CN111500497B - 带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用 - Google Patents

带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于三赞胶的制备，特别是指一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用。是将带有分子标记且保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中通气发酵并经后提取制成，本发明解决了使用含有三赞胶的产品及合成菌缺乏快速鉴定的方法，所制备的三赞胶等主要性能指标低等问题。具有可以快速鉴定产品中是否含有三赞胶，所制备的三赞胶产品的主要技术指标明显高于现有产品等优点。

Description

带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞 胶制备中的应用
技术领域
本发明属于三赞胶的制备，特别是指一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用。
背景技术
三赞胶又称鞘氨醇胶Ss，是由三赞鞘氨醇单胞菌合成的一种新型微生物胶，具有优良的增稠、胶凝、乳化和悬浮稳定性能，是鞘氨醇胶类聚合物的一个新品种，也是第一个完全由国内自主研发并实现工业化生产的微生物源食品胶。根据《食品添加剂新品种申报与受理规定》和《食品添加剂新品种管理办法》的规定，2018年12月三赞胶已通过国家卫健委专家评审委员会技术审查，主要作为增稠剂、稳定剂和凝固剂，用于果蔬汁(浆)类饮料、植物蛋白饮料和肉灌肠等产品中。
从生产菌株保护和应用市场规范的角度出发，微生物胶中的三赞胶(特别是国内自主研发的三赞胶)需要一种鉴别三赞胶及其合成菌的方法。随着三赞胶的应用及推广，规范产品的应用市场，鉴别一种产品中是否添加了三赞胶成为一个亟需解决的问题。
目前三赞胶的工业化生产是以鞘氨醇单胞菌为生产菌种，以葡萄糖和无机氮源为主要原料，利用生物和化工技术，经过发酵、提取、干燥等工艺制成。
专利号为200610048338.X的发明专利中公开了一种鞘氨醇单胞菌以及采用该菌种生产微生物多糖的方法，是以拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650为菌种，在以葡萄糖或蔗糖培养基的碳源，在通风量0.2vvm-0.5vvm，搅拌转速120-160转/分钟，培养温度35℃-40℃，发酵周期为60-70小时的条件下制得三赞胶发酵液，发酵完成后的发酵液用可溶性中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后即得微生物多糖三赞胶，上述工艺的三赞胶收率约为18g/L左右，所制备的三赞胶的1％KCl溶液粘度1200MPa·s、0.25％合成盐水粘度300MPa·s、1％水溶液粘度600MPa·s、凝胶强度约为18g/cm2。
随着三赞胶的应用领域日益拓展以及对于其产品性能要求的提高，有效降低三赞胶的生产成本，提高三赞胶发酵收率，提高其产品包括1％KCl溶液粘度、0.25％合成盐水粘度、1％水溶液粘度、凝胶强度等性能指标，不仅是扩大三赞胶工业化应用领域的现实需求，而且也是本领域的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌。
本发明的目的之二在于提供一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在制备三赞胶中的应用。
本发明的整体技术构思是：
一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌，其保藏编号为CGMCCNo.19480，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，所述分子标记为SEQ No.1所示的核苷酸序列。
本发明的菌种为鞘氨醇单胞菌，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.19480，上述菌种申请人已于2020年3月16日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，简称CGMCC。
本发明中的菌种是对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCCNo.1650进行诱变得到，该菌种菌落形态呈圆形、颜色白色、隆起，在温度为28℃-32℃条件下培养100小时菌落直径0.3mm-0.5mm，菌种形态杆菌、不规则排列。该菌种所合成的三赞胶具有较好的粘度及凝胶特性等良好性能。
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为28℃-32℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
为便于菌种的生长以及合成终产物，优选的技术方案是，所述的步骤A的培养基中的碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合。
为便于菌体生长，更好地实现工业发酵并控制发酵周期，更为优选的技术方案是，所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为10％-20％的接种量将保藏编号为CGMCCNo.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
为便于菌种生长及合成终产物，所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源40％-60％；氮源3％-5％；硫酸镁1％-2％；磷酸氢二钾3％-4％；可溶二价铁盐3-5ppm；碳酸钙1％-3％；泡敌0.3％-0.5％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
为便于实现三赞胶的工业化生产，优选的技术方案是，所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为10％-20％的接种量接种于培养基中。
