CN116854836A - 一种超高分子量黄原胶及其生产菌株和检测用分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超高分子量黄原胶及其生产菌株和检测用分子标记，属于微生物制品技术领域。本发明利用基因工程手段构建一种产黄原胶的工程菌株，经检测，其单糖组成和重复单元与普通黄原胶相同，但分子量大于2.0×107Da，高于文献报道黄原胶的分子量范围(0.2～2.0)×107Da，因此本发明生产的黄原胶为超高分子量黄原胶，扩宽了黄原胶的应用领域。同时本发明还提供了一种检测生产菌株或超高分子量黄原胶加工产品的分子标记，可快速鉴定超高分子量黄原胶合成菌株及其中轻度加工产品。
Description
技术领域
本发明属于微生物制品技术领域，具体涉及一种超高分子量黄原胶及其生产菌株和检测用分子标记。
背景技术
微生物胞外多糖是一类由微生物合成、性能多样、生物相容、可降解并可持续生产的生物胶，已经广泛应用于食品、日化、医药、环境保护、造纸、石油、建材等二十多个行业几百种用途，是一类与人们生活息息相关的生物技术产品。黄原胶是第二种实现工业化大生产的微生物胞外多糖，因其高粘度、高稳定性、耐盐耐高温等特性，在食品、化妆品、医药和石油工业等领域有着广泛的应用。
黄原胶是一种杂多糖，它是一种由五糖重复单元聚合而成的高分子聚合物。黄原胶的重复单元由两个葡萄糖、两个甘露糖和一个葡萄糖醛酸组成，摩尔比2：2：1，其中两个葡萄糖构成主链，与纤维素结构相似，由β-1-4-糖苷键连接。侧链结构为两个甘露糖中间间隔一个葡萄糖醛酸，其中葡萄糖醛酸分别以β-1-4-糖苷键和β-1-2-糖苷键与内侧和外侧的甘露糖相连接，这种三糖侧链通过β-1-3-糖苷键间隔连接在主链的葡萄糖上。黄原胶的分子质量一般为2×106～2×107Da，其高粘度、高稳定性、耐盐耐高温等特性与分子量密切相关，分子量越大，黄原胶的粘度越大，粘弹性越好，耐盐耐高温性能越强。普通型黄原胶粘度低，耐盐耐高温性能差限制着黄原胶在某些特殊领域的应用。
目前研究表明，黄原胶的分子量受发酵过程中的菌种、碳源、氮源、发酵温度、发酵方式和C/N比影响，现阶段改变黄原胶分子量主要是通过改变生产过程中的发酵条件，稳定性差，且分子量提高程度有限。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超高分子量黄原胶，单糖组成与普通黄原胶一致，但分子量远高于现有技术报道的普通型黄原胶的分子量范围。
本发明还提供了一种生产上述超高分子量黄原胶的菌株T-XM及其构建方法，将与黄原胶合成相关的基因插入到敲除三赞胶合成相关基因的NXdPE菌株中，获得能够合成超高分子量的黄原胶生产菌株T-XM。
本发明提供了一种超高分子量黄原胶，重复单元的结构与普通型黄原胶一致，分子量大于2.0×107Da。
优选的，所述普通型黄原胶的重复结构单元为由两个葡萄糖、两个甘露糖和一个葡萄糖醛酸组成，重复结构单元的结构为两个葡萄糖通过β-1-4-糖苷键连接形成主链，侧链结构为两个甘露糖中间间隔一个葡萄糖醛酸，其中葡萄糖醛酸分别以β-1-4-糖苷键和β-1-2-糖苷键与内侧和外侧的甘露糖相连
接，侧链结构通过β-1-3-糖苷键间隔连接在主链的葡萄糖上。
优选的，分子量为(2.91～14.3)×107Da。
本发明提供了一种生产所述超高分子量黄原胶的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)菌株T-XM，在鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP的基础上，用野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)中黄原胶合成基因簇替代部分三赞胶合成相关基因。
优选的，所述黄原胶合成基因簇是以野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)的DNA为模板，采用引物对扩增得到；
所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:2所示的反向引物。
优选的，所述黄原胶合成基因簇由所述菌株NXdP的P916启动子启动表达；
所述部分三赞胶合成相关基因包括orf0831基因和orf0533-orf0536基因。
优选的，所述菌株T-XM的保藏编号为CGMCC No.27299。
本发明提供了一种所述菌株T-XM的构建方法，包括以下步骤：
敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP中部分三赞胶合成相关基因，得到缺陷菌株NXdPE；
将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP中P916启动子片段和野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)来源的黄原胶合成基因簇克隆至所述缺陷菌株NXdPE，得到生产超高分子量黄原胶的工程菌株T-XM。
