CN103772520B - 高粘度迪优坦胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了迪优坦多糖的生产，所述多糖显示粘度特性提高。通过产生鞘氨醇单孢菌ATCC53159的衍生物生产这种改进的迪优坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪优坦多糖的生物合成基因的多拷贝广谱宿主性质粒。所述质粒能在宿主鞘氨醇单孢菌菌株内产生用于这种多糖合成的多个基因拷贝。以这种方式提供的方法不仅能提高靶迪优坦多糖的产量，还能产生物理特性改进(上述较高的粘度)的迪优坦多糖。已证实这种迪优坦多糖在油田应用和水泥材料中作为增粘剂可能特别有用。本发明还包括产生这种改进迪优坦多糖的创造性方法以及这种方法中产生改进迪优坦所需的新克隆基因。此外，本发明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇单孢菌菌株。

Description

高粘度迪优坦胶及其制备方法
本申请是申请日为2006年10月31日，申请号为“200680048801.9”，发明名称为“高粘度迪优坦胶及其制备方法”的申请的分案申请。
发明领域
本发明描述了与重复单元类型相同的以前生产的多糖相比，显示粘度特性增加的迪优坦(diutan)多糖。通过产生鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas sp.)ATCC 53159的衍生物来制备这种改进的迪优坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪优坦多糖的生物合成基因的多拷贝广谱宿主性质粒。所述质粒能在宿主鞘氨醇单孢菌菌株内产生用于这种多糖合成的多个基因拷贝。以此方式提供的方法不仅能提高靶迪优坦多糖的产量，还能产生物理特性改进(上述较高的粘度)的迪优坦多糖。现已证实这种迪优坦多糖在油田应用和水泥材料中作为增粘剂(viscosifier)可能特别有用。本发明还包括产生这种改进迪优坦多糖的创造性方法以及这种方法中产生改进迪优坦所需的新克隆基因。此外，本发明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇单孢菌菌株。
发明背景
多糖或树胶一般用于使水溶液增稠或使之成为凝胶状，通常分为两类：增稠剂和胶凝剂。典型的增稠剂包括：淀粉、黄原胶、迪优坦胶、文莱胶(welan gum)、瓜尔胶、羧甲基纤维素、海藻酸盐、甲基纤维素、刺梧桐树胶和黄蓍胶。常见的胶凝剂包括明胶、结冷胶、淀粉、海藻酸盐、果胶、角叉菜聚糖、琼脂和甲基纤维素。
多年来，某些多糖，或者更具体地说，生物胶，例如黄原胶、结冷胶、文莱胶和迪优坦胶通过微生物发酵生产。这些生物胶表现出不同特征，例如使其应用于许多不同领域的粘度改进能力。用于食品，例如糖果凝胶(confectionery jelly)、果酱和果冻、甜食凝胶、糖霜和乳制品，以及微生物培养基组分的胶凝剂属于该清单。此外，可将增稠剂用于许多最终应用领域以改进靶液体的粘度。特别感兴趣的是这些胶能改变地下和/或水下石油液体粘度，从而有助于收集这些液体，虽然可能有许多其它不同的最终应用存在(例如，包括水泥生产)。已从不同的细菌来源产生了不同的生物胶，例如野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestris)的黄原胶、伊乐藻鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas elodea)的结冷胶、鞘氨醇单孢菌ATCC 31555的文莱胶和鞘氨醇单孢菌ATCC 53159的迪优坦胶(S-657)。在过去已对这些菌株进行了遗传修饰以求明显改变通过上述发酵方法产生的胶物质。这种修饰能导致诸如除去酰基等变化，从而产生表现出不同物理特性的不同胶物质。这些遗传修饰的类型一般是：通过改变宿主生物内的基因表达来最终改变靶生物胶的组成，或者通过引入单独显示基因扩增的质粒来提高靶生物胶产量(例如授予Pollock等的美国专利号5,854,034，5,985,623和6,284,516以及授予Pollock个人的美国专利号6,709,845)。
迪优坦胶(也称为杂多糖(heterpolysaccharide)S-657)通过发酵菌株鞘氨醇单孢菌ATCC 53159制备，其在水溶液中表现出增稠、助悬和稳定特性。迪优坦通常表现为六聚体重复单元，所述重复单元由主链中的4个糖(葡萄糖-葡糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖)以及与所述葡萄糖残基之一相连的两鼠李糖残基的侧链构成。迪优坦胶的结构细节见Chowdhury，T.A.，B.Lindberg，U.Lindquist和J.Baird，Carbohydrate Research 164(1987)117-122。迪优坦显示每个重复单元具有两个乙酰基取代基，参见Diltz等，Carbohydrate Research331(2001)265-270。两篇参考文献均通过引用全文纳入本文。制备迪优坦胶的细节可参见通过引用全文纳入本文的美国专利号5,175,278。可采用标准发酵技术，例如利用碳水化合物源(非限制性例子如葡萄糖、麦芽糖等)、氮源和其它盐类从鞘氨醇单孢菌菌株制备迪优坦。
