CN109182486B - 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 - Google Patents
一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109182486B CN109182486B CN201811206214.9A CN201811206214A CN109182486B CN 109182486 B CN109182486 B CN 109182486B CN 201811206214 A CN201811206214 A CN 201811206214A CN 109182486 B CN109182486 B CN 109182486B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gum
- molecular marker
- primer
- mul
- pcr amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种可以同时扩增三赞胶、结冷胶和温轮胶分子标记的引物，所述分子标记的引物为SX‑1和SX‑2，所述引物SX‑1的序列为SEQ7，所述引物SX‑2的序列为SEQ8。三赞胶特异性分子标记为396bp，序列为SEQ11，结冷胶特异性分子标记为397bp，序列为SEQ12，温轮胶特异性分子标记为397bp，序列为SEQ13。本发明克服了通过多糖结构鉴别微生物胶时，方法复杂，检测时间长，费用昂贵的缺点，通过分子标记鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶，具有检测时间短、准确性高的优点，可以从包含三赞胶、结冷胶和温轮胶的中轻度加工产品中鉴别出这三种微生物胶。
Description
技术领域
本发明属于微生物胶鉴别技术领域，尤其是一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用。
背景技术
自然界中的许多微生物都具有合成生物聚合物的能力，这些聚合物主要由多糖组成，它们粘附在细胞表面或以不定形粘液状分泌到培养液中，对微生物有保护作用。一些微生物源的聚合物已经成为重要的生物技术产品，被称为微生物胶，在化工、食品等行业被广泛应用。目前已经商业化应用的微生物胶包括，野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestris)合成的黄原胶，出芽短梗霉(Aureobacidium pullulans)合成的普鲁兰多糖，产碱杆菌属菌株(Alcaligenes sp.)合成的可得然胶，肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)合成的右旋糖酐，鞘氨醇单胞菌属菌株(Sphingomonas sp.)合成的鞘氨醇胶(Sphingans)。鞘氨醇胶是鞘氨醇单胞菌属某些菌株合成的一类结构相似的多糖统称，这类多糖的主链都由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖或鼠李糖组成，但多糖的侧链基团种类、位置有极大的多样性，这赋予鞘氨醇胶每一成员独特的物理性质和广泛的用途。目前已商业化开发的鞘氨醇胶包括：少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461)合成的结冷胶(Gellan)，鞘氨醇单胞菌ATCC 31555(Sphingomonas sp.ATCC 31555)合成的温轮胶(Welan)和三赞鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)合成的三赞胶(Sanxan)。
结冷胶具有优良的增稠和胶凝性能，主要作为食品胶凝剂、稳定剂使用，近年来也逐渐用于生物医疗领域，作为药物的赋形剂和缓释剂，以及医学组织工程中的三维框架材料。温轮胶具有高粘度和优良的耐盐、耐温性能，主要用于水泥和混凝土中，能够增强泥浆的保水性。三赞胶具有优良的增稠性和剪切稀释性，还可以形成弹性凝胶，在食品领域用作增稠剂、稳定剂和凝固剂。
随着微生物胶应用范围的不断扩展，如何判断一个产品中添加了哪种微生物胶成为一个难题。虽然不同微生物胶的多糖结构各不相同，但组成这些多糖的单糖成分接近，而且食品领域的产品中大都添加有葡萄糖等糖组分，因此仅靠单糖组分的差别无法区分不同的微生物胶。靠多糖的结构差别可以鉴别微生物胶，但多糖的结构比较复杂，在分析方法上有许多困难，例如多糖没有特征吸收光谱，在检测上很不方便，需要纯化多糖和使用核磁共振等复杂的分析方法。
随着鞘氨醇胶的广泛应用，特别是三赞胶应用领域的不断扩展，如何保护三赞胶新产品使用的自主知识产权，规范这类产品的应用市场，成为一个亟需解决的问题，因此需要一种用于鉴定产品中三赞胶、结冷胶和温轮胶的检测技术。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用，本发明克服了通过多糖结构鉴别微生物胶时，方法复杂，检测时间长，费用昂贵的缺点，通过分子标记鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶，具有检测时间短、准确性高的优点，可以从包含三赞胶、结冷胶和温轮胶的中轻度加工产品中鉴别出这三种微生物胶。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物，所述分子标记的引物为SX-1和SX-2，所述引物SX-1的序列为SEQ7：5'taaggtccccaagtcacgtc 3'，所述引物SX-2的序列为SEQ8：5'tctctcaagcgccttggtat 3'。
利用所述的用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物获得的三赞胶的特异性分子标记，所述三赞胶的特异性分子标记为SEQ11。
如上所述的三赞胶的特异性分子标记在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面的应用。
一种如上所述的三赞胶的特异性分子标记的获得方法，步骤如下：