优选的，所述克隆至所述缺陷菌株NXdPE的方法，将P916启动子片段和黄原胶合成基因簇以及鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP的上下游同源臂构建重组载体，将所述重组载体结合转移至缺陷菌株NXdPE中，进行单交换和双交换筛选，得到双交换的工程菌株。
本发明提供了一种所述菌株T-XM、所述超高分子量黄原胶或其加工产品检测用分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明提供了一种超高分子量黄原胶，其重复单元的结构与普通型黄原胶一致，分子量大于2.0×107Da。本发明利用基因工程化手段构建一种包含野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)的黄原胶合成基因簇替换部分三赞胶合成基因的鞘氨醇单胞菌菌株NXdP，命名为胞外多聚物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassanxanigenens)，菌株编号为T-XM菌株，经发酵培养，测定生产多糖的单糖组成，超高分子量黄原胶的单糖组成为葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，与普通型黄原胶一致。经傅里叶红外光谱测定，结构与普通型黄原胶一致。采用多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定多糖的分子量，结果表明，超高分子量黄原胶的重均分子量为(2.91～14.3)×107Da，远超出文献报道普通型黄原胶的分子量范围(2.0×106～2.0×107Da)。经过粘度测定以及耐盐耐高温性能测定，结果表明，所述超高分子量黄原胶具有良好的粘度、高稳定性以及耐盐耐高温特定，可作为稳定剂和增稠剂在食品、化妆品、医药和石油工业等领域有着广泛的应用。
附图说明
图1为HPLC法测定超高分子量产品的单糖组成；
图2为多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定超高分子量黄原胶结果1；
图3为多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定超高分子量黄原胶结果2；
图4为本发明制备的超高分子量黄原胶、普通黄原胶和三赞胶的结构测定结果；
图5为超高分子量黄原胶和普通黄原胶的粘度测定结果。
生物材料保藏信息
胞外多聚物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassanxanigenens)，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年05月09日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.27299。
具体实施方式
本发明提供了一种超高分子量黄原胶，重复单元的结构与普通型黄原胶一致，分子量大于2.0×107Da。
在本发明中，所述普通型黄原胶的分子量优选为(0.2～2.0)×107Da；所述普通型黄原胶的重复结构单元为由两个葡萄糖、两个甘露糖和一个葡萄糖醛酸组成，重复结构单元的结构为两个葡萄糖通过β-1-4-糖苷键连接形成主链，侧链结构为两个甘露糖中间间隔一个葡萄糖醛酸，其中葡萄糖醛酸分别以β-1-4-糖苷键和β-1-2-糖苷键与内侧和外侧的甘露糖相连接，侧链结构通过β-1-3-糖苷键间隔连接在主链的葡萄糖上。在本发明实施例中，首先进行单糖组成分析，结果表明超高分子量黄原胶的单糖组成为葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，与普通型黄原胶一致。此外，将普通型黄原胶与超高分子量黄原胶进行傅里叶红外光谱分析，结果表明两者光谱图一致，说明超高分子量黄原胶的重复单元与普通型黄原胶一致。
在本发明中，超高分子量黄原胶的分子量优选大于2.0×107Da。本发明实施例中，利用多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定超高分子量黄原胶的分子量，结果表明，超高分子量黄原胶的重均分子量为(2.91～14.3)×107Da，远超出文献报道普通型黄原胶的分子量范围(2.0×106～2.0×107Da)，属于超高分子量黄原胶范畴。
在本发明中，经过粘度测定以及耐盐耐高温性能测定，结果表明，所述超高分子量黄原胶具有良好的粘度、高稳定性以及耐盐耐高温特定，可作为稳定剂和增稠剂在食品、化妆品、医药和石油工业等领域有着广泛的应用
