ES2877099T3

ES2877099T3 - Beta-glucano en combinación con agentes anticáncer que afectan al microambiente tumoral

Info

Publication number: ES2877099T3
Application number: ES15818863T
Authority: ES
Inventors: Nandita Bose; Keith Gorden; Anissa Sh Chan; Steven Leonardo; Jeremy Graff; Xiaohong Qiu; Takashi Kangas; Kathryn A Fraser; Jonas Adria Bykowski; Nadine Ottoson
Original assignee: Hibercell Inc
Current assignee: Hibercell Inc
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: US10111901B2; CN106687122A; WO2016007876A1; CN106687122B; JP2021020921A; EP3166616B1; US20220047620A1; US20170100425A1; EP3166616A1; JP6893594B2; US20190060351A1; EP3166616A4; EP3851111A1; JP2017524737A

Abstract

β(1,6)-[Poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-β(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-L1 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo que no activa el complemento.

Description

DESCRIPCIÓN

Beta-glucano en combinación con agentes anticáncer que afectan al microambiente tumoral

Antecedentes

La presente invención se refiere a combinaciones de p-glucano soluble y agentes anticáncer que afectan al microambiente tumoral, incluyendo agentes anticáncer que alivian la inmunosupresión. El p-glucano es un PAMP fúngico y es reconocido por la molécula de reconocimiento de patrones C3 en el suero, así como por el receptor de reconocimiento de patrones, receptor del complemento 3 (CR3) en las células inmunitarias innatas, incluyendo neutrófilos y monocitos. El p-glucano (p(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa), un polisacárido p-glucano derivado de la levadura, se está desarrollando como agente inmunoterapéutico en combinación con anticuerpos monoclonales antitumorales para el tratamiento de varios cánceres. El p-glucano permite que las células efectoras inmunitarias innatas destruyan las células tumorales recubiertas del complemento a través de un mecanismo dependiente de CR3 del complemento. Numerosos modelos de tumores animales han demostrado que la administración de p-glucano soluble en combinación con un complemento activador, el anticuerpo dirigido al tumor da como resultado una reducción significativa del crecimiento tumoral y una supervivencia global mejorada en comparación con cualquiera de los agentes solos.

Los cánceres, sin embargo, no son solo masas de células malignas sino "órganos" complejos, que reclutan y usan muchas otras células no transformadas. Las interacciones entre células malignas y no transformadas crean el microambiente tumoral (TME). Las células no malignas de la TME tienen una función dinámica y, a menudo, promotora de tumores en diversas fases de la carcinogénesis. Una red compleja y dinámica de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y enzimas inflamatorias y de remodelación de la matriz impulsan la comunicación intercelular dentro del tejido afectado. Para vencer eficazmente al cáncer, por lo tanto, deben desarrollarse terapias para suprimir la naturaleza promotora de tumores del TME.

Modak S. et al., Leukemia Research 29 (2005) 679-683, desvelan que la terapia con rituximab del linfoma se potencia mediante la administración oral de (1^-3),(1^4)-D-p-glucano.

Vasilakos J.P. et al., Proceedings of the 101st Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 17 21 de abril de 2010; Washington, DC, desvela la actividad antitumoral de los beta-1,3/1,6 glucanos solubles y que la estructura es importante.

El documento WO 2016/073763 A2 desvela la combinación de p-glucano soluble y agentes que alivian la inmunosupresión que afectan al microambiente tumoral. El p-glucano soluble promueve un entorno inmunoestimulador, que permite una eficacia potenciada de los antiangiogénicos, inhibidores de puntos de control incluyendo anticuerpos dirigidos a no tumores.

El documento WO 2006/121168 A1 desvela anticuerpos monoclonales humanos contra la muerte programada 1 (PD-1) y métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos anti-PD-1 solos o en combinación con otros inmunoterapéuticos.

Sumario de la invención

Esta divulgación describe, en un aspecto, usos y composiciones de p-glucano soluble en combinación con agentes anticáncer que afectan al microambiente tumoral.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cuando a continuación se use la palabra invención y/o las características se presenten como opcionales, esto debe interpretarse de tal manera que se busque protección solo para la invención como se reivindica.

El sumario anterior de la presente invención no pretende describir cada realización desvelada o cada implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud, se proporciona orientación a través de listas de ejemplos, cuyos ejemplos pueden usarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista citada solo sirve como grupo representativo y no debe interpretarse como una lista excluyente.

Breve descripción de las figuras

FIGURA 1A-1D. Caracterización morfológica y funcional de macrófagos M1 y M2 humanos cultivados in vitro. FIGURA 2A-2D. Caracterización morfológica, fenotípica y funcional de macrófagos M2 solubles tratados con pglucano.

FIGURA 3A-3D. Evaluaciones de la proliferación de células T CD4 y la modulación de la producción de IFN-y e IL-4 en macrófagos M1 y M2 tratados con p-glucano a partir de proteínas de unión alta y proteínas de unión baja. FIGURA 4. Evaluaciones de la proliferación de células T y la modulación de IFN-y en macrófagos M2 y M2a tratados con p-glucano en condiciones inmunosupresoras.

FIGURA 5A-5E. Evaluaciones de p-glucano sobre la proliferación y activación de células T CD4/CD8 en presencia de Tregs.

FIGURA 6A-6B. Caracterización de células dendríticas derivadas de monocitos inmaduras humanas(imMoDC) y células dendríticas derivadas de monocitos maduros (mMoDC) cultivadas in vitro.

FIGURA 7A-7D. Evaluaciones del efecto del p-glucano sobre la maduración de las MoDC.

FIGURA 8A-8C. Resultados de una proliferación de células T CD4 aumentada por M2-p-glucano debido al contacto de célula a célula.

FIGURA 9. Resultados de una proliferación de células T CD4 aumentada por M2-p-glucano debido a factores solubles.

FIGURA 10. Análisis de macrófagos M2 tratados con p-glucano en proteínas de unión alta frente a proteínas de unión baja.

FIGURA 11A-11B. Resultados de la evaluación funcional de M2-p-glucano derivado de monocitos de proteínas de unión baja en presencia de suero de una proteína de unión alta.

FIGURA 12A-12B. Regulación positiva de PD-L1 en macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en presencia de citocinas inmunosupresoras (TCM).

FIGURA 13. Regulación positiva de PD-L1 en MiaPaCa.

FIGURA 14A-14B. Efectos del p-glucano soluble en las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). FIGURA 15. Evaluación de la expresión de PD-L1 inducida por p-glucano en células tumorales.

FIGURA 16. Resultados del estudio en ratones usando IMPRIME PGG en combinación con el anticuerpo DC101. FIGURA 17A-17C. Efecto in vivo sobre el microambiente tumoral de p-glucano soluble y bevicizumab.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

Los p-glucanos son polímeros de glucosa derivados de diversas fuentes microbiológicas y vegetales que incluyen, por ejemplo, levaduras, bacterias, algas, algas marinas, hongos, avena y cebada. De estos, los p-glucanos de levadura se han evaluado extensamente por sus propiedades inmunomoduladoras. Los p-glucanos de levadura pueden estar presentes en diversas formas tales como, por ejemplo, levadura intacta, zimosano, partículas de glucano entero purificado, polisacárido de zimosano solubilizado o p-glucanos solubles altamente purificados de diferentes pesos moleculares. Estructuralmente, los p-glucanos de levadura están compuestos por monómeros de glucosa organizados como un esqueleto de glucopiranosa enlazada en p-(1,3) con ramificaciones periódicas de p-(1,3) glucopiranosa enlazadas al esqueleto mediante enlaces p-(1,6) glucosídicos. Las diferentes formas de p-glucanos de levadura pueden funcionar de manera diferente entre sí. El mecanismo a través del cual los p-glucanos de levadura ejercen sus efectos inmunomoduladores puede verse influenciado por las diferencias estructurales entre las diferentes formas de los p-glucanos, tales como, por ejemplo, su naturaleza particulada o soluble, conformación terciaria, longitud de la cadena principal, longitud de la cadena lateral y frecuencia de las cadenas laterales. Las funciones inmunoestimulantes de los p-glucanos de levadura también dependen de los receptores involucrados en diferentes tipos de células en diferentes especies, que de nuevo, puede depender de las propiedades estructurales de los p-glucanos.

