CN102703427A - 基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法，是将一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存；所述凝胶的熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，解决了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。本发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物试剂保存技术领域，具体涉及一种生化试剂组合物的保存方法，确切地说是分子生物学中核酸等温扩增反应试剂及试剂混合物的常温保存方法。
背景技术
在过去的20年里，以多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技术，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用；尤其是在核酸检测及诊断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。
虽然等温扩增技术本身优势明显，但基于等温扩增技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰。其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于等温扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。
对于大规模生产、商品化的基于等温扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。申请号为200810159414.3的发明专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法”公开了一种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法，但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸等温扩增试剂的保存方法，能够使核酸等温扩增反应试剂的混合物在常温或室温长期保存，从而弥补现有技术的不足。
本发明的保存方法，是将一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。
上述的凝胶，其熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。
上述的凝胶，还包括有熔点高于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，添加比例不高于熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。
上述的核酸等温扩增反应液的组分为用于核酸等温扩增的聚合酶。
上述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）和/或三磷酸核苷酸（NTP）、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。
上述的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。
上述的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。
本发明的保存方法，一种操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。
本发明的保存方法，另一种操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质与水混合加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到核酸等温扩增反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。
上述的可形成凝胶的物质在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.01%~30%。
上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。
上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。
上述能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖（又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰）、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸（又称藻酸、褐藻酸、海藻素）、海藻酸盐（如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶）、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶中的任一种或几种。
上述能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任一种或几种。
上述的凝结多糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.2%~3%，优选为0.5%~2%。
上述的超低熔点琼脂糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.3%~3.5%，优选为0.5%~3%。
本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物（核酸等温扩增反应液），可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
具体实施方式
在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂（即核酸等温扩增反应液的组分）如引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）或三磷酸核苷酸（NTP）、聚合酶（DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等）、聚合酶的反应缓冲液（不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂）等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下1~2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液（即等温扩增反应试剂混合物）中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；在常温或室温条件下，等温扩增反应液（即等温扩增反应试剂混合物）中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法参与基因扩增。申请人在长期的研究中发现，在等温扩增反应试剂混合物中添加0.01%~30%（W/V，即重量体积比）可以形成凝胶的物质，加热至合适的温度使凝胶分子熔解（或溶解），然后使反应试剂混合物温度下降，混合物可由液态变为固态（或半固态）的凝胶，聚合酶分子就会被凝胶分子形成的三维网状结构所固定，酶分子的空间结构（三维结构或高级结构）得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持；凝胶也会将等温扩增反应试剂混合物中的引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）或三磷酸核苷酸（NTP）及聚合酶反应缓冲液中的各种成分固定，使其包埋在凝胶分子形成的微孔内，彼此间形成物理性的隔断，同时也隔绝空气，从而使等温扩增反应试剂混合物的各种成分得以长期稳定保存。
而当需要使用添加了凝胶的等温扩增反应试剂混合物（即含有凝胶的核酸等温扩增反应液）时，可在其中加入核酸模板，加热到一定温度进行保温，在这一温度下凝胶完全熔化成液态，等温扩增反应即可顺利进行。在较便利的贮存条件下（如常温或室温）和一定的贮存期内，上述添加凝胶后的等温扩增反应试剂混合物进行等温扩增反应所得的结果与用新鲜配制的反应混合物所得到的结果完全相同。
因不同类型的等温扩增所需的最适反应温度不同，所以不同类型的等温扩增反应试剂混合物需要添加不同种类、不同熔点的凝胶或其不同比例的混合物来实现基于凝胶固定的常温长期保存。实际使用中，应根据等温扩增所需要的最适温度选择在该温度下能够完全或部分熔解的凝胶以取得较佳保护及扩增效果；通常情况下，所选用的凝胶的熔点应低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度，有时为了提高凝胶的强度，可以添加部分熔点高于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，但这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，且添加比例不高于熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%，如可利用“10%明胶+0.1%结冷胶”的方式提高明胶的强度，或可利用“2.0%琼脂糖+0.2%聚丙烯酰胺”的方式提高琼脂糖凝胶的强度（上述百分比表示凝胶在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度，为质量体积百分比g/ml）。