本发明提供了一种生产所述超高分子量黄原胶的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)菌株T-XM，在鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP的基础上，用野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)中黄原胶合成基因簇替代部分三赞胶合成相关基因。
在本发明中，所述黄原胶合成基因簇优选是以野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestri)的DNA为模板，采用引物对扩增得到；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GCTTATAAGCGCGACAAAGGATGTGTTCGTTCTATGCCAT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:2(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG)所示的反向引物。本发明对所述野油菜黄单孢菌没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌株即可，例如保藏编号为CGMCCNO.15155或ATCC 33913的菌株。所述保藏编号为CGMCC NO.15155的野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)菌株的来源为土壤，在公开号为CN109706110A的专利中记载和公开。所述ATCC 33913菌株通过商品途径购买即可。
在本发明中，所述黄原胶合成基因簇优选由所述菌株NXdP的P916启动子启动表达。所述P916启动子扩增用引物优选为核苷酸序列如SEQ ID NO:5(CAACGCCGTCAAAAAAATGGGCGCAGCTTCACCGACATCC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG)所示的反向引物。所述P916启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示(CTGCTGTTCACCTGGCTCCAGACCGGGCTGGTTCCCCGCTATCCGAC CGCGGTGCTGGCGACCGGCCTTACCATCGTCGCCTTCCTCAGTTTCGCCTGCGGCCTCATCCTCGACACGGTGGTGCACGGGCGGCGCGAGATGCGGCGGATCGCCTATCTTTCGCATGCTGCGCCGGGCGCGGCCGACGCCCGAAGCGAGGCCCCTTGAAGCCGCCCCGCTTTCACCCGATGTAGGGACACG)。
在本发明中，所述部分三赞胶合成相关基因优选包括orf0831基因和orf0533-orf0536基因。所述orf0831基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。所述orf0533-orf0536基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在本发明中，所述菌株T-XM进行了国家知识产权局指定的单位进行保藏，保藏编号为CGMCC No.27299。
本发明提供了一种所述菌株T-XM的构建方法，包括以下步骤：
敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP中部分三赞胶合成相关基因，得到缺陷菌株NXdPE；
将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP中P916启动子片段和野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestri)来源的黄原胶合成基因簇克隆至所述缺陷菌株NXdPE，得到生产超高分子量黄原胶的工程菌株T-XM。
在本发明中，所述敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdPE中部分三赞胶合成相关基因的方法，优选包括以下步骤：依次敲除菌株NXdP中与三赞胶合成相关的orf0831、orf0533-orf0536基因。所述敲除的方法参见201810737183.3的专利所述双交换同源重组方法完成即可。
在本发明中，所述克隆至所述缺陷菌株NXdPE的方法，优选将P916启动子片段和黄原胶合成基因簇以及鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株NXdP的上下游同源臂构建重组载体，将所述重组载体结合转移至缺陷菌株NXdPE中，进行单交换和双交换筛选，得到双交换的工程菌株。