获得三赞胶合成菌的基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA 1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃30-45s，58-61℃30-45s，72℃45-60s，30个循环；72℃延伸10min；
电泳检测，三赞胶的PCR扩增产物为560bp；
三赞胶PCR产物直接测序，去除影响测序准确性的序列，得到代表三赞胶的核心保守序列396bp，即为三赞胶的特异性分子标记。
利用所述的用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物获得的结冷胶的特异性分子标记，所述结冷胶的特异性分子标记为SEQ12。
如上所述的结冷胶的特异性分子标记在包含结冷胶的中轻度加工产品中结冷胶的鉴别方面的应用。
一种如上所述的结冷胶的特异性分子标记的获得方法，步骤如下：
获得结冷胶合成菌的基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA 1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃30-45s，58-61℃30-45s，72℃45-60s，30个循环；72℃延伸10min；
电泳检测，结冷胶的PCR扩增产物为560bp；
结冷胶PCR产物直接测序，去除影响测序准确性的序列，得到代表结冷胶的核心保守序列397bp，即为结冷胶的特异性分子标记。
利用所述的用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物获得的温轮胶的特异性分子标记，所述温轮胶的特异性分子标记为SEQ13。
如上所述的温轮胶的特异性分子标记在包含温轮胶的中轻度加工产品中温轮胶的鉴别方面的应用。
一种如上所述的温轮胶的特异性分子标记的获得方法，步骤如下：
获得温轮胶合成菌的基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA 1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃30-45s，58-61℃30-45s，72℃45-60s，30个循环；72℃延伸10min；
电泳检测，温轮胶的PCR扩增产物为560bp；
温轮胶PCR产物直接测序，去除影响测序准确性的序列，得到代表温轮胶的核心保守序列397bp，即为温轮胶的特异性分子标记。
本发明的优点和积极效果是：
依靠多糖结构检测来鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶，需要分离得到高纯度的多糖样品，并进行核磁共振等复杂的仪器检测过程。不同微生物胶的合成菌各不相同，可以通过菌种来鉴别其多糖产物。由于纯化多糖的步骤复杂，成本很高，目前的微生物胶产品都不是完全的多糖纯组分，会含有菌体细胞，通过提取产品中的核酸组分，并检测代表微生物胶的特异性DNA分子标记可以鉴别产品中的微生物胶组分。本发明克服了通过多糖结构鉴别微生物胶时，方法复杂，检测时间长，费用昂贵的缺点，通过分子标记鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶，具有检测时间短、准确性高的优点，可以从包含三赞胶、结冷胶和温轮胶的中轻度加工产品中鉴别出这三种微生物胶。
附图说明
图1为本发明中引物SX-1/SX-2对微生物胶合成菌的PCR扩增产物电泳检测图谱，其中M为分子量标记，1为黄原胶，2为三赞胶，3为结冷胶，4为温轮胶，5为普鲁兰多糖，6为可得然胶，7为右旋糖酐；
图2为本发明中三赞胶、结冷胶和温轮胶分子标记DNA序列的同源性比对图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊规定，均为本领域内常用的原料；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记，所述分子标记的引物为SX-1和SX-2，所述引物SX-1的序列为SEQ7：5'taaggtccccaagtcacgtc 3'，所述引物SX-2的序列为SEQ8：5'tctctcaagcgccttggtat 3'。
上述用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记及其引物的获得方法，步骤如下：
1、用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物的获得方法，步骤如下：
将结冷胶合成菌Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461，温轮胶合成菌Sphingomonas sp.ATCC 31555和三赞胶合成菌Sphingomonas sanxanigenens，黄原胶合成菌Xanthomonas campestris，普鲁兰多糖合成菌Aureobacidium pullulans，可得然胶合成菌Alcaligenes sp.，右旋糖酐合成菌Leuconostoc mesenteroides，分别接种到装有100mL灭菌液体培养基的250mL三角瓶中，培养基配方(g/L)：葡萄糖12.0，麦芽浸粉4.0，蛋白胨2.5，酵母粉1.5，pH7.0。150r/min，30℃摇床震荡培养48h后，6000r/min，离心15min，收集菌体细胞备用。
按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行菌株基因组DNA提取，所得DNA溶液置于-20℃冻存，备用。
根据GenBank/EMBL/DDBJ数据库中结冷胶合成菌Sphingomonas paucimobilisATCC 31461，温轮胶合成菌Sphingomonas sp.ATCC 31555和三赞胶合成菌Sphingomonassanxanigenens的基因组信息，进行比较基因组分析，搜索鞘氨醇单胞菌属菌株独有，且三赞胶、结冷胶和温轮胶合成菌之间同源性小于95％的序列，并设计PCR扩增引物(如下表所示)：
| 编号 | 引物序列 | 编号 | 引物序列 |
| SEQ1： | cgtaacgacttccccactgt | SEQ6： | tatctcaagcgccttgatat |
