CN102703433B - 基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂，所述的保存方法是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。本发明方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物试剂保存技术领域，具体涉及一种生化试剂组合物的保存方法，确切地说是分子生物学中核酸等温扩增反应试剂及其混合物的常温保存方法，以及采用该方法制作的可以常温保存和运输的反应试剂。
背景技术
在过去的20年里，以多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技术，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用，尤其是在核酸检测及诊断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。
虽然等温扩增技术本身优势明显，但基于等温扩增技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于等温扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。
对于大规模生产、商品化的基于等温扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。申请号为200810159414.3的发明专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法”公开了一种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法，但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。所以，有必要开发新的、更加简便、经济、高效的核酸等温扩增试剂常温长期保存方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多孔材料的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂，以弥补现有技术的不足。
本发明的一个方面是提供一种在核酸等温扩增反应试剂中添加多孔材料从而使核酸等温扩增试剂或其混合物在常温或室温长期保存的方法。
本发明的另一个方面是提供一种采用上述方法制作的核酸等温扩增试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。
本发明的保存方法，其特征是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。
上述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。
上述核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）和/或三磷酸核苷酸（NTP）、核酸等温扩增聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。
上述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
上述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。
上述的多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.005%~60%。
上述的多孔材料为孔径不小于1纳米的多孔材料。
上述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。
上述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。
上述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。
上述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种。
上述的硅藻土在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.01%~10%，优选为0.02%~5%。
上述的活性炭在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.01%~35%，优选为0.02%~35%。
上述的介孔二氧化硅在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.01%~20%，优选为0.02%~20%。
上述的多孔磷酸盐微晶玻璃在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1%~60%，优选为5%~50%。
本发明还涉及一种可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料制备的。
上述的核酸等温扩增反应液为核酸等温扩增的聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。
本发明还包括一种核酸等温扩增反应试剂盒，该试剂盒包含有上述可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂。
本发明方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分（等温扩增反应试剂的单独组分或其混合物），可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
说明书附图
图1：固定化的LAMP反应体系在4℃储存下的活性衰减特征图；
图2：固定化的LAMP反应体系在25℃储存下的活性衰减特征图；
图3：固定化的LAMP反应体系在37℃储存下的活性衰减特征图。
具体实施方式
在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂（即核酸等温扩增反应液的组分）如引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）或三磷酸核苷酸（NTP）、聚合酶（DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和内切酶等）、聚合酶的反应缓冲液（不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂）等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下1~2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液（即等温扩增反应试剂混合物）中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；同时在常温或室温条件下，等温扩增反应液（即等温扩增反应试剂混合物）中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法参与基因扩增。
核酸等温扩增反应试剂中体积较大的有机活性成分如聚合酶（DNA聚合酶和/或RNA聚合酶）、模板核酸、引物等分子质量在1～100千道尔顿（kDa）之间，直径大约介于1～100纳米（nm）。申请人在研究中发现，将多孔材料添加到核酸等温扩增反应液的组分中，聚合酶、核酸模板、引物等分子会组装或固定在多孔材料的孔道中或多孔材料颗粒的间隙里，一方面聚合酶分子就会被多孔材料的孔道或间隙所固定，酶分子的空间结构（三维结构或高级结构）得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持；另一方面核酸模板、引物等分子也会组装或固定在酶分子附近，能使酶更易与底物接触反应，这样即使在长期保存后仍能表现出较高的反应效率。在较便利的贮存条件下（如常温或室温）和一定的贮存期内，上述添加多孔材料后的等温扩增反应液（即等温扩增反应试剂混合物）进行等温扩增反应所得的结果与用新鲜配制的反应混合物所得到的结果完全相同。