在本发明中，所述重组载体的构建方法，优选包括以下步骤：
将上游同源臂片段、P916启动子片段、黄原胶合成基因簇和下游同源臂按顺序克隆至骨架载体上，得到重组载体。所述上游同源臂片段的扩增引物对优选为核苷酸序列如SEQID NO:7(CCTAGATCCTTTAATTCGAGCCGCGATCAGATGCTGCTTGA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG)所示的反向引物。所述下游同源臂的扩增引物对优选为核苷酸序列如SEQ ID NO:9(TGGTGGTGTCGTTGTTGGCATGGATCGTCGCGCATCAGAC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10(TCAAACATGAGAATAGCTTGCCCCAGGTGCCGATATCGTCC)所示的反向引物。所述克隆优选使用HiFi DNAAssemblyMastermix一步法实现连接至骨架载体中。本发明对所述骨架载体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的骨架载体即可。在本发明实施例中，所述骨架载体优选为pLO3载体。
在本发明中，将所述重组载体结合转移至缺陷菌株NXdPE，进行单交换和双交换筛选的方法，优选参见201810737183.3专利中公开的结合转移方法即可。
在本发明中，采用上述构建方法获得的菌株T-XM进行生产超高分子量黄原胶的方法，参见201810737183.3专利中公开的水凝胶的制备方法，优选包括以下步骤：
将菌株T-XM接种至TPG液体培养基中，震荡培养20～26h，得培养液；将所述培养液接种至种子培养基中，震荡培养20～26h，得种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中，发酵68～75h，得发酵液；将所述发酵液用乙醇沉淀絮状物，分离，得到沉淀；将所述沉淀去除水分，得到超高分子量黄原胶。
在本发明中，所述震荡培养的温度优选为28～35℃，更优选为30～32℃。所述发酵培养基，优选包括：葡萄糖30～70g/L，豆饼粉0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L和NaNO31～2g/L。所述发酵的温度为28～35℃，更优选为30～32℃。所述沉淀的去除水分的方法优选为60～90℃烘干2～6℃，更优选为70～85℃烘干4h。去除水分后，优选将沉淀进行粉碎和过筛，收集80目筛下物，得到超高分子量黄原。
本发明提供了一种所述菌株T-XM、所述超高分子量黄原胶或其加工产品检测用分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO:11(TGGCGGATCTTCCGGACGATCGGCACGCTGTATCGTATCGAGCGGCC GGTGCTCTATTTCGGCGGGATCGGCGCCGTGCTGGTGCTGGCGGCGGTGATCCTGGCGCTGCCGCTGCTGTTCACCTGGCTCCAGACCGGGCTGGTTCCCCGCTATCCGACCGCGGTGCTGGCGACCGGCCTTACCATCGTCGCCTTCCTCAGTTTCGCCTGCGGCCTCATCCTCGACACGGTGGTGCACGGGCGGCGCGAGATGCGGCGGATCGCCTATCTTTCGCATGCTGCGCCGGGCGCGGCCGACGCCCGAAGCGAGGCCCCTTGAAGCCGCCCCGCTTTCACCCGATGTAGGGACACGGCAAAAGGCTTATAAGCGCGACAAAGGATGTGTTCGTTCTATGCCATAGTGCACTGCAACACGCGATTCAACGTTGGTCCCGGCACGCGTCGGGATGCAACTTCCTGTCGTACGTTCGTGCTGGCGCCTGAGCCGGTTGAATGCTGCGCGAGGTCCTGTCCCACCCAACAGAGGCAGCCAGCTACACGCATGAAGAAACTGATCGGACGACTCTGCCAAGGCCTCAGCCTGGCTCTGCTCTGCTCGATGTCGCTGGGCGCTTGCAGCACCGGCCCGGAGATGGCGTCTTCGCTGCCGCATCCGGACCCGCTGGCAATGTCCACGGTGCAGCCCGAATACCGTCTTGCGCCGGGCGATCTGTTGCTGGTGAAGGTGTTTCAGATCGACGATCTGGAGCGGCAGGTCCGCATCGACCAGAACGGTCACATCTCACTGCCGTTGATTGGCGACGTCAAGGCCGCCGGTCTGGGCGTTGGCGAACTGGAAAAGCTGGTCGCCGATCGGTATCGCGCAGGCTACCTGCAGCAGCCGCAGATTTCGGTATTCGTGCAGGAGTCCAACGGGCGTCGCGTCACGGTCACTGGTGCGGTAGACGAGCCGGGCATCTACCCGGTGATCGGCGCCAACCTCACCTTGCAGCAGGCGATCGC)所示。所述分子标记扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(TGGCGGATCTTCCGGACGAT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(GCGATCGCCTGCTGCAAGGT)所示的反向引物。