En general, las inmunoterapias con p-glucano pueden incluir la administración a un sujeto de cualquier forma adecuada de p-glucano o cualquier combinación de dos o más formas de p-glucano. Los p-glucanos adecuados y la preparación de p-glucanos adecuados a partir de sus fuentes naturales se describen en, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. N.° US2008/0103112 A1. En algunos casos, el p-glucano puede derivar de una levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En determinados casos, el p-glucano puede ser o derivar de p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa, también denominada en el presente documento PGG (IMPRIME PGG, Biothera, Eagan, m N), una forma altamente purificada y bien caracterizada de p-glucano soluble derivado de levadura. Por otra parte, las inmunoterapias basadas en p-glucanos pueden implicar el uso de, por ejemplo, un p-glucano modificado y/o derivatizado tales como aquellos descritos en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US12/36795. En otros casos, la inmunoterapia con p-glucano puede implicar administrar, por ejemplo, un pglucano soluble particulado o una preparación de p-glucano soluble particulado, cada uno de los cuales se describe en, por ejemplo, la Patente de EE.Uu . N.° 7.981.447.

Los fármacos inmunoterapéuticos contra el cáncer destruyen las células cancerosas mediante múltiples modalidades: 1) activación directa de las células inmunitarias innatas, 2) activación directa de las células inmunitarias adaptativas, 3) activación indirecta de las células inmunitarias tanto innatas como adaptativas, ya sea haciendo que las células tumorales sean más inmunogénicas o subvirtiendo la inmunosupresión inducida por el tumor.

Existe una creciente evidencia de que las células mieloides en el microambiente tumoral (TME), incluyendo los macrófagos M2, neutrófilos N2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), desempeñan un papel crítico en la inmunosupresión al provocar directamente el agotamiento funcional de las células T citotóxicas o al aumentar indirectamente el poder supresor de las células T reguladoras (Tregs). Esto conduce a un equilibrio inmunoestimulador frente a inmunosupresor sesgado en el TME. El ambiente inmunoestimulador del TME está determinado en gran medida por la presencia de células T citotóxicas y células NK, macrófagos M1 citolíticos e inductores de fagocitosis, neutrófilos N1 citotóxicos, células B inductoras de respuesta humoral y células dendríticas inmunogénicas (DC) presentadoras de antígenos. Citocinas y quimiocinas inmunoestimuladoras tales como interferón gamma (IFN-y), interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), etc. son coordinadores clave de la actividad inmunoestimuladora. Los jugadores importantes que influyen en la naturaleza inmunosupresora del TME son las células Th2 antiinflamatorias, neutrófilos N2, macrófagos M2, Tregs y DC tolerogénicas. Las citocinas y quimiocinas inmunosupresoras tales como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina-10 (IL-10), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), interleucina-4 (IL-4), etc. son coordinadores clave de la actividad inmunosupresora.

El p-glucano soluble, en virtud de ser un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) que se une a CD11b en células de origen mieloide, a saber, neutrófilos y monocitos, se une y aumenta las funciones inmunoestimuladoras de los neutrófilos N1 y los macrófagos M1 y disminuye las funciones inmunosupresoras de MDSC, neutrófilos N2 y macrófagos M2. Esta modulación conduce a un diálogo cruzado entre los diferentes subconjuntos de células innatas y adaptativas en el TME y, finalmente, inclina la balanza hacia la inmunoestimulación. Más específicamente, una vez unido a los monocitos de sangre periférica, el p-glucano soluble modula la diferenciación de monocitos a macrófagos en condiciones de polarización Ml/antitumorigénica frente a M2/protumorigénica, de tal manera que se potencia la polarización M1, lo que aumenta las funciones inmunoestimuladoras de los macrófagos y se inhibe la polarización M2, lo que reduce las funciones inmunosupresoras de los macrófagos. El p-glucano soluble afecta directamente la repolarización de M2 al fenotipo M1 e impulsa la polarización de Th1 y las células inmunitarias innatas preparadas con p-glucano soluble generan citocinas que afectan indirectamente la proliferación de células T CD4 y Cd8, incluso en presencia de Tregs, y finalmente impulsan la polarización Th1.

El p-glucano soluble provoca una respuesta inmunitaria adaptativa a través de los dos subconjuntos de células innatas que se sabe que unen las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, macrófagos derivados de monocitos y células dendríticas y regularán positivamente la expresión de PD-L1 tanto en macrófagos derivados de monocitos como en células dendríticas. A pesar de la regulación positiva de PD-L1, los macrófagos derivados de monocitos y las células dendríticas tratados con p-glucano soluble mejoran la activación y proliferación de las células T y la respuesta inmunitaria coordinada provocada por el p-glucano soluble provoca una respuesta tumoral similar a la resistencia inmunitaria adaptativa, es decir, regulación positiva de la expresión superficial de PD-L1.

El p-glucano soluble puede combinarse con Mab de alivio de la supresión inmunitaria dirigidos al tumor que no activan el complemento. Por ejemplo, el p-glucano soluble puede combinarse con inhibidores del punto de control inmunitario anti-PD-L1 (MAb IgG1 modificado con Fc) en el tratamiento de varios cánceres, incluyendo, melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, etc. Se ha informado que la efectividad de los anticuerpos anti-PD1/PD-L1 es dependiente del nivel de expresión de PD-L1 en tumores. Uno de los mecanismos de expresión de PD-L1 en tumores se llama inmunorresistencia adaptativa donde la expresión de PD-L1 se induce adaptativamente como consecuencia de respuestas inmunitarias dentro del microambiente tumoral (por ejemplo, producción de interferón gamma por células T activadas). El p-glucano soluble induce directa o indirectamente la polarización de Th1. Este efecto regula positivamente la expresión de PD-L1 en las células tumorales y, por lo tanto, mejora la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-PD1/PD-L1. Los ejemplos de inhibidores de puntos de control son nivolumab y pembrolizumab.

El p-glucano soluble puede combinarse con Mab no dirigidos al tumor que no activan el complemento que potencian la coestimulación inmunitaria. Por ejemplo, a) MAb anti-CD40 (IgG2 MAb), dirigido a células dendríticas, b) anti-OX40, anti-41BB, potenciador de la coestimulación de las células T en el tratamiento de varios cánceres.

El p-glucano soluble también puede combinarse con moléculas pequeñas que alivian la inmunosupresión no dirigidas a tumores que no activan el complemento, y a moléculas pequeñas que alivian la inmunosupresión dirigidas a tumores que no activan el complemento. Puede usarse como adyuvante en vacunas contra el cáncer para impulsar la polarización Th1. Puede usarse terapéuticamente para disminuir los mecanismos supresores en enfermedades crónicas (es decir, TB) para acelerar la eliminación completa de la infección. Finalmente, puede usarse para sesgar el equilibrio Th2-Th1 en enfermedades autoinmunitarias dominantes Th2 (alergias, asma, enfermedades atópicas) a un entorno polarizado Th1.

Aunque pueden preferirse agentes que alivien la inmunosupresión que no activen el complemento, especialmente para agentes dirigidos no tumorales, el tratamiento también puede llevarse a cabo con agentes que alivian la inmunosupresión que activan el complemento. Un ejemplo puede ser el bavituximab.

La presente divulgación incluye, en parte, coadministrar un p-glucano con otro agente farmacéutico, que, como se usa en el presente documento, puede ser una preparación de anticuerpo o una preparación de molécula pequeña o cualquier preparación administrada para afectar la TME. Como se usa en el presente documento, "coadministrado" se refiere a dos o más componentes de una combinación administrada de manera que los efectos terapéuticos o profilácticos de la combinación pueden ser mayores que los efectos terapéuticos o profilácticos de cualquiera de los componentes administrados solos. Pueden coadministrarse dos componentes de forma simultánea o secuencial. Los componentes coadministrados simultáneamente pueden proporcionarse en una o más composiciones farmacéuticas. La coadministración secuencial de dos o más componentes incluye casos en que los componentes se administran de tal manera que ambos componentes estén simultáneamente biodisponibles después de que ambos se administren. Independientemente de si los componentes se administran de forma simultánea o secuencial, los componentes pueden coadministrarse en un solo sitio o en diferentes sitios.