| SEQ2： | gcctatcaacgtggtggtct | SEQ7： | taaggtccccaagtcacgtc |
| SEQ3： | gtaccgtgagggaaaggtga | SEQ8： | tctctcaagcgccttggtat |
| SEQ4： | ctcatgtctgcattcgcact | SEQ9： | cgtaacgacttccccactgt |
| SEQ5： | ggtccccaagtcacgtctaa | SEQ10： | gcgcgaatagagcaattagg |
以黄原胶、三赞胶、结冷胶、温轮胶、普鲁兰多糖、可得然胶、右旋糖酐合成菌的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA 1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP 0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，59℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。取上述PCR扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，电泳，用GoldView核酸染料染色10min，在凝胶成像仪中拍照。
其中引物7/8的PCR扩增结果如图1所示，可以看出三赞胶、结冷胶和温轮胶的PCR扩增条带均为560bp左右，黄原胶，普鲁兰多糖，可得然胶和右旋糖酐均无扩增条带出现，实现了从微生物胶产品中鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的目的。选择引物7和8作为三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的PCR扩增引物，分别命名为引物SX-1和SX-2。
将三赞胶、结冷胶和温轮胶的PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶、结冷胶和温轮胶的特异性分子标记。
三赞胶的特异性分子标记396bp，具体序列SEQ11如下：
结冷胶的特异性分子标记397bp，具体序列SEQ12如下：
温轮胶的特异性分子标记397bp，具体序列SEQ13如下：
用软件DNAMAN8对三赞胶、结冷胶和温轮胶的特异性分子标记进行同源性比对，结果如图2所示，三赞胶与结冷胶分子标记的同源性为91.94％，三赞胶与温轮胶分子标记的同源性为92.44％，结冷胶与温轮胶分子标记的同源性为94.46％，说明三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记具有特异性，实现了用同一对引物进行PCR扩增，而分子标记序列可以彼此区分鉴别的目标。
本发明用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的相关应用：
实施例1
分子标记的检测：
样品种类：使用三赞胶的悬浮饮料，果蔬汁(浆)类饮料和植物蛋白饮料等。
取500mL样品，加入500mLCTAB缓冲液(CTAB10g，NaCl40.95g，Tris6.05g，Na2EDTA3.75g，PVP-4010g)，于大容量涡旋震荡器上混合10min，65℃温育30min，期间每隔5min颠倒样液3次，混合样品。加入1000mL的氯仿-异戊醇(氯仿：异戊醇的体积比为24:1)，涡旋震荡5min，37℃温育15min，12000×g离心5min。吸取上清液，加入500mL于4℃预冷的异丙醇，4℃静置10min，将所有溶液加到可特异性吸附核酸DNA的硅膜离心吸附柱上，8000×g离心1min，弃去收集管中的废液；向离心柱中加入4℃预冷的70％乙醇，10000×g离心1min，弃去收集管中的废液，用70％乙醇重复洗涤一次。将吸附柱放回收集管中，12000×g离心5min，室温下放置至吸附柱上的液体挥干。取出吸附柱，置于干净的离心管中，在吸附柱中央加入200μL预热到65℃的TE缓冲液，室温静置1min，10000×g离心1min洗脱DNA，4℃保存备用。
以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，59℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增条带为560bp左右，PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记。
因此，本发明三赞胶的特异性分子标记能够应用在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面。
实施例2：
分子标记的检测：
样品种类：使用三赞胶的可食用膜，保鲜浸膜和肉灌肠类产品。
取50g样品，加入100mLTE溶液中，涡旋震荡，用200目的尼龙滤布过滤，收集滤液；另取50g样品，放入滤液中，重复上述操作；反复10次，收集到的滤液中加入100mLCTAB缓冲液(CTAB2g，NaCl8.19g，Tris1.21g，Na2EDTA0.75g，PVP-402g)，涡旋震荡10min，65℃温育30min，期间每隔5min颠倒样液3次，混合样品。加入200mL的氯仿-异戊醇(氯仿：异戊醇的体积比为24:1)，涡旋震荡5min，37℃温育15min，12000×g离心5min。吸取上清液，加入100mL于4℃预冷的异丙醇，4℃静置10min，将所有溶液加到可特异性吸附核酸DNA的硅膜离心吸附柱上，8000×g离心1min，弃去收集管中的废液；向离心柱中加入4℃预冷的70％乙醇，10000×g离心1min，弃去收集管中的废液，用70％乙醇重复洗涤一次。将吸附柱放回收集管中，12000×g离心5min，室温下放置至吸附柱上的液体挥干。取出吸附柱，置于干净的离心管中，在吸附柱中央加入100μL预热到65℃的TE缓冲液，室温静置1min，10000×g离心1min洗脱DNA，4℃保存备用。
以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，59℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增条带为560bp左右，PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记。
