CN111440885B - 用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物的鉴别，特别是指一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用。以鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650或CGMCC No.19480的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以序列分别为SEQ No.5、SEQ No.6的引物1及引物2作为引物进行PCR扩增后获得，本发明克服了使用三赞胶、结冷胶和温轮胶的复配胶体系中必需通过克隆测序等其他操作才能将三种胶体彼此分开，步骤比较繁琐等问题。具有可以从包含三赞胶的中轻度加工产品中鉴别出三赞胶，具有检测时间短、准确性高的优点。

Description

用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用
技术领域
本发明属于微生物的鉴别，特别是指一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用。
背景技术
食品胶由多糖及其复合物组成，充分水化后能形成粘稠或凝胶状的高分子水溶胶，在食品加工中起到增稠、胶凝、悬浊等作用，使食品获得所需要的各种形状和软、硬、脆、黏等口感。食品胶按来源可分为植物胶、动物胶、微生物胶和化学改性胶，其中微生物胶性能优越、生产周期短、不受气候、地理环境的影响，已经在食品领域大规模应用，例如野油菜黄单胞菌合成的黄原胶和少动鞘氨醇单胞菌合成的结冷胶等。
近年来研究者发现，除结冷胶外，鞘氨醇单胞菌属的菌株还能合成多种微生物胶，例如温轮胶、三赞胶等，这些微生物胶的多糖主链都由葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖和(或)甘露糖组成，但侧链基团种类、位置多样，具有各自独特的理化性质和用途，被统称为鞘氨醇胶。三赞胶又称鞘氨醇胶Ss，是由三赞鞘氨醇单胞菌合成的一种新型微生物胶，具有优良的增稠、胶凝、乳化和悬浮稳定性能，是鞘氨醇胶类聚合物的一个新品种，也是第一个完全由国内自主研发并实现工业化生产的微生物源食品胶。根据《食品添加剂新品种申报与受理规定》和《食品添加剂新品种管理办法》的规定，2018年12月三赞胶已通过国家卫健委专家评审委员会技术审查，主要作为增稠剂、稳定剂和凝固剂，用于果蔬汁(浆)类饮料、植物蛋白饮料和肉灌肠等产品中。食品胶在生物工业应用时，经常根据食品胶单体的性质和功能，将两种或两种以上功能互补或有协同作用的单体按照一定比例进行复配，从而产生无数种复配胶，以满足食品生产的不同需要。微生物胶中的三赞胶、结冷胶和温轮胶等品种都是鞘氨醇单胞菌属菌株合成，目前还没有一种快速鉴别方法，特别是国内自主研发的三赞胶，从生产菌株保护和应用市场规范的角度出发都需要一种鉴别三赞胶合成菌和从复配胶产品中鉴别三赞胶的方法。随着三赞胶的应用和推广，规范这类产品的应用市场，鉴别一种产品中是否添加了三赞胶，特别是使用复配胶后，如何快速鉴别三赞胶成为亟需解决的问题。
凭借多糖的结构鉴别三赞胶非常复杂，需要纯化多糖，然后使用Sminth水解、甲基化分析和二维核磁共振谱等复杂的步骤和分析方法。申请号为201811206214.9的专利文献共公开了“一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用”，该专利文献中公开的技术可用于三赞胶的鉴别，但在同时使用三赞胶、结冷胶和温轮胶的复配胶体系中，由于这三种微生物胶是鞘氨醇单胞菌属不同菌株合成的，彼此之间的同源性较高，鉴别引物会扩增得到大小接近的三种PCR产物，必需通过克隆测序等其他操作才能将三种胶体彼此分开，步骤比较繁琐。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记。
本发明的目的之二在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对。
本发明的目的之三在于提供一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记的制备方法。
本发明的目的之四在于提供用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在三赞胶及其合成菌快速鉴定及检测中的应用。
本发明的目的之五在于提供用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面的应用。
本发明的整体技术构思是：
一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记所述分子标记为SEQ No.13所示的核苷酸序列。
一种用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，所述引物对能够扩增得到SEQ No.13所示的核苷酸序列。
用于三赞胶及其合成菌鉴别的引物对，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQ No.5所示的核苷酸序列，或为SEQ No.5所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列；所述引物2为SEQ No.6所示的核苷酸序列，或为SEQ No.6所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。
用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记的制备方法，包括上述所述的引物对、DNA聚合酶和/或dNTPs，具体步骤如下:
A、以保藏编号为CGMCC No.1650或者CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以引物1及引物2作为引物进行PCR反应；