En otro aspecto, el método incluye administrar a un sujeto una composición que incluye un resto de p-glucano conjugado con un anticuerpo, un anticuerpo terapéutico, un anticuerpo antitumoral o un fragmento de anticuerpo tal como la porción Fc de un anticuerpo. El p-glucano soluble modificado y/o derivatizado, incluyendo conjugados de pglucano de un resto de p-glucano y un anticuerpo se describen en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US12/36795, que también puede aplicarse a conjugados de fragmentos de anticuerpos. El resto de p-glucano puede ser, o puede derivar de un p-1,3/1,6 glucano. En este contexto, "derivado de" reconoce que un conjugado puede prepararse necesariamente creando un enlace covalente que reemplaza uno o más átomos del p-glucano. Como se usa en el presente documento, "derivado de un p-1,3/1,6 glucano" se refiere a una porción del p-glucano que permanece como parte de un conjugado después de reemplazar uno o más átomos del p-glucano para formar el enlace covalente del conjugado.

El p-glucano, la preparación de anticuerpo o molécula pequeña y/o la combinación de ambos componentes pueden formularse en una composición junto con un "vehículo". Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, vehículo, recubrimiento, diluyente, agente antibacteriano y/o antifúngico, agente isotónico, agente de retardo de la absorción, tampón, solución vehículo, suspensión o coloide. El uso de tales medios y/o agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el p-glucano o el anticuerpo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos complementarios.

Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otra manera, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el p-glucano y/o el agente farmacéutico sin provocar ningún efecto biológico indeseable o sin interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la cual está contenido.

El p-glucano, el agente farmacéutico y/o la combinación de ambos componentes pueden formularse en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden proporcionarse en una única formulación. En otras realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden proporcionarse en formulaciones separadas. Una composición farmacéutica puede formularse en una diversidad y/o en una pluralidad de formas adaptadas a una o más vías de administración preferidas. Por lo tanto, una composición farmacéutica puede administrarse a través de una o más vías conocidas que incluyen, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, intradérmica, transcutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.) o tópica (por ejemplo, intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutánea, rectal, etc.). Una composición farmacéutica, o una porción de la misma, puede administrarse a una superficie mucosa, tal como mediante administración a, por ejemplo, la mucosa nasal o respiratoria (por ejemplo, mediante pulverizador o aerosol). Una composición farmacéutica, o una porción de la misma, también puede administrarse mediante liberación sostenida o retardada.

Una formulación puede presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Los métodos para preparar una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen la etapa de poner en asociación el p-glucano y/o el agente farmacéutico con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, puede prepararse una formulación asociando uniforme y/o íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en las formulaciones deseadas.

El p-glucano, el agente farmacéutico y/o la combinación de ambos componentes puede proporcionarse en cualquier forma adecuada, incluyendo pero no limitado a una solución, una suspensión, una emulsión, un pulverizador, un aerosol o cualquier forma de mezcla. La composición puede administrarse en formulación con cualquier excipiente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la formulación puede administrarse en una forma de dosificación tópica convencional tal como, por ejemplo, una crema, una pomada, una formulación en aerosol, un pulverizador sin aerosol, un gel o una loción. La formulación puede incluir además uno o más aditivos incluyendo tales como, por ejemplo, un adyuvante, un potenciador de la penetración de la piel, un colorante, una fragancia, un saborizante, un humectante o un espesante.

En algunas realizaciones, el p-glucano puede derivar de levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, el p-glucano puede incluir un p-1,3/1,6 glucano tal como, por ejemplo, p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa.

En algunas realizaciones, el método puede incluir la administración de suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto, aunque en algunas realizaciones los métodos pueden realizarse administrando el p-glucano en una dosis fuera de este intervalo. En algunas realizaciones, el método incluye la administración de suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 4 mg/kg.

Alternativamente, la dosis puede calcularse usando el peso corporal real obtenido justo antes del comienzo de un curso del tratamiento. Para las dosificaciones calculadas de esta manera, se calcula el área de superficie corporal (m2) antes del comienzo del curso del tratamiento usando el método de Dubois: m2 = (peso en kg0425 x altura en cm0725) x 0,007184. En algunas realizaciones, por lo tanto, el método puede incluir la administración de suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.

En algunas realizaciones, el método puede incluir administrar suficiente anticuerpo que se una específicamente al pglucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto, aunque en algunas realizaciones los métodos pueden realizarse administrando el anticuerpo en una dosis fuera de este intervalo. En algunas realizaciones, el método incluye la administración de suficiente anticuerpo para proporcionar una dosis de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.

Alternativamente, la dosis puede calcularse usando el peso corporal real obtenido justo antes del comienzo de un curso del tratamiento. Para las dosificaciones calculadas de esta manera, se calcula el área de superficie corporal (m2) antes del comienzo del curso del tratamiento usando el método de Dubois: m2 = (peso en kg0425 x altura en cm0725) x 0,007184. En algunas realizaciones, por lo tanto, el método puede incluir la administración de suficiente anticuerpo para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.

En algunas realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden coadministrarse, por ejemplo, de una sola dosis a múltiples dosis por semana, aunque en algunas realizaciones el método puede realizarse coadministrando el p-glucano y el agente farmacéutico a una frecuencia fuera de este intervalo. En determinadas realizaciones, el pglucano y el agente farmacéutico pueden administrarse de aproximadamente una vez al año a una vez por semana.

El término "y/o" significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados; los términos "comprende" y las variaciones del mismo no tienen un significado limitante cuando estos términos aparecen en la descripción y en las reivindicaciones; a menos que se especifique de otra manera, "un", "una", "el", "la", y "al menos un/a" se usan indistintamente, y significa uno/a o más de uno/a; y las menciones de intervalos numéricos mediante los puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

En la descripción anterior, pueden describirse realizaciones particulares de forma aislada para mayor claridad. A menos que se especifique expresamente lo contrario que las características de una realización particular son incompatibles con las características de otra realización, determinadas realizaciones pueden incluir una combinación de características compatibles descritas en el presente documento en relación con una o más realizaciones.

Para cualquier método desvelado en el presente documento que incluya etapas discretas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según sea apropiado, cualquier combinación de dos o más etapas puede llevarse a cabo simultáneamente.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Debe entenderse que los ejemplos, materiales, cantidades y procedimientos en particular deben interpretarse ampliamente de acuerdo con el alcance de la invención como se expone en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1

Establecimiento y caracterización de macrófagos M1 y M2 humanos cultivados in vitro: CD14+ Los monocitos de sangre completa humana se enriquecieron usando un gradiente de Ficoll y una separación de perlas magnéticas. Los monocitos enriquecidos (5 x 105 células por ml) se cultivaron en medio polarizador M1 (medio XVivo 10 (Grupo Lonza) suplementado con suero autólogo al 5 % y factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos humanos recombinantes (rhGM-CSF) 100 ng/ml (R&D Systems) o bien polarizador M2 (medio XVivo 10 suplementado con suero autólogo al 10% y factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinantes (rhM-CSF) 50 ng/ml (R&D Systems) durante 6 días. En experimentos realizados para evaluar el efecto del p-glucano, la sangre completa se incubó primero con vehículo (tampón de citrato de sodio) o 25 pg/ml de p-glucano soluble durante 2 horas a 37 °C y después los monocitos se aislaron y se diferenciaron. Se comprobó la morfología antes de recolectar los macrófagos para el análisis fenotípico. Se recogió medio de cultivo del cultivo de macrófagos del día 6 (MCM), se centrifugó para retirar el sedimento celular contaminado y después se congeló para el análisis posterior de citocinas mediante ELISA o utilizado para configurar un cocultivo con células T CD4 estimuladas con CD3 y CD28 (MCM-CD4 T) para la evaluación de marcadores de superficie o proliferación de células T CD4. Los macrófagos se usaron para establecer un cocultivo con células T CD4 estimuladas con CD3 y CD28 o solo con CD3 (Mac-CD4 T) el día 6 para evaluar la modulación del marcador de superficie o el efecto sobre la proliferación de células T CD4. Para el estudio de proliferación de células T Mac-CD4, los macrófagos M1 o M2 se cultivaron con células T CD4 autólogas, estimuladas con CD3 y CD28 o solo con CD3, marcadas con CFSE, a una relación de 1:10. La proliferación de células T se midió al final del experimento (día 9-día 11) mediante citometría de flujo, y los resultados se muestran gráficamente como picos de dilución de CFSE. La evaluación de las células T estimuladas solo con CD3 siempre se realizó el día 11. Los resultados cuantitativos se informaron como el índice de división (el número medio de divisiones celulares que experimentó una población) calculado para cada uno de los pocilios por triplicado en cada una de las condiciones de cultivo. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de los cocultivos Mac-CD4 T para el análisis de citocinas posterior.