在本发明中，所述分子标记是超高分子量黄原胶合成的必需基因，缺失该序列后菌株并不能合成胞外多糖，所述分子标记在鉴定超高分子量黄原胶合成菌株或所有超高分子量黄原胶的中轻度加工产品中的应用。
在本发明中，所述检测的方法，优选包括以下步骤：
提取待测样本的基因组DNA，将所述基因组DNA为模板，用分子标记的扩增用引物进行PCR扩增，经PCR扩增产物进行电泳检测和测序，得到1001bp长度的结果说明待测样本为超高分子量黄原胶生产菌株或超高分子量黄原胶加工产品。
下面结合实施例对本发明提供的一种超高分子量黄原胶及其生产菌株和检测用分子标记进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种超高分子量黄原胶的生产菌株的构建方法，包括以下步骤：
1.本实验中涉及的引物及具体序列见表1。
表1引物序列
2.实验方法
1)不能合成三赞胶的基因工程菌株Sphingomonas sp.NXdPE的构建方法
根据专利ZL201810737183.3所述方法依次敲除菌株NXdP中与三赞胶合成相关的orf0831、orf0533-orf0536基因，获得三赞胶和PHB缺陷菌株NXdPE，具体步骤如下。
靶基因通过双交换同源重组而失活。使用提取试剂盒提取NXdP的基因组，靶基因的上下游同源臂以NXdP基因组为模板，分别使用引物gene-su/gene-sl和gene-xu/gene–xl及PrimeSTAR DNA聚合酶(Takara Bio,Tokyo,Japan)扩增。PCR扩增体系为10～50ng/μL的DNA模板0.5μL，20μM的引物对各0.4μL，PrimeStarpremix聚合酶12.5μL，DMSO 2mL，加水至25μL；PCR反应条件为：98℃：15s，55℃：10s，72℃：30s，35个循环。
通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和XbaI或PacI进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pLO3-Δgene，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取PCR检测(检测引物gene-su/gene-xl)正确的单菌落进行甘油保存。
通过结合转移的方法将敲除质粒导入菌株NXdP中，进行单交换、双交换筛选，单交换菌株同时具备氯霉素和四环素抗性，双交换通过PCR检测(检测引物为对应的基因1/对应的基因2)验证正确的单菌落。orf0831、orf0533-orf0536基因依次敲除。
其中，检测PCR条件：PCR扩增体系为10～50ng/μL的DNA模板0.5μL，20μM的引物各0.4μL，rTaq聚合酶12.5μL，DMSO 2mL，加水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性10min；94℃：45s，55℃：45s，72℃：60s，35个循环；72℃延伸10min。
2)包含黄原胶合成基因簇目的基因片段的重组载体构建方法
(1)分别提取菌株NXdP(CGMCC NO.15406)和Xanthomonas campestris(CGMCCNO.15155)菌株的基因组；
(2)扩增黄原胶合成基因簇、启动子片段以及上下游同源臂片段：
PCR扩增体系为10～50ng/μL的DNA模板0.5μL，20μM的引物对各0.4μL，PrimeStarpremix聚合酶12.5μL，DMSO 2mL，加水至25μL；
其中上游同源臂所使用引物为U-F(CCTAGATCCTTTAATTCGAGCCGCGATCAGATGCTGCTTGA，SEQ ID NO:7)/U-R(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG，SEQ ID NO:8)，模板为NXdP菌株基因组；
P916启动子片段所使用引物为P916-F(CAACGCCGTCAAAAAAATGGGCGCAGCTTCACCGACATCC，SEQ ID NO:5)/P916-R(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG，SEQ ID NO:6)，模板为NXdP菌株基因组；