某些工业需要各种野生型迪优坦生物胶赋予的物理特征，特别是其粘度改进特性和/或保水特性。不幸的是，已证实产生迪优坦的成本效率低。此外，目前这些成本问题妨碍了迪优坦的广泛应用，因为这种生物胶所表现出的粘度不足以替代其它更便宜但有效的生物胶(例如，黄原胶)。因此，需要提供至少能以较低成本生产这种有效迪优坦的方法，和/或提供生产物理特性显示明显改进的迪优坦型生物胶的方式。目前，对任何类型的相关结冷胶类多糖(sphingan)生产的唯一描述(对于迪优坦未证明有任何特异性)涉及较高的产率(见上述Pollock等的专利)。现在还没有任何方式讨论或合理地提出能提供某种方法来生产分子量较高的迪优坦胶，借助这种生产方法，所述迪优坦胶在粘度测量值会体现出改善。
发明简述
现已知道，在宿主鞘氨醇单孢菌微生物内扩增迪优坦生物合成所用的某些新分离的DNA序列不仅能提高迪优坦胶产量，还产生了表现出粘度特性增加的迪优坦胶。因此，这种新的DNA序列(通过任何熟知的方法，例如但不限于利用质粒引入宿主微生物内)提供了迪优坦合成方法所寻求的所需结果。采用质粒扩增这些基因的这种方法的明显优点在于将这种分离DNA序列掺入迪优坦合成过程较为简单。另一优点是能产生这种粘度特性较高的靶迪优坦胶，同时还可能提高发酵生产效率(如果需要的话)。
因此，本发明包括在许多不同的粘度测试中表现出改进的迪优坦胶。其中：i)固有粘度高于150，优选高于155，更优选高于160dL/g；ii)海水3rpm粘度高于35，优选高于37，更优选高于40，最优选高于42表盘读数(dial reading)；iii)海水0.3rpm粘度高于35,000，优选高于39,000，更优选高于40,000，最优选高于41,000厘泊(cP)；PEG低剪切率粘度高于3500，优选高于3700，更优选高于3900，最优选高于4000cP。如以上术语所定义的，本发明还包括产生这种迪优坦胶的方法，所述方法通过将特定的基因簇引入宿主鞘氨醇微生物并发酵所述微生物以产生迪优坦胶。此外，本发明包括特定的DNA序列和任何载体(例如质粒)来提供基因的多个拷贝或利用更强的启动子来提高这些基因表达，等等。另外，还包括遗传修饰的鞘氨醇菌株，所述菌株含有这种独特的分离DNA序列所确定的迪优坦生物合成基因的多个拷贝。
本发明的另一方面提供了一种生产迪优坦胶的方法，所述方法包括：
将至少一种迪优坦生物合成酶的编码序列引入产生迪优坦的鞘氨醇单孢菌宿主微生物；
在发酵条件下培养该宿主微生物，从而使得该宿主微生物产生至少显示以下特征之一的迪优坦胶：
a)固有粘度大于150dL/G；
b)海水3rpm粘度高于35表盘读数；
c)海水0.3rpm粘度高于35,000厘泊；和
d)聚乙二醇分散剂存在时的低剪切率粘度高于3500厘泊。
发现这种独特的分离DNA序列需要至少一种迪优坦生物合成酶，即DpsG聚合酶。在另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。在还有另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和鼠李糖基转移酶IV；β-1,4-葡糖醛酸基转移酶II；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I；和葡糖基转移酶III。在还有另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和多糖输出蛋白DpsD、DpsC和DpsE。在还有另一可能的实施方式中，这种diutab生物合成酶包括鼠李糖基转移酶IV；β-1,4-葡糖醛酸基转移酶II；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I；葡糖基转移酶III；葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。本发明方法和属于本发明产物的迪优坦生物合成酶一般选自：聚合酶；裂合酶；鼠李糖基转移酶IV；β-1,4-葡糖醛酸基转移酶II；葡糖基转移酶III；多糖输出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I；葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶；dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶和它们的组合。本发明还包括分离的核酸分子(除靶染色体上可能存在的DNA外)，其编码如以下SEQ ID NO所示的至少一种迪优坦生物合成酶：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43；或编码与以下SEQ ID NO有至少95％相同的酶5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。
在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶。
在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和多糖输出蛋白。
在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和鼠李糖基转移酶IV；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I；β-1,4-葡糖醛酸基转移酶II；和葡糖基转移酶III。
在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。
在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶；裂合酶；鼠李糖基转移酶IV；β-1,4-葡糖醛酸基转移酶II；葡糖基转移酶III；多糖输出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I；葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。