Para la evaluación de la modulación del marcador de superficie de células T Mac-CD4, los macrófagos M2 se cocultivaron con células T como se describió anteriormente y las células se recolectaron el día 8, el día 9 y el día 10 para realizar la tinción del receptor de superficie tanto en macrófagos M2 como en células T.

Para el estudio de proliferación de células T MCM-CD4, células T CD4 marcadas con CFSE, estimuladas con CD3 y CD28 se cultivaron con MCM al 50 %. La proliferación de células T se midió el día 11 como se describió anteriormente. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo del cocultivo de células T MCM-CD4 para el análisis de citocinas posterior. La evaluación del marcador de superficie de células T MCM-CD4 se realizó como se describió anteriormente.

Los macrófagos M1 y M2 se prepararon y se caracterizaron como se describió anteriormente para A ) morfología, B) fenotipo, C) evaluación funcional de la proliferación de células T Mac-CD4 y D) análisis de citocinas en los cocultivos. La FIGURA 1A-FIGURA 1C incluye resultados representativos de 5 experimentos diferentes.

Según la bibliografía, la morfología de M1 parecía más redondeada y M2 eran más alargadas como fibroblastos (FIGURA 1A). La expresión de marcadores específicos de M1/M2 se evaluó mediante citometría de flujo. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

De acuerdo con la bibliografía sobre el fenotipo, los macrófagos M1 expresaron normalmente niveles más altos de HLA-DR y CD274 (PD-L1), mientras que los macrófagos M2 expresaron niveles más altos de CD163 y CD14. Adicionalmente, en comparación con macrófagos M2 diferenciados in vitro, los macrófagos M1 también ayudaron significativamente a las células T CD4 a proliferar como se muestra en la FIGURA 1B. Concomitante con una proliferación aumentada, se observó una producción aumentada de interferón gamma (IFN-y) en los sobrenadantes de los cocultivos de células T M1 y CD4 (FIGURA 1C).

Las etapas para un método alternativo para el cultivo in vitro y la caracterización de macrófagos humanos que incluye la activación de macrófagos M1 y M2 (denominados macrófagos M1a y M2a) se describen a continuación. Esta metodología se usó en la siguiente serie de experimentos.

WB (no tratado o tratado con p-glucano o vehículo durante 2 horas a 37 °C)

I

Aislar PBMC mediante separación Ficoll

I

Enriquecer los monocitos mediante selección negativa

I

Cultivo de monocitos en medio XVivo10 durante 6 días: Medio M1-XVivo10 suplementado con suero humano al 5 % y medio de cultivo rhGM-CSF M1a-M1 100 ng/ml con adición de LPS 10 ng/ml y medio IFN-y M2-XVivo10 50 ng/ml suplementado con suero humano al 10 % y medio de cultivo rhM-CSF M2a-M250 ng/ml con la adición de 10 ng/ml de IL-4 durante las últimas 72 horas |

I

Recoger el sobrenadante del cultivo de macrófagos (MCM) y recolectar células

Determinar la morfología mediante microscopía Analizar el fenotipo mediante citometría de flujo Estudiar la función de la proliferación de células T estimuladas con CD3/CD28 o CD3 solo en presencia de macrófagos (T Mac-CD4) mediante un ensayo de dilución de CFSE

Los macrófagos activados M1a y M2s, preparados y caracterizados como se describe anteriormente, se caracterizaron por su morfología y fenotipo. Aquí se muestran los resultados representativos de 5 experimentos diferentes.

La FIGURA 1D muestra la morfología de los macrófagos M1a y M2a. La expresión de marcadores específicos de M1a/M2a se evaluó mediante citometría de flujo. Se calculó la mediana de m F i para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Ejemplo 2

Efecto de p-glucano en repolarización M2 a M1: Se prepararon macrófagos M1 y M2 de sangre completa tratada con vehículo o con p-glucano como se describió anteriormente. Una expresión de un panel de marcadores específicos de M1/M2 (incluyendo HLA-DR, CD163, CD206, CD209, CD80, CD86 y PD-L1) se midieron mediante citometría de flujo. El pretratamiento con p-glucano no afectó al fenotipo del macrófago M1 pero sí al fenotipo del macrófago M2. Como se muestra en la FIGURA 2A, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CD163 se modula negativamente en macrófagos M2 tratados con p-glucano. Además, se potenció la expresión de superficie de CD86 así como los niveles de proteína y ARNm de PD-L1 (FIGURA 2B).

Después, se cultivaron macrófagos M1 o M2 tratados con vehículo o con p-glucano con células T CD4 autólogas estimuladas con CD3 y CD28, marcadas con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) y la proliferación de las células T se midió al final del experimento mediante citometría de flujo y los resultados se informaron cuantitativamente como índice de división (el número promedio de divisiones celulares a las que se ha sometido una población). La FIGURA 2C es un ensayo representativo de proliferación de células T con dilución de CFSE realizado mediante el cultivo conjunto de células T con macrófagos M2 tratados con p-glucano, y los resultados muestran la capacidad de los macrófagos M2 tratados con p-glucano de potenciar la proliferación de células T CD4.

Los sobrenadantes del cultivo del ensayo de proliferación de células T con dilución de CFSE (FIGURA 2B) también se midieron para los niveles de IFN-gamma mediante ELISA. La FIGURA 2D es un gráfico representativo de los niveles de IFN-gamma que muestra un aumento concomitante en la producción de IFN-gamma. Por lo tanto, el p-glucano afecta a la repolarización de M2 a M1 e impulsa la polarización Th1 antitumorigénica.

Ejemplo 3

Efecto de p-glucano en la repolarización de M2 a M1 en células de proteínas de unión de alta frente a proteínas de unión baja: Los primeros estudios que evaluaron la unión de p-glucano soluble a neutrófilos y monocitos revelaron que los sujetos tienen diferentes capacidades de unión. Los estudios posteriores encontraron que el p-glucano soluble se unía al menos a algunas de las células inmunitarias de proteínas de unión alta y las proteínas de unión alta también tenían niveles más altos de anticuerpos anti-p-glucano naturales. Los estudios funcionales identificaron cortes generales de unión y niveles de anticuerpos, que se usaron para identificar a los sujetos como proteínas de unión alta (alta respuesta al p-glucano) y proteínas de unión baja (baja respuesta al p-glucano).

Para este fin, se llevaron a cabo evaluaciones de macrófagos M1/M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano soluble de proteínas de unión alta y proteínas de unión baja. Los macrófagos M1 y M2 de los quelantes altos y bajos se evaluaron posteriormente en cuanto a A) fenotipo, B) potenciación de la proliferación de células T CD4 y C) modulación de la producción de IFN-y e IL-4. La FIGURA 3A-FIGURA 3C son resultados representativos de 4 experimentos diferentes.

La expresión de un panel de marcadores se evaluó mediante citometría de flujo para los macrófagos M1 y M2 derivados de proteína de unión alta, tratados con vehículo y p-glucano (CD163 se evaluó dos veces). Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3-Proteína de unión alta

(continuación)

CD163 y CD86 se evaluaron mediante citometría de flujo para los macrófagos M1 y M2 derivados de proteína de unión baja, tratados con vehículo y p-glucano. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4-Proteína de unión baa

El resultado clave es que los macrófagos M2 tratados con p-glucano tenían una menor expresión de CD163, uno de los marcadores M2 clave. Curiosamente, este resultado fue específico para proteínas de unión alta ya que la expresión de CD163 permaneció igual entre macrófagos M2 tratados con vehículo y con p-glucano.