因不同类型的等温扩增所需的聚合酶不同，所以不同类型的等温扩增反应试剂混合物需要添加不同种类、不同孔径的多孔材料实现常温长期保存。实际使用中，可以选用的多孔材料可以是孔道排布规则有序、孔径均一的孔径小于2nm的微孔材料（但不小于1nm）、孔径在2～50nm介孔材料、孔径大于50nm的大孔材料（也称为宏孔材料），也可以是孔径不规则的无序多孔材料如无定型的微晶玻璃、氧化硅多孔材料和氧化铝多孔材料等。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）反应试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析
1.LAMP反应试剂混合物添加不同质量体积百分比和不同种类多孔材料进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物16.128mL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl26mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1％，Bst DNA聚合酶5376U）按每管288μL分装于56个1.5mL的离心管中，按表1第1、2、3列（共56种，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃（常温）与37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物3168μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶1056U）按每管288μL分装于11个1.5mL的离心管中，按表2第1、2、3列（共11种，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次130个的LAMP反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的核酸（30ng/μL）130μL等量分装于130个装有混合有多孔材料的LAMP反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于63°C保温60min进行LAMP反应。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳性对照均显绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（LAMP反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20℃和37°C条件下保存）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表1和表2。对上述部分阳性对照、空白对照和添加多孔材料的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表1和2）表明：保存时间为1个月、2个月时，在20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天、20天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。
表1.不同质量体积百分比、不同种类多孔材料对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1、2和3列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表2.两种以上多孔材料对LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例2核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）反应试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析
1.NASBA反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类多孔材料进行保存
按照如下的配方配制NASBA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.5）、70mM KCl、12mM MgCl2、1mM dNTP、2mM NTP、15%DMSO、10mM DTT、引物各0.2μM、40U T7RNA聚合酶、8U AMV逆转录酶、0.2U RNase H、20U RNasin和2μg BSA，共配制9792μL；按每管288μL分装于34个1.5mL的离心管中，按表3第1、2和3列（共34行，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.NASBA反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存
按照如下的配方配制NASBA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.5）、70mM KCl、12mM MgCl2、1mM dNTP、2mM NTP、15%DMSO、10mM DTT、引物各0.2μM、40U T7RNA聚合酶、8U AMV逆转录酶、0.2U RNase H、20U RNasin和2μg BSA，共配制3168μL。按每管288μL分装于11个1.5mL的离心管中，按表4第1、2和3列（共11行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.NASBA反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次90个的NASBA反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾桃拉病毒（Taurasyndrome viru，TSV）的核酸（呈TSV阳性的对虾的RNA，30ng/μL）90μL等量分装于90个装有混合有多孔材料的NASBA反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的NASBA反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于41°C保温120min进行NASBA反应，然后将反应管置于-20℃终止反应。
3）利用Merck-Novagen的GeBAflex-tube回收各0.2mL的离心管中NASBA的反应产物：将0.2mL的离心管中含有反应产物的多孔材料转移入GeBAflex-tube中，加入0.1倍体积的KAc（试剂盒提供）和等体积的异丙醇混合，-20℃保温10min，4℃条件下10000rpm离心30min，用70%冰冷的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃条件下10000rpm离心5min，室温下干燥沉淀，然后用DEPC水重溶即可得到反应产物。
4）利用地高辛标记的探针检测反应产物。