因此，本发明三赞胶的特异性分子标记能够应用在包含三赞胶的中轻度加工产品中三赞胶的鉴别方面。
实施例3：
分子标记的检测：
样品为使用结冷胶的悬浮饮料。
DNA提取方法同实施例1，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，59℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增条带为560bp左右，PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表结冷胶的特异性分子标记。
因此，本发明结冷胶的特异性分子标记能够应用在包含结冷胶的中轻度加工产品中结冷胶的鉴别方面。
实施例4：
分子标记的检测：
样品为质量浓度为0.2％的温轮胶溶液。DNA提取方法同实施例1，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10-30ng/uL的模板DNA1μL，10μM的引物SX-10.5μL，10μM的引物SX-20.5μL，10mM的dNTP0.5μL，10×缓冲液2.5μL，5U/μL的Taq酶0.5μL，加水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃45s，59℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增条带为560bp左右，PCR扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表温轮胶的特异性分子标记。
因此，本发明温轮胶的特异性分子标记能够应用在包含温轮胶的中轻度加工产品中温轮胶的鉴别方面。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 1
cgtaacgact tccccactgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 2
gcctatcaac gtggtggtct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 3
gtaccgtgag ggaaaggtga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 4
ctcatgtctg cattcgcact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 5
ggtccccaag tcacgtctaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 6
tatctcaagc gccttgatat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 7
taaggtcccc aagtcacgtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 8
tctctcaagc gccttggtat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 9
cgtaacgact tccccactgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> PCR扩增引物(Unknown)
<400> 10
gcgcgaatag agcaattagg 20
<210> 11
<211> 396
<212> DNA/RNA
<213> 三赞胶的特异性分子标记(Unknown)
<400> 11
cctttaaaga aagcgtaaca gctcactggt ctaaacaaga gatcctgcgg cgaagatgta 60
acggggctca agacgtgcac cgaagcttag ggtgtggatt tgtccacgcg gtagcggagc 120
gttccgtaag ccggtgaagc ggtctggtaa tggaccgtgg aggtatcgga agtgcgaatg 180
cagacatgag tagcgataaa gagggtgaga tgccctctcg ccgaaagccc aagggttcct 240
gcgcaaggct aatccgcgca gggtgagtcg gcccctaaga cgagcccgaa gggggtagtc 300
gatgggaatc aggttaatat tcctgaacct ggtggtgtgt gacggatctc gtgtgttgtc 360
atcccttaac ggattgggat ggcctcgaag aggttc 396
<210> 12
<211> 397
<212> DNA/RNA
<213> 结冷胶的特异性分子标记(Unknown)
<400> 12
cctttaaaga aagcgtaaca gctcactggt ctaaacaagg gtttctgcgg cgaagatgta 60
acggggctca agacacgcac cgaagcttag ggtgtgatct ttgatcacgc ggtagcggag 120
cgttccgtaa gcctgcgaag cgatctggta atgggtcgtg gaggtatcgg aagtgcgaat 180
gcagacatga gtagcgataa agagggtgag atgccctctc gccgaaagac caagggttcc 240
tgcgcaaggc taatccgcgc agggtgagcc ggcccctaag acgagcccga agggggtagt 300
cgatgggaac cacgttaata ttcgtgggcc tggtggtgtg tgacggatct cgtgtgttgt 360
acgtccttat cggattggac gtgcctcgaa gaggtcc 397
<210> 13
<211> 397
<212> DNA/RNA
<213> 温轮胶的特异性分子标记(Unknown)
<400> 13