Después, se evaluó la capacidad de los macrófagos M1/M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano soluble de proteínas de unión alta y baja para mejorar la proliferación de células T CD4 estimuladas por CD3 y CD28. La FIGURA 3A muestra los resultados del ensayo de proliferación de células T CD4 en una proteína de unión alta mientras que la FIGURA 3B muestra los resultados en una proteína de unión baja. Los macrófagos M2 tratados con p-glucano tenían una capacidad significativamente mayor para mejorar la proliferación de células T CD4 estimuladas con CD3 y CD28 en comparación con la observada con los macrófagos M2 tratados con vehículo en proteínas de unión alta mientras que no hubo una proliferación mejorada en proteínas de unión baja. Además, los macrófagos M1 tratados con p-glucano no mostraron diferencias en esta capacidad funcional en comparación con los macrófagos M2 tratados con vehículo en proteínas de unión alta o proteínas de unión baja.

Después se evaluó la modulación de la producción de IFN-y e IL-4 de macrófagos M2 tratados con vehículo y pglucano. Concomitante con una proliferación aumentada, se observó una producción significativamente aumentada de IFN-y, pero no se de IL-4 en cocultivos de macrófagos M2 tratados con p-glucano y células T CD4 en proteínas de unión alta (FIGURA 3C) pero no en proteínas de unión baja (FIGURA 3D). Por lo tanto, los macrófagos M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano son similares a M1 en proteínas de unión alta.

Ejemplo 4

Efecto de p-glucano en la repolarización de M2 a M1 en condiciones inmunosupresoras:

Se llevó a cabo la evaluación fenotípica y funcional de macrófagos M2a tratados con p-glucano y M2 tratados con pglucano en presencia de citocinas inmunosupresoras. Se prepararon macrófagos M2 o M2a como se describió anteriormente. El día 3, se añadió medio condicionado portumor (TCM) a cultivos de macrófagos M2 para representar el 70 % del volumen del cultivo y después se evaluó la expresión de CD163 y la actividad funcional el día 6. El TCM de BxPC3, una línea celular de cáncer de páncreas, ha demostrado contener varias citocinas inmunosupresoras incluyendo M-CSF, TGF-beta, IL-4, etc. Los macrófagos M2a se cultivaron en IL-4 como se describió anteriormente.

Los macrófagos M2a tratados con p-glucano cultivados en macrófagos IL-4 y M2 cultivados en TCM se evaluaron en primer lugar para determinar la expresión de CD163 y CD86. Se evaluaron CD163 y CD86 mediante citometría de flujo y se calculó la mediana de m F i para la tinción del control de isotipo y la tinción del antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5-Condiciones^ inmunosu resoras

Como se vio en experimentos anteriores de diferenciación de M2 usando M-CSF, los monocitos tratados con p-glucano cultivados en TCM también mostraron una marcada regulación negativa de CD163. Además, los macrófagos M2 tratados con p-glucano tuvieron una mayor expresión de HLA-DR (datos no mostrados).

Se realizó después una evaluación funcional de la capacidad para modular la proliferación de células T CD4 mediante un ensayo de proliferación de células T CD4 (tres o seis réplicas en cada condición). Los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en TCM y macrófagos M2a cultivados en IL-4 mantuvieron la capacidad de potenciar la proliferación de células T CD4 en comparación con la observada con los macrófagos M2 y M2a tratados con vehículo. Concomitante con una proliferación aumentada, se observó un aumento significativo de la producción de IFN-y en cocultivos de macrófagos y células T CD4 (FIGURA 4).

Los ejemplos anteriores demuestran que el p-glucano soluble tiene la capacidad de inhibir la polarización M2 e inducir más células similares a M1, como lo demuestra la expresión reducida de CD163, la expresión aumentada de CD86 e inhibiendo la capacidad de M2 para suprimir la proliferación de células T CD4. Incluso en condiciones inmunosupresoras, simuladas por la presencia de IL-4 en combinación con M-CSF o medio acondicionado para tumores (TCM), el p-glucano soluble fue capaz de inhibir la polarización de M2 y mejorar su capacidad para ayudar a la proliferación de células T CD4. La mejora de la proliferación de células T CD4 por p-glucano soluble en M2 se acompañó de un aumento en la citocina proinflamatoria, polarizante Th1, IFN-y y ningún cambio en la producción de citocina inmunosupresora IL-4.

Ejemplo 5

Efecto de p-glucano en la proliferación y activación de células T CD4/CD8 en presencia de Tregs: Para obtener plasma, la sangre completa se trató durante 6 horas con 25 pg/ml de p-glucano o vehículo, se centrifugó y el plasma se retiró. Se cultivaron 50.000 PBMC autólogas marcadas con CFSE en el plasma tratado durante 3 días en presencia de 50.000 perlas CD3/28 activadoras de linfocitos T (DYNABEADS Human T-Activator CD3/CD28 para expansión y activación de linfocitos T). Al final del cultivo, las PBMC se tiñeron con CD4 y CD8 y se midió la proliferación de células T mediante dilución de CFSE. Como se muestra en los gráficos de dilución de CFSE representativos en la FIGURA 5A, el plasma de sangre completa tratada con p-glucano proporcionó una mejora significativa en la proliferación de CD4 y CD8 en comparación con los controles tratados con vehículo.

Después, para mostrar el efecto del p-glucano soluble en la activación de las células CD4 y CD8, se llevó a cabo de nuevo el ensayo de proliferación de células T descrito anteriormente. El día 3, sin embargo, las células se tiñeron para los marcadores de activación, incluyendo la producción de Granzima B y la regulación positiva de CD25. Los gráficos mostrados en la FIGURA 5B demuestran que el plasma tratado con p-glucano potencia la activación de las células CD4 y CD8.

La mejora en la proliferación fue mayor cuando se trató sangre completa durante el período de incubación de 6 horas antes del aislamiento del plasma, lo que indica que este efecto sobre la proliferación de las células T es el resultado de un mecanismo indirecto (es decir, la liberación de citocinas por las células inmunitarias innatas). Para determinar si el aumento de la proliferación de células T por p-glucano es directo o indirecto, Los ensayos de proliferación de células T se llevaron a cabo como se describió anteriormente, excepto que el plasma de sangre completa no tratada (vehículo) se trató después con p-glucano o vehículo antes de añadirlo a las PBMC autólogas. La dilución de CFSE se cuantificó mediante el índice de división usando el software FLOWJO y se representó como multiplicidad sobre el control de vehículo. Los resultados mostrados en la FIGURA 5C indican que el efecto mejorado del p-glucano se debe a mecanismos indirectos.

Dado que estos cultivos de PBMC contienen Tregs, la capacidad supresora de Tregs parece estar alterada en presencia de p-glucano soluble y se llevaron a cabo estudios para determinar si el p-glucano afectaba la supresión de Treg. Se añadió plasma de sangre completa tratada con p-glucano o tratada con vehículo (descrito anteriormente) a 25.000 células T CD4 autólogas aisladas marcadas con CFSE (CD4+CD25') junto con un número creciente de Treg autólogas aisladas (CD4+CD25+) resultando en pocillos con relaciones en aumento. A continuación, las células se estimularon con 50.000 perlas de CD3/28 que activan células T durante 3 días. Posteriormente, la proliferación se midió mediante dilución de CFSE y se cuantificó mediante el Índice de división, que se usó para calcular el % de supresión de Tregs en el cocultivo. % de supresión = 100-(Índice de división del pocillo Treg/Índice de división de 1:0 pocillo)/100. Los resultados se muestran en la FIGURA 5D. El plasma de sangre completa tratado con p-glucano mostró disminuciones significativas en la capacidad supresora de Tregs en comparación con el plasma de sangre completa tratada con vehículo.

La supresión de Treg por p-glucano también dio como resultado una producción mejorada de IFN-gamma. El ensayo de supresión de Treg se realizó como se describió anteriormente, y después de 3 días de co-cultivo, se analizaron los sobrenadantes para determinar la producción de IFN-gamma. La FIGURA 5E muestra los resultados de la producción de IFN-gamma de los pocillos cultivados en una relación de células T a Treg de 8:1. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el p-glucano afecta a la proliferación de CD4 y CD8 junto con la función Treg, lo que da como resultado una función efectora adaptativa antitumoral mejorada.