在某些实施方案中，所述核酸分子可包含SEQ ID NO:1所示核酸序列。
本发明的又一方面提供了一种制备结冷胶类多糖胶的方法，所述结冷胶类多糖的平均聚合物长度较长，所述方法包括：
将至少一种结冷胶类多糖聚合酶的编码序列引入产生结冷胶类多糖的鞘氨醇单孢菌宿主微生物；
在发酵条件下培养该宿主微生物，从而使得该宿主微生物产生的结冷胶类多糖胶的平均聚合物长度长于引入所述编码序列前该鞘氨醇微生物产生的。
因此，本发明方法(以及由此制备的产品)涉及结冷胶类多糖胶，特别是迪优坦型，包括但不限于：S88、S60和S657。
如上所述，本发明是发展的顶点，并且实现了将多拷贝的特定DNA序列引入某些鞘氨醇单孢菌菌株增加高粘度迪优坦多糖的生物合成产量。与非工程改造的细菌相比，含有用于提高产量的这些基因的工程改造细菌产生的迪优坦多糖量明显较高，同时产生了上述的高粘度特性。
按照本发明，可通过本领域熟知的技术分离、回收和克隆引入宿主微生物中的DNA序列(采取任何熟知的形式，例如非限制性的例子还是质粒)，从而产生上述产量增加和粘度增加的特性(不想依赖于任何具体的科学理论，但据信这是经由分子量范围特性增加所致)。然后，将多拷贝的所述DNA递送入鞘氨醇单孢菌属细菌中(借助质粒，其它已知的方式)或借助合适的例如更强启动子提高基因表达。插入靶细菌后，可通过发酵该工程改造细菌并根据所产生的数量和质量来比较产量从而测定迪优坦的生产情况。通过比较本发明方法所得的迪优坦产量和野生型迪优坦生产菌株(ATCC 53159)的可同时测定产量增加和粘度增加(量)。
发明详述
与本发明有关的以下术语用于通篇说明书中，其意义如下所示：
通篇说明书利用术语“鞘氨醇单孢菌”指鞘氨醇单孢菌属的革兰氏阴性细菌菌株。
通篇说明书利用术语“提高的生产者”或“提高的生产”描述含有多拷贝DNA序列的工程改造细菌，所述DNA序列分离自与野生型细菌的相同菌株相比产生显著较高(以重量计至少高约5％)迪优坦多糖的相同菌株。
利用术语“分离的”描述从某微生物中取出并经历至少一定程度纯化，即一步或多步纯化步骤的DNA，可利用限制性酶切割所述DNA并将其克隆或插入质粒载体，或者插入或掺入细菌中。
利用术语“序列”描述根据其核苷酸单位鉴定的具体DNA区段。通篇说明书利用术语“插入”描述将从生产迪优坦的鞘氨醇单孢菌菌株的染色体DNA分离的DNA区段转移入鞘氨醇单孢菌菌株的过程和结果(非限制性例子是借助质粒)。首先可采用本领域熟知的技术将这种分离的DNA引入(依然是非限制性的可能性)所需质粒(此处是pLAFR3)，然后通过，例如接合或迁移将其转移入受者鞘氨醇单孢菌细菌。插入受者鞘氨醇单孢菌细菌后，含有相关DNA序列的质粒在受者细胞中复制，从而获得产生高粘度(仍然相信是高分子量范围的)迪优坦多糖所需的DNA区段的若干(至少两个，一般是4-10个)拷贝。采用接合或迁移将所述质粒载体转移入受者细菌通常是有效的。还可利用纯化的DNA以电穿孔或化学转化感受态细胞。可利用其它载体或噬菌体将DNA转移入宿主细胞中。在产生迪优坦的受者鞘氨醇单孢菌中，无需使DNA区段维持在质粒(或其它熟知的递送载体)上。将其它的数拷贝DNA区段引入细菌染色体是惯常的，从而可通过复制细菌DNA的相同机制复制各代区段。或者，可利用更强的启动子元件提高基因表达。
利用术语“基因扩增”表示例如通过将靶基因克隆到多拷贝质粒上(例如，4-10个拷贝)或将基因的多个拷贝(例如，4-10个)插入细菌基因组中来增加基因的拷贝数，或者表示通过修饰启动子元件来增加基因表达。这些方法和其它方法均可增加所编码蛋白质的数量。
通篇说明书利用术语“生物合成”描述通过鞘氨醇单孢菌细菌生物学产生或合成迪优坦。通过许多细菌酶所调控的一系列步骤从单个碳水化合物单元合成迪优坦多糖。
可以任何选择的形式(例如仍然优选质粒形式，但不一定)掺入受者细菌的相关DNA序列编码已知对迪优坦多糖的产量增加和分子量增加有益或必需的遗传信息。此外，不依赖于具体的科学理论，虽然据信本发明具体DNA序列(例如质粒pS8中的)能诱导，而不只是提高产量，但还增加了在迪优坦本身的各聚合物内聚合的重复单元数量。因此，据信重复单元的这种增加使得迪优坦胶提供的粘度特性出乎意料地高。由于检测到固有粘度增加，因而可假定分子量增加，二者有幂定律关系。因此，已知线形聚合物(如迪优坦胶)的固有粘度实际上以那种关系与分子量成比例。
采用标准技术和方法分离相关DNA序列，所述DNA序列是本发明方法的基础并产生了粘度增加的迪优坦多糖。因此，可采用标准方法培养产生迪优坦的鞘氨醇单孢菌菌株，进而从中产生这些序列。然后可通过，例如先将细菌细胞离心并重悬，再经纯化柱洗脱DNA进行DNA提取。纯化完成后，可用限制性核酸内切酶消化分离的DNA，克隆入所需质粒或其它递送载体中，然后转移至受者菌株。可采用本领域已知的其它技术而不作具体限定。
在本发明中，DNA的克隆取决于本领域标准的常规技术和方法。应该注意，可采用任何方法克隆本发明DNA区段，本发明不限于，例如利用质粒克隆载体。例如，可通过插入噬菌体载体来克隆DNA片段。
然后可利用质粒或其它递送载体将克隆的DNA序列引入鞘氨醇单孢菌菌株。然后可通过发酵，利用遗传修饰的鞘氨醇单孢菌菌株产生迪优坦。适于发酵的培养基基本上是水性培养基，其通常含有碳源，例如包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽糖糊精在内的碳水化合物；氮源，例如无机铵，有机硝酸酯，有机氨基酸或蛋白物质，如水解酵母菌、大豆粉或酪蛋白、蒸馏酒厂废液浓缩物或玉米浆；和无机盐。各种发酵培养基支持产生本发明迪优坦。