检测结果显示，实验设置的阳线对照有杂交信号，表明该NASBA反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（NASBA反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20℃和37°C条件下保存）无杂交信号，表明NASBA反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的NASBA反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表3和表4。
添加不同浓度、不同种类多孔材料的NASBA反应试剂混合物的保存效果的检测结果（见表3和4）表明：保存时间为1个月、2个月时，在20℃条件下贮存的混合物绝大部分具有正常的反应活性；保存时间为10天、20天时，在37℃条件下贮存的混合物部分具有正常的反应活性。
选用的NASBA引物为TSV的特征引物（引物序列参见Teng PH,Chen CL,Wu CN,Wu SY，Ou BR,Lee PY..Rapid and sensitive detection of Taura syndromevirus using nucleic acid-based amplification.Dis Aquat Organ.2006,21;73（1）:13-22.），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表3.不同浓度、不同种类多孔材料对NASBA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1、2和3列示NASBA反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的NASBA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示NASBA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示NASBA反应试剂混合物没有扩增活性。
表4.两种以上多孔材料对NASBA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示NASBA反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的NASBA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示NASBA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示NASBA反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例3链替代扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）反应试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析
1.SDA反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类多孔材料进行保存
按照如下的配方配制SDA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.0）、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM dNTP、5mM DTT、50μg/mL BSA（牛血清白蛋白）、5μM SSB（单链结合蛋白）、引物各0.5μM、400nM（0.45U/μL）DNA聚合酶（SequenaseTM Version 2.0）和3nM（0.04U/μL）限制性内切酶Nt.BspQI，配制11.520mL。按每管288μL分装于40个1.5mL的离心管中，按表5第1、2和3列（共40行，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.SDA反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存
按照如下的配方配制SDA反应试剂的混合物：每24μL反应体系中包含40mM Tris-HCl（pH8.0）、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM dNTP、5mM DTT、50μg/mL BSA（牛血清白蛋白）、5μM SSB（单链结合蛋白）、引物各0.5μM、400nM(0.45U/μL)DNA聚合酶（SequenaseTM Version 2.0）、3nM(0.04U/μL)限制性内切酶Nt.BspQI，配制3168μL。按每管288μL分装于11个1.5mL的离心管中，按表6第1、2、3列（共11行，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.SDA反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述6个贮存时间段，共需进行9批次、每批次102个的SDA反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的阳性质粒（20ng/μL）102μL等量分装于102个装有混合有多孔材料的SDA反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的SDA反应液24μL，添加阳性模板核酸（20ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于40°C保温60min进行SDA反应，然后将反应管置于-20℃终止反应。
3）利用Merck-Novagen的GeBAflex-tube回收各0.2mL的离心管中SDA的反应产物：将0.2mL的离心管中含有反应产物的多孔材料转移入GeBAflex-tube中，加入0.1倍体积的KAc（试剂盒提供）和等体积的异丙醇混合，-20℃保温10min，4℃条件下10000rpm离心30min，用70%冰冷的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃条件下10000rpm离心5min，室温下干燥沉淀，然后用水重溶即可得到反应产物。
4）反应产物的电泳检测
上述纯化后的SDA反应产物在含有2%琼脂糖的多孔材料中进行电泳，电泳结束后用GenefingderTM染色，然后用多孔材料成像系统观察电泳结果并拍照。检测结果显示，实验设置的阳线对照有目的条带出现，表明该SDA反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（SDA反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20℃和37°C条件下保存）无目的条带，表明SDA反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的SDA反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表5和表6。
添加不同浓度、不同种类多孔材料的SDA反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表5和6）表明：保存时间为1个月、2个月时，在20℃条件下贮存的混合物大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天和20天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分具有正常的反应活性。
选用的阳性片段、SDA引物、扩增方法参见文献Aric Joneja,XiaohuaHuang.Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNAamplification.Anal Biochem,2011;414(1):58-69.，其中引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表5.不同浓度、不同种类多孔材料对SDA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1、2和3列示SDA反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的SDA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示SDA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示SDA反应试剂混合物没有扩增活性。
表6.两种以上多孔材料对SDA反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示SDA反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的SDA反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示SDA反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示SDA反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例5多孔材料固定化BstDNA聚合酶长期保存后对LAMP扩增效果影响分析
1.添加不同浓度和不同种类多孔材料对Bst DNA聚合酶进行固定化并储藏
按表9第1、2和3列（共54行）所示的浓度和种类向54个装有100μLBstDNA聚合酶（2U/μL）的1.5mL的离心管中加入相应的多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），然后将上述1.5mL的离心管置于金属浴上，于65℃保温10分钟，中间混匀2~3次，使Bst DNA聚合酶在多孔材料中固定，再将每个1.5mL离心管中含有Bst DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
2.添加两种及两种以上多孔材料对Bst DNA聚合酶固定化并储藏
按表10第1、2、3列（共11行）所示的浓度和种类向11个装有100μLBstDNA聚合酶（4U/μL）的1.5mL的离心管中加入相应的多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），然后将上述1.5mL的离心管置于金属浴上，于65℃保温10分钟，中间混匀2~3次，使Bst DNA聚合酶在多孔材料中固定，再将每个1.5mL离心管中含有Bst DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。
3.多孔材料固定化Bst DNA聚合酶长期储藏后对LAMP扩增的影响检验
保存于20℃的装有固定化Bst DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有固定化Bst DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次130个的固定化BstDNA聚合酶的有效性检测，每次检测的时候需将除被测样品核酸、Bst DNA聚合酶以外的各种LAMP反应试剂的混合物2600μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%）按每管20μL的量分装于每批次抽检的130个0.2mL的离心管中，再将变性后的对虾白班综合征病毒（WSSV）的核酸（30ng/μL）130μL等量分装于上述每批次的130个装LAMP反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述0.2mL的离心管于63°C保温60min进行LAMP反应，反应过程中每隔10分钟，混匀0.2mL的离心管一次。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳线对照均显色绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（不添加任何多孔材料直接在20℃和37°C条件下保存的Bst DNA聚合酶）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表9和表10。对上述部分阳性对照、空白对照和添加多孔材料的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表9和10）表明：保存时间为1个月、2个月时，在20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天、20天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。
表9.不同浓度、不同种类多孔材料对对Bst DNA聚合酶的保护效果
注：1.表的第1、2和3列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表10.两种以上多孔材料对Bst DNA聚合酶的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例6基于环介导等温扩增（LAMP）的试剂盒中反应试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析
1.组装下列各组分到试剂盒的包装盒中：
（1）扩增检测管，内装LAMP反应试剂混合物和核酸染料；
（2）阴性对照管，内装无WSSV核酸的FTA膜片；
（3）阳性对照管，内装吸附了WSSV核酸的FTA膜片；
上述FTA膜片为英国Whatman的FTA卡上样品区裁剪下来的大小3平方毫米大小的纸片。
2.试剂盒中LAMP反应试剂混合物添加不同质量体积百分比和不同种类多孔材料进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物15.552mL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl26mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1％，Bst DNA聚合酶5184U）按每管288μL分装于54个1.5mL的离心管中，按表11第1、2和3列（共54行，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀（对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取），再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分装入试剂盒，将试剂盒分别置于20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间段进行抽检，每次抽检2个试剂盒作为重复）。
3.试剂盒中LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存