更为优选的技术方案是，所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为10％-20％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
更进一步，所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.5％-0.8％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为28℃-32℃，通风量0.4vvm-0.6vvm，种龄20-24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升斜面菌种培养基中包括如下质量的组分：
蔗糖1.2g；蛋白胨0.25g；磷酸氢二钾0.25g；酵母粉0.15g；磷酸氢二铵0.15g；硫酸镁0.01g；琼脂20g；pH＝7.0-7.2；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g-15g；氮源5g-8g；硫酸镁1g-2g；磷酸氢二钾3g-4g；可溶性亚铁盐3ppm-5ppm；泡敌0.3g-0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合。
更进一步，所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g-15g；氮源5g-8g；硫酸镁1g-2g；磷酸氢二钾3g-4g；可溶性亚铁盐3ppm-5ppm；泡敌0.3g-0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝10％-20％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度28℃-30℃，通风量0.4vvm-0.6vvm，种龄20-24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
更进一步，所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.5％-2.8％；麦芽糖1.5％-2.0％；豆粉0.8％-1.0％；硫酸铵0.2％-0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％-18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-32℃、通风量0.9vvm-1.0vvm、培养周期8-10小时。
为便于菌种生长以合成三赞胶，所述的步骤B中通风量为0.6-1.0vvm。
为便于发酵液粘度的检测，以利用发酵终点的控制，优选的技术方案是，所述的步骤B中发酵液粘度的测定方法如下：
(1)取约50ml发酵液，去掉表皮，用玻璃棒搅拌2-3圈；
(2)校正粘度计水平：调节底脚螺丝，使粘度计水平；
(3)安装转子：将4号转子轻轻旋转安装；
(4)将盛发酵液的烧杯置于升降台上，转子的正下方，调节升降台，使发酵液液面至转子的刻度线处；
(5)打开粘度计电源开关，调节粘度计转速为60转/分钟，待读值稳定后读取读值，粘度＝读值×100。
为便于从发酵液中提取三赞胶，优选的技术实现手段是，所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.5-2.0，升温到60-80℃，维持30-50分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的盐酸、硫酸、氯乙酸中的一种或其结合。
更为优选的技术实现手段是，所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或其混合物，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
发酵液中残糖的测定可以采用现有的教科书或工具书上记载的方法，其操作步骤是：
(1)用2.5毫升针管吸取1毫升发酵液于250毫升三角烧杯中；
(2)加蒸馏水5毫升，摇匀；
(3)用20毫升吸管准确吸取斐林试剂20毫升，加入到上述三角瓶中，摇匀；
(4)将三角瓶置于电炉加热，沸腾后保持沸腾1分钟，冷却至室温；
(5)加硫酸15ml(硫酸浓度2摩尔/升)，摇匀；
(6)用Na2S2O3(浓度0.1摩尔/升)标准液滴定至溶液呈淡黄色，然后加淀粉指示剂1ml(浓度1％)，继续滴定至蓝色消退，显示白色。读取硫代硫酸钠消耗体积数。(可预先加入10毫升硫代硫酸钠，加淀粉指标剂，再用0.1摩尔/升Na2S2O3标准液滴定)；
(7)计算：空白溶液消耗硫代硫酸钠毫升数减去样品消耗硫代硫酸钠毫升数，查糖含量表(克/100毫升)。
为验证本发明的所制备三赞胶的工艺以及产品性能，申请人进行了如下试验：
一、出胶率检测，方法如下：
(1)在烧杯中称量100克发酵液；
(2)加入约200毫升的盐酸溶液(盐酸浓度1：10-1：20)，玻璃棒搅拌至沉降完全，无包浆、过滤布挤干；
(3)挤干物料放入培养皿，撕碎放于烤灯下烘干(约4小时)；
(4)然后转入105℃烘箱中烘至恒重(约4小时)，取出于天平称量；
(5)计算公式如下：
出胶率＝(称样克数×1.08)÷体积×100％。
二、1％氯化钾溶液粘度的测定
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001克；高速搅拌器；布式粘度计：测定误差±5％，或其它同等性能粘度计；
2、测定条件
转子型号：3号转子；
转子转速：60转/分钟；
测定温度：25±1℃；
3、分析步骤
(1)含有1％试样和1％氯化钾的溶液的制备
用洁净、干燥的称量纸分别准确称取3克试样和3克氯化钾(精确至0.001克)，混合均匀。量取300毫升蒸馏水倒入盛液杯中。将上述盛水的盛液杯置于搅拌器下，开启搅拌器，转速8000转/分钟，将混合好的试样慢慢加入盛液杯中，并开始计时，连续搅拌15分钟。然后停止搅拌，取出盛液杯，用搅拌棒或其它类似物上下翻动溶液几下；
(2)测定
将含有1％试样和1％氯化钾的溶液置于高型烧杯中，在上述的测定条件下测定并读出粘度值。
三、0.25％合成盐水粘度的测定
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001g；高速搅拌器；布式粘度计：测定误差±5％，或其它同等性能粘度计；