黄原胶合成基因簇所使用引物为gum-F(GCTTATAAGCGCGACAAAGGATGTGTTCGTTCTATGCCAT，SEQ ID NO:1)/gum-R(GGATGTCGGTGAAGCTGCGCCCATTTTTTTGACGGCGTTG，SEQ ID NO:2)，模板为Xanthomonas campestri(CGMCCNO.15155)菌株的基因组；
下游同源臂所使用引物为D-F(TGGTGGTGTCGTTGTTGGCATGGATC GTCGCGCATCAGAC，SEQ ID NO:9)/D-R(TCAAACATGAGAATAGCTT GCCCCAGGTGCCGATATCGTCC，SEQ ID NO:10)，模板为NXdP菌株基因组。
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃：15s，54℃：15s，72℃：10-60s，35个循环；72℃延伸3min；
(3)将琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收目的条带，得到目的片段。
(4)重组载体的构建：
使用HiFi DNAAssembly Mastermix一步法依次将上游同源臂、P916启动子、黄原胶合成基因簇和下游同源臂依次连接至pLO3载体上，构建重组载体pLO3-P916gum。
(5)将目的片段插入Sphingomonas sp.NXdPE基因组
根据专利ZL201810737183.3所述方法，将pLO3-P916gum载体结合转移至受体菌菌株NXdPE中，经过单交换，双交换筛选，其中单交换检测用引物包括916gumUC1、916gumUC2、916gumDC1、916gumDC2；上下游同源臂同时发生单交换即为双交换菌株。双交换筛选后得到的菌株为生产超高分子量黄原胶的工程菌株。
实施例2
生产超高分子量黄原胶的工程菌株生产超高分子量的黄原胶的方法
根据专利ZL201510110078.3和ZL201810737183.3记载的生产多糖的方法进行发酵菌株T-XM，收集发酵液。向发酵液中加入2～3倍体积乙醇搅拌得到絮状沉淀，收集沉淀，60～90℃烘干2～6h，粉碎，过80目筛，获得超高分子量黄原胶产品。
实施例3
采用酸解样品和高效液相色谱分析两个步骤测定超高分子量黄原胶产品的单糖组成
1.酸解样品：称取5mg干燥的样品于安瓿瓶中，加入1mL 2mol/L的三氟乙酸溶液，将安瓿瓶瓶口熔封，放置于鼓风干燥箱中，设定温度为120℃对黄原胶样品进行酸解10h，酸解过程中，每隔两小时混匀安瓿瓶中的样品。酸解结束后，取出500μL酸解液于1.5mL的EP管中，在95℃水浴中挥发液体，必要时可以使用氮气吹干，然后加入200μL超纯水，使用0.2M氢氧化钠调节其至中性，12000g离心去除不溶物，然后使用0.22μm的滤膜过滤。
2.配置1g/L的标准糖溶液(葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖)，使用0.22μm的滤膜过滤。
3.液相色谱条件：Agilent 1100液相色谱系统装有Waters Sugar-PakTMI色谱柱。流动相：50mg/L的EDTA-2NaCa溶液。
色谱条件设置：进样体积20μL，柱温为85℃，流速设定为0.5mL/min，采用示差检测器，检测器温度为35℃。
结果如图1所示，显示超高分子量黄原胶的单糖组成为葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，与普通型黄原胶一致。
实施例4
多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定产品的分子量1
根据文献已经报道的方法采用多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定产品的分子量。
样品准备：称取10mg干燥的样品充分溶解于10mL超纯水中，然后使用0.22μm的滤膜过滤。
体积排阻色谱条件：Agilent 1260液相色谱系统装有WatersUlturahudrogelTMlinear色谱柱；流动相为磷酸缓冲液(pH 7.2)；进样体积为200μL；柱温为室温；流速设定为0.6mL/min；采用示差检测器，检测器温度为35℃。
多角度激光散射仪：MALLS，WyattTechnology DAWN HELEOS，Santa Barbara,CA,USA。
标准样品：牛血清蛋白BSA。
数据采集和分析软件：ASTRA软件。
结果如图2所示，显示超高分子量黄原胶的重均分子量为2.91×107Da，远超出文献报道普通型黄原胶的分子量范围(2.0×106-2.0×107Da)，属于超高分子量黄原胶范畴。
同时，此方法用于区分市场现有黄原胶产品和超高分子量黄原胶产品。