发酵肉汤中可含有各种含量的碳水化合物，但以重量计通常在发酵培养基的约1-10％之间(优选2-8％)。可先加入碳水化合物，再发酵，或者可在发酵期间加入。以重量计，水性培养基中的氮含量在约0.01％-约0.4％。可使用一种碳源或氮源，也可使用这些碳氮源的混合物。发酵鞘氨醇单孢菌细菌可用的无机盐是含有钠、钾、铵、硝酸根、钙、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根和相似离子的盐类。还优选包含痕量金属，例如镁、锰、钴、铁、锌、铜、钼、碘化物和硼酸盐。
发酵可在约25℃-40℃之间，优选约27℃-35℃的温度范围进行。可通过体积放大的标准方法制备接种物，包括摇瓶培养和小规模的深层搅拌发酵。制备接种物的培养基可以与生产培养基相同，或者可以是本领域熟知的几种标准培养基中的任一种，例如Luria肉汤或YM培养基。可采用多个种子阶段(seed stage)以获得所需的接种体积。典型的接种体积范围是最终发酵总体积的约0.5％-约10％。
发酵容器可装有搅拌器来搅拌内含物。该容器还可装有自动pH和气泡控制装置。可将生产培养基加入容器中，通过加热来适当灭菌。或者，可先将碳水化合物或碳源单独灭菌再加入容器中。可将经培养的种子培养液加入冷却的培养基中(通常在约27℃-约35℃的优选发酵温度)，搅拌发酵培养液约48-约110小时，从而产生高粘度的肉汤。通过用醇，一般是异丙醇沉淀等标准方法从肉汤中回收迪优坦多糖。
本发明的优选实施方式
提供以下实施例是为说明本发明。实施例的描述不应误解为以任何方式限制了本发明的范围。
DNA序列分离/质粒产生
为首先分离和测定上述创造性结果的合适序列，如下所示构建ATCC53159微生物的基因文库：分离鞘氨醇单孢菌ATCC 53159的染色体DNA，用Sau3AI限制性核酸内切酶部分消化。用琼脂糖凝胶纯化15-50kb范围内的DNA片段，将这些片段连接入BamHI消化的粘粒克隆载体pLAFR3(根据Staskawicz等，“分子表征丁香假单胞菌大豆致病变种群0和群1的克隆无毒力基因”(Molecular characterization of cloned avirulence genes from race0and race 1of Pseudomonas syrinae pv.Glycinea)，J.Bacteriology.1987.169:5789-94)，该载体分离自大肠杆菌(Eschericia coli)菌株JZ279(Harding等，“在野油菜黄单孢菌中生物合成黄原胶必需的基因簇的遗传学和物理分析”(Genetic and physicalanalysis of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesis inXanthomonas campestris)，J.Bacteriology.1987.169:2854-61)。将连接反应(产物)包装入λ噬菌体颗粒(利用吉格帕克III金包装提取物(Gigapack III Gold packagingextract)，斯特拉基因公司(Stratagene)，拉霍亚，加利福尼亚州)，并转染入文库效率(Library Efficiency)大肠杆菌DH5αMCR细胞中(生命技术公司(Life Technologies)，罗克维尔，马里兰州)。合并约10,000个四环素耐受性菌落以形成基因文库。然后分离该文库的各序列。该实施例所进行的这项工作包括从鞘氨醇单孢菌ATCC 53159微生物分离用于多糖生物合成的特定基因。
通过与多糖合成缺陷型突变体，特别是第一个步骤，即葡糖基转移酶I被阻断的那些突变体互补来鉴定用于多糖生物合成的这些基因。由于最初未获得ATCC 53159的转移酶I缺陷型突变体，利用与伊乐藻鞘氨醇单孢菌和野油菜黄单孢菌的转移酶I缺陷型突变体互补来鉴定用于迪优坦多糖生物合成的基因。可利用提供IncP转移功能的辅助质粒，通过三-亲本接合(tri-parental conjugation)将质粒pLAFR3从其大肠杆菌宿主转移至其它革兰氏阴性细菌(根据Ditta等，“革兰氏阴性细菌的广谱宿主性DNA克隆系统：构建苜蓿根瘤菌的基因库”(Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria:construction of a gene bank of Rhizobium meliloti)，Proc.Natl.Acad.Sci.1980.77:7347-51.)。大肠杆菌中每个染色体的RK2型质粒拷贝数估计有5-7个(Figurski等，“利用体外构建的杂交质粒中的Inc P-I质粒RK2抑制ColE1复制特性”(Suppression of CoIEl replication properties by the Inc P-I plasmid RK2inhybrid plasmids constructed in vitro)，J.MoI.Biol.1979 133:295-318.)。
通过三亲本接合将大肠杆菌中的ATCC 53159染色体DNA的基因文库转移入伊乐藻鞘氨醇单孢菌ATCC 31461的非黏液突变体(nonmucoid mutant)(GPS2)，选择四环素和氯霉素耐受性。所用的辅助质粒是pRK2013(大肠杆菌菌株JZ279中)，其含有窄宿主性复制起点，但显示出迁移pLAFR3所需的反式作用功能(trans acting function)。质粒pRK2013在鞘氨醇单孢菌菌株中不复制。伊乐藻鞘氨醇单孢菌ATCC 31461产生多糖结冷胶。结冷胶和迪优坦多糖均具有由[→4)-α-L-鼠李糖-(1→3)-β-D-葡萄糖-(l→4)-β-D-葡糖醛酸-(l→4)-β-D-葡萄糖-(1→]构成的相同四糖重复单元。然而，迪优坦还包含与所述葡萄糖残基之一相连的两个鼠李糖分子构成的侧链，该侧链经乙酰基修饰，而结冷胶不具有侧链糖并经乙酰基和甘油基修饰。