B、PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA＝1.0μL；10μM的引物1＝0.5μL；10μM的引物2＝0.5μL；10mM的dNTP＝1.0μL；10×缓冲液＝2.5μL；5U/μL的Platinum Taq DNA聚合酶＝0.5μL；加超纯水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，55℃-63℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；
电泳检测PCR扩增产物为950bp左右；
C、PCR扩增产物DNA测序，去除影响测序准确性的两端引物序列后，得到代表三赞胶及其合成菌的核心保守序列920bp，即为用于鉴别三赞胶及其合成菌的特异性分子标记。
用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在三赞胶及其合成菌快速鉴定及检测中的应用。
用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面的应用。
三赞胶合成菌为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.1650或者CGMCC No.19480。
本发明的菌种为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.1650，上述菌种申请人已于2006年3月14日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所(该保藏机构目前已迁址至北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC。
本发明中的鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCCNo.19480，上述菌种申请人已于2020年3月16日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，简称CGMCC。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
本发明从三赞胶合成基因簇和比较基因组的角度，筛选出三赞胶及三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650或CGMCC No.19480的特异性分子标记，可以从包含三赞胶的中轻度加工产品中鉴别出这种微生物胶，具有检测时间短、准确性高的优点。
附图说明
本发明的附图有：
图1为三赞胶与温轮胶、结冷胶的多糖结构比较图，图中Glc为葡萄糖，Man为甘露糖，GlcA为葡萄糖醛酸，Rha为鼠李糖，Acetyl为乙酰基，Glyceroyl为甘油酰基。
图2为本发明中引物1/2对微生物胶合成菌的PCR扩增产物电泳检测图谱，其中M为分子量标记，1为阴性对照；2为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650；3为结冷胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.14238；4为温轮胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1561；5为黄原胶合成菌——野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCC No.10122。
图3为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650或CGMCC No.19480分子标记与GenBank数据库中所有物种的核酸序列BLASTN比对时，得到的最高同源物种Boseavaviloviae strain Vaf18的序列与本专利分子标记序列的比对图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。
实施例1
一种用于鉴别三赞胶及其合成菌的分子标记，所述分子标记的引物1的序列为SEQ5：5'-TCAGGCCGTGTGGGGAA-3'，所述引物2的序列为SEQ6：5'-GATCCGATCCAGCTTTCGGG-3'。
上述用于鉴别三赞胶及其合成菌的引物的获得方法，步骤如下：
1、用于鉴别三赞胶及其合成菌的分子标记的引物的获得方法，步骤如下：将三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.1650、结冷胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.14238、温轮胶合成菌——鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.CGMCC No.1561、黄原胶合成菌——野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCCNo.10122分别接种到装有100mL灭菌液体培养基的250mL三角瓶中，培养基配方如下(g/L)：葡萄糖12.0，麦芽浸粉4.0，蛋白胨2.5，酵母粉1.5，pH＝7.0。150转/分钟，30℃摇床震荡培养48小时后，6000转/分钟，离心15分钟，收集菌体细胞备用。按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行菌株基因组DNA提取，所得DNA溶液置于-20℃冻存，备用。
三赞胶与其他微生物多糖的差别在于单糖组成、单糖主链及侧链的连接方式，三赞胶与结冷胶和温轮胶等鞘氨醇胶，是鞘氨醇单胞菌属同一个属不同菌株合成的产物，单糖组成相似，但三赞胶主链上有甘露糖，分别与葡萄糖和葡萄糖醛酸以1，4糖苷键连接，在单糖主链及侧链的连接方式上与结冷胶和温轮胶存在显著差异，如图1所示。根据上述多糖结构上的差异，筛选三赞胶合成基因簇中相应的糖基转移酶和负责多糖聚合、输出的基因，结合三赞胶与结冷胶和温轮胶的比较基因组差异分析，设计PCR扩增引物(如下表所示)：
Figure GDA0002526437210000051
Figure GDA0002526437210000061