实施例5
多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定产品的分子量2
根据文献已经报道的方法采用多角度激光散射仪-体积排阻色谱联用测定产品的分子量。
样品准备：称取10mg干燥的样品充分溶解于10mL超纯水中，然后使用0.22μm的滤膜过滤。
体积排阻色谱条件：Agilent 1260液相色谱系统装有WatersUlturahudrogelTMlinear色谱柱；流动相为磷酸缓冲液(pH 7.2)；进样体积为200μL；柱温为室温；流速设定为0.6mL/min；采用示差检测器，检测器温度为35℃。
多角度激光散射仪：MALLS，WyattTechnology DAWN HELEOS，Santa Barbara,CA,USA。
标准样品：牛血清蛋白BSA。
数据采集和分析软件：ASTRA软件。
结果如图3所示，显示超高分子量黄原胶的重均分子量为1.43×108Da，远超出文献报道普通型黄原胶的分子量范围(2.0×106-2.0×107Da)，属于超高分子量黄原胶范畴。
同时，此方法用于区分市场现有黄原胶产品和超高分子量黄原胶产品。
实施例6
傅里叶红外光谱鉴定超高分子量黄原胶、普通黄原胶及原始多糖三赞胶的一级结构差异。
取5mg样品与KBr一起研磨压片，用Nicolet170SX型红外光谱仪进行红外扫描。根据图谱中一定波数下谱峰的有无来判断有关基团的有无，谱峰的强弱来判断量的多少，谱峰的宽窄、形状来区分各种不同基团。具体结果如图4所示。超高分子量黄原胶和普通黄原胶具有基本一致的峰图，而原始多糖三赞胶在1055cm-1处具有鼠李糖的特征峰，说明工程菌株产生多糖为黄原胶，且高分子量黄原胶具有与普通黄原胶基本一致的功能基团种类和含量，由此可断定两者除分子量外，结构一致。
图4超高分子量黄原胶、普通黄原胶和三赞胶的红外图谱
实施例7
超高分子量黄原胶的粘度测定
配置浓度1.0％的超高分子量黄原胶水溶液，以保藏编号CGMCCNO.15155菌株合成的普通黄原胶做对照。利用TADHR-1流变仪测定其在0.01—1001/s条件下的粘度变化。
结果如图5所示。在超低剪切速率下，超高分子量黄原胶粘度为626Pa.s，而普通黄原胶粘度为510Pa.s；随着剪切速率增加，超高分子量黄原胶与普通黄原胶的粘度差异逐渐增大。由此说明，超高分子量黄原胶具有比普通黄原胶更高的粘度。
实施例8
超高分子量黄原胶产生菌株及其产品的分子标记及其鉴定方法
根据菌株T-XM构建过程中的插入至NXdPE菌株基因组中的基因序列并以该序列的一部分作为分子标记，具体核苷酸序列如SEQ ID NO:11(TGGCGGATCTTCCGGACGATCGGCACGCTGTATCGTATCGAGCG GCCGGTGCTCTATTTCGGCGGGATCGGCGCCGTGCTGGTGCTGGCGGCGGTGATCCTGGCGCTGCCGCTGCTGTTCACCTGGCTCCAGACCGGGCTGGTTCCCCGCTATCCGACCGCGGTGCTGGCGACCGGCCTTACCATCGTCGCCTTCCTCAGTTTCGCCTGCGGCCTCATCCTCGACACGGTGGTGCACGGGCGGCGCGAGATGCGGCGGATCGCCTATCTTTCGCATGCTGCGCCGGGCGCGGCCGACGCCCGAAGCGAGGCCCCTTGAAGCCGCCCCGCTTTCACCCGATGTAGGGACACGGCAAAAGGCTTATAAGCGCGACAAAGGATGTGTTCGTTCTATGCCATAGTGCACTGCAACACGCGATTCAACGTTGGTCCCGGCACGCGTCGGGATGCAACTTCCTGTCGTACGTTCGTGCTGGCGCCTGAGCCGGTTGAATGCTGCGCGAGGTCCTGTCCCACCCAACAGAGGCAGCCAGCTACACGCATGAAGAAACTGATCGGACGACTCTGCCAAGGCCTCAGCCTGGCTCTGCTCTGCTCGATGTCGCTGGGCGCTTGCAGCACCGGCCCGGAGATGGCGTCTTCGCTGCCGCATCCGGACCCGCTGGCAATGTCCACGGTGCAGCCCGAATACCGTCTTGCGCCGGGCGATCTGTTGCTGGTGAAGGTGTTTCAGATCGACGATCTGGAGCGGCAGGTCCGCATCGACCAGAACGGTCACATCTCACTGCCGTTGATTGGCGACGTCAAGGCCGCCGGTCTGGGCGTTGGCGAACTGGAAAAGCTGGTCGCCGATCGGTATCGCGCAGGCTACCTGCAGCAGCCGCAGATTTCGGTATTCGTGCAGGAGTCCAACGGGCGTCGCGTCACGGTCACTGGTGCGGTAGACGAGCCGGGCATCTACCCGGTGATCGGCGCCAACCTCACCTTGCAGCAGGCGATCGC)所示，总长度为1001bp。上下游鉴定引物为TXM1(TGGCGGATCTTCCGGACGAT)和TXM2(GCGATCGCCTGCTGCAAGGT)序列。分子标记用于鉴定具体鉴定方法如下：