突变型GPS2在多糖生物合成的第一步中有缺陷，即通过葡糖基转移酶I将葡萄糖-1-磷酸从UDP-D-葡萄糖转移至细菌异戊二烯基(bactoprenyl)磷酸脂质载体。以非黏液菌落为背景，从四环素选择平板分离产生多糖(黏液)的菌落。推测恢复产生多糖的克隆包含编码葡糖基转移酶I的ATCC 53159基因加上约20-25kb毗连DNA。从8个黏液GPS2转接合子分离质粒DNA，通过电穿孔转移至大肠杆菌菌株DH5α(生命技术公司)。从大肠杆菌分离质粒以而获得用于限制性核酸内切酶HindIII/EcoRI(切割多接头中BamHI限制性核酸内切酶位点的任一侧)进行双重消化的足够DNA，进而从载体上切下插入的DNA。通过凝胶电泳测定克隆中插入DNA的大小。通过从侧接载体的BamHI位点的质粒序列的特异性引物开始测序来测定几种质粒的终序列。利用BLASTX比较计算机数据库中的序列来分析各序列。类似地，通过三亲本接合将ATCC53159基因文库转移入转移酶I缺陷的利福平耐药性非黏液野油菜黄单孢菌突变体(CXC109)中(例如，上述Harding等的参考文献所述)，选择四环素和利福平耐药性。野油菜黄单孢菌产生黄原胶多糖，转移酶I将葡萄糖-1-磷酸从UDP-D-葡萄糖转移至细菌异戊二烯基磷酸脂质载体也能启动其合成(Ielpi等，“在野油菜黄单孢菌中顺序装配和聚合黄原胶多糖的聚异戊烯醇连接的五糖重复单元”(Sequential assembly andpolymerization of the polyprenol-linked pentasaccharide repeating unit of thexanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris)，J.Bacteriology.1993.175:2490-500)。如上所述从黏液转接合子纯化质粒并如上所述测定末端序列。
德克萨斯州休斯顿市的拉克技术公司(Lark Technologies Inc.，Houston，TX)采用双链鸟枪测序对克隆在质粒pS8和pX6中的S657DNA进行了完全测序。分析了这些序列以鉴定用于迪优坦生物合成的基因。根据与数据库中其它基因，特别用于S-88结冷胶类多糖(例如，上述‘516Pollock等的专利所述的)、GeneBank登录号U51197和结冷胶(GenBankAY217008和AY220099)生物合成的公布基因的同源性指定基因功能。鉴定了编码主链中四种糖的转移酶的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因。用于多糖分泌的基因基于与生物合成其它多糖的基因的同源性。两种基因编码与参与蛋白质分泌的蛋白质同源的蛋白质。推测两种基因编码聚合酶和裂合酶。质粒pX6中的插入物含有17种基因，包括编码转移酶I(启动迪优坦合成的第一步)的基因dpsB，用于分泌的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因，但缺乏转移酶II、III和IV的基因，和聚合酶及裂合酶的推测基因。质粒pS8含有dps基因簇的20种基因，包括所有4种主链糖转移酶的基因，用于dTDP-鼠李糖合成的四种基因，用于多糖分泌的基因，包括聚合酶和连接酶的推测基因，但缺乏功能未知的基因，orf6和orf7。质粒pS6含有用于分泌和4种糖转移酶的基因，但不含用于dTDP-鼠李糖合成的所有基因或聚合酶的基因。质粒pX4只含有dps区域的一小部分，但包含Pollock等报道的用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因和编码转移酶I的基因，从而足以导致鞘氨醇菌株中多糖产量增加。
菌株产生
然后通过上述的三亲本接合将上述四种质粒引入鞘氨醇单孢菌ATCC53159号菌株中，从而形成新的S657工程改造菌株(S657/pS8、S657/pS6、S657/pX6和S657/pX4)。然后如上所述进行发酵，从而产生了下述的生物胶物质。所有4种质粒对迪优坦生产量均产生有益作用；然而，pS8质粒还出乎意料地极大提高了迪优坦粘度并增加了其分子量。提供了pS8的DNA序列(26278bp)(1号DNA序列)，下表1以表格的形式列出了编码的基因。质粒pS8中的插入物DNA包含基因DpsG到rmlD和基因dpsS和orf7的一部分。
以下基因列表基本上是质粒pS8中插入物的DNA序列所代表基因的清单。
表1
ps8质粒插入物上的基因
*第一框内密码子，起始密码子不存在
迪优坦产生
在Applikon 20L发酵罐中用相同的液体培养基进行三次发酵，同时搅拌并通气，以测定含质粒的工程改造鞘氨醇单孢菌S657菌株相对于不含质粒的S657野生型菌株的dioutan产量。对于含质粒的菌株，在整个发酵过程中加入5mg/L的抗生素四环素以确保质粒的维持。视需要加入KOH以控制pH。采用两种子阶段，接种转移量为1％-6％。用于发酵的培养基含有玉米糖浆作为碳水化合物来源、可同化的氮源和盐。本领域熟知可用于发酵的营养物，包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽糊精；氮源，例如无机氮，如铵或硝酸盐，有机氮，如氨基酸、水解酵母提取物、大豆蛋白或玉米浆；和含有，例如氯、磷酸根、磷酸根、钙、铜、铁、镁、钾、钠或锌的其它盐。
测定肉汤的粘度和沉淀的纤维来检测所得的迪优坦产量。利用布氏粘度计，4号纺锤，60rpm检测发酵肉汤的粘度，结果见表2。发酵结束时，通过熟知的引入葡萄糖淀粉酶的方法处理肉汤来水解任何残留的玉米糖浆寡糖。然后用两体积的异丙醇沉淀肉汤试样中产生的迪优坦胶。用过滤器收集纤维，干燥。在表2中，术语DWY表示水解剩余的玉米糖浆寡糖后可沉淀生物胶的总干重得率。
