェロモン等の調節物質も含まれる。

ヒト以外、および、更には咽乳動物以外の種由来の物質は、菌類、病原性ウィル ス、プロトシェア、種々の病原性微生物およびＰＰＬＯおよびマイコプラズマ等 の池の中間形態の細菌（特に、グラム陰性菌つから得られる。ウィルス（および 他の生体〕は、生または死菌であるか、あるいは、例えば、外被膜、中心部また は「ウィロイド」粒子に再分割される。あるいは、かかる物質は、病原体、寄生 体、共生体、牛丼生体および非病原体に分類される。

本発明において用いられるマイトジェンは、例えば、抗原、ウィルス、レクチン または化学物質である。特に用いられるマイトジェンは、植物性血球凝集素およ びアメリカヤマゴボウマイトジェン等の植物性レクチン、リポポリサッカライド 、インターロイキン、１９７３球因子、硫酸バリウムおよびカルシウムイオン等 のマイトジェン性無機化学物質である。本発明において好ましいマイトジェンは 、ＥＢｖである。

新規方法の第一段階１こおいてＢ　ＩＪンバ球およびマイトジェンを接触させる 前に、リンパ球を刺激または感作するのが望ましい場合もある。かかる方法は、 １９８５年７月３０日、アクソン・ヘルスケア・リミテッド、スターキーおよび ウィリアムス（Ａｘｏｎ　ＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬ　ｔ　ｄ、、５ｔａｒｋｉｅ 　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ）により出願の国際特許出願（発明の名称：細胞処 理〕に記載されており、かかる記載は見出しの付記部分の丁にあり、本明細書に おいて参照する。

本発明の方法（こおいて、ヒ）　Ｂ　ＩＪ　７パ球を−まず例えばＥＢｖで感染 させることにより、培養物中に惹起して複製する。細胞を次いで普通培地に移す 。例えば、す。

ンパ球を栄養溶液Ｉこ浸す。

ヒトＢリンパ球は、ヒト血液、ヒトリンパ節またはヒト組織、例えば悪性組織か ら得られる。細胞を密度勾配沈殿により分離する１、全血、ヘパリン化血液また は線維未除去血液も、密度勾配沈殿により分離することができる。次いで細胞を 通常の技術により、例えば、細胞を懸濁させた培地および例えばフィコールおよ びトリオシルの混合物の界面から回収する。洗浄後、細胞をマイトジェンで処理 し、適当な培地上で増殖させる。

この段階において、Ｔ　ＩＪ　７パ球を普通培地、例えば懸濁液から種々の方法 により除去する。例えば、細胞毒性または親和性結合抗血清または抗体、ヒツジ 赤血球（ＡＥＴ処理したちの〕を用いた親和性除去、またはツクロスボリンＡを 用いることができる１）次いで８９７３球の複製を顕微鏡で評価する。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で複製するヒトＢリンパ球は、イムノグロブリンを合成し、 放出する。ヒトイムノグロブリンは、廃培地の試料を酵素免疫測定法または他の 標準的技法に付すことにより、検出および測定される。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で複製するヒｌ−Ｂ　ＩＪンバ球を分離および単離して、一 種の細胞が複製して一種の細胞のクローンとなるようにすることができる。単一 の細胞のクローンにより産生される抗体はモノクローナル抗体であり、全ての分 子は同じＨ鎖およびＩ−鎖イツタイブ、アロタイプおよびイディオタイプを有し 、全ての分子の抗原結合サイトは抗原に関して同じ特異性および親和性、および 同じ結合サイトイディオタイプを有する。

本方法の次の段階は、クローンを単離するものである。まず、支持細胞の懸濁液 をマルヂウエル培養血中に入れる。支持細胞は、培養物中、急速に増殖しないが 、単離されたヒトＢ　ＩＪンバ芽球腫細胞の増殖を支持するあらゆる生存可能な 細胞である。例としては、ヒト線維芽細胞、ヒトまたは他の種由来の内皮細胞、 ヒ）　Ｂ　１７７３球またはヒトリンパ芽球腫細胞が挙げられ、その複製は、照 射または化学物質、例えば細胞増殖抑制性またはキレート化合物、または血液ま たは腹膜等の身体の部分から得られるヒトまたは他のマクロファージにより防止 される。