2、测定条件
转子型号：1号转子；
转子转速：3转/分钟；
测定温度：25±1℃；
3、分析步骤
(1)制备合成盐水
准确称取10克NaCl和1.11克CaCl2溶于400毫升蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000毫升；
(2)溶液的制备
用洁净、干燥的称量纸准确称取1克试样(精确至0.001克)，量取400毫升合成盐水倒入盛液杯中；将盛液杯置于搅拌器下，开启搅拌器，转速为8000转/分钟，将试样慢慢加入盛液杯中，并开始计时，连续搅拌15分钟。停止搅拌，取出盛液杯，用搅拌棒或其它类似物上下翻动溶液几下；
(3)测定
将溶液置于高型烧杯中，在上述测定条件下测定并读出粘度值。
四、1％水溶液粘度的测定
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001克；高速搅拌器；布式粘度计：测定误差±5％，或其它同等性能粘度计；
2、测定条件
转子型号：3号转子；
转子转速：60转/分钟；
测定温度：25±1℃；
3、分析步骤
(1)溶液的制备
用洁净、干燥的称量纸准确称取3克试样(精确至0.001克)。量取300毫升蒸馏水倒入盛液杯中。将上述盛水的盛液杯置于搅拌器下，开启搅拌器，转速8000转/分钟，将试样慢慢加入盛液杯中，并开始计时，连续搅拌15分钟。然后停止搅拌，取出盛液杯，用搅拌棒或其它类似物上下翻动溶液几下；
(2)测定
将含有1％试样溶液置于高型烧杯中，在上述测定条件下测定并读出粘度值。
五、凝胶强度的测定
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001克；恒温箱：温度范围5℃-50℃；凝胶强度仪；水浴锅：控温范围：室温至100℃；
2、测试条件
探头形状与尺寸：1.0平方厘米不锈钢活塞式圆柱体；
探头移动速度：10毫米/秒；
3、分析步骤
(1)试样制备
称取3克试样(精确至0.001克)，在转速8000转/分钟搅拌的条件下慢慢加入到装有300毫升蒸馏水的盛液杯中，搅拌15分钟。将试样溶液倒入高型烧杯中，置于95℃的水浴锅内加热，用玻璃棒间断搅拌3次，每次搅拌5-10下，加热30分钟后取出烧杯，去掉上层泡沫，趁热将胶溶液倾入平底容器，液面高度为4厘米，静置，自然冷却至凝胶后，放入恒温箱中20℃静置20小时，待测；
(2)测定
用凝胶强度仪测定三个平行样，取算术平均值。
六、粒度的测定
1、仪器与设备
分析天平：精确至0.001克；标准筛：80目(0.175毫米孔径)筛；
2、分析步骤
称取试样50克(精确至0.001克)试样于80目(0.175mm孔径)筛中，立即手摇，拍击标准筛试样不再漏下为止，称取筛余物质量；
3、结果计算
粒度w按下式计算：
w＝(m-n)÷m×100％
式中：
m——称取试样质量，单位为克(g)；
n——筛余物质量，单位为克(g)；
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于2％。
七、白度的测定
1、原理
在规定条件下，通过样品对蓝光的反射率与标准白板对蓝光反射率进行对比，得到试样白度；
2、仪器
(1)白度仪：波长可调到457纳米，有合适的样品盒及标准白板，读值须精确至0.1；
(2)压样器；
3、操作过程
(1)样品预处理
试样应充分混匀；
(2)白度仪操作
按照白度仪使用说明完成调“黑”及白板标定；
(3)测定
按白度仪使用说明操作步骤，用压样器分别压制两个白度测试样品，用白度仪对试样进行平行测定，读取白度值；
(4)结果表示
①表示方法
以白度仪测定的蓝光白度值为试样的白度；
取平行试验的算术平均值为结果，保留一位小数；
②重复性
平行试验结果的绝对差值，不应超过0.2；
若超出上述限值，应重新测定。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明从三赞胶合成基因簇和比较基因组的角度，筛选出三赞胶及其合成菌的特异性分子标记，可以从包含三赞胶的中轻度加工产品中鉴别出三赞胶，具有检测时间短、准确性高的优点。
2、筛选出一株高产三赞胶且所合成的三赞胶产品性能上明显优于现有菌种的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CGMCC No.19480。
3、采用本发明的菌种制备三赞胶收率高于现有工艺，所制备的三赞胶在1％KCl溶液粘度、0.25％粘度(合成盐水)、1％水溶液粘度、凝胶强度等性能指标上明显优于现有三赞胶产品。
附图说明
本发明的附图有：
图1为三赞胶与温轮胶、结冷胶的多糖结构比较图，图中Glc为葡萄糖，Man为甘露糖，GlcA为葡萄糖醛酸，Rha为鼠李糖，Acetyl为乙酰基，Glyceroyl为甘油酰基。
图2为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas Sp.CGMCC No.19480与GenBank数据库中所有物种的核酸序列BLASTN比对时，得到的最高同源物种Bosea vavi loviae strain Vaf18的序列与本专利分子标记序列的比对图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。
实施例1
一种带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌，其保藏编号为CGMCCNo.19480，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，所述分子标记为SEQ No.1所示的核苷酸序列。
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为28℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
所述的步骤A的培养基中的碳源选自蔗糖；氮源选自蛋白胨。
所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为10％-20％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源40％；氮源3％；硫酸镁1％；磷酸氢二钾3％；可溶二价铁盐3ppm；碳酸钙1％；泡敌0.3％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomon as sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为10％的接种量接种于培养基中。