Establecimiento y caracterización de células dendríticas derivadas de monocitos inmaduras humanas (im-MoDC) y células dendríticas derivadas de monocitos maduros (mMoDC) cultivadas in vitro:

Dado que los macrófagos y las células dendríticas son los dos tipos de células presentadoras de antígenos clave que unen la inmunidad innata y adaptativa, también se evaluó el efecto fenotípico y funcional del p-glucano soluble en células dendríticas derivadas de monocitos humanos (MoDC). Los monocitos enriquecidos con sangre completa tratada con p-glucano soluble o con vehículo se cultivaron en un medio que contenía las citocinas adecuadas, GM-CSF más IL-4, para la diferenciación de células dendríticas. Las etapas incluidas en el método para el cultivo in vitro y la caracterización de los MoDC humanos se describen a continuación.

Sangre completa (no tratada o tratada con p-glucano soluble o vehículo durante 2 horas a 37 °C)

I

Aislar PBMC mediante separación Ficoll

I

Enriquecer los monocitos mediante selección negativa

I

Cultivar monocitos en medio XVivo15 (suplementado con suero autólogo humano al 10 %, rhGM-CSF 50 ng/ml y rhlL-4 50 ng/ml) durante 6-7 días |

I

Inducir la maduración de MoDC por LPS (50 ng/ml) TNF-a (25 ng/ml) durante 48-72 horas |

I

Morfología de MoDC determinada por microscopía Análisis fenotípico por citometría de flujo Estudio funcional por reacción alogénica de linfocitos mixtos (allo-MLR)

imMoDC y mMoDC, preparados como se describe anteriormente, se muestran en la FIGURA 6A. La morfología de los mMoDC se caracteriza por la presencia de largas proyecciones o dendritas.

Los mMoDC se evaluaron para la expresión de CD80, CD83, CD86 y HLA-DR por citometría de flujo, y la mediana de MFI se calculó para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6

mMoDC mostró una expresión superficial aumentada de los marcadores de maduración coestimuladores CD80, CD83, CD86 así como HLA-Dr . Adicionalmente, estos mMoDC también mostraron inmunogenicidad en una reacción de linfocitos mixtos alogénicos (cuatro réplicas en cada condición), desencadenando una mayor expansión de células T CD4 y CD8 (FIGURA 6B).

Ejemplo 7

Efecto de p-glucano en la maduración de MoDC: Se llevó a cabo la evaluación fenotípica y funcional de mMoDC preparado a partir de sangre completa tratada con p-glucano soluble de una proteína de unión alta y una proteína de unión baja. mMoDC de una proteína de unión alta y una proteína de unión baja se prepararon como se describe anteriormente. Los mMoDC se evaluaron para la expresión de CD80, CD83, CD86 y h LA-DR mediante citometría de flujo, y se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7-mMoDC

La expresión aumentada de CD80, CD86, CD83 y HLA-DR en mMoDC tratados con p-glucano derivados de proteínas de unión alta indica que estos mMoDC son más maduros que aquellos derivados de proteínas de unión baja.

El mMoDC tratado con p-glucano derivado de proteínas de unión alta también mostró una inmunogenicidad aumentada en un allo-MLR (cuatro réplicas en cada condición), desencadenando de nuevo un aumento de la expansión de células T CD4 y CD8 (FIGURA 7A) sobre células derivadas de proteínas de unión baja (FIGURA 7B).

Además, el mMoDC tratado con p-glucano derivado de proteínas de unión alta fue capaz de modular la producción de IFN-y sobre células derivadas de proteínas de unión baja y mMoDC tratados con vehículo (FIGURA 7C).

Los MoDC derivados de monocitos tratados con p-glucano son más maduros incluso en condiciones inmunosupresoras. Los MoDC se prepararon como se describió anteriormente. Se añadió TCM para representar el 70 % del volumen del cultivo el día 0 y estuvo presente durante todo el período de cultivo. Los mMoDC cultivados en presencia de TCM se evaluaron posteriormente para detectar cambios fenotípicos. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígeno de superficie y los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8-Condiciones inmunosu resoras

Ejemplo 8

El contacto de célula a célula y los factores solubles aumentan la proliferación de células T CD4 a macrófagos M2 tratados con p-glucano: Usando la proliferación de células T CD4 como lectura, se estudió el requisito de contacto de célula a célula o factor o factores solubles para iniciar la proliferación por macrófagos M2 tratados con p-glucano. Para estudiar el contacto de célula a célula entre macrófagos y células T, se midió la proliferación de células T CD4 cuando se cultivaron conjuntamente con macrófagos M2 tratados con p-glucano en ausencia de coestimulación con CD28 y se estudió la modulación de los marcadores de activación de superficie tanto en macrófagos M2 tratados con p-glucano como en células T en el cocultivo.

La evaluación del contacto de célula a célula se llevó a cabo como sigue: se usaron macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano y cocultivos de linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28 frente a CD3 para medir la proliferación de linfocitos T CD4 y la producción de IFN-y.

Como se muestra en la FIGURA 8A, los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados con células T CD4 en ausencia de anticuerpo CD28 exógeno demostraron una capacidad significativamente mayor para potenciar la proliferación de células T CD4. Concomitante con una proliferación aumentada, se observó una producción significativamente aumentada de IFN-y en cocultivos de macrófagos M2 tratados con p-glucano y células T CD4 (Figura 8B).

También se midieron los cambios en la expresión del marcador de superficie tanto en macrófagos como en células T estimuladas con CD3 y CD28. Los macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano y las células T CD de los cocultivos se evaluaron mediante citometría de flujo para la modulación de moléculas coestimuladoras o co inhibidoras. La FIGURA 8C y la Tabla 9 son resultados representativos de 2 experimentos diferentes.

Tabla 9

De todos los marcadores de superficie probados, se observó un aumento relativo en la expresión superficial de CD86 (día 8) y PD-L1 (día 9) en la superficie de macrófagos M2 tratados con p-glucano en comparación con la de los macrófagos M2 tratados con vehículo. Se observó un aumento de la expresión de PD-1 (día 9) en la superficie de células T cocultivadas con macrófagos M2 tratados con p-glucano.

Para determinar si se requieren factores solubles secretados por macrófagos M2 tratados con p-glucano, se llevaron a cabo mediciones de la proliferación de células T CD4 cocultivadas con macrófagos M2 tratados con p-glucano MCM (50 % del volumen) y se observó modulación del marcador de activación de superficie en células T incubadas con MCM. La FIGURA 9 es representativa de 2 experimentos diferentes. Cuando se evalúa mediante un ensayo de proliferación de células T CD4, MCM de macrófago M2 tratado con p-glucano cultivado con células T CD4 demostró una capacidad significativamente mayor para potenciar la proliferación de células T CD4 (FIGURA 9) en comparación con el MCM de macrófago M2 tratado con vehículo. Además, las células T CD4 cultivadas en MCM de macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano se evaluaron para determinar la modulación de moléculas coestimuladoras o co-inhibidoras (CD80, CD28, CTLA-4, 4-1BB y PD-1). Sorprendentemente, no se observó ningún cambio en ninguno de los marcadores de células T (datos no mostrados).

Ejemplo 9

Análisis de macrófagos M2 tratados con p-glucano en proteínas de unión alta frente a proteínas de unión baja: Como se ha analizado anteriormente, se ha demostrado que los umbrales de anticuerpos anti-p-glucano (ABA) en sujetos son importantes para la inmunoterapia con p-glucano. Por lo tanto, se investigó la importancia del umbral de a Ba en la capacidad del p-glucano para modular la polarización M1/M2. La capacidad del p-glucano para modular la polarización M l/M2 en proteínas de unión alta frente a proteínas de unión baja se determinó mediante evaluaciones fenotípicas y funcionales.

Se prepararon macrófagos M2 de 4 proteínas de unión alta y 4 proteínas de unión baja y se evaluó su capacidad para modular la proliferación de células T CD4. Los sobrenadantes de las diversas condiciones de proliferación de células T CD4 se midieron para IFN-y mediante ELISA. Los resultados mostrados en la FIGURA 10 son representativos de 4 experimentos diferentes. Se representa la multiplicidad sobre los niveles de IFN-y producidos en los cocultivos de macrófagos M2 tratados con vehículo y células T CD4 para cada uno de los 4 donantes.

En proteínas de unión baja, el p-glucano no moduló ninguno de los marcadores fenotípicos en los macrófagos derivados de monocitos en condiciones de polarización M1/M2 (datos no mostrados), y en una evaluación funcional de proteínas de unión baja por ensayo de proliferación de células T CD4, los macrófagos M2 tratados con p-glucano no mejoraron la proliferación de células T CD4 ni aumentaron la producción de IFN-y.

Ejemplo 10

Estudios de suero cruzado: Debido a que el p-glucano no mostró modulación de la polarización M1/M2 en proteínas de unión baja, se evaluó la modulación por p-glucano usando monocitos de una proteína de unión baja en presencia de suero que contenía niveles más altos de ABA (suero cruzado de una proteína de unión alta). Para probar esto, los macrófagos M2 se prepararon como se describió anteriormente con algunas modificaciones. La sangre completa de una proteína de unión baja se centrifugó para retirar el plasma y después las células se reconstituyeron con suero obtenido de una proteína de unión alta. La sangre reconstituida se trató con vehículo o p-glucano (25 pg/ml) durante 2 horas a 37 °C. Se evaluó la unión de los monocitos usando un anticuerpo monoclonal específico anti-p-glucano y una citometría de flujo posterior. Los monocitos tratados con vehículo o p-glucano en sangre completa se aislaron y diferenciaron en macrófagos M2, y se usaron las células M2 (datos no mostrados) o el MCM para evaluar su capacidad para mejorar la proliferación de células T CD4 (seis réplicas en cada condición) y el aumento de la producción de IFN-Y usando los métodos descritos anteriormente.

Los monocitos en la sangre completa de una proteína de unión baja no se unieron a p-glucano pero mostraron una unión significativamente más alta cuando se añadió suero de una proteína de unión alta que contenía niveles más altos de ABA a la sangre completa de la proteína de unión baja (FIGURA 11A). Además, los MCM de macrófagos M2 tratados con p-glucano de una proteína de unión baja cruzados con un suero de proteína de unión alta tienen una capacidad significativamente más alta para potenciar la proliferación de células T CD4 en comparación con la observada con los macrófagos M2 tratados con vehículo. Concomitante con una proliferación aumentada, se observó una producción significativamente aumentada de IFN-y en cocultivos de macrófago M2 tratados con p-glucano y células T CD4 (FIGURA 11B).

Ejemplo 11

Regulación positiva de PD-L1 en macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en presencia de citocinas inmunosupresoras (TCM): Se prepararon monocitos o macrófagos M2 como se describió anteriormente. El día 3, se añadió TCM para representar el 70 % del volumen del cultivo y luego se evaluó la expresión de PD-L1 con TCM y luego de nuevo cuando se cocultivó con células T CD4.

Los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en TCM tenían una mayor expresión superficial de PD-L1 (FIGURA 12A). También hubo un aumento de la expresión cuando se co-cultivaron con células T CD4 (FIGURA 12B).

Usando el sistema anterior, se determinó que el p-glucano tiene la capacidad de inhibir la polarización M2 como lo demuestra la expresión reducida de un marcador M2 clave, CD163, e inhibiendo la capacidad de M2 para suprimir la proliferación de células T CD4. Incluso en un ambiente inmunosupresor, estimulado por la presencia de IL-4 en combinación con M-CSF (datos no mostrados) o bien medio condicionado por tumores (TCM), el p-glucano fue capaz de inhibir la polarización de M2 y mejorar su capacidad para ayudar a la proliferación de células T CD4. La mejora de la proliferación de células T CD4 por M2-p-glucano se acompañó de un aumento en la citocina proinflamatoria, polarizante Th1, IFN-y y ningún cambio en la producción de citocina inmunosupresora IL-4. Como se esperaba con el aumento de la activación de las células T y la producción de IFN-y, se observaron aumentos en la expresión superficial de PD-L1 en macrófagos M2 tratados con p-glucano y PD-1 en células T. Los propios macrófagos M2 tratados con pglucano, así como los factores solubles secretados por las células son importantes para potenciar la proliferación de células T CD4. Finalmente, el p-glucano inhibió la polarización de M2 solo en las células de donantes sanos que tenían niveles más altos de ABA.

Ejemplo 12

Regulación positiva de PD-L1 en MiaPaCa: Se cultivaron macrófagos M2 tratados con p-glucano y vehículo y macrófagos M2 tratados con p-glucano ABA con suero de proteína de unión alta y suero de proteína de unión baja para evaluar la expresión de PD-L1 en células tumorales. La FIGURA 13 muestra que los macrófagos M2 tratados con p-glucano aumentaron la expresión de PD-L1 en las células tumorales en proteínas de unión alta y con la adición de ABA, los macrófagos M2 tratados con p-glucano también aumentaron la expresión de PD-L1 en células tumorales en proteínas de unión baja.

Ejemplo 13

Efecto de p-glucano soluble en células supresoras derivadas de mieloides (MDSC): MDSC se acumulan en la sangre, los ganglios linfáticos y la médula ósea y en los sitios del tumor en la mayoría de los pacientes y animales de experimentación con cáncer e inhiben tanto la inmunidad adaptativa como la innata. Las MDSC son inducidas por factores secretados por tumores y secretados por el hospedador, muchas de las cuales son moléculas proinflamatorias. La inducción de MDSC por mediadores proinflamatorios llevó a la hipótesis de que la inflamación promueve la acumulación de MDSC que regulan negativamente la vigilancia inmunológica y la inmunidad antitumoral, facilitando así el crecimiento del tumor.

Se extrajo sangre en diversos momentos de un sujeto de estudio de caso sometido a tratamiento con IMPRIME PGG y se analizó la presencia de MDSC. La primera extracción de sangre se realizó antes de la infusión, ciclo 8, día 1. Como se muestra en la FIGURA 14A, una gran población de MDSC CD33+ están presentes en sangre periférica. Se realizó una segunda extracción de sangre después de la infusión, ciclo 8, día 1. Como se muestra en el segundo panel de la FIGURA 14A, pocas horas después de la infusión, MDSC desaparece transitoriamente. La última muestra de sangre se extrajo antes de la infusión, ciclo 8, día 15. Las MDSC CD33+ están nuevamente presentes en la sangre periférica.

En otro estudio, la sangre del cordón humano se enriqueció con células CD34+ y se cultiva durante 9 días para producir células CD33+CD11b+ (MDSC). A continuación, las MDSC se trataron con p-glucano soluble o tampón citrato (control) y se evaluó su capacidad para suprimir la proliferación de células T. El ensayo de proliferación de células T se llevó a cabo en una relación 2:1 de células T CD8 a MDSC tratadas o no tratadas. Como se muestra en la FIGURA 14B, las MDSC tratadas con p-glucano fueron menos supresoras de la proliferación de células T.

Estos resultados indican que el p-glucano modula la población de MDSC haciéndolas dejar transitoriamente la circulación sanguínea periférica y menos supresoras de la proliferación de células T. Por lo tanto, si uno o más fármacos inmunoterapéuticos contra el cáncer o fármacos quimioterapéuticos se administran en combinación con pglucano soluble, especialmente durante el período de pérdida transitoria de la población celular CD33+, las terapias serían más eficaces contra los tumores.

Ejemplo 14

El sobrenadante de macrófagos M2/MoDC tratados con p-glucano y co-cultivo de células T induce la expresión de PD-L1 en células tumorales: Se prepararon macrófagos M2 y MoDC como se describió anteriormente. Los macrófagos y MoDC se usaron posteriormente en ensayos de proliferación de células T como se describió anteriormente. Los sobrenadantes de estos ensayos de proliferación se recolectaron e incubaron con diversas líneas de células tumorales, incluyendo NSCLC, mama, pancreático, colon y linfoma de células B. La expresión de PD-L1 en estas líneas de células tumorales se evaluó después de 48 horas mediante citometría de flujo. Lo mostrado en la FIGURA 15 son resultados representativos de 3 experimentos diferentes.

Las células T requieren tres señales para sus mecanismos efectores. La señal 1 es el antígeno presentado en el contexto de moléculas MHC en las células presentadoras de antígeno (APC), la señal 2 se proporciona por las moléculas coestimuladoras de la membrana en la APC y la señal 3 son las citocinas producidas en el medio para la función efectora. Las moléculas coinhibidoras, tales como PD-L1 pueden inhibir las funciones efectoras de las células T.