複製８９７８球を、増殖培地で希釈し、ウェルに入れて、一定体積中に統計的に 予想され得る数、例えば０．３．１または５の１３　＋）ンパ球が存在するよう にする。

次いで種々の培養物をインキュベートし、要すれば、例えば毎日、新しい培地を 各ウェルに添加する。

１１リンパ球の単離およびその複製を、顕微鏡で評価する。そのヒトイムノグロ ブリンの産生およびその抗体活性を、通常の酵素免疫測定法または他の公知の方 法により検出おＪ：び測定する１、抗体検出の方法は５ｘ９８５年７月３ｏ日、 アクソン・ヘルスケア・リミテッド、スターキーおよびウィリアムス（Ａｘｏｎ 　Ｈｅａｌ　−１ｃａｒｅ　Ｌｔｄ、　、　５ｔａｒｋｉｅ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌ ｉａｍｓ　）　により出願された国際特許出願（発明の名称：抗体検出法）（こ 記載されている。

本発明の方法は有益なモノクロナール抗体の調製に使用することができる。生成 物は、例えば、Ｉ（Ｌ　Ａ組織の類型分類、治療、血液の類型分類および診断に 使用できる。該方法は、第１に、乏枝神経膠腫の細胞と結合するヒト・モノクロ ナール抗体、第２に、ンウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の基準生物を包 含する１１またはそれ以上の細菌の抗原と結合する１つ、またはそれ以上のヒト ・モノクロナール抗体を産生させるために用いられる。

つぎの実施例で本発明を説明する。

実施例１ ヒト乏枝神経膠腫からヒトＢ　ＩＪンバ球を得た。該組織をメスの刀または針で 刻み、引き裂き、液体脂］哉培養増殖培地で洗浄した。ヒトＢ　ＩＪンバ球を包 含する多数の細胞を該培地中に懸濁させた。培地を集め、数分（通常、約１５分 ）放置し、粒子を試験管中で沈降させた。この方法を４回までくり返した。各沈 ｉ′ｌを新たな培地中に再懸濁させ、細胞分密度勾配沈澱により分離した。細胞 の懸濁液１０ゴを注意深く、ハイバク（ＨＹＰａｑｕｅ）　２０　ｍｅ上で層を 形成させ、４００ダで２０分間遠心分離した。必要な細胞を培地とハイバクの境 界面から収集した。

細胞を増殖培地中で２回洗浄し、ついで、増殖培地中ＥＢｖの懸濁液（溶液）１ ゴにさらし、５Ｘ１０５細胞／　ｍｅの濃度とし、５チ二酸化炭素中、３７℃、 相対湿度１００％をごてインキュベートした。

ゲイクロポリンＡ（ｌｒＮＩ／ａ６無水エタノール）１μｅを、該ＥＢｖ感染細 胞を希釈した増殖培地の各１ｍ／！にＬ］えることにより、該懸濁液から−ｆ　 ＋）ンパ球を効果的）こ除去した。

殺したばかりのマウスの腹腔内に、３７℃で増殖培地１０ｍ１を注入し、ついて 、増額培地を引きぬき、フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）　細胞を得た。フィーダー 細胞の懸濁液Ｏ１１ｍｌを９６ウエル培養プレートの谷ウェルに入れた。複製１ ３１Ｊンパ球の懸濁液０．１　ｍｌを各ウェルに加えた。該懸濁液は、各ウェル 中に、統計的に予想できる数の８９７８球が存在するように増殖培地で希釈した 。各０．２　ｍｌづつの培養を、５％ＣＯ３中、３７℃、相対湿度１００チにて インキュベートした。ウシ胎児血清０．０１　ｍｅを、グルタミン、ピルビン酸 塩および抗生物質と共に、毎日、各々の容量が０．３５ｍｅｆこ達するまで各ウ ェルに加えた。

８９７８球の複製は顕微鏡的に計画した。クローンを単離し、膠腫に対する抗体 を産生ずるクローンを得た５、ヒト免疫グロブリンの放出およびその抗体活性は 通常の酵素イムノアッセイにより検出した。