所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为10％-20％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.5％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为28℃，通风量0.4vvm，种龄20小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升斜面菌种培养基中包括如下质量的组分：
蔗糖1.2g；蛋白胨0.25g；磷酸氢二钾0.25g；酵母粉0.15g；磷酸氢二铵0.15g；硫酸镁0.01g；琼脂20g；pH＝7.0-7.2；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g；氮源5g；硫酸镁1g；磷酸氢二钾3g；可溶性亚铁盐3ppm；泡敌0.3g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖；氮源选自蛋白胨。
所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g；氮源5g；硫酸镁1g；磷酸氢二钾3g；可溶性亚铁盐3ppm；泡敌0.3g-0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖；氮源选自蛋白胨；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝10％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度28℃，通风量0.4vvm，种龄20小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.5％；麦芽糖1.5％；豆粉0.8％；硫酸铵0.2％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％-18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃、通风量0.9vvm、培养周期8小时。
所述的步骤B中通风量为0.60vvm。
所述的步骤B中发酵液粘度的测定方法如下：
(1)取约50ml发酵液，去掉表皮，用玻璃棒搅拌2-3圈；
(2)校正粘度计水平：调节底脚螺丝，使粘度计水平；
(3)安装转子：将4号转子轻轻旋转安装；
(4)将盛发酵液的烧杯置于升降台上，转子的正下方，调节升降台，使发酵液液面至转子的刻度线处；
(5)打开粘度计电源开关，调节粘度计转速为60转/分钟，待读值稳定后读取读值，粘度＝读值×100。
所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.5，升温到60℃，维持30分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的盐酸。
所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入碳酸钠，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为32℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
所述的步骤A的培养基中的碳源选自葡萄糖；氮源选自酵母膏。
所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为20％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源60％；氮源5％；硫酸镁2％；磷酸氢二钾4％；可溶二价铁盐5ppm；碳酸钙3％；泡敌0.5％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomon as sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为20％的接种量接种于培养基中。
所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为20％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.8％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为32℃，通风量0.6vvm，种龄24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源15g；氮源8g；硫酸镁2g；磷酸氢二钾4g；可溶性亚铁盐5ppm；泡敌0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自葡萄糖；氮源选自酵母膏。
所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源15g；氮源8g；硫酸镁2g；磷酸氢二钾4g；可溶性亚铁盐5ppm；泡敌0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自葡萄糖；氮源选自酵母膏；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝20％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量0.6vvm，种龄24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.8％；麦芽糖2.0％；豆粉1.0％；硫酸铵0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃、通风量1.0vvm、培养周期10小时。
所述的步骤B中通风量为1.0vvm。