上述凝胶是指溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接或自身分子吸水膨胀，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体的一种特殊的分散体系。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析
1.LAMP反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物6048μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl26mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶2016U）按每管432μL分装于14个1.5mL的离心管中，按表1第1列（共14行，包括不添加凝胶的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物6048μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶2016U）按每管432μL分装于14个1.5mL的离心管中，按表2第1列（共14行，包括不添加凝胶的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟（应低于Bst DNA聚合酶的灭活温度80℃），使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的LAMP反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于56个装有混合有凝胶的LAMP反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于63°C保温60min进行LAMP反应。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳线对照均显绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（LAMP反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4°C、20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表1和表2。对上述部分阳性对照、空白对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表1和2）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。
表1.不同浓度、不同种类凝胶对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表2.两种以上凝胶对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例2核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析
1.NASBA反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存
按照如下的配方配制NASBA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.5）、70mM KCl、12mM MgCl2、1mM dNTP、2mM NTP、15%DMSO、10mM DTT、引物各0.2μM、40U T7RNA聚合酶、8U AMV逆转录酶、0.2U RNase H、20U RNasin和2μgBSA，共配制3456μL。按每管432μL分装于8个1.5mL的离心管中，按表3第1列（共8行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于40~55℃保温5分钟（应低于T7RNA聚合酶和AMV逆转录酶的灭活温度70℃），使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.NASBA反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存
按照如下的配方配制NASBA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.5）、70mM KCl、12mM MgCl2、1mM dNTP、2mM NTP、15%DMSO、10mM DTT、引物各0.2μM、40U T7RNA聚合酶、8U AMV逆转录酶、0.2U RNase H、20U RNasin和2μg BSA，共配制2592μL。按每管432μL分装于6个1.5mL的离心管中，按表4第1列（共6行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于40~45℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.NASBA反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次28个的NASBA反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾桃拉病毒（Taurasyndrome viru，TSV）的核酸（呈TSV阳性的对虾的RNA，30ng/μL）28μL等量分装于28个装有混合有凝胶的NASBA反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的NASBA反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于41°C保温120min进行NASBA反应，然后将反应管置于-20℃终止反应。
3）利用Merck-Novagen的GeBAflex-tube回收各0.2mL的离心管中NASBA的反应产物：将0.2mL的离心管中含有反应产物的凝胶转移入GeBAflex-tube中，加入0.1倍体积的KAc（试剂盒提供）和等体积的异丙醇混合，-20℃保温10min，4℃条件下10000rpm离心30min，用70%冰冷的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃条件下10000rpm离心5min，室温下干燥沉淀，然后用DEPC水重溶即可得到反应产物。
4）利用地高辛标记的探针检测反应产物。
检测结果显示，实验设置的阳线对照有杂交信号，表明该NASBA反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（NASBA反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）无杂交信号，表明NASBA反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4°C、20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的NASBA反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表3和表4。
添加不同浓度、不同种类凝胶的NASBA反应试剂混合物的保存效果的检测结果（见表3和4）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物大部分具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物部分具有正常的反应活性。
选用的NASBA引物为TSV的特征引物（引物序列参见Teng PH,Chen CL,Wu CN,Wu SY，Ou BR,Lee PY.Rapid and sensitive detection of Taura syndromevirus using nucleic acid-based amplification.Dis Aquat Organ.2006,21;73(1):13-22.），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表3.不同浓度、不同种类凝胶对NASBA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示NASBA反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的NASBA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示NASBA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示NASBA反应试剂混合物没有扩增活性。
表4.两种以上凝胶对NASBA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示NASBA反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的NASBA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示NASBA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示NASBA反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例3连替代扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析
1.SDA反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存