(1)提取待测菌株或者中轻加工产品(含黄原胶的食品、日化、石油级等产品)的基因组，作为PCR模板；
(2)PCR扩增体系为：10～50ng/μL的DNA模板0.5μL，20μM的引物对(TXM1/TXM2)0.4μL，premix Taq聚合酶12.5μL，DMSO 2mL，加水至25μL；
(3)PCR反应条件为：95℃预变性10min；94℃：45s，55℃：45s，72℃：60s，35个循环；72℃延伸10min；
(4)电泳检测，胶回收目的片段。将目的片段送至测序公司测序，全长1001bp，测序结果与预期序列一致，即待测样本为超高分子量黄原胶生产菌株或超高分子量黄原胶的加工产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种超高分子量黄原胶，其特征在于，重复单元的结构与普通型黄原胶一致，分子量大于2.0×107Da。
2.根据权利要求1所述超高分子量黄原胶，其特征在于，所述普通型黄原胶的重复结构单元为由两个葡萄糖、两个甘露糖和一个葡萄糖醛酸组成，重复结构单元的结构为两个葡萄糖通过β-1-4-糖苷键连接形成主链，侧链结构为两个甘露糖中间间隔一个葡萄糖醛酸，其中葡萄糖醛酸分别以β-1-4-糖苷键和β-1-2-糖苷键与内侧和外侧的甘露糖相连接，侧链结构通过β-1-3-糖苷键间隔连接在主链的葡萄糖上。
3.根据权利要求1所述超高分子量黄原胶，其特征在于，分子量为(2.91～14.3)×107Da。
4.一种生产权利要求1～3中任意一项所述超高分子量黄原胶的胞外多聚物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassanxanigenens)菌株T-XM，其特征在于，在鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)菌株NXdP的基础上，用野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestri)中黄原胶合成基因簇替代鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)菌株NXdP中部分三赞胶合成相关基因。
5.根据权利要求4所述菌株T-XM，其特征在于，所述黄原胶合成基因簇是以野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestri)的DNA为模板，采用引物对扩增得到；
所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的反向引物。
6.根据权利要求4所述菌株T-XM，其特征在于，所述黄原胶合成基因簇由所述菌株NXdP的P916启动子启动表达；
所述部分三赞胶合成相关基因包括orf0831基因和orf0533-orf0536基因。
7.根据权利要求4～6中任意一项所述菌株T-XM，其特征在于，所述菌株T-XM的保藏编号为CGMCCNo.27299。
8.一种权利要求4～7中任意一项所述菌株T-XM的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)菌株NXdP中部分三赞胶合成相关基因，得到缺陷菌株NXdPE；
将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)菌株NXdP中P916启动子片段和野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestri)菌株来源的黄原胶合成基因簇克隆至所述缺陷菌株NXdPE，得到生产超高分子量黄原胶的工程菌株T-XM。
9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述克隆至所述缺陷菌株NXdPE的方法，将P916启动子片段和黄原胶合成基因簇以及鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)菌株NXdP的上下游同源臂构建重组载体，将所述重组载体结合转移至缺陷菌株NXdPE中，进行单交换和双交换筛选，得到双交换的工程菌株。
10.一种权利要求4～7中任意一项所述菌株T-XM、权利要求1～3中所述超高分子量黄原胶或其加工产品检测用分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
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