所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝2.0，升温到80℃，维持50分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的硫酸。
所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入氢氧化钠，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
其余内容如前述。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为30℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
所述的步骤A的培养基中的碳源选自玉米绵白糖；氮源选自硝酸钠。
所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为15％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源50％；氮源4％；硫酸镁1.5％；磷酸氢二钾3.5％；可溶二价铁盐4ppm；碳酸钙2％；泡敌0.4％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为15％的接种量接种于培养基中。
所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为15％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.65％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为30℃，通风量0.5vvm，种龄22小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源13g；氮源6.5g；硫酸镁1.5g；磷酸氢二钾3.5g；可溶性亚铁盐4ppm；泡敌0.4g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自玉米绵白糖；氮源选自硝酸钠。
所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源13g；氮源6.5g；硫酸镁1.5g；磷酸氢二钾3.5g；可溶性亚铁盐4ppm；泡敌0.4g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自玉米绵白糖；氮源选自硝酸钠；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝15％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度29℃，通风量0.5vvm，种龄22小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.7％；麦芽糖1.7％；豆粉0.9％；硫酸铵0.25％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝15％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度31℃、通风量0.95vvm、培养周期9小时。
所述的步骤B中通风量为0.8vvm。
所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.7，升温到70℃，维持40分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的氯乙酸。
所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入氢氧化钾，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
其余内容如前述。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为29℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
所述的步骤A的培养基中的碳源选自淀粉水解糖；氮源选自氯化铵。
所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为13％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源45％；氮源3.5％；硫酸镁1.2％；磷酸氢二钾3.2％；可溶二价铁盐3.5ppm；碳酸钙1.5％；泡敌0.35％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomon as sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为13％的接种量接种于培养基中。
所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为13％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.55％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为29℃，通风量0.45vvm，种龄21小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源11g；氮源5.5g；硫酸镁1.2g；磷酸氢二钾3.2g；可溶性亚铁盐3.5ppm；泡敌0.35g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自淀粉水解糖；氮源选自氯化铵。