以三赞胶合成菌的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA 1μL，10μM的引物1＝0.5μL，10μM的引物2＝0.5μL，10mM的dNTP 1.0μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，55-63℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。取上述PCR扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，电泳，用GoldView核酸染料染色10min，在凝胶成像仪中拍照，结果表明均不能扩增出条带。优化PCR扩增条件，发现使用Platinum Taq DNA聚合酶，退火温度为62℃时，以三赞胶合成菌的基因组DNA为模板，引物SEQ5/6可以扩增到950bp左右的清晰条带，其他引物扩增得到多条带或不能扩增出条带。
以三赞胶、结冷胶、温轮胶和黄原胶合成菌的基因组DNA为模板，SEQ5/6为引物进行PCR扩增，结果如图2所示，可以看出三赞胶合成菌PCR扩增得到950bp左右的清晰条带，而结冷胶、温轮胶和黄原胶合成菌均无扩增条带出现，说明SEQ5和SEQ6可以作为三赞胶合成菌特异性分子标记的PCR扩增引物，分别命名为引物1和引物2。
将三赞胶合成菌的PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶及其合成菌的特异性分子标记。
特异性分子标记920bp，具体序列SEQ13如下：
ACGGCAGGACCTCGCCTTGCAGCAGCCGCGTCGCCTGGCGACGGTCGAGCGCGCGCGAGAAGAGGAAGCCTTGGCCATATTTGCAGCCATAGCGCTGCAGCAGCCGGCACTGCGCCTCCGTCTCGATTCCCTCGGCGACGACCCGCAGCTTGAGACCGTCGGCAATCGCGATCAGCCCCTGCACGATCGCAGCGCTGCCCGCATCGGTGCCGAGCTGCTGGACGAAGGAGCGGTCGATCTTGATGATGTCCACCGGCACCGAGAGCAGGTGCGTCAGCGAGGCATAGCCGGTACCGAAATCGTCGAGCGCGATGCGGAGCCCGCGCGCCTGCAATCCTTCGAGAACGCGGCGCACGGTATCGGCGCGCCGGTCCATATGGACCGTCTCGGTCACTTCGACGACCAGATGGCCGAGCGGCACGCGGGCATGCTCGAACGTGTCGGCCAGCGTGCGTTCGAGCAGGCCGCCGCCATGGATGTCGGCGGAGCCGACGTTGATCGAGATCTGCGGATCGGCGATGCCCAGCCGCATCCAGTGCGCGATGTCGCCGGCGACGATCCTCAGCATCCGTCGCGTGAGTTCCGGGGCGATGCGCGGGTGCGACATCGCTTGGTGGAAGGCGGCGGCCGGCAGCACTTCGCCCGTGGACGTCGTCAGGCGGCAGAGCGCCTCGAACGACGTTACCGCCCATGTCTCCAGTTCGACGACCGGCTGATAATAGGCGTCGATACGATCTTCGTGCAGTGCGCGCTCAAGATCGTGCAACGCGTCGGGATGGCTCGCCACCGCATTGCCCAGGCTCGCGGAATAAGCGAGGTGGCCGCCGCGGTGCGACTGCTTGGCGTGCTGCAGCGCATTGGTGGCATGTTCGAACAGAATGTCGGACGTCTTCGCCGGATCGCTGATCGCAAAGCCGATG
将920bp的三赞胶合成菌特异性分子标记与GenBank数据库中所有物种的核酸序列进行BLASTN比对，结果表明与其同源性比对分值最高的为Bosea vaviloviae strainVaf18，序列覆盖率(Query Cover)28％，即与三赞胶合成菌分子标记仅有28％的序列长度存在可比对的同源性，同源性为76％，如图3所示；该分子标记与结冷胶和温轮胶合成菌的基因组无可比对的同源性序列，从生物信息学的角度再次验证本发明的分子标记具有高度特异性。
实施例2
三赞胶合成菌分子标记的检测
将如实施例1所述的三赞胶合成菌鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCCNo.1650，结冷胶合成菌，温轮胶合成菌，黄原胶合成菌分别接种到装有100mL灭菌液体培养基的250mL三角瓶中，培养基配方如下(g/L)：葡萄糖12.0，麦芽浸粉4.0，蛋白胨2.5，酵母粉1.5，pH7.0。150r/min，30℃摇床震荡培养48h后，6000r/min，离心15min，收集菌体细胞，用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取。以引物1、引物2为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，10mM的dNTP 1.0μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Platinum Taq DNA聚合酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，62℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。取上述PCR扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，电泳，用GoldView核酸染料染色10min，在凝胶成像仪中观察结果，表明三赞胶合成菌可以PCR扩增得到950bp左右的清晰条带，测序得到分子标记的序列SEQ13，而结冷胶、温轮胶和黄原胶合成菌均无扩增条带，说明该分子标记可以用于三赞胶合成菌的鉴别。
实施例3