携带迪优坦生物合成基因额外拷贝的质粒pX4、pX6、pS6或pS8的所得物质产率明显较高。然而，与干重得率增加相比，pS8质粒的肉汤粘度出乎意料地大大增加，表明除增加迪优坦产量外的某些因素影响了粘度。
表2
发酵含质粒的菌株
肉汤粘度
上述四种质粒的任一种所得物质的产量明显较高，而pS8和pS6质粒的肉汤粘度出乎意料地高，因此还表明产物质量高。然后测定了所得迪优坦胶产物的质量，即粘度。
应用测试中迪优坦的流变学
然后分析了这些迪优坦胶样品在两个不同领域的的潜在有益用途：用于原油回收的油田添加剂和用于保水性和快速配制的水泥添加剂。
油田工业依赖于称为“海水粘度”(SWV)的测试来估计原油回收用胶的可接受性能。这种测试基本上是胶增加海水粘度(例如，从海床重复回收)的有效性指标。
通常接受根据测试海水制剂的粘度改进作用来预测得到的胶作为原油回收目的的合适粘度调节剂的可行性。将419.53克海盐(ASTM D-1141-52)混合在9800克去离子水中来制备这种“合成海水”制剂。对于海水粘度测试，将0.86克样品胶加入307.0g合成海水，用泛氏混合机(Fann Multimixer)(9B5型，零件号N5020)以约11,500rpm混合35分钟。35分钟结束时，先将溶液冷却至约26℃，再检测粘度。对于3-rpm读数，将样品置于泛氏样品台(泛氏，35A型；扭簧MOC 34/35F0.2b；摆锤(Bob)B1；转子R1)，将电动机调至低速并将变速器设置在中间位置从而将转速设置为3rpm。然后使读数稳定，从仪表读出剪切应力值，记录为SWV 3rpm表盘读数(DR)。对于0.3-rpm读数，利用布氏粘度计(布氏LV DV-II或DV-II粘度计，装有LV-2C纺锤)检测粘度。纺锤的速度设置为0.3rpm，先使纺锤旋转至少6分钟再将粘度记录为SWV-0.3rpm读数并以厘泊(cP)表示。对于水泥应用，PEG LSRV测试(如下所述，利用聚乙二醇作为分散剂的低剪切率粘度)为该工业提供了粘度添加剂的性能效力指标。这种测试检测了0.25％的生物胶标准自来水(STW)溶液的粘度。将10.0克NaCl和1.47克CaCl2·2H2O加入10升去离子水中来制备STW。对于粘度检测，将0.75克生物胶加入400-mL烧杯中的4.5克聚乙二醇200(CAS 25322-68-3)中，彻底分散。然后，将299克STW加入该烧杯，利用低调(low-pitched)搅拌桨型搅拌器以800±20rpm混合约4小时。混合4小时后，将烧杯置于25℃水浴中，静置约30分钟。然后，利用装有2.5+扭矩弹簧的布氏LV粘度计(或相当的仪器，例如DEV 2.5+型)，以3rpm，使用LV 1纺锤检测粘度，先使纺锤旋转3分钟再检测，以厘泊(cP)表示。
以此方式测试以上产生的迪优坦样品，结果如下所示：
表3
含质粒菌株的迪优坦的流变学
SWV＝海水中的粘度
LSRV＝低剪切率粘度
出乎意料的是，一些含质粒的工程改造菌株产生的本发明迪优坦胶表现出粘度增加有限。然而，最出乎意料的是，pS8菌株的3rpm SWV粘度增加是80％，而对pX6菌株所作的相同分析只比野生型结果高9.6％。质粒pS6和pX4没有明显增加。类似地，较低的SWV rpm测试显示pS8型高于野生型51.5％，而pX6只高2％。最后，聚乙二醇LSRV测试显示与野生型胶相比，pS8造成粘度增加超过77％，而pX6迪优坦增加不到16％，pX4增加7.2％，质粒pS6没有显著增加。这些情况中极其出乎意料的结果再次显示通过在pS8质粒中利用示例的所需基因序列，例如将这种序列引入产迪优坦的靶细菌中的一种方式，(粘度的)极大改善与迪优坦胶产量一致。
因此，通过引入pS8产生的本发明迪优坦显示惊人地提高了所有三种计数的粘度检测值，特别是与野生型和pX6质粒产生的种类相比。因此，估计这种新的迪优坦能在典型的油田条件和水泥应用中起到非常好的作用。
流变学改善的基础解释
以上实施例显示S67/pS8菌株的迪优坦的流变学参数显著增加。因此，海水和PEG低剪切率粘度测量值的这种实质性增加不能单单归因于产量增加，因为pX6菌株也显示了相同的产率结果(如果不大于的话)。实际上，在表2所示的以上实施例中，S657/pS8菌株的干重产率(醇可沉淀的物质)增加了8％，而流变学参数增加得更为显著(52-80％)。进行了基础研究来解释为何菌株S657/pS8获得的流变学改善胜过野生型菌株。
固有粘度是聚合物科学中推测大分子分子量的熟知技术(C.Tanford，1961.《大分子的物理化学》(Physical Chemistry of Macromolecules)约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons，纽约)。通过绘制比浓粘度(粘度对浓度标准化)与溶液浓度的关系图，并将数据的线性回归外推至0浓度可获得固有粘度(图中的y-截距)。如下表所示，所得的胶出乎意料地显示固有粘度增加。
评估了五种迪优坦样品的固有粘度、中性糖并作了有机酸分析，其中两种来自野生型菌株(对照1，对照2)，三种来自S657/pS8菌株(样品1、样品2、样品3)。通过以下步骤纯化这些样品：醇沉淀、再水合、用次氯酸盐处理、用葡萄糖淀粉酶处理、用溶菌酶处理并最终用蛋白酶处理(按照该顺序)。然后按照4:1的CBM:肉汤之比回收迪优坦，干燥并研磨。CBM是以重量计包含约82％异丙醇的异丙醇/水共沸混合物。
如下所示测试各样品的水分含量：通常采用Mettler HB 43卤素水分平衡(halogen moisture balance)测试两份0.7克样品试样。然后求出两次试验结果的平均值，利用这些结果校正水分。
获得水分数据后，根据校正的水分用0.01M NaCl制备0.2％的胶溶液。对于这些试验，制备总共200克0.2％溶液。在分析天平上称取最接近千分之十的胶，将其加入最接近千分之一称取的水中。在400ml高型烧杯(tall form beaker)中用2.5英寸直径的搅拌桨混合器以1000rpm搅拌各样品两小时。