cctttaaaga aagcgtaaca gctcactggt ctaaataagg gttcctgcgg cgaagatgta 60
acggggctca agacgtgcac cgaagcttag ggtgtgatct ttgatcacgc ggtagcggag 120
cgttccgtaa gcctgtgaag tggaagggta accgaccatg gaggtatcgg aagtgcgaat 180
gcagacatga gtagcgataa agagggtgag atgccctctc gccgaaagac caagggttcc 240
tgcgcaaggc taatccgcgc agggtgagcc ggcccctaag acgagcccga agggggtagt 300
cgatgggaac cacgttaata ttcgtgggcc tggtggtgtg tgacggatct cgtgagttgt 360
cagtccttaa cggattggac tggcttcgaa gaggtcc 397
Claims (2)
1.利用一种引物鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的方法，其特征在于：所述引物为SX-1和SX-2，所述引物SX-1的序列为SEQ ID No.7，所述引物SX-2的序列为SEQ ID No.8；
步骤如下：
以三赞胶、结冷胶和温轮胶合成菌的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增；
通过电泳检测PCR扩增产物，其PCR扩增条带均为560bp；
分别对上述PCR扩增产物进行DNA测序，去除影响测序准确性的引物附近序列，得到代表三赞胶的特异性分子标记396bp，具体序列为SEQ ID No.11，代表结冷胶的特异性分子标记397bp，具体序列为SEQ ID No.12，代表温轮胶的特异性分子标记397bp，具体序列为SEQID No.13，上述分子标记序列能够彼此区分鉴别的目标。
2.根据权利要求1所述的利用一种引物鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的方法，其特征在于：
PCR扩增体系为：10-30ng/μL的模板DNA 1μL，10 μM的引物SX-1 0.5 μL，10μM的引物SX-2 0.5 μL，10mM的dNTP 0.5 μL，10×缓冲液 2.5 μL，5 U/μL的Taq酶 0.5 μL，加水至25μL；
PCR反应条件为：95℃预变性 5min；94℃ 30-45s，58-61℃ 30-45s，72℃ 45-60s，30个循环；72℃延伸10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811206214.9A CN109182486B (zh) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811206214.9A CN109182486B (zh) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109182486A CN109182486A (zh) | 2019-01-11 |
| CN109182486B true CN109182486B (zh) | 2021-11-19 |
Family
ID=64945451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811206214.9A Active CN109182486B (zh) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109182486B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111440885B (zh) * | 2020-04-27 | 2023-03-31 | 河北鑫合生物化工有限公司 | 用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用 |
| CN111500497B (zh) * | 2020-04-27 | 2022-09-06 | 河北鑫合生物化工有限公司 | 带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用 |
| CN111955536B (zh) * | 2020-08-21 | 2022-04-15 | 天津农学院 | 一种三赞胶在涂膜保鲜剂方面中的应用、基于三赞胶的涂膜保鲜剂和制备方法 |
| CN112314861A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-05 | 河南工业大学 | 一种高拉伸性能冷冻熟面的制备工艺 |
| CN114014944B (zh) * | 2021-11-05 | 2022-08-26 | 南开大学 | 一种天然合成的低酰基三赞胶及其生产方法和鉴定方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899505A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-12-01 | 浙江省林业科学研究院 | 鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物及方法 |
| CN102703427A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-10-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法 |
| CN103114149A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-05-22 | 浙江省林业科学研究院 | 鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法 |