所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源115g；氮源5.5g；硫酸镁1.2g；磷酸氢二钾3.2g；可溶性亚铁盐3.ppm；泡敌0.35g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自淀粉水解糖；氮源选自氯化铵；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度28℃，通风量0.45vvm，种龄21小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.55％；麦芽糖1.6％；豆粉0.85％；硫酸铵0.22％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝13％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃、通风量0.92vvm、培养周期8.5小时。
所述的步骤B中通风量为0.7vvm。
所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.5-2.0，升温到65℃，维持35分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的盐酸与硫酸的混合物。
所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入碳酸钠与氢氧化钠的混合物，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
其余内容如前述。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为31℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
所述的步骤A的培养基中的碳源选自蔗糖与葡萄糖的混合物；氮源选自蛋白胨与硝酸钠的混合物。
所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为18％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源55％；氮源4.5％；硫酸镁1.8％；磷酸氢二钾3.8％；可溶二价铁盐4.5ppm；碳酸钙2.5％；泡敌0.45％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomon as sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为18％的接种量接种于培养基中。
所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为18％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.7％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为31℃，通风量0.55vvm，种龄23小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源14g；氮源7g；硫酸镁1.8g；磷酸氢二钾3.8g；可溶性亚铁盐4.5ppm；泡敌0.45g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖与葡萄糖的混合物；氮源选自蛋白胨与硝酸钠的混合物。
所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源14g；氮源7g；硫酸镁1.8g；磷酸氢二钾3.8g；可溶性亚铁盐4.5ppm；泡敌0.45g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖与葡萄糖的混合物；氮源选自蛋白胨与硝酸钠的混合物；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃，通风量0.55vvm，种龄23小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.7％；麦芽糖1.9％；豆粉0.95％；硫酸铵0.28％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝17％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度32℃、通风量0.98vvm、培养周期9.5小时。
所述的步骤B中通风量为0.9vvm。
所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.5-2.0，升温到75℃，维持45分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的硫酸与氯乙酸的混合物。
所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入氢氧化钠与氢氧化钾的混合物，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
其余内容如前述。
实施例6
取拉丁文名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.19480的鞘氨醇单胞菌发酵液，10000转/分钟，离心15分钟，收集菌体细胞，用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取。以引物1(5'-TCAGGCCGTGTGGGGAA-3'，SEQ2)、引物2(5'-GATCCGATCCAGCTTTCGGG-3'，SEQ3)为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，10mM的dNTP 1.0μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Platinum Taq DNA聚合酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃45秒，62℃45秒，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。取上述PCR扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，电泳，用GoldView核酸染料染色10分钟，观察到950bp左右的PCR扩增条带。将PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，得到以下序列：