将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物3168μL（包括LAMP引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO48mM，(NH4)2SO410mM，Triton X-1000.1%，Bst DNA聚合酶1056U）按每管288μL分装于11个1.5mL的离心管中，按表12第1、2、3列（共11行，包括不添加多孔材料的空白对照）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于12个0.2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0.2mL的离心管分装入试剂盒，将试剂盒分别置于20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间段进行抽检，每次抽检2个试剂盒作为重复）。
4.LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验
保存于20℃的试剂盒，其内装有反应试剂混合物的0.2mL离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验；保存于37℃的试剂盒，其内装有反应试剂混合物的0.2mL离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：
1）依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次130个的LAMP反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的WSSV的核酸（30ng/μL）130μL等量分装于试剂盒内130个装有混合多孔材料的LAMP反应试剂混合物的0.2mL离心管中。同时，按照本实施例步骤2中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。
2）将上述离心管于63°C保温60min进行LAMP反应。
LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2μL 10倍稀释的核酸染料GeneFinderTM，然后于90°C保温5min使反应产物染色并终止反应。
如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性。检测结果显示，实验设置的阳性对照均显绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组（LAMP反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20℃和37°C条件下保存）均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20℃和37°C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表1和表2。对上述部分阳性对照、空白对照和添加多孔材料的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。
添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表1和2）表明：保存时间为1个月、2个月时，在20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天、20天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。另外，针对阳性对照管中吸附了WSSV核酸的FTA膜片进行检测，发现该FTA膜片吸附的病毒核酸也依然能够作为LAMP反应的模板进行正常扩增；这与Whatman公司所称该TFA膜片（卡片）能够长期室温保存核酸相符合。
表11.不同质量体积百分比、不同种类多孔材料对试剂盒内LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1、2和3列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
表12.两种以上多孔材料对试剂盒内LAMP反应试剂混合物的保护效果
注：1.表的第1列示LAMP反应试剂混合物中添加多孔材料的种类和浓度。
2.表中空白对照为不添加任何多孔材料的LAMP反应试剂混合物。
3.表中“+”号表示LAMP反应试剂混合物有良好扩增活性，“-”表示LAMP反应试剂混合物没有扩增活性。
实施例7.以添加硅藻土为例定量分析多孔材料对LAMP反应试剂混合物的保护作用
1）LAMP反应试剂混合物中添加硅藻土并与不同条件下保存
按25μL LAMP反应体系配制不含酶、模板和外补水的LAMP预混物，其中含20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1%TritonX-100，1.4mM dNTP，1.2M Betaine，1.6μM FIP/BIP(each)，0.02μM B3/F3(each)，0.8μM LF/LB(each)，6mM MgCl2，一次性配制预混物，然后分装成每份14μL体积，用于后续实验。在LAMP反应前，加入约20ng经95℃变性5min的模板，1μLBst DNA Polymerase(Large Fragment)，并用去离子水补足反应体积至25μL。反应过程为63℃反应60min、85℃灭活5min。
按硅藻土与酶比例（质量体积比，g/ml）0.0002:1将该酶与硅藻土的混合物加入PCR管中（配制0.0002:1组混合物时，称量0.0004g硅藻土与2μL酶混合拌匀后分装），置于35℃金属浴上搅拌10min，立即放置冰上2min，10000g/min离心5min。使硅藻土完全浸没在酶液中，然后在固定化酶中加入预先配置好的14μL体系和1μL模板，用水补齐25μL，进行LAMP反应。反应过程中每15min取出用振荡器混匀一次。以新鲜配制的普通LAMP体系作为对照。
用去离子水配制70%的海藻糖母液，将一定量的海藻糖母液与酶保存液混合后与相应比例的硅藻土混合并固定，分装入各管并10000g/min离心5min（保证每管含酶液1μL，海藻糖在最终反应试剂混合物中的浓度分别为5%、10%、15%（质量/体积比，w/v））。将3组上述处理组分别储存于4℃和25℃，然后分别于第0d、10d、20d、30d、60d和90d取出加入1μL模板进行LAMP反应，反应过程中每15min取出用搅拌器搅拌一次。
上述LAMP反应均采用等量的DNA添加适量双蒸水和1μL已变性的模板使反应体系恢复至25μL，进行LAMP反应，用2.5%琼脂糖凝胶与1×TBE电泳缓冲液进行电泳检测反应产物。
用Gel-pro(9.0)软件打开需要处理的图片后，使用工具栏中的定位泳道选项选择图片中所需要的泳道及分析区域，每个泳道除了点样孔之外的区域全选。使用扣除背景选项消除除泳道之外的背景对荧光强度的影响。之后即可选择显示结果按钮得到所需的总荧光强度IOD。然后使用每张图片中添加量相同的标准分子量泳道marker的IOD值来消除电泳图片因拍照产生的IOD的误差：
泳道N的LAMP相对产物量=IODN/IODM
其中，IODN表示泳道N的IOD，IODM表示标准分子量泳道M (Marker)的IOD。
将用Gel-pro软件读取并处理的LAMP相对产物量数据输入Sigmaplot（10.0）中进行非线性回归分析(结果如图)，得到相对产物量对储藏天数的衰退方程：
Y=(a±Δa)*e-(b±△b)x（半衰期=1/b）
其中，x代表储存天数，y为其对应的LAMP相对产物量。
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。通过LSD法进行单因素方差多重比较，P<0.05为显著性差异。
2）添加硅藻土的LAMP反应试剂混合物在不同存储温度条件下的保存效果