最初的水合后，用0.01M NaCl将各样品稀释至0.02％。称取20克所述0.2％溶液加入400ml烧杯中，然后加入180ml该稀释剂实现所述稀释。将稀释的样品再混合30分钟。最后从该样品制备用于测定固有粘度的最终稀释液。评估以下浓度的各迪优坦样品：0.004％、0.008％、0.010％和0.012％。
利用VE系统检测粘度。先用水将Vilastic校正到误差低于2.0％，再进行检测。采用2Hz计时器程序、应力为1和剪切率约12 1/秒检测各样品，所有检测均在23℃进行。各样品检测5次并求出平均值。然后，利用平均粘度数据计算固有粘度。以下表4提供了这些试验的最终结果。
表4
根据固有粘度计算值比较迪优坦
这些结果表明S657/pS8菌株一致地产生固有粘度显著较高的迪优坦；事实上，本发明菌株的平均比浓粘度是165.2，而对照是140.7，检测的固体水平均相似。这些结果表明S657/pS8产生的迪优坦的分子量高于野生型对照。
为测定S657/pS8的较高粘度迪优坦胶是否与野生型菌株的迪优坦组成相同，通过测试中性糖和有机酸来确定组成。中性糖分析利用固有粘度检测所用的纯化样品。用三氟乙酸将各纯化样品的等份试样水解(100℃/约18小时)成组分糖。通过高效阴离子交换层析，利用脉冲电流计检测来定量测定水解产物中性糖。通过高效离子交换层析，利用化学抑制电导率检测来定量测定水解产物有机酸。表5总结了中性糖分析的结果。如其所示，S657/pS8菌株的中性糖分布与S657野生型菌株的中性糖分布几乎相同。虽然两种结果不同于理论值，但这些结果表明利用pS8产生的迪优坦胶的重复单元的结构与野生型产生的相同，pS8物质导致粘度有任何增加是因为链较长，即分子量较高。
表5
pS8和野生型(对照)迪优坦菌株的中性糖和有机酸分析
菌株 鼠李糖％ 葡萄糖％ 乙酸盐％
样品1 S657/pS8 32 19 8.9
样品2 S657/pS8 32 19 8.2
样品3 S657/pS8 32 17 8.6
对照1 S657野生型 30 18 8.6
对照1 S657野生型 33 20 8.7
平均值 S657/pS8 32 18.3 8.6
平均值 S657野生型 31.5 19 8.65
理论值 --- 46 30 8
因此，S657/pS8工程改造菌株所产生迪优坦的海水粘度和PEG低剪切率粘度的极大增加是因为迪优坦分子的分子量或长度增加，即每个分子中重复单元更多，而不是因为其组成改变，因此不是因为重复结构本身的改变。流变学(参数)的这种改善也不是单纯因为迪优坦产量增加。虽然对克隆有迪优坦生物合成基因簇不同部分的4种质粒pS6、pS8、pX4和pX6的评估显示生产量均有所增加，但只有质粒pS8显示回收的迪优坦产物的流变学参数有出乎意料且非常高的增加。
对克隆在测试质粒中的迪优坦生物合成基因进行比较提示，最有可能导致分子量增加的基因是基因dpsG，因为该基因存在于pS8中而不存在于其它质粒中。基因dpsG编码与参与多糖合成的其它膜蛋白同源性强的疏水性膜蛋白。该蛋白质的一部分与催化重复单元连接以形成高分子量多糖的聚合酶蛋白具有同源性。已有人推测S60中的同源基因gelG起到结冷胶合成聚合酶的功能(Harding，N.E.等2004.“组织伊乐藻鞘氨醇单孢菌ATCC31461中结冷胶多糖生物合成所需的基因”(Organization of genes required for gellanpolysaccharide biosynthesis in Sphingomonas elodea ATCC31461)J.Ind.Microbiol.Biotech.31:70-82。Sa-Correia，I.等2002.“在少动鞘氨醇单孢菌ATCC31461中生物合成结冷胶：基因、酶和表多糖产生工程改造”(Gellan gum biosynthesis inSphingomonas paucimobilis ATCC 31461:Genes,enzymes and exopolysaccharideproduction engineering)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.29:170-176)。还从产生多糖S88和S7的鞘氨醇单孢菌菌株ATCC 31554和ATCC 21423分离了dpsG的同源物(Pollock等，美国专利号5,854,034，5,985,623和6,284,516；Pollock，T.J.美国专利号6,709,845)。因此，聚合酶基因的额外拷贝很可能对迪优坦分子的分子长度增加有影响。也不能排除dpsG可能需要与迪优坦生物合成基因簇中的其它基因组合以实现观察到的粘度增加。可能的候选对象是编码糖转移酶I、II、III和IV的基因dpsB、dpsL、dpsK和dpsQ，特别是编码将重复单元的第一个糖加入脂质载体的转移酶I的基因dpsB。其它重要的基因可以是dpsD、dpsC和dpsE，它们与基因gumB和gumC同源，而后二者在多拷贝质粒上扩增时显示能增加黄原胶分子量。实现粘度极大增加可能需要克隆在质粒pS8中所有的基因。
虽然联系某些优选实施方式和实践描述和揭示了本发明，但绝非要将本发明局限于那些具体的实施方式，而应涵盖所附权利要求书及其等价方式的范围所限定的结构等价物和所有其它的实施方式及改进。
保藏
根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，以下细菌菌株于2005年10月21日由美国模式培养物保藏所(弗吉尼亚州，马纳萨斯，大学大道10801，20110)的专利保藏部门(Patent Depository)保藏：
含质粒pS8的鞘氨醇单孢菌菌株S657。