将三赞胶合成菌鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.19480接种到装有100mL灭菌液体培养基的250mL三角瓶中，培养基配方如下(g/L)：葡萄糖12.0，麦芽浸粉4.0，蛋白胨2.5，酵母粉1.5，pH7.0。150r/min，30℃摇床震荡培养48h后，6000r/min，离心15min，收集菌体细胞，用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取。以引物1、引物2为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，10mM的dNTP 1.0μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的PlatinumTaq DNA聚合酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，62℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。取PCR扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，电泳，用GoldView核酸染料染色10min，在凝胶成像仪中观察结果，表明三赞胶合成菌鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.19480可以PCR扩增得到950bp左右的清晰条带，测序得到分子标记的序列SEQ13，说明该分子标记可以用于三赞胶合成菌鉴别。
实施例4
三赞胶分子标记的检测
样品种类：使用三赞胶的悬浮饮料，果蔬汁(浆)类饮料和植物蛋白饮料等。
制备含三赞胶的柑橘悬浮饮料，方法如下：将采用实施例1中的三赞胶合成菌制备的三赞胶按0.05％的质量体积百分比加入水中，搅拌12h，充分溶解后加热到90℃并维持15min，冷却至50℃时，加入6％质量体积百分比的柑橘囊胞，加入5％质量体积百分比的白砂糖，用1mol/mL柠檬酸调节溶液pH至4.0，装瓶，121℃灭菌15min，冷却，摇匀后静置48h，得柑橘悬浮饮料成品。取上述含三赞胶的柑橘悬浮饮料，用200目的滤网过滤，清液在43000×g条件下离心30min，反复进行上述操作，富集沉淀物至10g，使用北京索莱宝科技有限公司的基因组大量提取试剂盒，按照说明书进行基因组DNA的提取，电泳检测。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系和反应条件，同实施例1。电泳检测到950bp左右的PCR扩增条带，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记SEQ13。
因此，本发明的特异性分子标记能够在包含三赞胶的中轻度加工产品中应用，用于三赞胶的鉴别。
实施例5
分子标记的检测
制备含结冷胶的柑橘悬浮饮料，方法如下：将采用实施例1中的结冷胶合成菌所制备的结冷胶按0.05％的质量体积百分比加入水中，搅拌12h，充分溶解后加热到90℃并维持15min，冷却至50℃时，加入6％质量体积百分比的柑橘囊胞，加入5％质量体积百分比的白砂糖，装瓶，121℃灭菌15min，冷却，摇匀后静置48h，得含结冷胶的柑橘悬浮饮料成品。
制备含温轮胶的柑橘悬浮饮料，方法如下：将采用实施例1中的温轮胶合成菌制备的温轮胶按0.05％的质量体积百分比加入水中，搅拌12h，充分溶解后加热到90℃并维持15min，冷却至50℃时，加入6％质量体积百分比的柑橘囊胞，加入5％质量体积百分比的白砂糖，装瓶，121℃灭菌15min，冷却，摇匀后静置48h，得含温轮胶的柑橘悬浮饮料成品。
基因组DNA的提取方法同实施例3，PCR扩增体系和反应条件同实施例2。电泳检测结果表明从含结冷胶和温轮胶的柑橘悬浮饮料中均未扩增到条带，说明本发明的分子标记具有特异性。
实施例6
分子标记的检测
制备含复配胶的柑橘悬浮饮料，方法如下：将采用实施例1中的三赞胶合成菌制备的三赞胶按0.03％的质量体积百分比，结冷胶按照0.02％的质量百分比加入水中，搅拌12h，充分溶解后加热到90℃并维持15min，冷却至50℃时，加入6％质量体积百分比的柑橘囊胞，加入5％质量体积百分比的白砂糖，用1mol/mL柠檬酸调节溶液pH至4.0，装瓶，121℃灭菌15min，冷却，摇匀后静置48h，得柑橘悬浮饮料成品。
基因组DNA的提取方法同实施例3，PCR扩增体系和反应条件同实施例2。电泳检测到950bp左右的PCR扩增条带，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记SEQ13。
说明本发明的分子标记能够应用在包含三赞胶的复配胶体中，用于三赞胶的鉴别。
实施例7
分子标记的检测：使用三赞胶的可食用膜
制备含三赞胶的可食用膜，方法如下：将采用实施例1中的三赞胶合成菌制备的三赞胶按1％的质量体积百分比加入水中，50℃条件下磁力搅拌12h；加入三偏磷酸钠至质量百分比0.1％，于25℃、pH7.5条件下交联1h；交联改性的三赞胶溶液中加入等体积的1％海藻酸钠溶液和0.7％的甘油，得到膜液，涂抹在草莓等水果的表面用于保鲜。
取上述包裹含三赞胶可食用膜的草莓，用0.5倍质量的自来水反复冲洗30min，冲洗下来的膜液在磁力搅拌器上室温搅拌12h，然后用200目的滤网过滤，清液在43000×g条件下离心30min，反复进行上述操作，富集沉淀物至10g，使用北京索莱宝科技有限公司的基因组大量提取试剂盒，按照说明书进行基因组DNA的提取，电泳检测。PCR扩增体系和反应条件同实施例1。电泳检测到950bp左右的PCR扩增条带，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记SEQ13。说明本发明的分子标记能够应用在包含三赞胶的可食用膜中，用于三赞胶的鉴别。
序列表
<110> 河北鑫合生物化工有限公司
<120> 用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用
<130> none
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
tgaggtcgag gaacttgtgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 2
gtcgtgaccg actatcgcat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 3
aggtcgagga acttgtgcag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 4
tcgccaccaa gatctatcgc 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 5