4℃储存条件下，分别对未经任何处理的LAMP反应体系（即LAMP反应试剂混合物，a组），经固定化的LAMP体系（b组）和添加了15%海藻糖的固定化LAMP反应体系（c组）的活性保留情况进行了观察（图1）。由图中可以看出，a组处理在储存的30d内，活性丧失较快，与b，c两个处理组差异显著。经SigmaPlot将荧光强度对储藏天数进行非线性回归，得到4℃储藏条件下a，b，c三组处理的拟合方程分别为a:A=(1.1388±0.0844)*e-(0.0611±0.0078)D(R2=0.8972)，半衰期为16.3d；b：A=(1.0391±0.0313)*e-(0.0054±0.0006)D(R2=0.8986)，半衰期为185.2d；c：A=(1.0611±0.0434)*e-(0.0036±0.0010)D(R2=0.7702)，半衰期为277.8d。固定化处理和添加海藻糖处理使LAMP体系反应活性的半衰期分别增长了11.2倍（b）和16.0倍（c）。此外，使用SPSS软件进行各处理间的显著性分析后发现，添加15%海藻糖的固定化体系其扩增相对产物量与仅进行固定化的体系的产物量无显著性差异，但添加海藻糖确实能在原有基础上增强LAMP混合物保护效果。以上结果说明，硅藻土固定化处理和添加海藻糖处理能显著性的延长LAMP反应试剂混合物在4℃的保存期限。
为了测试硅藻土固定化和海藻糖添加处理对LAMP反应试剂混合物保存在室温条件下的活性衰减情况，以未经任何处理的LAMP体系（a组）作为对照，将经硅藻土固定化的LAMP体系（b组）和添加了15%海藻糖的固定化LAMP体系（c组）放置于25℃恒温箱中每10天观察一次其活性变化情况（图2）。相对于对照组a在受测的15d内活性快速降低，直至LAMP反应无扩增的情况，b、c两实验组表现出良好的稳定性，经软件分析计算，可得到b、c两实验组的半衰期分别为178.6d和217d，分别是普通LAMP体系在25℃下半衰期的42.8倍和52.0倍（b的衰退方程为A=（1.0319±0.0182)*e-(0.0056±0.0004)D(R2=0.9645)；c的衰退方程为A=(1.0844±0.0362)*e-(0.0046±0.0009)D(R2=0.8839)）。与4℃储存条件下得到的结果一致，25℃条件下，硅藻土固定化处理和添加15%海藻糖处理可以显著性的阻止LAMP体系中的生物活性物质的快速失活，提供室温条件下稳定性较良好的LAMP反应体系。
硅藻土固定化和海藻糖添加处理对LAMP反应试剂混合物保存效果影响的实验结果显示，未作任何处理的LAMP反应试剂混合物在37℃条件下储存9d后已基本无扩增活性；37℃条件下18d的储存使固定化LAMP反应体系丧失其近50%的活性，而30d后硅藻土固定化体系的反应活性为其初始体系活性的17.1%（图3）。经SigmaPlot软件拟合，得到37℃储藏条件下经硅藻土固定化的LAMP反应试剂混合物活性的衰减方程为A=（1.0426±0.1129)*e-(0.0333±0.0087)D(R2=0.7786)，半衰期为24.8d，相对于普通LAMP反应试剂混合物的半衰期的8.3倍（在该温度下普通LAMP反应试剂混合物的半衰期为3.0d）。这个结果表明硅藻土固定化能在一定程度上保护LAMP反应试剂混合物在37°C的活性，可实现LAMP反应试剂混合物在超过25℃条件下的短时间贮存或运输，但其效果无法令LAMP反应试剂混合物在37℃条件下长时间（超过一个月）保存。
上述实施例中所选用的LAMP引物FIP、BIP、F3和B3为WSSV的特征引物（引物序列参见Kono T,Savan R,Sakai M,Itami T.Detection of white spotsyndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification.J Virol Methods.2004;115（1）:59-65..），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
除了在实施例中列出的具体的多孔材料外，其它直径大于1纳米的多孔材料物质也可以选用。并且，也可以是三种或三种以上的多孔材料混合使用。
由于等温扩增反应试剂中包含聚合酶等易丧失活性的成分，所以目前等温扩增反应试剂的保存和运输都是采用冰箱、冰袋或干冰等维持低温的条件下进行的，这不仅导致等温扩增反应试剂的储运难度加大还增加了相关等温扩增技术的使用成本；采用本发明方法处理等温扩增反应试剂后，等温扩增反应试剂可实现常温（20℃）贮存3个月仍保持有正常的反应活性，这无疑为等温扩增反应试剂的储运提供了很便捷的选择。同时本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂或其混合物在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用。
本发明实施例中所用的试剂和材料来源如下：甜菜碱，Tris-HCl、KCl、MgSO4、MgCl2、(NH4)2SO4、Triton X-100和牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程技术服务有限公司，各种DNA聚合酶、RNA聚合酶和SSB等购自NEB公司，AMV反转录酶购自Promega公司，核酸染料GeneFinderTM购自厦门百维信生物科技有限公司。采用市售的其它同类产品也可以实现本发明。
Claims (11)
1.一种核酸等温扩增反应试剂的保存方法，其特征在于，是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存；所述的多孔材料的孔径不小于1纳米；且多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.005％～60％；所述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料；其中有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种；无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种，其中一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包含有核酸等温扩增的聚合酶。
2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。
3.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。
5.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的保存方法，其特征在于所述的硅藻土在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.01％～10％。
7.如权利要求5所述的保存方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0.01％～20％。
8.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的多孔磷酸盐微晶玻璃在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1％～60％。
9.一种可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是按照权利要求1所述的核酸等温扩增反应试剂的保存方法制备的。
10.如权利要求9所述的反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增反应试剂还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。
11.一种核酸等温扩增反应试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求9所述的核酸等温扩增反应试剂。
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