実施例２ 結腸癌患者の腸間膜リンパ腺腫から得たヒトＢリンパ球を用いる以外は実施例１ をくり返した。

実施例３ 卵巣癌患者の末梢血から得たヒトＢリンパ球を用いる以外は実施例１をくり返し た。

実施例４ ヒト乳癌の流出リンパ腺ＩＪｆｆおよび、別途、ヒト乳癌からイ８たヒｌ−Ｂ　 ＩＪンパ球を用いる以外は実施例１そくり返した。

実施例５ シウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｃｕｄｏｍａｎａｓ　ａｅｒｕ　−ｇｉｎ ｏｓａ）血清型２、シウドモナス・アエルギノーサ血清型６、シウドモナス・ア エルギノーサ血清型７、シウドモノナス・アエルギノーサ血清型１１、シゲラ・ ソニイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｉ）　、サルモネラ・バラチフィ（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎ ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎりの抗原と反応性の循環抗体を有する正常人の末梢血 液から得たヒ）　Ｂ　ＩＪンバ球を用いる以外は実施例１をくり返した。

ウサギ・モノクロナール抗体は、前記のヒト・モノクロナール抗体と同様な手順 により産生できる。

補　遺 細胞処理 発明の分野 本発明は、処理が、特定の抗体産生細胞の増殖を刺激するか、特定の抗体の産生 を細胞に誘発させるべきであるとの意図による細胞処理に関する。

発明の背景 Ｂ　ＩＪンパ球は抗原の存在により起因した刺激て１ｎｖｉｖｏ　で増殖する。

抗原にさらされた被験者における増殖細胞は、該特定の抗原に対する抗体を活発 に合成し、分泌する形質球、および該抗原の、存在によって刺激されるまで、有 効に不活性である記憶法の両方を産生ずる。かくして、記憶法は、該特定の抗原 による再感染に対する防御を被験者に与える。

発明の目的 ｉｎ　ｖｉＬｒｏ　で抗体を産生させることが本発明の１つの目的である。

発明の提示 本発明によれば、その抗原ｌこ対して特異的な抗体の産生をＢ　ＩＪンバ球に誘 導する条件下、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　て抗原Ｉこさらすことにより、８９７３球細 胞が感作される。

発明の詳細な記載 該細胞は無垢のＢ　ＩＪンパ球でよく、または、該感作はすでに感作したＢ　Ｉ Ｊンパ球に関する二次作用または刺激でもよい。かくして、本発明においては、 ８９７８球（免疫グロブリンを産生じても、シナくてもよい）および抗原Ｇ　（ Ｂ　ＩＪンパ球が増殖できる環境下〕、１３１Ｊンパ球に感作抗原に特異的な抗 体の産生を誘導させるか、該抗原に感作される１３１Ｊンバ球（Ｂ記憶球〕の増 殖を誘導させるよう　に接触させる。可能であれば、単離Ｂ記憶法を特定の目的 に用いてもよい。そのような細胞は、抗原にさらすと、増殖および抗原産生が直 ぢ）こ起るという利点を有している。

感作細胞は、それらが培養中で増殖し、例えば、前記のような、抗原上のエピト ープと結合する抗体を合成するように処理される。

本発明の方法を行なうのに適した条件は、いずれかの適当なり　ＩＪンパ球培養 培地を含む。これは、必要に応じ、または所望により、増殖を誘導する１つ以上 の薬剤、例えば、マウス大食細胞のようなフィーダー細胞で補足してもよい。

つきの実施例で本発明を１説明する（セー７アｌ）−ス（Ｓｃｐｈａｒｏｓｃ） 　は登録商標である）。

実施例１ 健常な成人から全血３０　ｍｅを採を（７，腺値：素含除去した。線維素除去１ １１１１０　ｄづつを、ハイバク１５ｍｇつつの上に重層り、　、　４　（，１ ０ｇで２０分間遠・Ｃ，ｒ分離した。

」二層から血清を除き、４Ｃて保存した。血清と／％イバクの曵胃面から白血球 を除いた。これら企、Ｒ１”Ｍ１１６４０増殖培地（１０％ウシ胎児血清を加え た）中で３回洗浄し、：２４　ｍｌのＲＰＭＩ１６４０．２．４ゴのウシ胎児血 清、０．４８ｍ１のし一グルタミン、０．４８ゴのペニシリンおよびストレプト マイシン、ＣＬ２４ｍｅのピルビン酸す１−リウムおよび健常成人からの血清２ ゜４ａｅを含有する増殖培地３Ｇ＋ｘＣに再懸濁させた。細胞懸濁ｅ、１　ｍ１ ！を１０培養ウェル３列の各４番ご入れた。