ACGGCAGGACCTCGCCTTGCAGCAGCCGCGTCGCCTGGCGACGGTCGAGCGCGCGCGAGAAGAGGAAGCCTTGGCCATATTTGCAGCCATAGCGCTGCAGCAGCCGGCACTGCGCCTCCGTCTCGATTCCCTCGGCGACGACCCGCAGCTTGAGACCGTCGGCAATCGCGATCAGCCCCTGCACGATCGCAGCGCTGCCCGCATCGGTGCCGAGCTGCTGGACGAAGGAGCGGTCGATCTTGATGATGTCCACCGGCACCGAGAGCAGGTGCGTCAGCGAGGCATAGCCGGTACCGAAATCGTCGAGCGCGATGCGGAGCCCGCGCGCCTGCAATCCTTCGAGAACGCGGCGCACGGTATCGGCGCGCCGGTCCATATGGACCGTCTCGGTCACTTCGACGACCAGATGGCCGAGCGGCACGCGGGCATGCTCGAACGTGTCGGCCAGCGTGCGTTCGAGCAGGCCGCCGCCATGGATGTCGGCGGAGCCGACGTTGATCGAGATCTGCGGATCGGCGATGCCCAGCCGCATCCAGTGCGCGATGTCGCCGGCGACGATCCTCAGCATCCGTCGCGTGAGTTCCGGGGCGATGCGCGGGTGCGACATCGCTTGGTGGAAGGCGGCGGCCGGCAGCACTTCGCCCGTGGACGTCGTCAGGCGGCAGAGCGCCTCGAACGACGTTACCGCCCATGTCTCCAGTTCGACGACCGGCTGATAATAGGCGTCGATACGATCTTCGTGCAGTGCGCGCTCAAGATCGTGCAACGCGTCGGGATGGCTCGCCACCGCATTGCCCAGGCTCGCGGAATAAGCGAGGTGGCCGCCGCGGTGCGACTGCTTGGCGTGCTGCAGCGCATTGGTGGCATGTTCGAACAGAATGTCGGACGTCTTCGCCGGATCGCTGATCGCAAAGCCGATG
申请人对于实施例1-5中的产品性能及出胶率进行了检测，结果如下：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
1％KCl溶液粘度(25℃)/MPa·s 1650 1700 1650 1800 1650
0.25％合成盐水粘度(25℃)/MPa·s 550 600 550 700 550
1％水溶液粘度(25℃)/MPa·s 950 1000 950 1000 950
凝胶强度(g/cm<sup>2·</sup>) 30 35 30 35 30
0.175mm孔径筛粒度(％) 96 96 97 96 96
白度 47 47 51 50 48
出胶率(％) 3.01 3.21 3.4 3.08 3.2
通过上述对比不难看出，本发明实施例1-5的三赞胶的1％KCl溶液粘度、0.25％合成盐水粘度、1％水溶液粘度、凝胶强度以及出胶率均明显优于现有工艺及产品。
序列表
<110> 河北鑫合生物化工有限公司
<120> 带有分子标记的三赞胶合成菌--鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用
<130> 200610048338.X
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 920
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
acggcaggac ctcgccttgc agcagccgcg tcgcctggcg acggtcgagc gcgcgcgaga 60
agaggaagcc ttggccatat ttgcagccat agcgctgcag cagccggcac tgcgcctccg 120
tctcgattcc ctcggcgacg acccgcagct tgagaccgtc ggcaatcgcg atcagcccct 180
gcacgatcgc agcgctgccc gcatcggtgc cgagctgctg gacgaaggag cggtcgatct 240
tgatgatgtc caccggcacc gagagcaggt gcgtcagcga ggcatagccg gtaccgaaat 300
cgtcgagcgc gatgcggagc ccgcgcgcct gcaatccttc gagaacgcgg cgcacggtat 360
cggcgcgccg gtccatatgg accgtctcgg tcacttcgac gaccagatgg ccgagcggca 420
cgcgggcatg ctcgaacgtg tcggccagcg tgcgttcgag caggccgccg ccatggatgt 480
cggcggagcc gacgttgatc gagatctgcg gatcggcgat gcccagccgc atccagtgcg 540
cgatgtcgcc ggcgacgatc ctcagcatcc gtcgcgtgag ttccggggcg atgcgcgggt 600
gcgacatcgc ttggtggaag gcggcggccg gcagcacttc gcccgtggac gtcgtcaggc 660
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<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 3
gatccgatcc agctttcggg 20

Claims (15)

1.一种带有分子标记的 鞘氨醇单胞菌，其特征在于其保藏编号为CGMCC No.19480，其拉丁文名称为Sphingomonas sp.，所述分子标记为SEQ No.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用。
3.根据权利要求2所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源的灭菌后的培养基中；
B、在温度为28℃-32℃的条件下通风发酵，当发酵液粘度≥3000cp，残糖≤0.3％时发酵结束；