tcaggccgtg tggggaa 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 6
gatccgatcc agctttcggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 7
cagaatgctc gtattgccgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 8
tctatctcga cgagcgcaac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 9
ggcttcggtg aagaacagga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 10
tcgatccacc atatgcagcc 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 11
cttggccata tttgcagcca ta 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 12
gaccggattt gctcagggtt 20
<210> 13
<211> 920
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 13
acggcaggac ctcgccttgc agcagccgcg tcgcctggcg acggtcgagc gcgcgcgaga 60
agaggaagcc ttggccatat ttgcagccat agcgctgcag cagccggcac tgcgcctccg 120
tctcgattcc ctcggcgacg acccgcagct tgagaccgtc ggcaatcgcg atcagcccct 180
gcacgatcgc agcgctgccc gcatcggtgc cgagctgctg gacgaaggag cggtcgatct 240
tgatgatgtc caccggcacc gagagcaggt gcgtcagcga ggcatagccg gtaccgaaat 300
cgtcgagcgc gatgcggagc ccgcgcgcct gcaatccttc gagaacgcgg cgcacggtat 360
cggcgcgccg gtccatatgg accgtctcgg tcacttcgac gaccagatgg ccgagcggca 420
cgcgggcatg ctcgaacgtg tcggccagcg tgcgttcgag caggccgccg ccatggatgt 480
cggcggagcc gacgttgatc gagatctgcg gatcggcgat gcccagccgc atccagtgcg 540
cgatgtcgcc ggcgacgatc ctcagcatcc gtcgcgtgag ttccggggcg atgcgcgggt 600
gcgacatcgc ttggtggaag gcggcggccg gcagcacttc gcccgtggac gtcgtcaggc 660
ggcagagcgc ctcgaacgac gttaccgccc atgtctccag ttcgacgacc ggctgataat 720
aggcgtcgat acgatcttcg tgcagtgcgc gctcaagatc gtgcaacgcg tcgggatggc 780
tcgccaccgc attgcccagg ctcgcggaat aagcgaggtg gccgccgcgg tgcgactgct 840
tggcgtgctg cagcgcattg gtggcatgtt cgaacagaat gtcggacgtc ttcgccggat 900
cgctgatcgc aaagccgatg 920

Claims (3)

1.能够扩增得到分子标记的引物对在非诊断目的三赞胶合成菌快速鉴定中的应用，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ No.13所示；所述三赞胶合成菌为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.1650。
2.引物对在非诊断目的三赞胶合成菌快速鉴定中的应用，其特征在于所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列如SEQ No.5所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQNo.6所示；所述三赞胶合成菌为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.1650。
3.根据权利要求1所述的分子标记的制备方法，其特征在于具体步骤如下:
A、以保藏编号为CGMCC No.1650、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以引物1及引物2作为引物进行PCR反应，所述引物1的核苷酸序列如SEQ No.5所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ No.6所示；
B、PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA=1.0μL；10μM的引物1=0.5 μL；10μM的引物2=0.5μL；10mM的dNTP=1.0μL；10×缓冲液=2.5μL；5U/μL的Platinum Taq DNA聚合酶=0.5μL；加超纯水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min；
电泳检测PCR扩增产物为950bp左右；
C、PCR扩增产物DNA测序，去除影响测序准确性的两端引物序列后，得到代表三赞胶合成菌的核心保守序列920bp，即为用于鉴别三赞胶合成菌的特异性分子标记，核苷酸序列如SEQ No.13所示。
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