殺したばかりのマウス３匹の腹１木内に増殖培地（３７℃）１０Ｋｌを注入し、 ついで、増殖培地中、マウス大食細胞の、懸濁液を引きぬくことにより、マウス 大食細胞を得た。得られた懸濁液ｌ　ｔｒｒｌづつを、前記の１０培養ウェル３ 列の各々に加えた。

ヒト患者の乏枝神経膠俤からの）重傷細胞をメスの刃で刻め、離解した。組織片 をボッター−一エレベイエルム（Ｐｏ【ｔＣｒ−Ｅｌｖｃｂｊｅｌｍ）ホモゲナ イザー中で均質化した１つ抗原物質を６００×ダて２０分間遠心分離し、ついで 、滅菌食塩水（０，８５ｇ／’ｌ　）　ｌこ再、懸濁して２ｇ／ｆとする。

腫瘍抗ｉｉ７再懸濁液の培加耐釈を調製し、各希釈０，１ｍｌを、マウス大食細 胞を含有する３列の培養ウェルの各々の１つのウェルに加えた。したがって、各 列ｆこおいて、各・′ウェルは、そのすぐ右のウェルの２倍多い抗原を受け、３ 列が１０培養つ１ルの３複製となるよう（こした。培養を５％二酸化炭素中、３ ７℃、相対湿度１００％で９日間インキュベートした。４８時間の間隔で、各培 養ウェルに増殖培地（４０μｅのウシ胎児血清、４０μｒの健常成人からの血清 、８μｅのペニシリンおよびストレプトマイシン、８μｅのＬ−グルタミンおよ び４μｅのピルビン酸ガドリウム含有）０゜１扉ｅを加えた。

９日後に得られた培養は、前記のように、エプスタイン−パール・ウィルスとの 形質転換により処理してもよい。

実施例２ ヒト患者からの卵巣癌から組織を得た以外は、実施例１の手順をくり返した。

実施例３ 抗原ンウドモナス・アエルギノーサ（匍清型１１）を標準的な細菌学的方法で培 養した。生物？収集し、滅菌食塩水に懸濁した。これらを、滅菌食塩水中、遠心 分離および滅菌吸引により、３回洗浄し、１０７生物、／　ｍｅの濃度（こ滅菌 食塩水中（こ再懸濁し１こ。液体窒素の温度までの凍結、ついで、３７℃への加 温を、懸濁液のテスト試別が生きた生物を含まナクするまでくり返し、生物を殺 した。通常、凍結および解凍の６サイクルで充分である。

殺した生物の培地中希釈液を調製し、各希釈の０．１ｒｎｅを、実施例１と同様 にして調製した。マウス大食細胞を含む培養ウェルの３列の各々の１つのウェル に加えた。ついで、実施例１の以降の手順２行なった。

実施例４ 抗原として、ブラナメラ・カタラリス （Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）を用いる以外は、実施例 ３の手順をくり返した。

実施例５ 抗原として、シゲラ・ソニイを用いる以外は、実施例３の手順をくり返した。

実施例６ セファロースＣＬ　６　Ｂに結合したマウス・ガンマ鎖；こ対するヤギ抗体を用 いるマウス血清のアフィニティクロマトグラフィー（こより、マウスＩｇ　Ｇ　 ｆ　得た。

該マウスＩｇＧ　を実施例１の手順において、抗原として用いた。

国際調査報告 ロ剖−畠−１へｔ６百１ＧＭ−甲ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３４０、ユＪＪＮＥＸ 　Ｔｏ　Ｔ！’：　：ＮＴＥ、−ＭＡＴ：０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＦ、ＲＥＰＯＲ τＯＮ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＢリンパ球をマイトジエンで刺激し、抗体産生・増殖細胞のクローンを 単離、選択することからなるヒト・モノクロナール抗体の製造方法。
2. ２．マイトジエンがエプステインーバール・ウイルスである前記第１項の方法。
3. ３．マイトジエンの感染により、リンパ球の培養中での複製を誘導し、ついで、 栄養培地に移す前記第１項または第２項の方法。
4. ４．刺激後にＴ細胞を除去する前記いずれかの項の方法。
5. ５．それらをマイトジエンと接触させる前に、該リンパ球を感作する追加工程か らなる前記いずれかの項の方法。