按照如下的配方配制SDA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.0）、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM dNTP、5mM DTT、50μg/mL BSA（牛血清白蛋白）、5μM SSB（单链结合蛋白）、引物各0.5μM、400nM（0.45U/μL）DNA聚合酶（SequenaseTM Version 2.0）和3nM（0.04U/μL）限制性内切酶Nt.BspQI，配制3456μL。按每管432μL分装于8个1.5mL的离心管中，按表5第1列（共8行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于37~50℃保温5分钟（应低于限制性内切酶Nt.BspQI的灭活温度65℃），使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.SDA反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存
按照如下的配方配制SDA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.0）、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM dNTP、5mM DTT、50μg/mL BSA（牛血清白蛋白）、5μM SSB（单链结合蛋白）、引物各0.5μM、400nM(0.45U/μL)DNA聚合酶（SequenaseTM Version 2.0）、3nM(0.04U/μL)限制性内切酶Nt.BspQI，配制2592μL。按每管432μL分装于6个1.5mL的离心管中，按表6第1列（共6行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按不同凝胶的溶解温度于37~40℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.SDA反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述9个贮存时间段，共需进行18批次、每批次28个的SDA反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的阳性质粒（20ng/μL）28μL等量分装于28个装有混合有凝胶的SDA反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的SDA反应液24μL，添加阳性模板核酸（20ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于40°C保温60min进行SDA反应，然后将反应管置于-20℃终止反应。
3）利用Merck-Novagen的GeBAflex-tube回收各0.2mL的离心管中SDA的反应产物：将0.2mL的离心管中含有反应产物的凝胶转移入GeBAflex-tube中，加入0.1倍体积的KAc（试剂盒提供）和等体积的异丙醇混合，-20℃保温10min，4℃条件下10000rpm离心30min，用70%冰冷的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃条件下10000rpm离心5min，室温下干燥沉淀，然后用水重溶即可得到反应产物。
4）反应产物的电泳检测
上述纯化后的SDA反应产物在含有2%琼脂糖的凝胶中进行电泳，电泳结束后用Genefingder染色，然后用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。检测结果显示，实验设置的阳线对照有目的条带出现，表明该SDA反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（SDA反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）无目的条带，表明SDA反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4°C、20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的SDA反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表5和表6。
添加不同浓度、不同种类凝胶的SDA反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表5和6）表明：保存时间为1个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物一小部分具有正常的反应活性。
选用的阳性片段、SDA引物、扩增方法参见文献Aric Joneja，XiaohuaHuang.Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNAamplification.Anal Biochem,2011;414(1):58-69.，其中引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表5.不同浓度、不同种类凝胶对SDA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示SDA反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的SDA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示SDA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示SDA反应试剂混合物没有扩增活性。
表6.两种以上凝胶对SDA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示SDA反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的SDA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示SDA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示SDA反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例4环介导等温扩增（LAMP）反应试剂混合物添加预混凝胶后的保存效果分析
1.LAMP反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类的预混凝胶进行保存
首先按表7第1列（共14行）所示的浓度和种类配制2倍于表中浓度的预混凝胶；将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物3024μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl26mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶2016U）按每管216μL分装于14个1.5mL的离心管中；将上述2倍于表中浓度的预混凝胶置于凝胶的熔点温度下熔解凝胶，按表7第1列所示的浓度和种类向上述每个1.5mL的离心管（共14个）中加入216μL重熔的凝胶的并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分分散于溶液中，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上预混凝胶进行保存
首先按表8第1列（共14行）所示的浓度和种类配制2倍于表中浓度的预混凝胶；将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物3024μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶2016U）按每管216μL分装于9个1.5mL的离心管中；将上述2倍于表中浓度的预混凝胶置于凝胶的熔点温度下熔解凝胶，按表8第1列所示的浓度和种类向上述每个1.5mL的离心管（共14个）中加入216μL重熔的凝胶的并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分分散于溶液中，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的LAMP反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的WSSV的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于56个装有混合有凝胶的LAMP反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照步骤1中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于63°C保温60min进行LAMP反应。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳线对照均显色绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（LAMP反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4°C、20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表1和表2。对上述部分阳性对照、空白对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表7和8）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。该结果与向等温扩增反应混合物中直接添加凝胶物质后反应混合物反应活性保持时间的结果一致。
表7.不同浓度、不同种类预混凝胶对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表8.两种以上预混凝胶对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例5凝胶固定化Bst DNA聚合酶长期保存后对LAMP扩增效果影响分析