C、将发酵液经萃取、固液分离、中和、干燥、粉碎后得三赞胶。
4.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤A的培养基中的碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合。
5.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤A中按种子液：培养基的体积百分比为10％-20％的接种量将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接入发酵罐中的培养基中。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤A中培养基由如下质量百分数的组分组成：
碳源40％-60％；氮源3％-5％；硫酸镁1％-2％；磷酸氢二钾3％-4％；可溶二价铁盐3-5ppm；碳酸钙1％-3％；泡敌0.3％-0.5％；余量为水，pH＝7.0-7.2。
7.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤A是将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌经过扩大培养后，按照种子液：培养基的体积百分比为10％-20％的接种量接种于培养基中。
8.根据权利要求7所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的扩大培养过程包括：
(1)将保藏编号为CGMCC No.19480、拉丁文名称为Sphingomonas sp.的鞘氨醇单胞菌接种于一级种子培养基中经通气培养制成一级种子；
(2)将一级种子经扩大培养后制成二级种子；
(3)将制成的二级种子按二级种子：发酵培养基的体积百分比为10％-20％的接种量接入培养基中进行通气发酵。
9.根据权利要求8所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的扩大培养过程步骤(1)中制备一级种子的工艺条件是：将斜面菌种按照质量比为0.5％-0.8％接入灭菌后的一级种子培养基中，经通气培养制成一级种子，培养温度为28℃-32℃，通风量0.4vvm-0.6vvm，种龄20-24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染；
每升斜面菌种培养基中包括如下质量的组分：
蔗糖1.2g；蛋白胨0.25g；磷酸氢二钾0.25g；酵母粉0.15g；磷酸氢二铵0.15g；硫酸镁0.01g；琼脂20g；pH＝7.0-7.2；
每升一级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g-15g；氮源5g-8g；硫酸镁1g-2g；磷酸氢二钾3g-4g；可溶性亚铁盐3ppm-5ppm；泡敌0.3g-0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合。
10.根据权利要求8所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的扩大培养过程步骤(2)中二级种子培养基包括如下质量的组分：
碳源10g-15g；氮源5g-8g；硫酸镁1g-2g；磷酸氢二钾3g-4g；可溶性亚铁盐3ppm-5ppm；泡敌0.3g-0.5g；pH＝7.0-7.2；
其中碳源选自蔗糖、葡萄糖、玉米绵白糖、淀粉水解糖中的一种或其结合；氮源选自蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或其结合；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝10％-20％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度28℃-30℃，通风量0.4vvm-0.6vvm，种龄20-24小时，转种条件为显微镜镜检菌种杆菌、无规则排列、无污染。
11.根据权利要求10所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的二级种子培养液由如下质量百分含量的组分组成：
葡萄糖2.5％-2.8％；麦芽糖1.5％-2.0％；豆粉0.8％-1.0％；硫酸铵0.2％-0.3％；余量为无菌水；pH＝7.0-7.3；
接种量为一级种子：二级种子培养液的体积比＝12％-18％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是培养温度30℃-32℃、通风量0.9vvm-1.0vvm、培养周期8-10小时。
12.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤B中通风量为0.6-1.0vvm。
13.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤B中发酵液粘度的测定方法如下：
(1)取约50ml发酵液，去掉表皮，用玻璃棒搅拌2-3圈；
(2)校正粘度计水平：调节底脚螺丝，使粘度计水平；
(3)安装转子：将4号转子轻轻旋转安装；
(4)将盛发酵液的烧杯置于升降台上，转子的正下方，调节升降台，使发酵液液面至转子的刻度线处；
(5)打开粘度计电源开关，调节粘度计转速为60rpm，待读值稳定后读取读值，粘度＝读值×100。
14.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤C中的萃取是加入酸调节发酵液pH＝1.5-2.0，升温到60-80℃，维持30-50分钟；所述的酸为体积百分比浓度为10％的盐酸、硫酸、氯乙酸中的一种或其结合。
15.根据权利要求3所述的带有分子标记的鞘氨醇单胞菌在三赞胶制备中的应用，其特征在于所述的步骤C中的中和是将纤维状物料加入碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或其混合物，使中和后物料pH＝6.5-7.5，并使中和后的物料均匀、无颗粒。
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