Los macrófagos y células dendríticas derivadas de monocitos tratados con p-glucano in vitro tienen niveles más altos de expresión de PD-L1, pero el tratamiento también aumenta la expresión de la molécula coestimuladora CD86, (señal 2) y citocinas (señal 3) que permiten una función efectora mejorada de las células T.

La respuesta inmunitaria más amplia innata y adaptativa provocada por el p-glucano también mejora la expresión de PD-L1 en las líneas de células tumorales. Estos resultados demuestran que la regulación positiva de la expresión de PD-L1 inducida por el p-glucano tanto en las células inmunitarias como en las tumorales lo convierte en un compañero de combinación prometedor con la inmunoterapia del cáncer con inhibidor del punto de control.

Es igualmente importante señalar que el p-glucano también tiene la capacidad de contrarrestar el efecto inhibidor de la regulación ascendente de PD-L1 mediante mecanismos compensatorios como el aumento de la expresión de moléculas coestimuladoras y la producción de citocinas inmunoestimuladoras.

Ejemplo 15

Efecto de p-glucano soluble en combinación con agentes anti-angiogénicos en el TME:

La angiogénesis tumoral altera la función inmunitaria en el TME dando como resultado un ambiente inmunosupresor. Los agentes antiangiogénicos, tales como el anticuerpo anti-VEGFR2 DC101 (ramucirumab de ratón), han demostrado su utilidad en la terapia del cáncer. Debido a que el p-glucano soluble puede desviar el TME hacia un entorno más antitumoral, se usó en combinación con DC101 para tratar xenoinjertos subcutáneos de cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC) NCI-H441 en ratones para aumentar la eficacia del anticuerpo DC101.

Se inyectaron ratones desnudos atímicos hembras de 6 a 8 semanas de edad con 5x106 células tumorales H441 en un volumen de 0,2 ml por vía subcutánea en el flanco. A los ratones se les administró una dosis cada dos semanas cuando el volumen medio del tumor alcanzó aproximadamente 150 mm3 con los siguientes agentes:

• vehículo 0,2 ml/ratón

• IMPRIME PGG 1,2 mg/ratón (Biothera, Inc.)

• DC101 10 mg/kg o 20 mg/kg (clon: DC101 n.° de catálogo: BE0060)

Se recogieron muestras de sangre el día 10 y 2 horas después de la última dosis.

Los grupos de tratamiento incluyeron vehículo (control de PBS), IMPRIME PGG solo, DC101 solo y DC101 IMPRIME PGG. Los tumores se aleatorizaron a los grupos de tratamiento una vez que el tamaño alcanzó una media de grupo de 150 mm3. Los resultados de los grupos de tratamiento de 10 mg/kg se muestran en la FIGURA 16.

Como es evidente a partir del gráfico, IMPRIME PGG+DC101 (un anticuerpo activador del complemento, no dirigido al tumor) actuó sinérgicamente para minimizar el crecimiento del tumor. Por lo tanto, el p-glucano soluble en combinación con un agente anti-angiogénico (que puede ser o no un anticuerpo activador del complemento, no dirigido al tumor) es una terapia eficaz contra el cáncer.

Ejemplo 16

El p-glucano soluble en combinación con anticuerpos anti-PD-Ll mejora la supervivencia libre de tumores: En otro estudio con animales, a los ratones se les inyectaron células tumorales MC38 y se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Se inyectaron ratones hembra C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad con 1x106 células tumorales MC38, un adenocarcinoma de colon que expresa niveles bajos de PD-L1, en un volumen de 0,1 ml inyectado por vía subcutánea en el flanco. A los ratones se les administró una dosis bisemanal a partir del día 3 con los siguientes agentes:

• vehículo 0,2 ml/ratón

• IMPRIME PGG 1,2 mg/ratón (Biothera, Inc.)

• anti-PDL-1 100 pg/ratón Clon: 10F.9G2 BioXcell n.° de catálogo: BE0101

Las muestras de sangre se recolectaron 1 hora antes de la dosis 1, 2 horas después de la dosis 3, el punto final y 2 horas después de la última dosis (día 20). Los grupos de tratamiento incluyeron vehículo (control de PBS), IMPRIME PGG solo, anticuerpo anti-PD-L1 solo y anti-PD-L1 IMPRIME PGG. Los tumores se aleatorizaron a los grupos de tratamiento una vez que el tamaño alcanzó una media de grupo de 150 mm3. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10

De nuevo, la combinación de anticuerpo anti-PD-L1+p-glucano soluble funcionó sinérgicamente para potenciar eficazmente la supervivencia sin tumores.

También debe tenerse en cuenta que la expresión de PD-L1 en tumores es un biomarcador de la capacidad de respuesta del anticuerpo anti-PD-1. Por lo tanto, debido a que el p-glucano soluble induce la expresión de PD-L1 en tumores, el p-glucano soluble también potenciará la eficacia de los anticuerpos anti-PD-1. Esto se confirma por el aumento de la expresión de PD-1 inducida por el tratamiento con p-glucano soluble descrito anteriormente.

Ejemplo 17

Efecto in vivo sobre TME de p-glucano soluble y agentes anti-angiogénicos: A los ratones que portaban tumores de NSCLC H1299 se les administró bevacizumab (un anticuerpo anti-angiogénico) e IMPRIME PGG como se describió anteriormente para los otros estudios en ratones. Como se muestra en la FIGURA 17A, el grupo de tratamiento al que se administró la combinación de bevacizumab e IMPRIME PGG mostró un aumento en la expresión de PD-L1, la FIGURA 17B muestra la modulación descendente de arginasa 1 y la FIGURA 17C muestra un aumento en la expresión de iNOS en el infiltrado inmunitario innato C11b positivo del TME en comparación con el del grupo al que se le administró bevacizumab solo. El iNOS aumentado y la Arginasa 1 disminuida son marcadores que indican un entorno M1, inmunoestimulador. Estos datos ilustran claramente que el p-glucano soluble aumenta la eficacia de los agentes antiangiogénicos y modula el TME in vivo.

La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han proporcionado solo para claridad de comprensión. No deben entenderse limitaciones innecesarias a partir de ello. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, ya que las variaciones obvias para un experto en la materia se incluirán dentro de la invención definida por las reivindicaciones.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan las cantidades de componentes, pesos moleculares y otros que se usan en la memoria descriptiva y reivindicaciones han de entenderse estando modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario de otro modo, los parámetros numéricos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que han de obtenerse mediante la presente invención. Como mínimo, y no en un intento de limitar la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.

A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que establecen el amplio alcance de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se presentan de la forma más precisa posible. Todos los valores numéricos, sin embargo, contiene de forma inherente un intervalo que resulta necesariamente de la desviación típica que se encuentra en sus respectivas mediciones de prueba.

Todos los títulos son para la conveniencia del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al título, a menos que así se especifique.

Claims

REIVINDICACIONES

1. p(1,6)-[Poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-LI para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-LI es un anticuerpo que no activa el complemento.

2. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-LI para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es melanoma, carcinoma de células renales o cáncer de pulmón.

3. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-LI para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de colon o linfoma de células B.

4. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-LI para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-L1 están en una formulación única.

5. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-L1 están en formulaciones separadas.

6. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa deriva de levadura.

7. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la levadura es Saccaromyces cerevisiae.

8. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa estimula el sistema inmunitario del sujeto.

9. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgG¹con Fc modificado por ingeniería genética.

10. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-L1 se administran por vía intravenosa.

11. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende además la administración de un anticuerpo dirigido a un tumor.

12. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende además la detección de anticuerpos beta-glucano.

13. p(1,6)-[Poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-L1 para su uso en un método para estimular el sistema inmunitario de un sujeto contra células cancerosas, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo que no activa el complemento.

14. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la estimulación inmunitaria comprende la activación de macrófagos M1, neutrófilos N1, células T o células dendríticas.

15. La p(1,6)-[poli(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y el anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la estimulación inmunitaria comprende la activación de interleucina-12, interferón-Y, factor de necrosis tumoral a o una combinación de los mismos.