1.添加不同浓度和不同种类凝胶对BstDNA聚合酶进行固定化并储藏
按表9第1列（共14行）所示的浓度和种类向14个装有100μLBst DNA聚合酶（2U/μL）的1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将上述1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中含有Bst DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.添加两种及两种以上凝胶对Bst DNA聚合酶固定化并储藏
按表10第1列（共14行）所示的浓度和种类向14个装有100μL Bst DNA聚合酶（4U/μL）的1.5mL的离心管中加入相应的可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中含有Bst DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.凝胶固定化Bst DNA聚合酶长期储藏后对LAMP扩增效果的影响检验
保存于4℃装有固定化Bst DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有固定化Bst DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有固定化Bst DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的固定化Bst DNA聚合酶的有效性检测，每次检测的时候需将除被测样品核酸、Bst DNA聚合酶以外的各种LAMP反应试剂的混合物1120μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%）按每管20μL的量分装于每批次抽检的56个0.2mL的离心管中，再将变性后的WSSV的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于上述每批次的56个装LAMP反应试剂混合物的0.2mL的离心管中，然后按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解。同时，配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述0.2mL的离心管于63°C保温60min进行LAMP反应。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳线对照均显色绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存的Bst DNA聚合酶）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4°C、20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表9和表10。对上述部分阳性对照、空白对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表9和10）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。
表9.不同浓度、不同种类凝胶对对BstDNA聚合酶的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表10.两种以上凝胶对Bst DNA聚合酶的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何凝胶的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
上述实施例中选用的LAMP引物FIP、BIP、F3和B3为对虾白班综合征病毒（WSSV）的特征引物（引物序列参见Kono T,Savan R,Sakai M,Itami T.Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermalamplification.J Virol Methods.2004;115(1):59-65.），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
由于等温扩增反应试剂中包含聚合酶等易丧失活性的成分，所以目前等温扩增反应试剂的保存和运输都是采用冰箱、冰袋或干冰等维持低温的条件下进行的，这不仅导致等温扩增反应试剂的储运难度加大还增加了相关等温扩增技术的使用成本；采用本发明方法处理等温扩增反应试剂后，等温扩增反应试剂可实现常温（20℃）贮存3个月仍保持有正常的反应活性，这无疑为等温扩增反应试剂的储运提供了很便捷的选择。同时本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂或其混合物在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用。
本发明实施例中所用的试剂和材料来源如下：凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钙、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、甜菜碱（Betaine）等均购自Sigma公司，魔芋胶购自汕头市捷成生物科技有限公司，Tris-HCl、KCl、MgSO4、MgCl2、(NH4)2SO4、Triton X-100和牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程技术服务有限公司，各种DNA聚合酶、RNA聚合酶和SSB等购自NEB公司，AMV反转录酶购自Promega公司，核酸染料GeneFinderTM购自厦门百维信生物科技有限公司。采用市售的其它同类产品也可以实现本发明。
Claims (17)
1.一种基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法，其特征在于所述的保存方法是将一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。
2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，其熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。
3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，还包括有熔点高于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，且熔点高于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的添加质量不高于熔点低于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%。
4.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为用于核酸等温扩增的聚合酶。
5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸dNTP和/或三磷酸核苷酸NTP、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。
6.如权利要求4或5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。
7.如权利要求4或5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
8.如权利要求5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为依赖核酸序列的扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。
9.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固进行保存。
10.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质与水混合加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到核酸等温扩增反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。
11.如权利要求9或10所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.01%~30%。
12.如权利要求9或10所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。
13.如权利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶中的任一种或几种。
14.如权利要求9或10所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。
15.如权利要求14所述的能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任一种或几种。
16.如权利要求13所述的保存方法，其特征在于所述的凝结多糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.2%~3%。
17.如权利要求13所述的保存方法，其特征在于所述的超低熔点琼脂糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.3%~3.5%。
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