Claims (16)

1.一种迪优坦胶，其显示固有粘度高于150deciL/g，其中所述固有粘度的测量使用VE系统进行，并在测量之前用水将Vilastic校正到误差低于2.0％，并且所述测量如下进行：
均在恒定温度23℃下，采用2Hz计时器程序、应力为1和剪切率约121/秒测量迪优坦胶样品；
对每个样品测量5次并对5个测量值求平均值；以及
利用平均粘度数据计算固有粘度，所述固有粘度是通过绘制比浓粘度与溶液浓度的关系图，并将数据的线性回归外推至0浓度获得的，
其中所述迪优坦胶包含具有比由野生型S657菌株产生的迪优坦分子每分子更多重复单元的迪优坦分子，其中增加的重复单元导致的增加的固有粘度是由于dpsG基因的过表达。
2.如权利要求1所述的迪优坦胶，其显示固有粘度高于155deciL/g多至170.7deciL/g。
3.如权利要求2所述的迪优坦胶，其显示固有粘度高于160deciL/g多至170.7deciL/g。
4.一种迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于35表盘读数多至47表盘读数，其中所述粘度如下测量：
将0.86克迪优坦胶样品加入307.0g合成海水并用泛氏混合机以约11,500rpm混合35分钟，其中所述合成海水通过将419.53克海盐混合在9800克去离子水中来制备；
在35分钟结束时，将溶液冷却至约26℃，再检测粘度；
将所述溶液置于泛氏样品台并通过将电动机调至低速并将变速器设置在中间位置来将速度调整为3rpm；
使读数稳定；以及
从仪表读出剪切应力值并记录为SWV 3rpm表盘读数，
其中所述迪优坦胶包含具有比由野生型S657菌株产生的迪优坦分子每分子更多重复单元的迪优坦分子，其中增加的重复单元导致的增加的粘度是由于dpsG基因的过表达。
5.如权利要求4所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于37表盘读数多至47表盘读数。
6.如权利要求5所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于40表盘读数多至47表盘读数。
7.如权利要求6所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于42表盘读数多至47表盘读数。
8.一种迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于35,000cp多至41,500cp，其中所述粘度如下测量：
将0.86克迪优坦胶样品加入307.0g合成海水并用泛氏混合机以约11,500rpm混合35分钟，其中所述合成海水通过将419.53克海盐混合在9800克去离子水中制备；
在35分钟结束时，将溶液冷却至约26℃，再检测粘度；以及
用装有LV-2C纺锤的布氏LV DV-II或DV-II粘度计检测粘度，其中所述纺锤被设置为0.3rpm的速度，并先使所述纺锤旋转至少6分钟，再将所述粘度记录为SWV-0.3rpm读数并以cP表示,
其中所述迪优坦胶包含具有比由野生型S657菌株产生的迪优坦分子每分子更多重复单元的迪优坦分子，其中增加的重复单元导致的增加的粘度是由于dpsG基因的过表达。
9.如权利要求8所述的迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于38,000cp多至41,500cp。
10.如权利要求9所述的迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于39,000cp多至41,500cp。
11.如权利要求10所述的迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于40,000cp多至41,500cp。
12.如权利要求11所述的迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于41,000cp多至41,500cp。
13.一种迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于3500cp多至4980cp，其中所述粘度在0.25％的迪优坦胶标准自来水(STW)溶液中测量，其中所述STW通过将10.0克NaCl和1.47克CaCl2·2H2O加入10升去离子水制备；并且所述粘度测量如下进行：
将0.75克迪优坦胶加入400-mL烧杯中的4.5克聚乙二醇200中并彻底分散；
将299克STW加入所述烧杯，并利用低调搅拌桨型搅拌器以800±20rpm混合约4小时；
4小时混合时间后，将所述烧杯置于25℃水浴中并允许静置30分钟；以及
利用装备有2.5+扭矩弹簧的布氏LV粘度计使用LV 1纺锤在使所述纺锤以3rpm旋转3分钟后测量所述粘度并以cp表示,
其中所述迪优坦胶包含具有比由野生型S657菌株产生的迪优坦分子每分子更多重复单元的迪优坦分子，其中增加的重复单元导致的增加的粘度是由于dpsG基因的过表达。
14.如权利要求13所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于3700cp多至4980cp。
15.如权利要求14所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于3900cp多至4980cp。
16.如权利要求15所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于4000cp多至4980cp。
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