| CN108719730A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-02 | 天津农学院 | 三赞胶在悬浮稳定剂中的应用、用于制备悬浮饮料的悬浮稳定剂和悬浮饮料 |
-
2018
- 2018-10-17 CN CN201811206214.9A patent/CN109182486B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899505A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-12-01 | 浙江省林业科学研究院 | 鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物及方法 |
| CN102703427A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-10-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法 |
| CN103114149A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-05-22 | 浙江省林业科学研究院 | 鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法 |
| CN108719730A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-02 | 天津农学院 | 三赞胶在悬浮稳定剂中的应用、用于制备悬浮饮料的悬浮稳定剂和悬浮饮料 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 三赞胶对钻井液性能影响的研究;杨振杰等;《精细与专用化学品》;20100621;第27-31+35页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109182486A (zh) | 2019-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109182486B (zh) | 一种用于鉴别三赞胶、结冷胶和温轮胶的分子标记的引物及分子标记和应用 | |
| CN111440885B (zh) | 用于三赞胶及其合成菌鉴别的分子标记及其制备和应用 | |
| CN103772520B (zh) | 高粘度迪优坦胶及其制备方法 | |
| JPS63240780A (ja) | シユードモナス種 ａｔｃｃ ３１４６１ の凍結乾燥培養物 | |
| CN111500497B (zh) | 带有分子标记的三赞胶合成菌——鞘氨醇单胞菌及其在三赞胶制备中的应用 | |
| CN106399199B (zh) | 一种土壤类芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104945527A (zh) | 一种半乳甘露聚糖抗原及其制备方法 | |
| SU923374A3 (ru) | Способ получени биомассы микроорганизмов | |
| CN106434475B (zh) | 一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用 | |
| CN113265337B (zh) | 一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用 | |
| CN105063016A (zh) | 一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法 | |
| JP5969390B2 (ja) | フコース含有細菌バイオポリマー | |
| WO2006047845A1 (en) | Process for preparing a xanthan biopolymer | |
| JP5953078B2 (ja) | 新規微生物およびその変異株並びにそれを用いた多糖類の製造方法 | |
| CN113956372B (zh) | 一种高酰基三赞胶及其生产菌株的分子标记和应用 | |
| US5043287A (en) | Recovery of water soluble biopolymers from an aqueous solution by employing a polyoxide | |
| Yanti et al. | Characterization of the gene encoding chitinase enzyme from bacillus isolates insulated from some locations in Southeast Sulawesi | |
| JP2003277416A (ja) | 糖類を含むアクリルアミド水溶液 | |
| CN114230681A (zh) | 一种胞外多糖提取物、胞外多糖及其应用 | |
| Revin et al. | Characteristics of the New Xanthan-Producing Strain Xanthomonas campestris М 28: Study of the Genome, Cultivation Conditions, and Physicochemical and Rheological Properties of the Polysaccharide | |
| Jindal et al. | Isolation of microbial polysaccharides | |
| JP3899462B2 (ja) | ガン細胞アポトーシス誘導剤 | |
| CN1771331B (zh) | 用于检测沙门氏菌种的stn基因寡核苷酸引物及使用该引物的检测方法 | |
| CN110241096A (zh) | 一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694及其用途 | |
| JP2002065292A (ja) | 多糖類の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |