CN110996972A - 用于癌症治疗的治疗性凋亡细胞 - Google Patents

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Abstract

本文公开的早期凋亡细胞群及其组合物的使用方法，包括治疗癌症或肿瘤、延长患有癌症或肿瘤的对象的生存时间以及减小癌症或肿瘤的尺寸或降低其生长速率的方法，其中向对象施用凋亡细胞或其组合物。癌症可包含实体瘤或弥漫性癌症，例如白血病。在某些情况下，组合物可以包含另外的化学治疗剂。此外，公开了失活的早期凋亡细胞群及其制备方法。

Description

用于癌症治疗的治疗性凋亡细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月8日提交的美国临时申请第62/516,714号和2016年8月24日提交的美国临时申请第62/549,465号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
感兴趣的领域
本文公开了包含早期凋亡细胞群的组合物及其用于癌症疗法的方法。本文公开的组合物可以用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低发病率。此外，组合物可用于增加患有癌症或肿瘤的对象的生存。所使用的组合物可以单独施用或与其他化学疗法联合施用。
背景技术
癌症是一种异常状态，其中一种或多种细胞群的失控增殖干扰正常的生物学功能。增殖性变化通常伴随着细胞特性的其他变化，包括回复至分化程度较低、发育更原始的状态。在体外癌症的相关因素称为细胞转化。转化的细胞通常显示以下几种或全部特性：球形形态、表达胚胎抗原、生长因子非依赖(growth-factor independence)、缺乏接触抑制、锚定非依赖和生长至高密度。
恶性疾病如肺癌和皮肤癌的致死性的主要原因是由于转移性扩散。在许多情况下，不可能预防转移性疾病的发作，因为癌症通常在诊断时就已经转移了，即使是在此阶段之前就诊断出癌症的情况下，也要通过外科手术完全移除或破坏最终能够产生转移的原发病灶组织。由于转移病灶的尺寸小和/或原发病灶中没有可靠的标记物(基于此可靠地预测其存在)，因此转移性疾病可能无法在早期诊断。由于这些病变是难以接近的、散布的(disseminated)和/或位置不易确定的(poorly localized)，因此可能难以或不可能通过消融方法对其进行治疗。化学疗法/放射疗法，是当前治疗某些转移性恶性肿瘤的选择方法，通常无效或未达最佳效果(suboptimally effective)，并且具有与特别有害和/或潜在致命的副作用相关的显著的缺点。
免疫疗法的癌症治疗方法(例如涉及抗原呈递细胞(APC)疫苗接种的那些)具有治疗难以接近的、散布的、微小的、复发的和/或位置不易确定的癌症病灶的最佳效果的潜力。一种有前途的免疫疗法途径涉及使用专门的APC，例如树突状细胞(DC)，以引发全身性抗癌症免疫。
树突状细胞是哺乳动物免疫系统的抗原产生和呈递细胞，其处理抗原物质并将其在细胞表面呈递给免疫系统的T细胞，从而能够使T细胞对新抗原和回忆(recall)抗原敏感。DC是最有效的抗原产生细胞，在先天和适应性免疫系统之间充当信使。DC细胞可用于通过产生攻击和裂解肿瘤的效应细胞来引发特异性抗肿瘤免疫。
凋亡细胞展现生理性细胞死亡的一种途径，最常通过凋亡发生，这引发了一系列分子稳态机制，包括识别、免疫应答和清除过程。此外，凋亡细胞是能够直接和间接诱导对树突状细胞和巨噬细胞的免疫耐受的免疫调节细胞。已经显示凋亡细胞调节树突状细胞和巨噬细胞并使它们具有耐受性并抑制促炎活性，如促炎性细胞因子的分泌和共刺激分子的表达。
对于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低发病率的组合物和方法，仍然存在未满足的需求。下文描述的凋亡细胞制备物、组合物及其用途通过提供可用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低发病率的早期凋亡细胞群来满足这一需求。此外，本文所述的使用方法解决了增加患有癌症和肿瘤的对象的生存(包括增加癌症或肿瘤的缓解)的需求。
发明内容
本文公开的一方面是治疗、预防对象中的癌症或肿瘤，抑制对象中的癌症或肿瘤的生长，延缓疾病进展，降低肿瘤负荷或降低发病率或其任意组合的方法，包括给所述对象施用包含早期凋亡细胞群的组合物的步骤，其中与未施用早期凋亡细胞群的对象相比，所述方法治疗、预防所述对象中的癌症或肿瘤，抑制所述对象中的癌症或肿瘤的生长，延缓疾病进展，降低肿瘤负荷或降低所述对象中的癌症或肿瘤的发病率或其任意组合。
在相关方面，所述癌症或肿瘤的尺寸或生长速率或其组合降低。在另一个相关方面，所述对象的生存增加。
在相关方面，所述早期凋亡细胞群包含单个核富集的细胞群，或稳定超过24小时的凋亡群，或缺乏细胞聚集的凋亡群，或在凋亡诱导后经辐照的凋亡群，或其任意组合。在另一个相关方面，所述早期凋亡细胞群包含早期凋亡细胞的合并群(pooled population)。
在相关方面，所述对象是人类对象。
在相关方面，癌症或肿瘤包括实体瘤或非实体瘤。在另一个相关方面，非实体癌症或肿瘤包括造血系统恶性肿瘤、血细胞癌、白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病。在另一个相关方面，实体瘤包括肉瘤或癌，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing’s瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌或肿瘤、乳腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、前列腺癌或肿瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、宫颈癌或肿瘤、子宫癌或肿瘤、睾丸癌或肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。在另一个相关方面，所述肿瘤或癌症包括肿瘤或癌症的转移。
在相关方面，所述施用包括单次输注所述早期凋亡细胞群。在另一个相关方面，所述施用包括多次输注所述凋亡细胞群。在另一个相关方面，该方法还包括给所述对象施用另外的免疫疗法、化学治疗剂或免疫调节剂或其任意组合。在另一个相关方面，在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后施用另外的免疫疗法、化学治疗剂或免疫调节剂。在另一个相关方面，免疫疗法包括施用CAR T细胞。在另一个相关方面，免疫调节剂包含抗体或其功能片段。在另一个相关方面，抗体或其功能片段包含利妥昔单抗(RtX)抗体或其功能片段。
在相关方面，与施用CAR T细胞且未施用早期凋亡细胞的对象相比，所述方法提高了所述CAR T细胞的功效。
在相关方面，所述方法包括一线治疗。
在相关方面，所述方法包括辅助疗法。
在相关方面，所述方法减少了最小残留疾病、增加了缓解、增加了缓解持续时间、降低了肿瘤复发率、防止了所述肿瘤或所述癌症的转移、或降低了所述肿瘤或所述癌症的转移率，或任意组合其。
一方面，本文公开了单个核凋亡细胞群，其包含处于早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述单个核凋亡细胞群包含的：非静止非凋亡活细胞百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合。
在相关方面，非静止非凋亡活细胞的降低的百分比小于10％。在另一个相关方面，所述单个核凋亡细胞群不包含活的非凋亡细胞。
在相关方面，所述单个核细胞群选自：淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。
在相关方面，在产生早期凋亡细胞之后辐照单个核凋亡细胞群。在另一个相关方面，所述辐照包含γ辐照、X射线辐照或UV辐照。在另一个相关方面，与未辐照的凋亡细胞群相比，经辐照的细胞群包含每群百分比降低的非静止非凋亡细胞。
在一个方面，本文公开了一种药物组合物，其包含单个核凋亡细胞群，其包含处于早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述单个核凋亡细胞群包含的：非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合，和药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本文公开了一种用于产生单个核凋亡细胞群的方法，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合，所述方法包括以下步骤，
获得外周血单个核富集的细胞群；
将所述单个核富集的细胞群在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻；
使所述单个核富集的细胞群解冻；
在包含最终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群；
将所述单个核富集的细胞群在施用介质中重悬；以及
使所述单个核富集的细胞群失活，其中所述失活在诱导后发生，
其中所述方法产生单个核凋亡细胞群，其包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合。
在相关方面，失活步骤包括在所述单个核凋亡细胞制备物内降低非静止非凋亡细胞的百分比，抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或减少任何活的非凋亡细胞的增殖，或其任意组合。在另一个相关方面，非静止非凋亡细胞的百分比降低至约10％。在另一个相关方面，非静止非凋亡细胞的百分比降低至约0％。
在相关方面，单个核富集的细胞群选自淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。
在相关方面，所述孵育持续约2-12小时。
在相关方面，步骤(f)使所述单个核富集的群体失活包含抑制或消除免疫应答，抑制或消除细胞的交叉反应性或降低或消除T细胞受体活性，并且其中所述群体包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合。在另一个相关方面，所述步骤(f)失活包括辐照步骤(e)中产生的单个核富集的凋亡细胞群。在另一个相关方面，辐照包括γ辐照、X射线辐照或UV辐照。在另一个相关方面，辐照包括约10-80个格雷单位(Gy)。在另一个相关方面，辐照包括约25-50个格雷单位(Gy)。
附图说明
在说明书的结论部分中特别指出并明确要求保护本文公开的主题。然而，当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本文公开的关于组合物和方法的组织和操作方法，以及其目的、特征和优点。
图1.流程图，显示早期凋亡细胞群制备方法的一个实施方案中的步骤，其中所述方法包括抗凝剂。
图2.体内弥漫性肿瘤SCID小鼠模型的生存曲线。曲线显示，与未施用凋亡细胞的小鼠(NO APO；虚线····)相比，施用早期凋亡细胞(APO；断续线----)延长了生存，其中对照SCID小鼠表现出100％的生存(实线______)。
图3A-3D.凋亡细胞输注增加了白血病小鼠的寿命，并增加了实现完全缓解的小鼠数目。同生群(cohort)：无白血病(对照-条纹状)；白血病+早期凋亡细胞(点状)；仅白血病(实灰色)。总共n＝51(p<0.001)。图3A.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了活过整个预期寿命的小鼠的百分比。图3B.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存多达预期寿命的12％的小鼠的百分比。图3C.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存多达预期寿命的30％的小鼠的百分比。图3D.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存多达预期寿命的100％并实现完全缓解的小鼠的百分比。
图4A-4E.凋亡细胞输注增加了白血病小鼠的寿命，增加了实现完全缓解的小鼠数目，并增强了抗CD20单克隆抗体(mAb)的治疗效果。同生群：仅白血病(实灰色)；白血病+早期凋亡细胞(条纹状)；白血病+抗CD20 mAb(方格)；白血病+抗CD20+早期凋亡细胞(点状)。总共n＝28(p<0.002)。图4A.显示用Raji细胞诱导白血病后，活过预期寿命的小鼠百分比(％)。图4B.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存比预期寿命长多达24％的小鼠百分比。图4C.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存比的预期寿命长多达59％的小鼠百分比，并增强了抗CD20 mAb对白血病小鼠寿命的效应。图4D.白血病诱导后，凋亡细胞输注增加了生存比预期寿命长多达76％的小鼠百分比，并增强了抗CD20 mAb对白血病小鼠寿命的效应。图4E.凋亡细胞输注增加了获得完全缓解的小鼠的百分比。
图5A和5B.在ApoCell存在或不存在的情况下，在HeLaCD19(白血病)的IP模型中测试CD19-CAR-T细胞的功效。HeLa-CD19-蓝色；HeLaCD19+Mock-绿色；HeLaCD19+CAR-T-紫色；和HeLaCD19+CAR-T+ApoCell-橙色。图5A是用0.5×106个CAR-T阳性细胞。图5B是用2.2×106个CAR-T阳性细胞。
图6.接受ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier生存图。(RPMI组，n＝15；Raji组，n＝23；Raji+ApoCell组，n＝24)RPMI(对照)-黑色；仅Raji-橙色；Raji+ApoCell-蓝色。
图7A-7C.Kaplan-Meier生存图。图7A提供了一项研究数据，其中对7周龄的雌性SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠IV注射0.1×106个Raji细胞(每组n＝10，三组)。小鼠接受三次IV剂量(第5、8、11天)的30×106个ApoCell。(RPMI-浅蓝色；Raji-橙色；Raji+ApoCell-深蓝色)图7B显示了一项研究数据，其中对7周龄的雌性SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠IV注射0.1×106个Raji细胞(每组n＝10，三组)。小鼠接受三次IV剂量(第5、8、11天)的30×106个ApoCell。(RPMI黑色；Raji-橙色；Raji+ApoCell-深蓝色)图7C显示了一项研究的数据，其中对8-9周龄的雌性SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠IV注射0.1×106个Raji细胞(每组n＝10，两组)。小鼠接受三次IV剂量(第5、8、12天)的30×106个ApoCell。(Raji-橙色；Raji+ApoCell-深蓝色)
图8接受RtX和ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier生存图。(仅Raji-橙色；Raji+ApoCell-蓝色；Raji+RtX 2mg-绿色；Raji+RtX 2mg+ApoCell-黄色；Raji+RtX 5mg-紫色；Raji+RtX 5mg+ApoCell-灰色。)
图9接受rtx和ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier生存图。(仅Raji-橙色；Raji+ApoCell-蓝色；Raji+RtX 2mg-绿色；Raji+RtX 2mg+ApoCell-黄色。)
图10A-10B.示意性示出了标准CAR T细胞疗法(图10A)，以及使用患者自身的细胞(自体)产生凋亡细胞或凋亡细胞上清液的患者中安全有效的CAR T细胞的癌症疗法的方法的实施方案(图10B)。
图11.示意性示出了使用供体细胞产生凋亡细胞或凋亡上清液的患者中安全有效的CAR T细胞癌症疗法的方法的实施方案。
图12A-12B.CAR T细胞疗法单独或与凋亡细胞共同施用后的生存。图12A代表如实施例6中所述的5个独立实验，并显示了通过单独的CAR T细胞疗法或CAR-T细胞疗法加凋亡细胞共同施用治疗的腹膜实体瘤Hela-CD19的生存曲线。(HeLa-CD19：无治疗对照；HeLa-CD19+CAR-T：包括用CAR T细胞治疗；HeLa-CD19+Mock-T：对照加Mock T细胞；Hela-CD19+CAR-T+OTS-ALC-4K：用CAR-T细胞和“现成的”用4000rad辐照的凋亡细胞治疗。图12B(荧光素酶体内成像系统(IVIS)结果)显示通过IVIS可视化的肿瘤进展，代表了导致导致图12A中所示的生存曲线结果的发展。在第15天就已经可以可视化肿瘤的扩散情况(Hela-CD19-Luc；无治疗对照)，而用CAR-T细胞治疗的小鼠直到第43天都没有显示出任何肿瘤扩散。当小鼠接受凋亡细胞联用CAR-T细胞治疗时，出乎意料的是，大多数小鼠直到第50天都没有显示出肿瘤扩散，并且肿瘤尺寸(见相关比例尺(scale for correlation))明显变小。
发明详述
在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本文公开的方法的透彻理解。然而，本领域技术人员会理解，可以实践这些方法而不用这些具体细节。在其他情况下，熟知的方法、过程和组分未详细描述，以免模糊本文公开的方法。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低癌症或肿瘤的发病率或其任意组合的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法治疗、预防、抑制所述对象的癌症或肿瘤的生长或降低癌症或肿瘤的发病率或其任意组合。
在一些实施方案中，本文公开了增加患有癌症或肿瘤的对象的生存的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法增加了所述对象的生存。
在一些实施方案中，本文公开了在对象中减小癌症或肿瘤尺寸或降低其生长速率或其组合的的方法，其包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法减小了所述癌症或所述肿瘤的尺寸或降低其生长速率。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞的组成包含处于早期凋亡状态的单个核细胞群体，其中所述单个核凋亡细胞群体包含的非静止非凋亡活细胞降低，任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制，或任何活的非凋亡细胞的增殖减少，或其任意组合。在一些实施方案中，本文公开了失活的早期凋亡细胞群，其包含处于早期凋亡状态的单个核细胞群，其中所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞降低，任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制，或任何活的非凋亡细胞的增殖减少，或其任意组合。
在一些实施方案中，本文公开的细胞群体是失活的。在另一个实施方案中，失活包括辐照。在另一个实施方案中，失活包括抑制或消除群体的免疫应答。在另一个实施方案中，失活包括抑制或消除早期凋亡细胞群和任意其他细胞群之间的交叉反应性。在其他实施方案中，失活包括降低或消除早期凋亡细胞群中T细胞受体活性。在另一个实施方案中，失活的细胞制备物包含的非凋亡细胞百分比降低，任何非凋亡细胞的细胞活化抑制，或任何非凋亡细胞的增殖降低，或其任意组合。
在另一个实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，失活的细胞群体包含的非静止非凋亡细胞数目减少。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含百分之50(50％)的或的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含40％的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含30％的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含20％的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含100％的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群体包含0％的非凋亡细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备失活的早期凋亡细胞群的方法。在一些实施方案中，本文公开了一种产生单个核凋亡细胞群的方法，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞降低，任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制，或任何活的非凋亡细胞的增殖减少，或其任意组合，所述方法包括以下步骤，获得外周血单个核富集的细胞群；将所述单个核富集的细胞群在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻；使所述单个核富集的细胞群解冻；在包含最终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群；将所述凋亡细胞群在施用介质中重悬；以及使所述单个核富集的细胞群失活，其中所述失活在诱导后发生，其中所述方法产生单个核凋亡细胞群，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞降低，任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制，或任何活的非凋亡细胞的增殖减少，或其任意组合。
在另一个实施方案中，辐照包括γ辐照、X射线辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，辐照的制备物具有数目减少的非静止非凋亡细胞。
凋亡细胞及其生产方法
在一些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞(“ApoCells”)的产生已经在WO 2014/087408中进行了描述，其通过引用整体并入本文，并且在下面的实施例1中进行了简要描述。在另一个实施方案中，以本领域已知的任何方式生产用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞与接受疗法的对象是自体的。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞与接受疗法的对象是同种异体的。在另一个实施方案中，包含凋亡细胞的组合物包含如本文公开的或本领域已知的凋亡细胞。
本领域技术人员会理解，术语“自体的”可以涵盖供体和受体是同一个人的组织、细胞、核酸分子或多肽。
本领域技术人员会理解，术语“同种异体的”可以涵盖衍生自相同物种的单独个体的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一些实施方案中，同种异体供体细胞在遗传上与受体不同。
在一些实施方案中，通过白细胞分离术(leukapheresis)实现根据本文公开的生产方法获得单个核富集的细胞组合物。本领域技术人员会理解，术语“白细胞分离术”可以涵盖血浆离析术(apheresis)程序，其中白细胞与供体的血液分离。在一些实施方案中，供体的血液进行白细胞分离术，从而根据本文公开的生产方法获得了单个核富集的细胞组合物。要注意的是，如本领域所已知的，在白细胞分离术期间需要使用至少一种抗凝剂，以防止收集的细胞凝结。
在一些实施方案中，白细胞分离术程序被配置成允许根据本文公开的制备方法收集单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，通过白细胞分离术获得的细胞收集物包含至少65％的单个核细胞。在一些实施方案中，如本文所述，至少70％或至少80％的单个核细胞。在一些实施方案在，在根据本文公开的制备方法获得单个核富集的细胞组合物的同时收集来自细胞供体的血浆。在一些实施方案中，在根据本文公开的制备方法获得单个核富集的细胞组合物的同时收集来自细胞供体的约300ml-600ml的血浆。在一些实施方案中，在根据本文公开的制备方法获得单核富集的细胞组合物的同时收集的血浆用作冷冻和/或孵育介质的一部分。获得用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞的富集群的其他详细方法可以在WO 2014/087408中找到，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少85％的单个核细胞。在进一步的实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少85％的单个核细胞，90％的单个核细胞或超过90％的单个核细胞。在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少90％的单个核细胞。在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少95％的单个核细胞。
要注意的是，在一些实施方案中，尽管在细胞收集时单个核富集的细胞制备物包含至少65％，优选至少70％，最优选至少80％的单个核细胞，但是在用于本文公开的方法的早期凋亡细胞生产方法后，最终药物群包含至少85％，优选地至少90％，最优选地至少95％的单个核细胞。
在某些实施方案中，用于生产用于本文公开的方法的早期凋亡细胞的组合物的单个核富集的细胞制备物在细胞收集时包含至少50％的单个核细胞。在某些实施方案中，本文公开了用于生产药物群的方法，其中所述方法包括从供体的外周血获得单个核富集的细胞制备物，所述单个核富集的细胞制备物包含至少50％的单个核细胞。在某些实施方案中，本文公开了用于生产药物群的方法，其中该方法包括冷冻包含至少50％的单个核细胞的单个核富集的细胞制备物。
在一些实施方案中，细胞制备物包含至少85％的单个核细胞，其中制备物中至少40％的细胞处于早期凋亡状态，其中制备物中至少85％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，凋亡细胞制备物包含不超过15％的CD15高表达细胞。
本领域技术人员会理解，术语“早期凋亡状态”可以涵盖显示凋亡的早期迹象而没有凋亡的后期迹象的细胞。细胞凋亡的早期迹象的实例包含磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露和线粒体膜电位的丧失。晚期事件的实例包含碘化丙锭(PI)进入细胞和最终DNA切割。在一些实施方案中，为了证明细胞处于“早期凋亡”状态，使用通过膜联蛋白-V和PI染色检测PS暴露，并且被膜联蛋白V而非PI染色的细胞被认为是“早期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，被膜联蛋白-V FITC和PI染色的细胞被认为是“晚期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，不被膜联蛋白-V或PI染色的细胞被认为是非凋亡生存细胞。
本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，术语“早期凋亡细胞”、“凋亡细胞”和“ApoCell”及其语法变体可以互换使用，其具有所有相同的特性和含义。本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法包括早期凋亡细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少90％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少80％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少70％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少60％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少50％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。
在一些实施方案中，包含凋亡细胞的组合物还包含抗凝剂。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞是稳定的。本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，稳定性包括随时间维持早期凋亡细胞特征，例如，在约2-8℃储存时维持早期凋亡细胞特征。在一些实施方案中，稳定性包含在冷冻温度，例如在0℃或低于0℃的温度储存时，维持早期凋亡细胞特征。
在一些实施方案中，根据用于本文公开的方法的早期凋亡细胞的生产方法获得的单个核富集的细胞群在冷冻介质中冷冻。在一些实施方案中，冷冻是渐进的。在一些实施方案中，收集后，将细胞维持在室温直至冷冻。在一些实施方案中，细胞制备物在收集细胞之后并且在冷冻之前在洗涤介质中进行至少一个洗涤步骤。
如本文所用，术语“获得细胞”和“细胞收集”可以互换使用。在一些实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的3-6小时内冷冻。在一些实施方案中，将细胞制备物在细胞收集的最多6小时内冷冻。在一些实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的1、2、3、4、5、6、7、8小时内冷冻。在其他实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的最多8、12、24、48、72小时内冷冻。在其他实施方案中，收集后，将细胞维持在2-8℃直至冷冻。
在一些实施方案中，根据早期凋亡细胞群的生产进行冷冻包括：将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻，随后将细胞制备物在约-80℃冷冻，和最后在液氮中冷冻细胞制备物直至解冻。在一些实施方案中，根据早期凋亡细胞群的生产进行冷冻包括：将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻至少2小时，将细胞制备物在约-80℃冷冻约2小时，最后在液氮中冷冻细胞制备物直至解冻。在一些实施方案中，在解冻之前，将细胞在液氮中维持至少8、10或12小时。在一些实施方案中，将细胞制备物的细胞维持在液氮中直至解冻并与诱导细胞凋亡的孵育介质一起孵育。在一些实施方案中，将细胞制备物的细胞维持在液氮中直到造血干细胞移植的当天。在非限制性实例中，从细胞收集和冷冻到制备最终群体的时间可以在1-50天之间，或者在6-30天之间。在替代实施方案中，细胞制备物可以在液氮中维持更长的时间，例如至少几个月。
在一些实施方案中，根据早期凋亡细胞群的生产进行冷冻包含将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻至少0.5、1、2、4小时。在一些实施方案中，根据早期凋亡细胞群的生产进行冷冻包含将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻约2小时。在一些实施方案中，早期凋亡细胞群的生产中的冷冻包含将细胞制备物在约-80℃冷冻至少0.5、1、2、4、12小时。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以维持冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、20个月。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以维持冷冻至少0.5、1、2、4、5年。在某些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以维持冷冻至少20个月。
在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少8、10、12、18、24小时。在某些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少8小时的时间段。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少约10小时。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少约12小时。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻约12小时。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物的总冷冻时间(在约-18℃至-25℃，在约-80℃和在液氮中)为至少8、10、12、18，24小时。
在一些实施方案中，冷冻至少部分地在单个核富集的细胞组合物的细胞中诱导早期凋亡状态。在一些实施方案中，冷冻介质包含RPMI 1640培养基，所述RPMI 1640培养基包含L-谷氨酰胺、Hepes、Hes、二甲基亚砜(DMSO)和血浆。在一些实施方案中，冷冻介质中的血浆是供体的自体血浆，其捐赠了单个核富集的细胞群。在一些实施方案中，冷冻介质包含RPMI 1640培养基，所述RPMI 1640培养基包含2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes、5％Hes、10％二甲亚砜和20％v/v血浆。
在一些实施方案中，冷冻介质包含抗凝剂。在某些实施方案中，在早期凋亡细胞群的产生过程中使用的介质(包括冷冻介质\孵育介质和洗涤介质)的至少一些包含抗凝剂。在某些实施方案中，在早期凋亡细胞群的产生过程中使用的包含抗凝剂的所有介质包含相同浓度的抗凝剂。在一些实施方案中，不将抗凝剂添加到细胞群体的最终悬浮介质中。
在一些实施方案中，将抗凝剂至少添加到冷冻介质中提高了细胞制备物的产率。在其他实施方案中，在高甘油三酯水平存在下，向冷冻介质中添加抗凝剂提高了细胞制备物的产率。如本文所用，细胞制备物的产率的提高涉及以下至少一项的提高：冷冻细胞中活细胞的百分比，活细胞中早期状态的凋亡细胞的百分比及其组合。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过72小时。
本领域技术人员会理解，术语“稳定”涵盖维持PS阳性(磷脂酰丝氨酸阳性)而仅极小百分比的PI阳性(碘化丙锭阳性)的凋亡细胞。PI阳性细胞提供膜稳定性的指示，其中PI阳性细胞允许进入细胞，表明膜较不稳定。在一些实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在早期凋亡中维持至少24小时，至少36小时，至少48小时或至少72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在早期凋亡中维持24小时，36小时，48小时或72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在早期凋亡中维持超过24小时，超过36小时，超过48小时或超过72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在延长的时间段内维持其状态。
在一些实施方案中，凋亡细胞群没有细胞聚集体。在一些实施方案中，凋亡细胞群没有大的细胞聚集体。在一些实施方案中，与在从供体收集细胞(白细胞分离术)以外的步骤中不添加抗凝剂而制备的凋亡细胞群相比，凋亡细胞群具有数目减少的细胞聚集体。在一些实施方案中，凋亡细胞群或其组合物包含抗凝剂。
在一些实施方案中，凋亡细胞没有细胞聚集体，其中所述凋亡细胞得自具有高血液甘油三酯的对象。在一些实施方案中，对象的血液甘油三酯水平高于150mg/dL。在一些实施方案中，凋亡细胞群没有细胞聚集体，其中所述凋亡细胞群是从得自具有正常血液甘油三酯的对象的细胞制备的。在一些实施方案中，对象的血液甘油三酯水平等于或低于150mg/dL。在一些实施方案中，细胞聚集体在凋亡细胞生产方法期间产生细胞损失。
本领域技术人员会理解，术语“聚集体”或“细胞聚集体”可以涵盖在低剪切力或郁积状态下血细胞的可逆凝集。在产生凋亡细胞的孵育步骤中可以目视观察细胞聚集体。可以通过本领域已知的任何方法来测量细胞聚集，例如通过在光学显微镜下对样品进行视觉成像或使用流式细胞仪。
在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、柠檬酸葡萄糖(ACD)Formula A及其组合。在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、柠檬酸葡萄糖(ACD)Formula A及其组合。
在制备早期凋亡细胞群及其组合物的方法的一些实施方案中，将抗凝剂添加到在群制备期间使用的至少一种介质中。在一些实施方案中，在群制备期间使用的至少一种介质选自：冷冻介质、洗涤介质、诱导细胞凋亡的孵育介质及其任意组合。
在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、ACD Formula A及其组合。应当注意，可以使用本领域已知的其他抗凝剂，例如但不限于Fondaparinaux、比伐卢定和阿加曲班。
在一些实施方案中，在群制备期间使用的至少一种介质包含5％的包含10U/ml肝素的ACD Formula A溶液。在一些实施方案中，不将抗凝剂添加到细胞群的最终悬浮介质中。如本文所用，术语“最终悬浮介质”和“施用介质”可互换使用，具有所有相同的特性和含义。
在一些实施方案中，在群制备期间使用的至少一种介质包含浓度在0.1-2.5U/ml之间的肝素。在一些实施方案中，在群制备期间使用的至少一种介质包含浓度在1％-15％v/v之间的ACD Formula A。在一些实施方案中，冷冻介质包含抗凝剂。在一些实施方案中，孵育介质包含抗凝剂。在一些实施方案中，冷冻介质和孵育介质均包含抗凝剂。在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、ACD Formula A及其组合。
在一些实施方案中，冷冻介质中的肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，冷冻介质中的ACD Formula A的浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，孵育介质中的肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，孵育介质中的ACD Formula A的浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，抗凝剂是柠檬酸葡萄糖(ACD)Formula A的溶液。在一些实施方案中，添加到至少一种在群制备期间使用的介质中的抗凝剂是ACDFormula A，其含有浓度为10U/mL的肝素。
在一些实施方案中，用于生产早期凋亡细胞群的细胞凋亡诱导孵育介质包含抗凝剂。在一些实施方案中，用于生产早期凋亡细胞群的冷冻介质和诱导细胞凋亡的孵育介质均包含抗凝剂。不希望受到任何理论或机制的束缚，为了在不同细胞组合物中维持高且稳定的细胞产率，而与细胞收集方案无关，在一些实施方案中，添加抗凝剂包括将抗凝剂添加到凋亡细胞群生产过程中的冷冻介质和凋亡诱导培养介质。在一些实施方案中，组合物中的高且稳定的细胞产率包含用于诱导细胞凋亡的初始细胞群的至少30％，优选至少40％，通常至少50％的细胞的细胞产率。
在一些实施方案中，冷冻介质和孵育介质这两者均包含抗凝剂。在一些实施方案中，向孵育介质和冷冻介质这两者中添加抗凝剂在本发明的组合物的不同制备物之间产生高并且稳定的细胞产率而与细胞收集条件无关，所述细胞收集条件例如但不限于在细胞收集期间添加抗凝剂的时间和/或类型。在一些实施方案中，向孵育介质和冷冻介质这两者中添加抗凝剂产生高并且稳定的产率的本发明的细胞制备物而与在白细胞分离术期间添加抗凝剂的时间和/或类型无关。在一些实施方案中，在高甘油三酯水平存在下制备本发明的细胞制备物会在不同的制备物之间产生低和/或不稳定的细胞产率。每一种可能性均代表了本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，由具有高甘油三酯水平的供体的血液制备细胞制备物会产生细胞制备物的低和/或不稳定的细胞产率。每一种可能性均代表了本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，术语“高甘油三酯水平”指的是高于具有相同的性别和年龄的健康受试者的正常水平的甘油三酯水平。在一些实施方案中，术语“高甘油三酯水平”指的是高于约1.7毫摩尔/升的甘油三酯水平。如本文所用，高并且稳定的产率指的是本发明的组合物中的细胞产率高到足以使得能够制备在向受试者施用时会表现出治疗功效的剂量。在一些实施方案中，治疗功效指的是治疗、预防或改善受试者的免疫性疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病的能力。每一种可能性均代表了本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，高并且稳定的细胞产率是最初冷冻的细胞当中有至少30％，可能至少40％，通常至少50％的细胞处于本发明的组合物中的细胞产率。
在一些实施方案中，在细胞制备物是从具有高甘油三酯水平的供体获得的情况下，所述供体将采取选以下的至少一种措施：在捐赠之前服用降低甘油三酯的药物，所述药物例如但不限于：他汀类(statin)和/或苯扎贝特(bezafibrate)；在捐赠之前空腹至少8小时、10小时、12小时的时间段；在捐赠之前至少24小时、48小时、72小时食用适当的饮食以降低血液甘油三酯水平；以及其任何组合。
在一些实施方案中，群中的细胞产率涉及组合物中的细胞数目除以进行凋亡诱导的细胞的初始数目。如本文所用，术语“诱导早期凋亡状态”和“诱导凋亡”可以互换使用。
在一些实施方案中，在冷冻和解冻之后，将单个核富集的细胞组合物在孵育介质中孵育。在一些实施方案中，在解冻和孵育之间存在至少一个洗涤步骤。如本文所用，术语“孵育介质”和“凋亡诱导孵育介质”可互换使用。在一些实施方案中，孵育介质包含补充有L-谷氨酰胺、Hepes、甲泼尼松和血浆的RPMI 1640培养基。在一些实施方案中，洗涤介质包含2mML-谷氨酰胺、10mMHepes和10％v/v血浆。在一些实施方案中，孵育介质中的血浆与细胞制备物的细胞衍生自相同供体。在一些实施方案中，在孵育的当天将血浆添加到孵育介质中。在一些实施方案中，在37℃和5％CO2进行孵育。
在一些实施方案中，孵育介质包含甲泼尼龙。在一些实施方案中，孵育介质中的甲泼尼龙进一步诱导单个核富集的细胞组合物中的细胞进入早期凋亡状态。在一些实施方案中，通过冷冻和在甲泼尼龙的存在下孵育，单个核富集的细胞组合物中的细胞被诱导进入早期凋亡状态。在一些实施方案中，早期凋亡细胞群的产生有利地允许基本上不诱导坏死地诱导早期凋亡状态，其中细胞在制备后约24小时维持稳定在所述早期凋亡状态。
在一些实施方案中，孵育介质包含浓度为约10-100μg/ml的甲泼尼龙。在一些实施方案中，孵育介质包含浓度为约40-60μg/ml，或者约45-55μg/ml的甲泼尼龙。在一些实施方案中，孵育介质包含浓度为50μg/ml的甲泼尼龙。
在一些实施方案中，孵育持续约2-12小时，可能4-8小时，通常约5-7小时。在一些实施方案中，孵育持续约6小时。在一些实施方案中，孵育持续至少6小时。在一个优选的实施方案中，孵育持续6小时。
在一些实施方案中，孵育介质包含抗凝剂。在一些实施方案中，将抗凝剂添加到孵育介质中提高了细胞制备物的产率。在一些实施方案中，孵育介质中的抗凝剂的浓度与冷冻介质中的浓度相同。在一些实施方案中，孵育介质包含选自以下的抗凝剂：肝素、ACDFormula A及其组合。在一些实施方案中，在孵育介质中使用的抗凝剂是含有10U/ml浓度的肝素的ACD Formula A。
在一些实施方案中，孵育介质包含肝素。在一些实施方案中，孵育介质中的肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，孵育介质中的肝素的浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，通常为约0.5U/ml。在某些实施方案中，孵育介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一些实施方案中，孵育介质包含ACD Formula A。在一些实施方案中，孵育介质中的ACD Formula A的浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，孵育介质中的ACDFormula A的浓度在1％-15％v/v之间，可能在4％-7％v/v之间，通常为约5％v/v。在一些实施方案中，孵育介质中的ACD Formula A的浓度为约5％v/v。
在一些实施方案中，细胞制备物的产率的提高包括所述制备物的早期凋亡活细胞的数目除以生产该制备物的冷冻细胞的数目的提高。
在一些实施方案中，向冷冻介质中添加抗凝剂有助于在药物群的不同制备物之间的高且稳定的产率。在优选的实施方案中，至少将抗凝剂添加到冷冻介质和孵育介质中导致药物组合物的不同制备物之间的高且稳定的产率，而与所使用的细胞收集方案无关。
在一些实施方案中，冷冻介质包含选自以下的抗凝剂：肝素、ACD Formula A及其组合。在一些实施方案中，在冷冻介质中使用的抗凝剂是含有10U/ml浓度的肝素的ACDFormula A。在一些实施方案中，冷冻介质包含5％v/v的ACD Formula A溶液，其包含浓度为10U/ml的肝素。
在一些实施方案中，冷冻介质包含肝素。在一些实施方案中，冷冻介质中的肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，冷冻介质中的肝素的浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，通常为约0.5U/ml。在某些实施方案中，冷冻介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一些实施方案中，冷冻介质包含ACD Formula A。在一些实施方案中，冷冻介质中的ACD Formula A的浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，冷冻介质中的ACDFormula A的浓度在1％-15％v/v之间，可能在4％-7％v/v之间，通常为约5％v/v。在一些实施方案中，冷冻介质中的ACD Formula A的浓度为约5％v/v。
在一些实施方案中，将抗凝剂添加到孵育介质和/或冷冻介质导致群内高且稳定的细胞产率，而与供体血液中甘油三酯水平无关。在一些实施方案中，当从具有正常或高甘油三酯水平的供体的血液中获得时，将抗凝剂添加至孵育介质和/或冷冻介质导致本发明组合物中的高且稳定的细胞产率。在一些实施方案中，至少将抗凝剂添加至孵育介质导致组合物内的高且稳定的细胞产率，而与供体血液中甘油三酯水平无关。在一些实施方案中，将抗凝剂添加到冷冻介质和孵育介质中导致组合物内的高且稳定的细胞产率，而与供体血液中甘油三酯水平无关。
在一些实施方案中，冷冻介质和/或孵育介质和/或洗涤介质包含浓度为至少0.1U/ml，可能至少0.3U/ml，通常至少0.5U/ml的肝素。在一些实施方案中，冷冻介质和/或孵育介质和/或洗涤介质包含浓度为至少1％v/v，可能至少3％v/v，通常至少5％v/v的ACDFormula A。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在细胞收集之后并且在重悬在冷冻介质中并冷冻之前进行至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在冷冻和解冻后进行至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤步骤包含将单个核富集的细胞组合物离心，然后提取上清液并将其重悬于洗涤介质中。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在早期凋亡细胞群产生的每个阶段之间进行至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在整个生产早期凋亡细胞群的洗涤步骤期间，将抗凝剂添加至洗涤介质。在一些实施方案中，在孵育后，单个核富集的细胞组合物进行至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在使用PBS孵育后，单个核富集的细胞组合物进行至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在将细胞制备物重悬在施用介质中之前，不将抗凝剂添加到最终的洗涤步骤中。在一些实施方案中，在将细胞制备物重悬在施用介质中之前，不将抗凝剂添加到用于最终洗涤步骤的PBS中。在某些实施方案中，不将抗凝剂添加到施用介质中。
在一些实施方案中，孵育期间的细胞浓度为约5×106个细胞/ml。
在一些实施方案中，在冷冻、解冻和孵育之后，将单个核富集的细胞组合物悬浮在施用介质中，从而产生药物群。在一些实施方案中，施用介质包含合适的生理缓冲剂。合适的生理缓冲剂的非限制性实例是：盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液(HBSS)等。在一些实施方案中，施用介质包含PBS。在一些实施方案中，施用介质包含有助于维持细胞生存力的补充剂。在一些实施方案中，在施用之前过滤单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在施用之前，使用至少200μm的过滤器过滤单个核富集的细胞组合物。
在一些实施方案中，将单个核富集的细胞群重悬于施用介质中，使得所得细胞制备物的最终体积在100-1000ml之间，可能在200-800ml之间，通常在300-600ml之间。
在一些实施方案中，细胞收集是指获得单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在生产早期凋亡细胞群期间进行的洗涤步骤在洗涤介质中进行。在某些实施方案中，在洗涤介质中进行洗涤步骤直至生产早期凋亡细胞群的孵育步骤。在一些实施方案中，洗涤介质包含补充有L-谷氨酰胺和Hepes的RPMI 1640培养基。在一些实施方案中，洗涤介质包含补充有2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes的RPMI 1640培养基。
在一些实施方案中，洗涤介质包含抗凝剂。在一些实施方案中，洗涤介质包含选自以下的抗凝剂：肝素、ACD Formula A及其组合。在一些实施方案中，洗涤介质中抗凝剂的浓度与冷冻介质中的浓度相同。在一些实施方案中，洗涤介质中抗凝剂的浓度与孵育介质中的浓度相同。在一些实施方案中，洗涤介质中使用的抗凝剂是ACD Formula A，其含有浓度为10U/ml的肝素。
在一些实施方案中，洗涤介质包含肝素。在一些实施方案中，洗涤介质中的肝素的浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，洗涤介质中的肝素的浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，通常为约0.5U/ml。在某些实施方案中，洗涤介质中的肝素浓度为约0.5U/ml。
在一些实施方式中，洗涤介质包含ACD Formula A。在一些实施方式中，洗涤介质中的ACD Formula A的浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，洗涤介质中的ACDFormula A的浓度在1％-15％v/v之间，可能在4％-7％v/v之间，通常为约5％v/v。在一些实施方案中，洗涤介质中的ACD Formula A的浓度为约5％v/v。
在一些实施方案中，在预期给对象施用所述群之前数小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物在约33℃至39℃解冻。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物解冻约30-240秒，优选40-180秒，最优选50-120秒。
在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少10小时解冻单个核富集的细胞组合物，或者在预期施用所述群之前至少20、30、40或50小时解冻。在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少15-24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少约24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少20小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少30小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在一些实施方案中，在预期施用所述群之前至少24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在融化之前和/或之后在洗涤介质中进行至少一个洗涤步骤。
在一些实施方案中，组合物还包含甲泼尼龙。在一些实施方案中，甲泼尼龙的浓度不超过30μg/ml。
在一些实施方案中，以高剂量使用凋亡细胞。在一些实施方案中，凋亡细胞以高浓度使用。在一些实施方案中，使用人凋亡多形核中性粒细胞(PMN)。在一些实施方案中，使用一组细胞，其中50％是凋亡细胞。在一些实施方案中，通过May-Giemsa染色的cytoprep验证凋亡细胞。在一些实施方案中，通过台盼蓝排除法评估细胞的生存力。在一些实施方案中，通过膜联蛋白V/碘化丙啶染色并通过FACS检测来确认细胞的凋亡和坏死状态。
在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞不包含坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于1％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于2％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于3％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于4％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于5％的坏死细胞。
在一些实施方案中，施用约140×106-210×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约10-100×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约20×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约30×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约40×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约50×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用60×106个凋亡细胞。在一些实施方案中，施用约60×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约70×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约80×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约90×106个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约1-15×107个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约10×107个凋亡细胞的剂量。在一些实施方案中，施用约15×107个凋亡细胞的剂量。
在一些实施方案中，施用10×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×107个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×108个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×109个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×1010个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×1011个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×1012个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×105个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×104个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×103个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10×102个凋亡细胞的剂量。
在一些实施方案中，施用高剂量的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用35×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用210×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用70×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用140×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用35-210×106个凋亡细胞的剂量。
在一些实施方案中，施用单剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用2剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用3剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用4剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用5剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用6剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用7剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用8剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用9剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多于9剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多剂的凋亡细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包含但不限于静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。
在一些实施方案中，凋亡细胞从得自不同于将接受所述凋亡细胞的对象的对象的细胞中制备。在一些实施方案中，本文公开的方法包括用于克服同种异体供体细胞排斥的另外的步骤，包括美国专利申请20130156794中描述的一种或多种步骤，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所述方法包括在施用凋亡细胞之前进行全部或部分淋巴消耗(lymphodepletion)的步骤，所述凋亡细胞在一些实施方案中是同种异体的凋亡细胞。在一些实施方案中，调节淋巴消耗以使其延迟宿主与移植物反应足够长的时间，以允许同种异体的凋亡细胞控制细胞因子的释放。在一些实施方案中，该方法包括施用延迟同种异体凋亡T细胞从淋巴结流出的物质(例如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)、5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]1,2,4-恶二唑(SEW2871)、3-(2-(-己基苯基氨基)-2-氧代乙氨基)丙酸(W123)、2-铵-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯硫基)苯基)-2-(羟甲基)丁基磷酸氢盐(KRP-203磷酸盐)或本领域已知的其他物质)的步骤，其可以用作本文公开的组合物和方法的一部分，以允许使用具有功效且缺乏引起移植物抗宿主病的同种异体凋亡细胞。在另一个实施方案中，使同种异体凋亡T细胞的MHC表达沉默以减少同种异体细胞的排斥。
在一些实施方案中，方法包括产生单个核凋亡细胞群，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合，所述方法包括以下步骤，获得外周血单个核富集的细胞群；将所述单个核富集的细胞群在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻；使所述单个核富集的细胞群解冻；在包含最终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群；将所述单个核富集的细胞群在施用介质中重悬；以及使所述单个核富集的细胞群失活，其中所述失活在诱导后发生，其中所述方法产生单个核凋亡细胞群，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在将凋亡细胞群施用给同一对象(自体ApoCells)之前，辐照衍生自对象的凋亡细胞群。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在将凋亡细胞群施用给受体之前，辐照衍生自对象的凋亡细胞(同种异体ApoCells)。
在一些实施方案中，以会减少凋亡细胞群内残余活细胞的增殖和/或活化的方式辐照细胞。在一些实施方案中，以降低群体中活的非凋亡细胞的百分比的方式辐照细胞。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至少于该群体的50％。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至少于该群体的40％。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至少于该群体的30％。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至少于该群体的20％。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至少于该群体的10％。在一些实施方案中，失活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至该群体的0％。
在另一个实施方案中，辐照的凋亡细胞保留其所有早期凋亡特性、免疫调节特性、稳定性特性。在另一个实施方案中，辐照步骤使用UV辐照。在另一个实施方案中，辐照步骤使用X射线辐照。在另一个实施方案中，辐照步骤使用γ辐照。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含的活的非凋亡细胞的百分比降低；包含一种制备物，所述制备物具有的存在于所述凋亡细胞制备物中的任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或包含一种制备物，所述制备物具有的存在于所述凋亡细胞制备物中的任何活的非凋亡细胞的增殖降低；或其任何组合。
在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不增加死细胞(PI+)的群体。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约1％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约2％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约3％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约4％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约5％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约6％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约7％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约8％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约9％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约10％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约15％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞(PI+)的群体增加超过约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
在一些实施方案中，在一个实施方案中，包含减少的或不存在的活的非凋亡细胞部分的细胞群可以提供不具有任何活(living)/活(viable)的细胞的单个核早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，在一个实施方案中，包含减少的或不存在的活的非凋亡细胞部分的细胞群可以提供不引起受体中GVHD的单个核凋亡细胞群。
在一些实施方案中，使用辐照的ApoCell消除可能的移植物vs白血病的作用(使用凋亡群(其包括很小部分的活细胞)可能引起的)，表明本文实施例所示的作用(参见实施例4)是由辐照的凋亡细胞造成的，而不是凋亡细胞群内存在的具有细胞活性的活的细胞增殖群。
在另一个实施方案中，所述方法包括在施用于受体之前辐照衍生自供体的WBC的凋亡细胞的步骤。在一些实施方案中，以避免凋亡细胞群内残留的活细胞增殖和/或活化的方式辐照细胞。在另一个实施方案中，被辐照的凋亡细胞保留其所有早期凋亡特性、免疫调节特性、稳定性特性。在另一个实施方案中，辐照步骤使用UV辐照。在另一个实施方案中，辐照步骤使用X射线辐照。在另一个实施方案中，辐照步骤使用γ辐照。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含百分比降低的活的非凋亡细胞，凋亡细胞包含的活的非凋亡细胞的百分比降低；包含一种制备物，所述制备物具有的存在于所述凋亡细胞制备物中的任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或包含一种制备物，所述制备物具有的存在于所述凋亡细胞制备物中的任何活的非凋亡细胞的增殖降低；或其任何组合。
在一些实施方案中，凋亡细胞包含合并的单个核凋亡细胞制备物。在一些实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物包含处于早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述合并的单个核凋亡细胞包含降低的百分比的活的非凋亡细胞，具有的任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制的制备物，或具有的任何活的非凋亡细胞的增殖降低的制备物，或其任意组合。在另一个实施方案中，已经辐照合并的单个核凋亡细胞。在另一个实施方案中，本文公开了合并的单个核凋亡细胞制备物，其在一些实施方案中源自得自献血的白细胞级分(WBC)。
在一些实施方案中，对凋亡细胞制备物进行辐照。在另一个实施方案中，所述辐照包含γ辐照、X射线辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞制备物相比，辐照的制备物具有的非凋亡细胞的数目减少。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞制备物相比，辐照的制备物具有的增殖细胞的数目减少。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞群相比，辐照的制备物具有的潜在的免疫活性细胞的数目减少。
在一些实施方案中，合并的血液包含供体和受体之间不匹配的第三方血液。
本领域技术人员会理解，术语“合并”可以涵盖从多个供体收集的血液，其被制备并且可能被存储以供以后使用。然后可以处理该组合的血液池以产生合并的单个核凋亡细胞制备物。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物确保了可容易获得的单个核凋亡细胞的供应。在另一个实施方案中，恰在诱导凋亡的孵育步骤之前合并细胞。在另一个实施方案中，在孵育步骤之后，在重悬步骤合并细胞。在另一个实施方案中，恰在辐照步骤之前合并细胞。在另一个实施方案中，在辐照步骤之后合并细胞。在另一个实施方案中，在制备方法中的任何步骤合并细胞。
在一些实施方案中，合并的凋亡细胞制备物衍生自存在于约2至25个单位血液的细胞。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制备物由存在于约2-5、2-10、2-15、2-20、5-10、5-15、5-20、5-25、10-15、10-20、10-25、6-13或6-25个单位血液的细胞组成。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制备物由存在于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、21、22、23、24或25个单位血液的细胞组成。所需的血液单位数目还取决于从血液中回收白细胞的效率。例如，低效率的WBC回收将导致需要更多的单位，而高效率的WBC回收将导致所需的单位更少。在一些实施方案中，每个单位是一袋血。在另一个实施方案中，合并的凋亡细胞制备物由存在于至少25个单位血液，至少50个单位血液或至少100个单位血液的细胞组成。
在一些实施方案中，血液单位包含来自血液捐献的白细胞(WBC)级分。在另一个实施方案中，捐献可以来自血液中心或血库。在另一个实施方案中，捐献可以来自在制备合并的凋亡细胞制备物时在医院中收集的供体。在另一个实施方案中，包含来自多个供体的WBC的血液单位被保存并维持在独立的血库中，该血库被创建用于本文所公开的组合物及其方法的目的。在另一个实施方案中，出于本文公开的组合物和方法的目的而开发的血库能够提供来自多个供体的包含WBC的血液单位，并且包含白细胞分离术单位。
在一些实施方案中，合并的WBC的单位不受HLA匹配的限制。因此，所得合并的凋亡细胞制备物包含不受HLA匹配限制的细胞群。因此，在某些实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物包含同种异体细胞。
不受HLA匹配限制的衍生自合并的WBC的合并的单个核凋亡细胞制备物的优势是，WBC的来源容易获得，并且降低了获得WBC的成本。
在一些实施方案中，合并的血液包含独立于HLA匹配的来自多个供体的血液。在另一个实施方案中，合并的血液包含来自多个供体的血液，其中已经考虑了与受体匹配的HLA。例如，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因已在供体和受体之间匹配。在另一个实施方案中，多个供体是部分匹配的，例如一些供体已进行HLA匹配，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因已在一些供体和受体之间匹配。每一种可能性均包含本文公开的实施方案。
在某些实施方案中，在下述的诱导凋亡步骤之后，可保留一些活的非凋亡细胞(抗凋亡的)(实施例1)。在一些实施方案中，在辐照步骤之前观察到这些活的非凋亡细胞的存在。这些活的非凋亡细胞可能能够增殖或被活化。在一些实施方案中，衍生自多个供体的合并的单个核凋亡细胞制备物可以针对宿主被活化，针对彼此被活化或针对两者被活化。
在一些实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，本文公开的辐照的细胞制备物具有抑制的细胞活化和降低的增殖。在另一个实施方案中，辐照包括γ辐照、X射线辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，辐照的细胞制备物具有数目减少的非凋亡细胞。在另一个实施方案中，辐照包含约10个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约15个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约20个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约25个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约30个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约35个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约40个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约45个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约50个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约55个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约60个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约65个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约70个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约75个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约80个格雷单位(Gy)。
在另一个实施方案中，辐照包含约10-80个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约20-65个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约10-65个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约20-80个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约30-50个格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含高达2500Gy。在另一个实施方案中，辐照的合并的凋亡细胞制备物维持与非辐照的合并的凋亡细胞制备物相同或相似的凋亡谱、稳定性和功效。
在一些实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定长达24小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少24小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过24小时。在又一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定长达36小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少36小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过36小时。在另一个实施方案中，本文所公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定长达48小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少48小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过48小时。
在一些实施方案中，包含辐照步骤的产生合并的细胞制备物的方法保留了在衍生自单个匹配供体的凋亡制备物中观察到的早期凋亡特性、免疫调节特性和稳定性特性，其中细胞制备可以不包括辐照步骤。在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物不引起移植物抗宿主病(GVHD)应答。
细胞制备物的辐照在本领域中被认为是安全的。当前，对捐献的血液常规进行辐照程序以防止与WBC反应。
在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物中凋亡细胞的百分比接近100％，从而减少了细胞制备物中活的非凋亡细胞的级分。在一些实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少40％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少50％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少60％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少70％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少80％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少90％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少99％。因此，在一个实施方案中，包含减少的或不存在的活的非凋亡细胞级分的细胞制备物可以提供在受体中不引起GVHD的合并的单个核凋亡细胞制备物。每种可能性代表本文公开的实施方案。
或者，在另一个实施方案中，通过特异性地除去活细胞群，例如通过靶向沉淀，来降低活的非凋亡WBC的百分比。在另一个实施方案中，可以使用与磷脂酰丝氨酸结合的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合非凋亡细胞而不是凋亡细胞的细胞表面上的标志物的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合凋亡细胞而不是非凋亡细胞的细胞表面上的标记物的磁珠来选择凋亡细胞用于进一步制备。在又一个实施方案中，通过使用超声降低活的非凋亡WBC的百分比。
在一个实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体。
在一些实施方案中，合并的细胞制备物包含至少一种选自以下的细胞类型：淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。在另一个实施方案中，合并的细胞制备物包含富集的单个核细胞群。在一些实施方案中，合并的单个核是单个核富集的细胞制备物，其包含选自以下的细胞类型：淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。在另一个实施方案中，单个核富集的细胞制备物包含不超过15％，或者不超过10％，通常不超过5％的多形核白细胞，也称为粒细胞(即嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。在另一个实施方案中，合并的单个核制备物没有粒细胞。
在另一个实施方案中，合并的单个核富集的细胞制备物包含不超过15％，或者不超过10％，通常不超过5％的CD15高表达细胞。在一些实施方案中，合并的凋亡细胞制备物包含少于15％的CD15高表达细胞。
在一些实施方案中，本文公开的合并的单个核富集的细胞制备物包含至少80％的单个核细胞，至少85％的单个核细胞，可选地至少90％的单个核细胞或至少95％的单个核细胞，其中每种可能性是本文公开的单独的实施方案。根据一些实施方案，本文公开的合并的单个核富集的细胞制备物包含至少85％的单个核细胞。
在另一个实施方案中，具有最终合并的单个核百分比至少为80％的任何合并的细胞制备物被认为是本文所公开的合并的单个核富集的细胞制备物。因此，将具有增加的多形核细胞(PMN)的细胞制备物与具有高单个核细胞且最终“合并”的单个核细胞为至少80％的细胞制备物合并，包含本文公开的制备物。根据一些实施方案，单个核细胞包含淋巴细胞和单核细胞。
本领域技术人员会理解，术语“单个核细胞”可以涵盖具有一个单叶核的白细胞。在另一个实施方案中，本文公开的合并的凋亡细胞制备物包含少于5％的多形核白细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞是T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自与CAR T细胞相同的合并的第三方供体T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自CAR T细胞群。
出乎意料的是，凋亡细胞减少了与细胞因子风暴有关的细胞因子的产生，包含但不限于IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)，单独或组合使用，同时维持了CAR T细胞疗法的有效性(实施例2)。在一实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中细胞因子的表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞降低巨噬细胞中细胞因子的表达水平。在一实施方案中，凋亡细胞抑制(suppress)巨噬细胞中细胞因子的表达水平。在一实施方案中，凋亡细胞抑制(inhibit)巨噬细胞中细胞因子的表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞维持IFN-γ水平以匹配或接近匹配CAR-T细胞施用之前存在的水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中细胞因子的表达水平，但不影响CAR T细胞中细胞因子的表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响DC中细胞因子的表达水平，但不影响CAR T细胞中细胞因子的表达水平。因此，出乎意料的是，凋亡细胞将可用于维持CAR T细胞疗法的有效性。
在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致降低CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致降低严重的CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响抑制导致CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致抑制严重的CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致抑制CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致抑制严重的CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致防止CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子的表达水平的影响导致防止严重的CRS。
在另一个实施方案中，凋亡细胞触发T细胞的死亡，但不通过细胞因子表达水平的改变来触发。
在另一个实施方案中，凋亡细胞对于启动巨噬细胞和树突状细胞分泌细胞因子起反作用，否则所述细胞因子将放大细胞因子风暴。在另一个实施方案中，凋亡细胞增加Treg，其抑制炎症应答和/或防止细胞因子过度释放。
在一些实施方案中，凋亡细胞的施用抑制一种或多种促炎性细胞因子。在一些实施方案中，促炎性细胞因子包含IL-1β、IL-6、TNF-α或IFN-γ，或其任意组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用促进一种或多种抗炎性细胞因子的分泌。在一些实施方案中，抗炎性细胞因子包含TGF-β、IL10或PGE2或其任意组合。
在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用抑制了暴露于TLR配体后的树突状细胞成熟。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用产生潜在的致耐受性树突状细胞，其在一些实施方案中能够迁移，并且在一些实施方案中，迁移是由于CCR7。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用引发各种信号传导事件，在一个实施方案中，其是TAM受体信号传导(Tyro3、Axl和Mer)，在一些实施方案中，其抑制抗原呈递细胞中的炎症。
在一些实施方案中，Tyro-3、Axl和Mer构成受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族，其特征在于激酶结构域和粘附分子样细胞外结构域内的保守序列。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用活化了通过MerTK的信号传导。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用活化了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径，在一些实施方案中，其负调节NF-κB。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用负调节炎性小体，在一个实施方案中，其导致促炎性细胞因子分泌的抑制、DC成熟或其组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用上调抗炎基因的表达，例如Nr4a、Thbs1或其组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用诱导高水平的AMP，在一些实施方案中，其以Pannexin1依赖性方式积累。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用抑制炎症。
在一些实施方案中，如本文所述，使用早期凋亡细胞的方法包括与抗体组合使用早期凋亡细胞或其组合物。在一些实施方案中，该抗体针对肿瘤细胞抗原。在另一个实施方案中，该抗体针对CD20。在另一个实施方案中，抗体是利妥昔单抗(Rtx)。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体包含在同一组合物中。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体包含在不同的组合物中。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合物的组合的施用是同时进行的。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合的组合的施用包含在抗体之前施用凋亡细胞或其组合物。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合的组合的施用包含在抗体施用后施用凋亡细胞或其组合物。
在另一个实施方案中，该抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀；Genentech)：针对ERBB2的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是贝伐珠单抗(阿瓦斯丁；Genentech/Roche)：针对VEGF的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是西妥昔单抗(爱必妥；Bristol-MyersSquibb)：针对EGFR的嵌合人-鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是帕尼单抗(维克替比；Amgen)：针对EGFR的人IgG2。在另一个实施方案中，抗体是伊匹单抗(Yervoy；Bristol-Myers Squibb)：针对CTLA4的IgG1。
在另一个实施方案中，抗体是阿仑珠单抗(Campath；Genzyme)：针对CD52的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是奥法木单抗(Arzerra；Genmab)：针对CD20的人IgG1。在另一个实施方案中，抗体是吉妥单抗(米罗他；Wyeth)：针对CD33的人源化IgG4。在另一个实施方案中，抗体是本妥昔单抗(Adcetris；Seattle Genetics)：针对CD30的嵌合IgG1。在另一个实施方案中，抗体是90Y标记的替伊莫单抗(泽娃灵；IDECP harmaceuticals)：针对CD20的鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是131I标记的托西莫单抗(百克沙；GlaxoSmithKline)：针对CD20的鼠IgG2。
在另一个实施方案中，所述抗体是雷莫芦单抗，其针对血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)。在另一个实施方案中，抗体是雷莫芦单抗(Cyramza Injection，Eli Lilly andCompany)、博纳吐单抗(BLINCYTO，AmgenInc.)、派姆单抗(KEYTRUDA，MerckSharp&DohmeCorp.)、阿托珠单抗(GAZYVA，Genentech，Inc.；先前已知为GA101)培妥珠单抗注射液(PERJETA，Genentech，Inc.)或地诺单抗(Xgeva，AmgenInc.)。在另一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗(Sisilect；Novartis)。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗(Zenapax；Roche)。
在另一个实施方案中，与凋亡细胞组合施用的抗体针对本文描述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。在另一个实施方案中，该抗体针对肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，该抗体针对作为血管生成因子的肿瘤相关抗原或其片段。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以与本文所述的组合物组合使用，例如但不限于包含早期凋亡细胞的组合物。
表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)是一种抗原靶向受体，由与细胞外肿瘤结合部分(最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv))融合的细胞内T细胞信号传导结构域组成。CAR直接识别细胞表面抗原，独立于MHC介导的呈递，从而允许在所有患者中使用对任何给定抗原具有特异性的单一受体构建体。最初的CAR将抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)复合体的CD3ζ活化链融合。尽管这些第一代CAR在体外诱导T细胞效应子功能，但它们在体内却受限于不良抗肿瘤功效。随后的CAR迭代包含与CD3ζ串联的次级共刺激信号，包括来自CD28或多种TNF受体家族分子(例如4-1BB(CD137)和OX40(CD134))的细胞内结构域。此外，第三代受体除CD3ζ外还包括两个共刺激信号，最常见地来自CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR显著提高了抗肿瘤功效，在某些情况下诱导晚期癌症患者完全缓解。
在一些实施方案中，CAR T细胞是包含抗原受体的免疫应答细胞，当其受体结合其抗原时被活化。
在一些实施方案中，在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第一代CART细胞。在一些实施方案中，在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第二代CAR T细胞。在一些实施方案中，在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第三代CAR T细胞。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CART细胞是第四代CART细胞。在一些实施方案中，每一代CART细胞都比前代CAR T细胞更有效。
在一些实施方案中，第一代CAR具有一个信号传导结构域，通常是CD3 TCRζ链的细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CART细胞是第二代CAR T细胞。在一些实施方案中，本文公开的CART细胞包含三方嵌合受体(TPCR)。在一些实施方案中，本文公开的CAR T细胞包含一种或多种以共刺激独立的方式活化初始T细胞的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR T细胞还编码肿瘤坏死因子受体家族的一种或多种成员，在一些实施方案中，其是CD27、4-1BB(CD137)或OX40(CD134)或其组合。
第三代CAR T细胞试图利用2个共刺激结构域的信号传导潜能：在一些实施方案中，CD28结构域后面是4-1BB或OX-40信号传导结构域。在一些实施方案中，在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞还编码共刺激信号传导结构域，在一些实施方案中是CD28。在一些实施方案中，信号传导结构域是CD3ζ链、CD97、GDI 1a-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、CD28信号传导结构域或其组合。
在一些实施方案中，端粒长度和复制能力与过继转移的T细胞系的植入效率和抗肿瘤功效相关。在一些实施方案中，CD28刺激维持T细胞中的端粒长度。
在一些实施方案中，可以通过引入另外的基因来进一步增强CAR修饰的T细胞效力，所述另外的基因包括编码增殖性细胞因子(即IL-12)或共刺激配体(即4-1BBL)的基因，从而产生“装甲的(armored)”第四代CAR修饰的T细胞。在一些实施方案中，“装甲的CAR T细胞”是被保护免受抑制性肿瘤微环境的CAR T细胞。在一些实施方案中，“装甲的”CAR技术结合了可溶性信号传导蛋白的局部分泌，以在肿瘤微环境内放大免疫应答，目的是使全身性副作用最小化。在一些实施方案中，信号蛋白信号是IL-12，其可以刺激T细胞活化和募集。在一些实施方案中，“装甲的”CAR技术在实体瘤适应症中特别有用，其中微环境和有效的免疫抑制机制具有使建立牢固的抗肿瘤应答更具挑战性的潜力。
在一些实施方案中，对CART细胞进行遗传修饰以编码参与防止细胞凋亡、肿瘤微环境重塑、诱导稳态增殖以及促进定向T细胞归巢的趋化因子受体的分子。
在一些实施方案中，使用细胞因子转基因的表达、与小分子抑制剂的联合疗法或单克隆抗体来增强在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，旨在改善CART细胞疗法的其他策略，包括使用双重CAR和趋化因子受体以更特异性靶向肿瘤细胞，被认为是本文公开的CAR T细胞和CAR T细胞疗法的一部分。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法的CAR T细胞包含第二结合结构域，其可以导致抑制或放大信号，以增加CAR T细胞对癌细胞相对于正常细胞的特异性。例如，可以对CAR T细胞进行工程化，使其在一种靶蛋白存在的情况下被触发，但是如果存在另一种蛋白，那么它将被抑制。或者，也可以对其进行工程化，以使需要两个靶蛋白使活化最大。这些方法可以相对于正常组织增加CAR对肿瘤的特异性。
在一些实施方案中，在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞编码基于抗体的外部受体结构和胞质结构域，所述胞质结构域编码由基于免疫受体酪氨酸的活化基序组成的信号传导模块。
在一些实施方案中，CAR T细胞进一步编码结合具有免疫抑制活性的多肽的单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4或其组合。
在一些实施方案中，CAR T细胞进一步编码结合具有免疫刺激活性的多肽的单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，具有免疫刺激活性的多肽是CD28、OX-40、4-1BB或其组合。在一些实施方案中，CAR T细胞进一步编码CD40配体(CD40L)，在一些实施方案中，其增强抗原的免疫刺激活性。
在一些实施方案中，免疫细胞是细胞毒性的。在一些实施方案中，用于遗传修饰的细胞毒性细胞可以得自对象或供体的骨髓。在其他情况下，细胞得自干细胞。例如，细胞毒性细胞可以衍生自人多能干细胞，如人胚胎干细胞或人诱导多能T细胞。在诱导多能干细胞(IPSC)的情况下，可使用来自对象的体细胞获得此类多能T细胞，向所述对象提供遗传修饰的细胞毒性细胞。在一些实施方案中，可以通过静脉穿刺、通过单血浆分离置换方法、通过白细胞动员后接的单血浆分离置换或静脉穿刺或通过骨髓抽吸收获细胞来从对象或供体获得免疫细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，以及对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体。在一些实施方案中，相对于表达CAR的免疫细胞但不施用凋亡细胞群而言，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体，并与凋亡细胞群结合，从而导致对象中细胞因子的产生减少但是细胞毒性基本上未受影响(图10A-10B和11)。在一些实施方案中，相对于表达CAR的免疫细胞但不施用凋亡细胞上清液而言，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体，并与凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物组合，从而导致对象中细胞因子产生减少但是细胞毒性基本上未受影响。在一些实施方案中，施用凋亡细胞群或来自凋亡细胞的上清液并不降低表达嵌合抗原受体的免疫细胞的功效。
在一些实施方案中，本文公开的是免疫细胞，在一些实施方案中，是其中T细胞对于对象是自体的CART细胞。在一些实施方案中，CAR T细胞对于对象是异源的。在一些实施方案中，CART细胞是同种异体的。在一些实施方案中，CAR T细胞是通用同种异体CAR T细胞。在一些实施方案中，T细胞可以是自体的、同种异体的或体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
在一些实施方案中，本文所述的CAR T细胞和凋亡细胞均衍生自相同来源。在另一个实施方案中，本文所述的CART细胞和凋亡细胞均衍生自所述对象(图10A和10B)。在另一个实施方案中，本文所述的CAR T细胞和凋亡细胞衍生自不同来源。在另一个实施方案中，CAR T细胞是自体的，并且本文所述的凋亡细胞是同种异体的(图11)。本领域技术人员会理解，类似地，凋亡细胞上清液可以由与CAR T相同细胞来源的细胞衍生，其在一些实施方案中可以是自体细胞，或者凋亡细胞上清液可以由来自与CAR T不同来源的细胞制备。
本领域技术人员会理解，术语“异源的”可以涵盖衍生自不同生物的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一些实施方案中，异源蛋白是最初从不同的T细胞类型或与受体不同的物种克隆或衍生的蛋白，并且通常不存在于细胞或得自细胞的样品中。
因此，本文公开的一个实施方案涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞毒性免疫细胞(例如NK细胞或T细胞)，由此细胞维持其细胞毒性功能。在一些实施方案中，嵌合抗原受体对于T细胞是外源的。在一些实施方案中，CAR被重组表达。在一些实施方案中，CAR由载体表达。
在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是初始CD4+T细胞。在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是初始CD8+T细胞。在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是效应T细胞。在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是细胞毒性T细胞。
遗传修饰的免疫细胞(例如T细胞)的来源已在文献中进行了广泛描述，例如参见Themelli et al.(2015)New Cell Sources for T Cell Engineering and AdoptiveImmunotherapy.Cell Stem Cell 16:357-366；Han et al.(2013)Journal ofHematology&Oncology 6:47-53；Wilkie et al.(2010)J Bio Chem 285(33):25538-25544；和van der Stegen et al.(2013)J.Immunol 191:4589-4598。可从商业渠道订购CAR T细胞，例如Creative Biolabs(NY USA)，其可提供定制的构建和生产嵌合抗原受体(CAR)的服务，还提供预制的CAR构建体库存，其可以诱导重组腺病毒疫苗编码的保护性免疫。定制的CAR T细胞也可以从Promab Biotechnologies(CA USA)获得，其可以提供专门设计的CAR T细胞。
靶向抗原
在一些实施方案中，CAR通过针对抗原的抗体或抗体片段与抗原的表位结合。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体片段是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，TCR经由遗传修饰的T细胞受体结合抗原的表位。
在一些实施方案中，本文公开的组合物的CAR T细胞结合至肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原是：粘蛋白1、细胞表面相关的(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM)、富含精氨酸的、在早期肿瘤中突变的(Armet)、热休克蛋白60(HSP60)、钙粘蛋白(CANX)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖型)2、次甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、基质金属肽酶(MMP6)、B黑素瘤抗原1(BAGE-1)、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V的异常转录物(GnTV)、Q5H943、癌胚抗原(CEA)、Pmel、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-1、MART-1、GPR143-OA1、前列腺特异性抗原(PSA)、TRP1、酪氨酸酶、FGP-5、NEU原癌基因、Aft、MMP-2、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、端粒酶相关蛋白2、前列腺酸磷酸酶(PAP)、Uroplakin II或蛋白酶3。
在一些实施方案中，在本领域技术人员想要破坏白血病中的B细胞的情况下，CAR与CD19或CD20结合以靶向B细胞。CD19是一种B细胞谱系特异性表面受体，其从proB细胞到早期浆细胞的广泛表达使其成为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的引人注目的靶。在一些实施方案中，CAR与ROR1、CD22或GD2结合。在一些实施方案中，CAR与NY-ESO-1结合。在一些实施方案中，CAR与MAGE家族蛋白结合。在一些实施方案中，CAR与间皮素结合。在一些实施方案中，CAR与c-erbB2结合。在一些实施方案中，CAR与肿瘤特异性的突变抗原结合，例如BRAFV600E突变和BCR-ABL易位。在一些实施方案中，CAR与肿瘤特异性的病毒抗原结合，例如HD的EBV、宫颈癌的HPV和Merkel癌的多瘤病毒。在一些实施方案中，CAR T细胞与Her2/neu结合。在一些实施方案中，CAR T细胞与EGFRvIII结合。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞与CD19抗原结合。在一些实施方案中，CAR与CD22抗原结合。在一些实施方案中，CAR与α叶酸受体结合。在一些实施方案中，CAR与CAIX结合。在一些实施方案中，CAR与CD20结合。在一些实施方案中，CAR与CD23结合。在一些实施方案中，CAR与CD24结合。在一些实施方案中，CAR与CD30结合。在一些实施方案中，CAR与CD33结合。在一些实施方案中，CAR与CD38结合。在一些实施方案中，CAR与CD44v6结合。在一些实施方案中，CAR与CD44v7/8结合。在一些实施方案中，CAR与CD123结合。在一些实施方案中，CAR与CD171结合。在一些实施方案中，CAR与癌胚抗原(CEA)结合。在一些实施方案中，CAR与EGFRvIII结合。在一些实施方案中，CAR与EGP-2结合。在一些实施方案中，CAR与EGP-40结合。在一些实施方案中，CAR与EphA2结合。在一些实施方案中，CAR与Erb-B2结合。在一些实施方案中，CAR与Erb-B2,3,4结合。在一些实施方案中，CAR与Erb-B3/4结合。在一些实施方案中，CAR与FBP结合。在一些实施方案中，CAR与胎乙酰胆碱受体结合。在一些实施方案中，CAR与GD2结合。在一些实施方案中，CAR与GD3结合。在一些实施方案中，CAR与HER2结合。在一些实施方案中，CAR与HMW-MAA结合。在一些实施方案中，CAR与IL-11Rα结合。在一些实施方案中，CAR与IL-13Rα1结合。在一些实施方案中，CAR与KDR结合。在一些实施方案中，CAR与κ轻链结合。在一些实施方案中，CAR与Lewis Y结合。在一些实施方案中，CAR与L1细胞粘附分子结合。在一些实施方案中，CAR与MAGE-A1结合。在一些实施方案中，CAR与间皮素结合。在一些实施方案中，CAR与CMV感染的细胞结合。在一些实施方案中，CAR与MUC1结合。在一些实施方案中，CAR与MUC16结合。在一些实施方案中，CAR与NKG2D配体结合。在一些实施方案中，CAR与NY-ESO-1(氨基酸157-165)结合。在一些实施方案中，CAR与胎粪抗原(h5T4)结合。在一些实施方案中，CAR与PSCA结合。在一些实施方案中，CAR与PSMA结合。在一些实施方案中，CAR与ROR1结合。在一些实施方案中，CAR与TAG-72结合。在一些实施方案中，CAR与VEGF-R2或其他VEGF受体结合。在一些实施方案中，CAR与B7-H6结合。在一些实施方案中，CAR与CA9结合。在一些实施方案中，CAR与αvβ6整联蛋白结合。在一些实施方案中，CAR与8H9结合。在一些实施方案中，CAR与NCAM结合。在一些实施方案中，CAR与胎乙酰胆碱受体结合。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞靶向CD19抗原，并且对患有B细胞恶性肿瘤、ALL、滤泡性淋巴瘤、CLL和淋巴瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD22抗原，并且对患有B细胞恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向α叶酸受体或叶酸受体α，并且对患有卵巢癌或上皮癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CAIX或G250/CAIX，并且对患有肾细胞癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD20，并且对患有淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和惰性(indolent)B细胞淋巴瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD23，并且对患有CLL的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CART细胞靶向CD24，并且对患有胰腺腺癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD30，并且对患有淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD33，并且对患有AML的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD38，并且对患有非霍奇金淋巴瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v6，并且对患有若干恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v7/8，并且对患有宫颈癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD123，并且对患有髓系恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CEA，并且对患有结肠直肠癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向EGFRvIII，并且对患有胶质母细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-2，并且对患有多种恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-40，并且对患有结肠直肠癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向EphA2，并且对患有胶质母细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B2或ErbB3/4，并且对患有乳腺癌和其他、前列腺癌、结肠癌、各种肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B2,3,4，并且对患有乳腺癌和其他的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向FBP，并且对患有卵巢癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向胎乙酰胆碱受体，并且对患有横纹肌肉瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向GD2，并且对患有成神经细胞瘤、黑素瘤或Ewing’s肉瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向GD3，并且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向HER2，并且对患有髓母细胞瘤、胰腺腺癌、胶质母细胞瘤、骨肉瘤或卵巢癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向HMW-MAA，并且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CART细胞靶向IL-11Rα，并且对患有骨肉瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13Rα1，并且对患有神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或髓母细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13受体α2，并且对患有若干恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向KDR，并且通过靶向肿瘤新脉管系统对患有肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向κ轻链，并且对患有B细胞恶性肿瘤(B-NHL、CLL)的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向Lewis Y，并且对患有各种癌或上皮衍生的肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向L1细胞粘附分子，并且对患有成神经细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CART细胞靶向MAGE-A1或HLA-A1 MAGE A1，并且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向间皮素，并且对患有间皮瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CMV感染的细胞，并且对具有CMV的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向MUC1，并且对患有乳腺癌或卵巢癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向MUC16，并且对患有卵巢癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向NKG2D配体，并且对患有骨髓瘤、卵巢和其他肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向NY-ESO-1(157-165)或HLA-A2 NY-ESO-1，并且对患有多发性骨髓瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向癌胚抗原(h5T4)，并且对患有各种肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向PSCA，并且对患有前列腺癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向PSMA，并且对患有前列腺癌/肿瘤脉管系统的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向ROR1，并且对患有B-CLL和套细胞淋巴瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向TAG-72，并且对患有腺癌或胃肠道癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向VEGF-R2或其他VEGF受体，并且通过靶向肿瘤新脉管系统对患有肿瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CA9，并且对患有肾细胞癌的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向CD171，并且对患有肾成神经细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向NCAM，并且对患有成神经细胞瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR T细胞靶向胎乙酰胆碱受体，并且对患有横纹肌肉瘤的对象具有治疗作用。在一些实施方案中，CAR与Sadelain et al.(Cancer Discov.2013 Apr；3(4):388–398)的表1中列出的靶抗原之一结合，其通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，CAR T细胞结合碳水化合物或糖脂结构。
在一些实施方案中，CAR T细胞结合血管生成因子，从而靶向肿瘤脉管系统。在一些实施方案中，血管生成因子是VEGFR2。在一些实施方案中，血管生成因子是内皮素(endoglin)。在一些实施方案中，本文公开的血管生成因子是血管促生蛋白(Angiogenin)；血管生成素-1(Angiopoietin-1)；Del-1；成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)；卵泡抑素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；白介素8(IL-8)；瘦素；中期因子(Midkine)；胎盘生长因子；血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)；多效蛋白(PTN)；颗粒蛋白前体；增殖蛋白；转化生长因子-α(TGF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)。在一些实施方案中，血管生成因子是血管生成蛋白。在一些实施方案中，生长因子是血管生成蛋白。在一些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的血管生成蛋白是成纤维细胞生长因子(FGF)；VEGF；VEGFR和神经毡蛋白1(NRP-1)；血管生成素1(Ang1)和Tie2；血小板源性生长因子(PDGF；BB-同二聚体)和PDGFR；转化生长因子-β(TGF-β)，内皮素和TGF-β受体；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；整合素αVβ3、αVβ5和α5β1；VE-钙黏素和CD31；肝配蛋白；纤溶酶原活化剂；纤溶酶原活化物抑制物-1；一氧化氮合酶(NOS)和COX-2；AC133；或Id1/Id3。在一些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的血管生成蛋白是血管生成素，在一些实施方案中，其是血管生成素1、血管生成素3、血管生成素4或血管生成素6。在一些实施方案中，内皮素也称为CD105；EDG；HHT1；ORW；或ORW1。在一些实施方案中，内皮素是TGFβ共受体。
在一些实施方案中，CAR T细胞结合与传染原(infectious agent)相关的抗原。在一些实施方案中，传染原是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌相关抗原是：抗原85B、脂蛋白IpqH、ATP依赖性解旋酶推定、未表征的蛋白Rv0476/MTO4941前体或未表征的蛋白Rv1334/MT1376前体。
在一些实施方案中，CAR T细胞结合抗体。在一些实施方案中，CAR T细胞是“抗体偶联的T细胞受体”(ACTR)。根据该实施方案，CAR T细胞是通用CAR T细胞。在一些实施方案中，在施用抗体之前、之后或同时施用具有抗体受体的CAR T细胞，然后与抗体结合，使T细胞紧邻肿瘤或癌症。在一些实施方案中，该抗体针对肿瘤细胞抗原。在一些实施方案中，该抗体针对CD20。在一些实施方案中，抗体是利妥昔单抗。
该抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀；Genentech)：针对ERBB2的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是贝伐珠单抗(阿瓦斯丁；Genentech/Roche)：针对VEGF的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是西妥昔单抗(爱必妥；Bristol-Myers Squibb)：针对EGFR的嵌合人-鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是帕尼单抗(维克替比；Amgen)：针对EGFR的人IgG2。在另一个实施方案中，抗体是伊匹单抗(Yervoy；Bristol-Myers Squibb)：针对CTLA4的IgG1。
在另一个实施方案中，抗体是阿仑珠单抗(Campath；Genzyme)：针对CD52的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是奥法木单抗(Arzerra；Genmab)：针对CD20的人IgG1。在另一个实施方案中，抗体是吉妥单抗(米罗他；Wyeth)：针对CD33的人源化IgG4。在另一个实施方案中，抗体是本妥昔单抗(Adcetris；Seattle Genetics)：针对CD30的嵌合IgG1。在另一个实施方案中，抗体是90Y标记的替伊莫单抗(泽娃灵；IDECP harmaceuticals)：针对CD20的鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是131I标记的托西莫单抗(百克沙；GlaxoSmithKline)：针对CD20的鼠IgG2。
在另一个实施方案中，所述抗体是雷莫芦单抗，其针对血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)。在另一个实施方案中，抗体是雷莫芦单抗(Cyramza Injection，Eli Lilly andCompany)、博纳吐单抗(BLINCYTO，AmgenInc.)、pembrolizumab(KEYTRUDA，MerckSharp&DohmeCorp.)、阿托珠单抗(GAZYVA，Genentech，Inc.；先前已知为GA101)培妥珠单抗注射液(PERJETA，Genentech，Inc.)或地诺单抗(Xgeva，AmgenInc.)。在另一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗(Sisilect；Novartis)。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗(Zenapax；Roche)。
在一些实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对本文所述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。在一些实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对与肿瘤相关的抗原。在一些实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对肿瘤相关抗原或其片段，所述抗原是血管生成因子。
在一些实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对本文所述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以与本文所述的组合物组合使用，例如但不限于包含CAR-T细胞或早期凋亡细胞或其任意组合的组合物。
药物组合物
在一些实施方案中，本文公开了用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低癌症或肿瘤的发病率的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于增加患有癌症或肿瘤的对象的生存的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于减小肿瘤或癌症的尺寸或降低其生长速率的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的早期凋亡细胞群和药学上可接受的赋形剂。
如本文所用，在一些实施方案中，术语“组合物”和“药物组合物”可以互换使用并具有所有相同的特性和含义。在一些实施方案中，本文公开了用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物用于维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖速率。在另一个实施方案中，用于维持或提高遗传修饰的免疫细胞的增殖速率的方法进一步包含减少或抑制细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发病率。在一些实施方案中，本文公开了用于增加遗传修饰的免疫细胞疗法的功效的药物组合物。在一些实施方案中，用于增加免疫细胞疗法的功效的方法中使用的组合物还包含减少或抑制CRS或细胞因子风暴的发病率。在一些实施方案中，本文公开了用于治疗、预防、抑制、减少对象的癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻对象的癌症或肿瘤的的方法的组合物。在一些实施方案中，用于治疗、预防、抑制、减少对象的癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻对象的癌症或肿瘤的的组合物，还包含降低或抑制CRS或细胞因子风暴的发病率。
在一些实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体CAR T细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的受体包含遗传修饰的T细胞受体。
在一些实施方案中，药物组合物包含早期凋亡细胞群。
在一些实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的CAR T细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的细胞毒性T细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含药学上可接受的赋形剂中的有效量本文所述的早期凋亡细胞群。
在一些实施方案中，本文所述的状况或疾病是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，本文公开了一种组合物，其包含与本文所述的感兴趣的蛋白质或肽结合的经遗传修饰的免疫细胞或其受体，例如CAR T细胞。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质或肽包含肿瘤抗原或其片段。
在一些实施方案中，本文公开的和本文公开的方法中使用的组合物包含凋亡细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，包含凋亡细胞的组合物用于本文公开的方法中，例如用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低对象的癌症或肿瘤的发病率或其任意组合。
在一些实施方案中，包含有效量的CAR T细胞或TCR T细胞的组合物可以与包含凋亡细胞群的组合物相同。在又一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的免疫细胞，例如CAR T细胞的组合物与包含凋亡细胞群的组合物不同。在一些实施方案中，组合物包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)和凋亡细胞，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在一些实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞是合并的第三方供体细胞。
在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞，例如CAR T细胞的组合物，进一步包含用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)和凋亡细胞的组合物还包含用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中细胞因子释放的另外的药物组合物。
在一些实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂，其在一些实施方案中是伊匹单抗。在一些实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在一些实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的碲基化合物。在一些实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的免疫调节剂。在一些实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节化合物，或其任意组合。
在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、碲基化合物或免疫调节剂的药物组合物包含单一组合物。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、碲基化合物或免疫调节剂的药物组合物任一或其任意组合的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一些实施方案中是CAR T细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合分别包含在单独的组合物中。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、碲基化合物或免疫调节剂的药物组合物任一或其任意组合的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一些实施方案中是CAR T细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合分别包含在多个组合物中。
在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和另外的物质。在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和抗体或其功能片段。在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和RtX抗体或其功能片段。在一些实施方案中，凋亡细胞和抗体或其功能片段可包含在不同的组合物中。在一些实施方案中，凋亡细胞和抗体或其功能片段可包含在同一组合物中。
本领域技术人员会理解，“药物组合物”可涵盖本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分(例如生理上合适的载剂和赋形剂)的制备物。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。
在一些实施方案中，本文公开了用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长或降低发病率的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于增加患有癌症或肿瘤的对象的生存的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于减小肿瘤或癌症的尺寸或降低其生长速率的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了一种药物，其包含用于减少患有癌症或肿瘤的对象中的肿瘤负荷。在一些实施方案中，本文公开的药物包含用于延迟患有癌症或肿瘤的对象的疾病进展。在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含用于降低患有癌症或肿瘤的对象中癌症或肿瘤的发病率。在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含用于减少患有癌症或肿瘤的对象中癌症或肿瘤的尺寸和/或生长速率。
本领域技术人员会理解，短语“生理上可接受的载剂”、“药学上可接受的载剂”、“生理上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的赋形剂”可以互换使用，可以涵盖不会对生物造成显著刺激并且不会消除所施用活性成分的生物学活性和特性的载剂、赋形剂或稀释剂。
本领域技术人员会理解，“赋形剂”可以涵盖添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。在一些实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
在"Remington’s Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中找到用于药物的配制和施用的技术，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，组合物是同时施用的。在一个替代实施方案中，组合物在不同时间施用。在一些实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在CAR-T细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。
在一些实施方案中，组合物是同时施用的。在一个替代实施方案中，组合物在不同时间施用。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前，施用包含凋亡细胞的组合物。
在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，在输注抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物不依赖于CAR T细胞。在一些实施方案中，将包含凋亡细胞的组合物与另外的物质组合施用。在一些实施方案中，所述另外的物质是抗体。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含治疗组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含治疗功效。
在一些实施方案中，将本文所公开的组合物施用一次。在一些实施方案中，将组合物施用两次。在一些实施方案中，将组合物施用三次。在一些实施方案中，将组合物施用四次。在一些实施方案中，将组合物施用至少四次。在一些实施方案中，将组合物施用超过四次。
在一些实施方案中，将本文所公开的CAR T细胞施用一次。在一些实施方案中，将CAR T细胞施用两次。在一些实施方案中，将CAR T细胞施用三次。在一些实施方案中，将CART细胞施用四次。在一些实施方案中，将CAR T细胞施用至少四次。在一些实施方案中，将组合物施用超过四次。
在一些实施方案中，本文公开的组合物是治疗组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物具有治疗功效。
在一些实施方案中，本文公开的是与仅包含CAR T细胞的组合物相比提供减少的炎性细胞因子或趋化因子释放的组合物，但是与仅包含CAR T细胞的组合物相比具有相当的细胞毒性。
本领域技术人员会理解，短语“生理上可接受的载剂”、“药学上可接受的载剂”、“生理上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的赋形剂”可以互换使用，可以涵盖不会对生物造成显著刺激并且不会消除所施用活性成分的生物学活性和特性的载剂、赋形剂或稀释剂。
本领域技术人员会理解，“赋形剂”可以涵盖添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。在一些实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
在"Remington’s Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中找到用于药物的配制和施用的技术，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含治疗组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含治疗功效。
配制物
本文公开的包含早期凋亡细胞群的药物组合物可以方便地以无菌液体制备物的形式提供，例如等渗水性溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制备物通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载剂，所述载剂可以是溶剂或包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的分散介质。
可通过掺入本文所述的早期凋亡细胞群来制备无菌注射溶液，并用于实施本文公开的方法，根据需要在所需量的适当溶剂中添加各种量的其他成分。这样的组合物可以与合适的载剂、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。所述组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、风味剂、颜色等，这取决于施用途径和所需的制备物。可以参考标准文本，如"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE",17th edition,1985(以引用方式并入本文)，以制备合适的制备物，而无需进行过多的实验。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包含抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本文的公开内容，所使用的任何媒介物(vehicle)、稀释剂或添加剂将必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
本文所述的组合物或配制物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本文公开的组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的物质例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠可能特别适用于含有钠离子的缓冲剂。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定水平。甲基纤维素可能是优选的，因为它可以容易且经济地获得并且易于使用。
其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度将取决于所选的物质。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。明显的，合适载剂和其他添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型例如液体剂型的性质(例如是否将组合物配制成溶液、悬浮液、凝胶剂或其他液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。
本领域技术人员会认识到，应将组合物或配制物的组分选择为化学惰性的，并且不影响本文所述的早期凋亡细胞群的活力或功效，以用于本文公开的方法中。对于本领域的化学和制药本领域技术人员而言，这不会成为问题，或者可以通过参考标准文本或通过简单的实验(不涉及不适当的实验)从本公开和本文引用的文献中容易地避免问题。
本领域技术人员可以容易地确定组合物中的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载剂的量，并以本文公开的方法施用。通常，任何添加剂(除(一种或多种)活性细胞和/或(一种或多种)活性剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001％至50％(重量)溶液，并且活性成分按微克至毫克的数量级存在，例如约0.0001至约5wt％。在一些实施方案中，约0.0001至约1wt％。在另一个实施方案中，约0.0001至约0.05wt％或约0.001至约20wt％。在另一个实施方案中，约0.01至约10wt％。在一些实施方案中，约0.05至约5wt％。当然，对于要施用于动物或人的任意组合物，以及对于任何特定的施用方法，因此，优选通过如在合适的动物模型(例如啮齿动物如小鼠)中例如确定致死剂量(LD)和LD50确定毒性；以及确定引起适当应答的组合物的剂量，其中的组分浓度和施用组合物的时间。根据本领域技术人员来自本公开和本文引用的文献的知识，这种确定不需要过度的实验。而且，无需过多实验即可确定顺序施用的时间。
使用方法
在一些实施方案中，本文公开的是用于治疗、预防、抑制癌症或肿瘤的生长或降低其发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包括施用本文所公开的组合物的步骤。
在一些实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制、减少对象的癌症或肿瘤发病率、改善或减轻对象的癌症或肿瘤的方法，该方法包括施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。在一些实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低对象的癌症或肿瘤发病率或其任意组合方法。在一些实施方案中，本文公开的方法减小了肿瘤或癌症的尺寸和/或生长速率。在一些实施方案中，本文公开的方法增加患有肿瘤或癌症的对象的生存。在一些实施方案中，凋亡细胞或其组合物的使用增加了遗传修饰的免疫细胞疗法的功效，例如但不限于CAR T细胞疗法。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，该方法包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含附加剂的组合物，其中所述附加剂包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞且未施用所述附加剂的对象相比，所述方法治疗、预防、抑制、减少所述对象的癌症或肿瘤发病率、改善或减轻所述对象的癌症或肿瘤。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或其组合物的施用并不降低所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞在治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合的附加剂不会降低所述施用的表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或其组合物的施用提高了所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞例如CAR T细胞在治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞、来自凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂的附加剂提高了所述施用的表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。
在一些实施方案中，提高遗传修饰的免疫细胞癌疗法例如CAR T细胞疗法的功效的方法包括施用所述遗传修饰的免疫细胞和包含凋亡细胞、来自凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或它们的任意组合或组合物的附加剂，其中与未施用所述附加剂的对象相比，功效增强。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是初始CD4+T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是初始CD8+T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是树突状细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是调节性T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR T细胞)。在另一个实施方案中，增加CAR T细胞癌症疗法的功效的方法包括施用所述遗传修饰的免疫细胞和包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂、或其任意组合或它们的组合物的附加剂，其中与未施用所述附加剂的对象相比，功效提高。
在另一个实施方案中，与接受免疫癌症治疗且未施用附加剂的对象的水平相比，本文的方法降低了至少一种促炎性细胞因子的产生水平。在另一个实施方案中，本文的方法在进行遗传修饰的免疫细胞癌治疗且未施用附加剂的对象中抑制或减少细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生。
在另一个实施方案中，本文公开的方法降低IL-6。
在另一个实施方案中，与接受免疫癌症治疗且未施用附加剂的对象的水平相比，本文的方法增加了至少一种细胞因子的产生水平。在一些实施方案中，附加剂是凋亡细胞。在其他实施方案中，附加剂是凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加IL-2。
本领域技术人员会理解，如本文所使用的关于细胞因子的术语“产生”可涵盖细胞因子的表达以及细胞因子从细胞的分泌。在一些实施方案中，细胞因子的产生增加导致细胞因子从细胞的分泌增加。在另一个实施方案中，细胞因子产生的减少导致细胞因子从细胞的分泌减少。在另一个实施方案中，本文公开的方法减少至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加IL-2的分泌。
在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是T细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是免疫细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是巨噬细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是B细胞淋巴细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肥大细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是内皮细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是成纤维细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是基质细胞。本领域技术人员会认识到，取决于细胞周围的环境，在分泌细胞因子的细胞中细胞因子的水平可以增加或减少。
在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂增加至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的附加剂不减少至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂增加IL-2的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂增加IL-2R的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的附加剂维持IL-2的分泌水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂不降低IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持或增加IL-2的分泌水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持或增加IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的附加剂不降低IL-2R的分泌水平。
在又一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持、增加或不减少IL-2的分泌水平，同时减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的附加剂维持、增加或不减少IL-2R的分泌水平，同时减少IL-6的分泌。
在一些实施方案中，增加本文公开的CAR T细胞癌症疗法的功效的方法包括降低所述对象中IL-6的水平，所述方法包括施用CAR T细胞和包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或它们的任意组合或组合物的附加剂，其中与未施用所述附加剂的对象相比，功效增强。在另一个实施方案中，增加本文公开的CAR T细胞癌症疗法的功效的方法包括增加所述对象中IL-2的水平，所述方法包括施用CAR T细胞和包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或它们的任意组合或组合物的附加剂，其中与未施用所述附加剂的对象相比，功效增强。在另一个实施方案中，增加本文公开的CAR T细胞癌症疗法的功效的方法包括增加所述CAR T细胞的增殖，所述方法包括施用CAR T细胞和包含凋亡细胞、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合或组合物，其中与未施用所述附加剂的对象相比，所述CAR T细胞的功效和增殖增强。
在一些实施方案中，增加CAR T细胞癌症疗法的功效、减少或抑制对象中细胞因子产生的方法，所述方法包括施用包含CAR T细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，或其组合物的组合物的步骤。在另一个实施方案中，治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻其发病率的方法也减少或抑制对象体内细胞因子的产生，所述方法包括施用组合物的步骤，所述组合物包含CAR T细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，或其组合物。
在另一个实施方案中，本文公开了在进行CAR T细胞癌症疗法的对象中治疗细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。
在另一个实施方案中，治疗、预防、抑制、减少癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻其发病率的方法也减少或抑制对象体内细胞因子的产生，所述方法包括施用组合物的步骤，所述组合物包含CART细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，或其组合物。
在另一个实施方案中，本文公开了一种治疗对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了一种预防对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了一种抑制对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了减少对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了改善对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了减轻对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。
在一些实施方案中，本文公开了在免疫疗法过程中维持或提高遗传修饰的免疫细胞的增殖速率的方法，该方法包括在免疫疗法过程中施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞包含T细胞、初始T细胞、初始CD4+T细胞、初始CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)、调节性T细胞(Treg)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞或遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。在另一个实施方案中，本文公开了在免疫疗法期间维持或增加CAR T细胞的增殖速率的方法，该方法包括在免疫疗法期间施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，维持或提高遗传修饰的免疫细胞的增殖速率的方法不降低或抑制免疫疗法的功效。例如，在另一个实施方案中，维持或增加CAR T细胞的增殖速率的方法不降低或抑制CAR T细胞癌症疗法的功效。在另一个实施方案中，维持或提高遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞的增殖速率的方法减少或抑制对象体内细胞因子的产生。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用与本文公开的凋亡细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合疗法。在一些实施方案中，CTLA-4是有效维持自身耐受性的T细胞活化的抑制物。在一些实施方案中，抗CTLA-4阻断剂(其在另一个实施方案中是抗体)的施用产生T细胞活化的净效应。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、CAR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合疗法。
在一些情况下，相对于未修饰的氨基酸序列，本文公开的方法的多肽以及用于本文公开的方法的多肽包含至少一个保守氨基酸取代。在其他情况下，多肽包含非保守氨基酸取代。在这种情况下，具有这种修饰的多肽相对于缺乏这种氨基酸取代的多肽表现出增加的稳定性或更长的半衰期。
在一些实施方案中，“治疗”包含治疗性治疗，“预防”包含预防性或预防性措施，其中目的是如上所述预防或减轻目标病理状况或病症。因此，在一些实施方案中，治疗可包含直接影响或治愈、抑制、抑制、预防、减轻其严重程度、延缓其发作、减轻与疾病、病症或状况或其组合有关的症状。因此，在一些实施方案中，“治疗”、“改善”和“缓解”尤其是指延迟进展、加快缓解、诱导缓解、增加缓解、加快恢复、增加对替代疗法的疗效或降低对替代疗法的抵抗力，或组合其。在一些实施方案中，“预防”尤其是指延迟症状发作、预防疾病复发、减少复发发作的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期或其组合。在一些实施方案中，“抑制”或“抑制”尤其是指减轻症状的严重性、减少急性发作的严重性、减少症状的数目、减少疾病相关症状的发病率、减少症状的潜伏期、改善症状、减轻继发症状、减少继发感染、延长患者生存期或其组合。
本领域技术人员会理解，术语“抗原识别受体”可以涵盖能够响应于抗原结合而活化免疫细胞(例如，T细胞)的受体。示例性抗原识别受体可以是天然或内源性T细胞受体或嵌合抗原受体，其中肿瘤抗原结合结构域与能够活化免疫细胞(例如，T细胞)的细胞内信号传导结构域融合。
在一些实施方案中，本文所述的方法增加了患有癌症或肿瘤的对象的生存，并且包括给所述对象施用早期凋亡细胞群，其中所述方法增加了对象的生存。
本领域技术人员会理解，术语“疾病”可涵盖损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或病症。疾病的实例包含瘤形成(neoplasia)或细胞的病原体感染。
本领域技术人员会理解，术语“有效量”可以涵盖足以具有治疗作用的量。在一些实施方案中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
本领域技术人员会理解，术语“瘤形成”可涵盖特征在于细胞或组织的病理性增殖及其随后向其他组织或器官的迁移或侵袭的疾病。瘤形成的生长通常是不受控制的和进行性的，并且发生在不会引发或不会引起正常细胞增殖的条件下。瘤形成可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道的器官，或其组织或细胞类型。瘤形成包含癌症，例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
本领域技术人员会理解，术语“病原体”可以涵盖能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物。
本领域技术人员会理解，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”可涵盖与正常或非IS肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上唯一或差异表达的抗原(例如多肽)。关于本文公开的组合物和方法，肿瘤抗原包含由肿瘤表达的能够通过抗原识别受体(例如，CD19、MUCI)活化或诱导免疫应答或能够通过受体-配体结合(例如，CD47、PD-L1/L2、B7.1/2)抑制免疫应答的任何多肽。
本领域技术人员会理解，术语“病毒抗原”可以涵盖由病毒表达的能够诱导免疫应答的多肽。
术语“包含”、“含有”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以表示“包括”、“包含”等。类似地，术语“由...组成”和“基本上由...组成”具有美国专利法赋予它们的含义。设想本文所公开的组合物和方法包括活性成分或特定步骤，由活性成分或特定步骤组成，或基本上由活性成分或特定步骤组成。
本领域技术人员会理解，术语“治疗”可以涵盖试图改变被治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗效果包含但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态和缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止在患病或诊断的对象或怀疑患有该病症的对象中由于病症引起的恶化，而且在有患疾病风险或怀疑患有该疾病的对象中治疗可以预防该病症的发作或该病症的症状。
本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，术语“对象”可以涵盖哺乳动物，并且在一些实施方案中，可以涵盖人类。在一些实施方案中，对象还可以指家养动物例如牛、绵羊、马、猫、狗和实验动物例如小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠等。
在一些实施方案中，本文公开了CAR T细胞，其中所述CAR针对感兴趣的肽。在一些实施方案中，CAR结合至感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR靶向感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR活化感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR是感兴趣的肽的配体。在另一个实施方案中，感兴趣的肽是CAR的配体。这些实施方案中的每一个都被认为是本文公开的一部分。
免疫疗法的一种方法涉及工程化患者自身的免疫细胞，以产生可以识别并攻击其肿瘤的经遗传修饰的免疫细胞。如本文所述，收集免疫细胞并进行遗传修饰，例如在其细胞表面产生嵌合抗原受体(CAR)，这将使免疫细胞(例如T细胞)识别肿瘤或癌细胞上的特定蛋白质抗原。然后将遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞的扩增群体施用于患者。在一些实施方案中，所施用的细胞在患者体内繁殖并识别并杀死在其表面上具有抗原的癌细胞和肿瘤细胞。在另一个实施方案中，所施用的细胞在患者体内繁殖并识别并杀死肿瘤相关抗原，这导致癌细胞和肿瘤细胞死亡。
在一些实施方案中，IL-6受体拮抗剂与本文公开的组合物和方法一起使用，在一些实施方案中所述IL-6受体拮抗剂为托珠单抗(tocilizumab)。
在一些实施方案中，过继转移的T细胞在淋巴细胞减少的宿主中移植并更有效地扩增。因此，在一些实施方案中，在转移CAR T细胞或其他修饰的免疫细胞之前，对对象进行淋巴消耗。在另一个实施方案中，给接受CAR T细胞的对象施用T细胞支持性细胞因子。
在一些实施方案中，T细胞是效应T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一个实施方案中，T单元是中央记忆(TCM)T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是Th17细胞。在另一个实施方案中，T细胞是T干记忆细胞。在另一个实施方案中，T细胞具有高复制能力。在另一个实施方案中，T细胞扩增发生在患者体内。在另一个实施方案中，少量细胞可以转移至患者。在另一个实施方案中，T细胞扩增在体外发生。在另一个实施方案中，可以多次将大量细胞转移至患者，可以将细胞和/或上清液多次转移至患者，或其组合。
在一些实施方案中，CAR T细胞的优点在于，因为它们对细胞表面分子具有特异性，所以它们克服了MHC限制的TCR识别的限制，并且通过抗原呈递或人白细胞抗原表达的损伤避免了肿瘤逃逸。
在一些实施方案中，本文公开了减轻对象的肿瘤负荷的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。
在一些实施方案中，减少肿瘤负荷包括减少对象中肿瘤细胞的数目。在另一个实施方案中，减少肿瘤负荷包括减少对象的肿瘤尺寸。在另一个实施方案中，减少肿瘤负荷包括根除对象中的肿瘤。
在另一个实施方案中，本文公开了在对象中诱导肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括向所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开的用于诱导对象的肿瘤细胞死亡的方法包括施用免疫细胞，例如包含工程化的嵌合抗原受体的NK细胞或T细胞，以及至少一种附加剂以减少毒性细胞因子释放或“细胞因子释综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一个实施方案中，本文公开了增加、延伸或延长患有瘤形成的对象的生存的方法，其包含向所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在另一个实施方案中，增加或延长对象生存的方法包括施用免疫细胞，例如包含工程化的嵌合抗原受体的NK细胞或T细胞，以及至少一种附加剂以减少毒性细胞因子释放或“细胞因子释综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一个实施方案中，本文公开了增加、延伸或延长患有瘤形成的对象的生存的方法，其包含给所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。
在一些实施方案中，本文公开了一种延迟对象的癌症进展的方法，其包含给对象施用本文所述的任意组合物或组合物的组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了一种延迟对象中白血病或淋巴瘤进展的方法，其包含给对象施用本文所述的任意组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了增加、延伸或延长患有癌症或肿瘤的对象的生存的方法，其包含给对象施用本文所述的任意组合物或组合物的组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了增加、延伸或延长患有白血病或淋巴瘤的对象的生存的方法，其包含给对象施用本文所述的任意组合物或组合物。在一些实施方案中，本文公开了减轻对象中肿瘤细胞负荷的方法，其包含给对象施用本文所述的任意组合物或组合物的组合。在一些实施方案中，在肝脏和骨髓减轻了肿瘤负荷。
在另一个实施方案中，本文公开了一种预防对象瘤形成的方法，所述方法包括向所述对象施用本文所述的任意组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，瘤形成选自血液癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌或它们的组合。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在需要其的对象中治疗血液癌的方法，其包含向所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在一些实施方案中，血液癌选自B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在有需要的对象中治疗实体瘤的方法，其包含向所述对象施用本文所述的任意组合物的步骤。在一些实施方案中，实体瘤选自任何细胞或器官起源的肿瘤，包括不明起源的肿瘤；任何原发性或转移性腹膜肿瘤；妇科起源或胃肠道起源或胰腺起源或血管起源的肿瘤，任何肿瘤，即腺癌、血液学实体瘤、黑素瘤等。在一些实施方案中，实体瘤包括肉瘤或癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing’s瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌或肿瘤、乳腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、前列腺癌或肿瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、宫颈癌或肿瘤、子宫癌或肿瘤、睾丸癌或肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。在另一个相关方面，所述肿瘤或癌症包含肿瘤或癌症的转移。
在一些实施方案中，施用包括施用包含CAR T细胞的组合物。在一些实施方案中，施用包括施用包含早期凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，施用包括施用包含得自早期凋亡细胞的上清液的组合物。在一些实施方案中，施用包括施用本文所述的组合物的组合。在一些实施方案中，施用包括以相同或不同的组合物施用CAR T细胞和凋亡细胞。在一些实施方案中，施用包括与本文所述的另外的药剂组合施用CAR T细胞。在一些实施方案中，施用包括以相同或不同的组合物施用凋亡细胞及其抗体或其片段。
在一些实施方案中，联合疗法提供协同作用。在一些实施方案中，与单独使用CART细胞相比，将早期凋亡细胞与CAR T细胞组合使用的方法增加了CAR T细胞功效。在一些实施方案中，与单独使用CAR T细胞相比，将早期凋亡细胞与CAR T细胞组合使用的方法延长了患有癌症或肿瘤的对象的生存时间。在一些实施方案中，与单独使用CAR T细胞相比，将早期凋亡细胞与CAR T细胞组合使用的方法延长了患有淋巴瘤或白血病的对象的生存时间。
在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与抗体或其片段组合使用的方法延迟了癌症的发作或肿瘤的出现。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与抗体或其片段组合使用的方法延迟了癌症的进展。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与抗体或其片段组合使用的方法延迟了肿瘤的生长。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞与抗体或其片段组合的方法延长了患有癌症或肿瘤的对象的生存时间。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞与抗体或其片段组合的方法延长了患有淋巴瘤或白血病的对象的生存时间。
在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，包含将早期凋亡细胞与包含RtX的抗体或其片段组合施用的使用方法延迟了癌症的发作或肿瘤的出现。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与包含RtX的抗体或其片段组合使用的方法延迟了癌症的进展。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与包含RtX的抗体或其片段组合使用的方法延迟了肿瘤的生长。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与包含RtX的抗体或其片段组合使用的方法延长了患有癌症或肿瘤的对象的生存时间。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，将早期凋亡细胞与包含RtX的抗体或其片段组合使用的方法延长了患有淋巴瘤或白血病的对象的生存时间。
在一些实施方案中，本文所述的使用方法降低了肿瘤负荷(tumor load)。本领域技术人员会理解，术语“肿瘤负荷”可以指癌细胞的数目、肿瘤的尺寸或体内癌症的量。术语“肿瘤负荷”可以与具有所有相同含义和质量的术语“肿瘤负荷(tumor burden)”互换使用。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞的对象相比，包含施用早期凋亡细胞的使用方法减少对象中癌细胞的数目、减小对象中肿瘤的尺寸或降低对象体内癌症的量，或任意组合。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞或未施用抗体或其组合的受试者相比，包含与抗体或其片段组合施用早期凋亡细胞的使用方法减少受试者中癌细胞的数目、减小对象中肿瘤的大小或降低对象身体中癌症的量或其任何组合。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞或未施用RtX抗体或其组合的受试者相比，包含与RtX抗体或其片段组合施用早期凋亡细胞的使用方法减少受试者中癌细胞的数目、减小对象中肿瘤的大小或降低对象身体中癌症的量或其任何组合。
在一些实施方案中，如本文所公开的，在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中减少或抑制细胞因子产生的方法，降低或抑制细胞因子生成。在另一个实施方案中，该方法减少或抑制促炎性细胞因子的产生。在另一个实施方案中，该方法减少或抑制至少一种促炎性细胞因子。在对象正在接受CAR T细胞癌症疗法的另一个实施方案中，该方法不降低CAR T细胞疗法的功效。
为了治疗，施用的量是有效产生所需效果的量。可以一次或多次施用来提供有效量。可以推注或通过连续输注提供有效量。
本领域技术人员会认识到“有效量”(或“治疗有效量”)可涵盖足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于对象。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其他方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包含对象的年龄、性别和体重、所治疗的状况、病症的严重程度以及所施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含在单个组合物中的包含遗传修饰的细胞和附加剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在单个组合物中的包含CAR T细胞和附加剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在单个组合物中的包含TCR T细胞和附加剂或其组合的组合物。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含在至少两种组合物中的包含遗传修饰的细胞和附加剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在至少两种组合物中的包含CART细胞和附加剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在至少两种组合物中的包含TCR T细胞和附加剂或其组合的组合物。
对于使用抗原特异性T细胞例如CAR T细胞的过继免疫疗法，通常输注106-1010(例如109)范围内的细胞剂量。在将遗传修饰的细胞施用于宿主并随后分化后，诱导出特异性针对特定抗原的T细胞。T细胞的“诱导”可以包含例如通过缺失或无应答使抗原特异性T细胞失活。失活对于建立或重建例如自身免疫性疾病的耐受性特别有用。修饰的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包含但不限于静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。在一些实施方案中，不腹膜内施用T细胞。在一些实施方案中，T细胞是肿瘤内施用的。
可以将包含CAR T细胞的组合物全身或直接提供给对象以治疗瘤形成、病原体感染或传染性疾病。在一些实施方案中，将本文公开的细胞直接注射到感兴趣的器官(例如，受瘤形成影响的器官)中。可选地，例如通过向循环系统(例如，肿瘤脉管系统)中施用，将包含CAR T细胞的组合物间接地提供给感兴趣的器官。可以在细胞施用之前、过程中或之后提供扩增和分化剂已增加体外或体内T细胞的生产。
如上文所述在本文公开的方法中，可以在施用遗传修饰的免疫细胞之前、同时或之后提供包含附加剂的组合物。在一些实施方案中，在本文公开的方法中，遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞在本文公开的附加剂之前施用。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中，遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞与附加剂同时施用，如本文公开的。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中，在施用附加剂后施用遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法施用包含本文公开的凋亡细胞的组合物。
可以在任何生理上可接受的媒介物中通常在血管内施用CAR T细胞，尽管它们也可以被引入骨骼或其他方便的部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，将至少施用1x105个细胞，最终达到1x1010或更多。本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种熟知的方法，例如荧光活化细胞分选(FACS)，容易地确定群体中遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫应答细胞的群体的纯度范围为约50至约55％，约55至约60％和约65至约70％。在其他实施方案中，纯度为约70至约75％，约75至约80％，约80至约85％。在进一步的实施方案中，纯度为约85至约90％，约90至约95％和约95至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。如果需要，还可以包含细胞因子，包含但不限于白介素例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-1、IL7、IL12、ILIS、IL21以及其他白介素、集落刺激因子例如G-、M-和GM-CSF，干扰素例如γ-干扰素和促红细胞生成素。
组合物包括药物组合物，其包含遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体。施用可以是自体的或异体的。例如，可以从一个对象获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其施用于同一对象或不同的相容对象。本文公开的外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射来施用，包含导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本文公开的治疗组合物(例如，包含遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳剂)。
在另一个实施方案中，本文公开了产生包含本文公开的CAR T细胞或其他免疫细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的方法，该方法包括将编码与感兴趣的抗原结合的CAR的核酸序列引入T细胞或免疫细胞中。在一个替代实施方案中，本文所公开的包含CART细胞或其他免疫细胞的组合物与包含凋亡细胞的组合物是分开的。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制恶性肿瘤，减少恶性肿瘤的发病率，改善或减轻恶性肿瘤的方法，该方法包括施用包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)和凋亡细胞的组合物的步骤。
本领域技术人员会理解，由遗传修饰的免疫细胞例如CAR修饰的T细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动免疫应答或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可能是过继免疫疗法方法的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱导对CAR中抗原结合部分具有特异性的免疫应答。
本领域技术人员会理解，免疫疗法可涵盖使用免疫效应细胞和分子靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者可以募集其他细胞来实际实现细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学疗毒素等)缀合，并仅用作靶向剂。可选地，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用。各种效应细胞包含细胞毒性T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于治疗、预防、抑制本领域已知的任何血液肿瘤的生长或降低其发病率。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于治疗、预防、抑制本领域已知的任何弥漫性(diffuse)癌症的生长或降低其发病率，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳房中未形成实体瘤。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于延长本领域已知的任何血液肿瘤的生存时间。在一些实施方案中，本文所公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于延长本领域已知的任何弥漫性癌症的生存时间，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳房中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，本文所公开的早期凋亡细胞及其组合物可以用于增加患有本领域已知的任何血液肿瘤的对象的生存。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于增加患有本领域已知的任何弥漫性癌症的对象的生存，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳房中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于降低本领域已知的任何血液肿瘤的生长速率。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于降低本领域已知的任何弥漫性癌症的生长速率，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳房中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，被治疗的肿瘤或癌症包含肿瘤或癌症的转移。在一些实施方案中，本文使用的方法预防或减少肿瘤或癌症的转移。在一些实施方案中，本文使用的方法抑制生长或降低转移的发病率。
在一些实施方案中，所述对象是人类对象。在一些实施方案中，对象是儿童。在一些实施方案中，对象是成人。在一些实施方案中，对象是动物哺乳动物。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含单个核富集的细胞群的早期凋亡细胞群，如上所述。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含稳定群细胞的早期凋亡细胞群，其中所述细胞群稳定超过24小时。上面已经详细描述了早期凋亡细胞的稳定群。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用早期凋亡细胞群，所述早期凋亡细胞群包含没有细胞聚集体的细胞群。没有聚集体的早期凋亡细胞群及其制备方法已在上面进行了详细描述。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括给有需要的对象施用自体早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，本文公开的方法包括给有需要的对象施用同种异体的早期凋亡细胞群。
在一些实施方案中，施用早期凋亡细胞群或其组合物的方法包括施用所述凋亡细胞群或其组合物的单次输注。在一些实施方案中，可以将单次输注作为预防剂施用于预先确定处于癌症或肿瘤风险的对象。在一些实施方案中，可以将单次输注定期施用于患有癌症或肿瘤的对象，作为对象治疗方法的一部分。在一些实施方案中，可以将单次输注作为预防剂施用于患有癌症或肿瘤的对象，以预防转移性癌症、降低其风险或延迟其出现。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞群或其组合物的施用方法包括所述凋亡细胞群或其组合物的多次输注。在一些实施方案中，可以将多次输注作为预防剂施用于预先确定的处于癌症或肿瘤风险的对象。在一些实施方案中，可以将多次输注定期施用于患有癌症或肿瘤的对象，作为对象治疗方法的一部分。在一些实施方案中，可以将多次输注作为预防剂施用患有癌症或肿瘤的对象，以预防转移性癌症、降低其风险或延迟其出现。
在一些实施方案中，多次输注包含至少两次输注。在一些实施方案中，多次输注包含2次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于2次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少3次输注。在一些实施方案中，多次输注包含3次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于3次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少4次输注。在一些实施方案中，多次输注包含4次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于4次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少5次输注。在一些实施方案中，多次输注包含5次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于5次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少六次输注。在一些实施方案中，多次输注包含6次输注。在一些实施方案中，多次输注包含超过6次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少7次输注。在一些实施方案中，多次输注包含7次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于7次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少8次输注。在一些实施方案中，多次输注包含8次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于8次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少九次输注。在一些实施方案中，多次输注包含9次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于9次输注。在一些实施方案中，多次输注包含至少10次输注。在一些实施方案中，多次输注包含10次输注。在一些实施方案中，多次输注包含多于10次输注。
在一些实施方案中，多次输注包含更少量的早期凋亡细胞，其中所施用的细胞的总剂量是输注的总和。
在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注。在一些实施方案中，在几天的时间施用多次输注。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少12小时。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少24小时。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中输注之间有至少一天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少两天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中输注之间有至少三天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少四天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中输注之间有至少五天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少六天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少七天。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中输注之间有至少一周。在一些实施方案中，在数小时的时间施用多次输注，其中在输注之间有至少两周。
在一些实施方案中，多次输注中的细胞量基本上彼此相等。在一些实施方案中，多次输注中的细胞量彼此不同。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括给所述对象施用另外的化学治疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，与早期凋亡细胞同时或基本同时施用另外的化学治疗剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，另外的化学治疗剂或免疫调节剂包含在与早期凋亡细胞相同的组合物中。在一些实施方案中，另外的化学治疗剂或免疫调节剂包含在与早期凋亡细胞不同的组合物中。
在一些实施方案中，在施用早期凋亡细胞之前施用另外的化学治疗剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，在早期凋亡细胞的施用之后施用另外的化学治疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，化学治疗剂包含化学治疗剂包括烷化剂、氮芥类、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂及其衍生物、非经典烷化剂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、N-亚硝基-N-甲基脲、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫斯汀(MeCCNU)、福莫司汀、链脲佐菌素、达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺、塞替派、丝裂霉素、亚丝醌(AZQ)、顺铂、卡铂、草酸铂、前卡巴嗪、六甲基三聚氰胺、抗代谢物、抗叶酸、甲氨蝶呤、培美曲塞、氟嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他滨、脱氧核苷类似物、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他丁、硫代嘌呤、硫代鸟嘌呤、巯基嘌呤、抗微管剂、长春花生物碱、紫杉烷类、长春新碱、长春花碱、半合成长春花生物碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、拓扑异构酶抑制剂、伊立替康、托泊替康、喜树碱、依托泊苷、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、催化抑制剂、新生霉素、merbarone、阿柔比星、细胞毒性抗生素、蒽环类、博来霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、放线菌素、阿霉素、到诺霉素、表阿霉素、伊达比星、蒽环类、吡柔比星、阿克拉比星、米托蒽醌、博来霉素、丝裂霉素、靶向疗法、单克隆抗体、裸单克隆抗体、缀合的单克隆抗体、化学标记的抗体、双特异性单克隆抗体或其任何组合。
在一些实施方案中，免疫调节剂包含抗体或其功能片段。在一些实施方案中，抗体或其功能片段包含单克隆抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
在一些实施方案中，本文公开的是本文公开的任何多肽或肽结构域的活性片段。本领域技术人员会理解，术语“片段”可以包含至少5、10、13或15个氨基酸。在其他实施方案中，片段是至少20个连续氨基酸。本文公开的片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如，从新多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过可变mRNA剪切或可变蛋白质加工事件去除氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，并且特别是指保留抗体结合活性的多克隆抗体、单克隆抗体或其任何片段。在某些实施方案中，本文公开的方法包括使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在一些实施方案中，术语“抗体”是指能够与本文所述的所需靶标特异性相互作用，例如与吞噬细胞结合的完整分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab')2和Fv。在一些实施方案中，抗体片段包含：
(1)Fab，其包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部分来产生；
(2)Fab'，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原得到完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体而无需随后还原而获得的抗体片段；F(ab')2是通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，是一种遗传工程片段，包含轻链可变区和重链可变区，表达为两条链；和
(5)单链抗体(“SCA”)，一种包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽接头作为遗传融合的单链分子连接。
制备这些片段的方法是本领域已知的。(参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白质表达系统)中表达编码片段的DNA来制备。
在一些实施方案中，可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得抗体片段。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F(ab')2的5S片段。该片段可以进一步切割以产生3.5S Fab'单价片段，所述切割使用硫醇还原剂，和任选地巯基的封闭基团，所述巯基由二硫键的断裂产生。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法例如由Goldenberg,U.S.Pat.Nos.4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献，其全部内容通过引用并入本文。另见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。也可以使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻链片段，进一步切割片段或其他酶促、化学或遗传技术，只要这些片段与可被完整抗体识别的抗原结合。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。此缔合可以是非公价的，如Inbar et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659-62,1972所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质例如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构建包含编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单个多肽链。产生sFv的方法描述于例如Whitlow and Filpula,Methods,2:97-105,1991；Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Pack et al.,Bio/Technology 11:1271-77,1993；和Ladner et al.,U.S.Pat.No.4,946,778，其通过引用整体并入本文。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见，例如，Larrick and Fry,Methods,2:106-10,1991。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或片段可包含抗体的“人源化形式”。在一些实施方案中，术语“抗体的人源化形式”是指非人(例如鼠)抗体(其是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')、sub.2或抗体的其他抗原结合亚序列))的嵌合分子，其包含最小的衍生自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包含人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)的CDR残基替代，如小鼠、大鼠或兔子。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体基本上包含至少一个可变结构域，并且通常是两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的CDR区结构域对应于非人免疫球蛋白的那些，以及所有或基本上所有的FR区结构域是人免疫球蛋白共有序列的序列。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones etal.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；andPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
使非人类抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人源引入的一种或多种氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。基本上可以按照Winter和同事的方法通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行人源化[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann etal.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
人抗体也可以使用本领域已知的各种技术产生，包含噬菌体展示文库libraries[Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole et al.和Boerner et al.的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole etal.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)andBoerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠来制备人。攻击后，观察到人类抗体产生，在各个方面都与人所见的相似，包含基因重排、装配和抗体库。该方法例如在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中以及以下科学出版物有所描述：Marks et al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology 14,826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
在一些实施方案中，免疫调节剂包含抗CD20单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD20单克隆抗体是利妥昔单抗。利妥昔单抗是市售的并以名称
Figure BDA0002380874480000731
出售，由Biogen和Genentech USA,Inc联合销售
在一些实施方案中，本文公开的方法包括一线治疗。
本领域技术人员会理解，术语“一线疗法”可以涵盖针对疾病的第一治疗。它通常是一组标准治疗的一部分，例如手术后进行化学疗法和放射。一线疗法单独使用时，是公认的最佳治疗。如果它不能治愈疾病或引起严重的副作用，则可以添加或使用其他治疗方法。也称为诱导疗法、初级疗法和初级治疗。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括辅助疗法。
本领域技术人员会理解，术语“辅助疗法”可以涵盖除主要或初始治疗之外所给与的治疗。在一些实施方案中，辅助疗法可以包含在准备进一步治疗之前在主要治疗之前施用的另外的癌症治疗。在一些实施方案中，辅助治疗可以包含在主要治疗之后施用的另外的癌症治疗，以降低癌症复发的风险。辅助疗法可包含化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法或生物疗法。
在一些实施方案中，本文公开的方法，减少最小残留疾病、增加缓解、增加缓解持续时间、降低肿瘤复发率、减小所述肿瘤的尺寸、降低所述肿瘤或所述癌症的生长速率、防止所述肿瘤或所述癌症的转移或降低所述肿瘤或所述癌症的转移率或其任意组合。
本领域技术人员会理解，术语“最小残留疾病”可以涵盖在治疗期间或当患者没有疾病的症状或体征时在治疗之后残留在患者体内的少量癌细胞。
另外，术语“缓解”可涵盖癌症的体征和症状的减少或消失，尽管癌症可能仍在体内。在一些实施方案中，缓解可以包括部分缓解，其中一些但不是全部癌症体征和症状已经消失。在一些实施方案中，缓解包括完全缓解，其中癌症的所有体征和症状都已经消失，尽管癌症仍可能在体内。在一些实施方案中，本文公开的方法可以包含缓解诱导疗法，其中用早期凋亡细胞或其组合物的初始治疗降低癌症的体征或症状或使其消失。
本领域技术人员会理解，术语“复发”可涵盖在一段时间的改善后疾病或疾病的体征和症状的回复。在一些实施方案中，本文所用的方法导致无复发的生存，其中无复发的生存涵盖癌症的主要治疗结束后患者生存而没有该癌症的任何体征或症状的时间长度。
本领域技术人员会理解，术语“转移”涵盖癌细胞从它们最初形成的位置到身体另一部分的扩散。在转移中，癌细胞会脱离原始(原发性)肿瘤，穿越血液或淋巴系统，并在身体的其他器官或组织中形成新的肿瘤。在一些实施方案中，新的转移性肿瘤是与原发性肿瘤相同类型的癌症。例如，如果乳腺癌扩散到肺，则肺中的癌细胞是乳腺癌细胞，而不是肺癌细胞。
恶性肿瘤
在一些实施方案中，CAR T细胞用于治疗、预防、抑制癌症或肿瘤,减少癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其中所述方法包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)的步骤。如本文所公开的，这些方法可以进一步包含为了抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生而施用附加剂。
在一些实施方案中，本文公开的方法增加了对象的生存。在一些实施方案中，本文公开了增加或延长患有弥漫性癌症的对象的生存的方法，其包含对所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法增加了对象的生存。
在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病。在另一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病。
在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症包含实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含腹部肿瘤。
在一些实施方案中，本文描述的方法减小癌症或肿瘤的尺寸或降低其生长速率，并且包含向所述对象施用早期凋亡细胞群，其中该方法减小癌症或肿瘤的尺寸或生长速率。在一些实施方案中，本文公开了降低弥漫性癌症的生长速率的方法，其包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法降低了癌症的生长速率。在一些实施方案中，本文公开了减小实体癌或肿瘤的尺寸或降低其生长速率的方法，其包括给对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中该方法减小该尺寸或降低该生长速率。
在一些实施方案中，癌症可包含实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含异常组织块，其通常不包含囊肿或液体区。实体瘤可能是良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液中的癌症)通常不会形成实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含肉瘤或癌。
在一些实施方案中，实体瘤是由除血液、骨髓或淋巴细胞以外的身体组织细胞的异常生长形成的赘生物(neoplasm)(细胞的新生长)或病变(解剖结构的损伤或生理功能的破坏)。在一些实施方案中，实体瘤由异常细胞团组成，该异常细胞团可能源于不同组织类型，例如肝脏、结肠、乳腺或肺，并且最初在其细胞起源的器官中生长。但是，此类癌症可能会在疾病晚期通过转移性肿瘤生长扩散到其他器官。
在一些实施方案中，实体瘤的实例包含肉瘤、癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含肉瘤或癌。在一些实施方案中，实体瘤是腹膜内肿瘤。
在一些实施方案中，实体瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、膀胱癌、肝脏癌和皮肤癌。在一些实施方案中，实体瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing’s瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌或肿瘤、乳腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、前列腺癌或肿瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、宫颈癌或肿瘤、子宫癌或肿瘤、睾丸癌或肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
在一些实施方案中，实体瘤包含肾上腺皮质肿瘤(腺瘤和癌)、癌、结直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤、生殖细胞瘤、肝母细胞瘤肝细胞癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌肉瘤以外的软组织肉瘤和Wilm’s瘤。在一些实施方案中，实体瘤是乳腺肿瘤。在另一个实施方案中，实体瘤是前列腺癌。在另一个实施方案中，实体瘤是结肠癌。在一些实施方案中，肿瘤是脑肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是胰腺肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是结肠直肠肿瘤。
在一些实施方案中，本文所公开的早期凋亡细胞或其组合物具有针对癌症或肿瘤的治疗和/或预防功效，例如肉瘤或癌(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing’s瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌或肿瘤、乳腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、前列腺癌或肿瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、宫颈癌或肿瘤、子宫癌或肿瘤、睾丸癌或肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤)。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于治疗、预防、抑制本领域已知的任何实体瘤的生长或降低其发病率。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于增加患有本文公开的或本领域已知的任何实体瘤的对象的生存。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于减小本文公开的或本领域已知的任何实体瘤的尺寸或降低其生长速率。
在一些实施方案中，癌症可以是弥漫性癌症，其中该癌症广泛扩散；不在局部或受局限。在一些实施方案中，弥漫性癌症可包含非实体瘤。弥漫性癌症的实例包含白血病。白血病包含始于血液形成组织(例如骨髓)并导致大量异常血细胞生成并进入血流的癌症。
在一些实施方案中，弥漫性癌症包含B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，弥漫性癌症包含白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，弥漫性癌症或肿瘤包含血液肿瘤。在一些实施方案中，血液肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。血液肿瘤可能来自两种主要的血细胞谱系：髓样和淋巴样细胞系。髓样细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞，而淋巴样细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤均来自淋巴样系，而急性和慢性骨髓性白血病(AML、CML)，骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病均起源于骨髓。
在一些实施方案中，非实体(弥漫性)癌症或肿瘤包含造血系统恶性肿瘤、血细胞癌、白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病。
在另一个实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物具有针对弥漫性癌症的治疗和/或预防功效，所述弥漫性癌症例如但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单个核白血病、急性单个核性白血病、急性红细胞白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、Waldenstrom's巨球蛋白血症、重链疾病。
本文公开的组合物和方法可用于治疗、预防、抑制、改善本领域已知的任何血液肿瘤，减少本领域已知的任何血液肿瘤的发病率或缓解本领域已知的任何血液肿瘤。
本领域技术人员会理解，在某些实施方案中，通篇使用术语“包含”可以由术语“基本上由...组成”或“由...组成”代替。本领域技术人员会理解，术语“包含”旨在表示系统包含所列举的元素，但不排除可能是可选的其他元素。例如，包含早期凋亡细胞但不限于该细胞群的组合物。此外，术语“基本上由……组成”可以包含一种方法，该方法包括所列举的元素，例如基本上或早期凋亡的细胞组成的组合物，但不包含可能对该方法的性能具有重要影响的其他元素。因此，这样的组合物仍然可以包含在治疗癌症中不包含必需活性的药学上可接受的赋形剂。此外，“由...组成”涵盖排除多于痕量的其他要素。因此，由早期凋亡细胞组成的这种组合物将不包含多于痕量的如本文所公开的其他要素。
本领域技术人员会理解，术语“约”可以涵盖与所指示的数目或数目范围之间的0.0001-5％之间的偏差。此外，它可以包含与所指示的数字或数字范围之间的1-10％的偏差。此外，它可能包含与所指示的数字或数字范围最多25％的偏差。
本领域技术人员会理解，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包含复数形式，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种物质”或“至少一种物质”可以包含多种物质，包含其混合物。
在整个本申请中，本文公开的各种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
每当在本文中指示数值范围时，其意在包含在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围/范围以及从第一指示数字到第二指示数字的范围/范围”在本文中可互换使用，并且意在包含第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有小数和整数。
实施例
实施例1：凋亡细胞的产生
目的：产生早期凋亡细胞。
方法：在国际公开号WO 2014/087408和美国申请公开号US2015/0275175-A1中已经很好地记载了制备早期凋亡细胞群的方法，例如参见“早期凋亡细胞群的制备”和“凋亡细胞的产生”实施例前面的“方法”部分(段落至)以及实施例11、12、13和14，其全部内容并入本文。
图1所示的流程图提供了在生产早期凋亡细胞群的过程中使用的步骤的一个实施方案的概述，其中在解冻和诱导凋亡步骤中包含抗凝剂。如国际公开号WO2014/087408的实施例14和美国申请公开号USUS-2015-0275175-A1的实施例中所述，制备早期凋亡细胞群，其中在冷冻时，或在孵育时，或在冷冻时以及在孵育时添加抗凝剂。所用的抗凝剂是柠檬酸葡萄糖，NIH Formula A(ACD Formula A)补充了10U/ml肝素，最终浓度为总体积的5％ACD和0.5U/ml肝素。
简而言之：收集细胞，然后在冷冻介质中加入5％抗凝柠檬酸葡萄糖Formula A和10U/ml肝素(ACDhep)进行冷冻。解冻，在含5％ACDhep的凋亡诱导介质中孵育，并且在密闭系统中进行最终产物制备。
在每个实验中进行凋亡和生存力分析，功效测定和细胞群表征。为了建立早期凋亡细胞产物的生产一致性，将初始批次的凋亡细胞的终产物(FP)储存在2-8℃，并在t0，t24h，t48h和t72h进行检查。在每个点进行细胞凋亡分析，短效测定(申请人CD14+冷冻的细胞)，台盼蓝测量和细胞群表征。测试FP的细胞计数，以评估在储存和凋亡以及生存力分析期间的平均细胞损失。
国际公开号WO2014/087408和美国申请公开号US US-2015-0275175-A1的以上引用的方法部分以及实施例11提供了在不存在抗凝剂的情况下制备凋亡细胞群的其他实施方案的细节，并在此全文并入。
制备辐照的凋亡细胞的方法：类似的方法用于制备失活的凋亡细胞群，其中单个核早期凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或增殖减少的任何活的非凋亡细胞；或其任意组合。
简而言之，通过白细胞分离术从健康的合格供体收集单个核富集的细胞级分。单血浆分离置换完成后，将细胞洗涤并用包含5％抗凝柠檬酸盐葡萄糖溶液-Formula A(ACD-A)和0.5U/ml肝素的冷冻介质重悬。然后将细胞逐渐冷冻并转移至液氮中以长期保存。
为了制备经辐照的ApoCell，将冻存的细胞解冻，洗涤并重悬于包含5％ACD-A、0.5U/ml肝素钠和50μg/ml甲泼尼龙的凋亡诱导介质。然后将细胞在5％CO2中于37℃孵育6小时。在孵育结束时，收集细胞，洗涤，并使用细胞处理系统(Fresenius Kabi,Germany)重悬于Hartmann溶液中。制备完成后，在放疗单元Hadassah Ein Kerem中使用g相机以4000cGy对ApoCell进行辐照。通过流式细胞仪使用AnnexinV和PI(分别为MBL，MA和USA)染色(分别≥40％和≤15％)确定ApoCell的凋亡和生存力。使用FCSExpress软件分析结果。
该经辐照的ApoCell群体被认为包含早期凋亡细胞，其中存在的任何活细胞均具有抑制的细胞活性和降低的增殖能力或没有增殖能力。在某些情况下，ApoCell群体没有生存的非凋亡细胞。
结果：
用包括抗凝剂的冷冻和孵育(凋亡诱导)然后在2-8℃保存产生的FP的稳定性如下表1所示。
表1：细胞计数*-使用MICROS 60血液分析仪进行。
FP时间点 细胞浓度(x10<sup>6</sup>个细胞\ml) 细胞损失％
t0 20.8 NA
t24h 20.0 -3.85
t48h 20.0 -3.85
t72h 19.7 -5.3
*结果代表6(六)个实验。
当在诱导介质中不包括抗凝剂的情况下制备细胞时，细胞可稳定放置24小时，此后较不稳定。
如表1所示，使用抗凝剂出乎意料地将凋亡细胞群的稳定性延长了至少72小时。
表2：台盼蓝的测量
FP时间点 台盼蓝阳性细胞(％)
t0 3.0
t24h 5.9
t48h 5.2
t72h 6.5
表2的结果表明FP维持高生存力至少72小时。
表3：细胞凋亡分析-(AnPI染色)使用流式细胞仪进行
Figure BDA0002380874480000801
表3的结果表明，在制备细胞后至少72小时的延长时间内，凋亡细胞与坏死细胞的百分比得以维持，以早期凋亡细胞的百分比计。
冷冻时和诱导细胞凋亡期间均包括抗凝剂，导致稳定的早期凋亡细胞的产率始终很高(早期凋亡细胞的平均产率为61.3±2.6％％，而平均为48.4±5.0％，其中100％产率基于冻结时的细胞数)。即使在2-8℃储存24小时后，也维持了这种高产率。
接下来，比较在冷冻或解冻时或在两者下包括抗凝剂的情况，其中测量了回收百分比(％)以及稳定性。所有群的细胞凋亡孵育混合物中均包括抗凝剂。表4示出了这些研究的结果。
表4：在冷冻(“F”)和解冻(“Tha”)过程中，添加(“+”)或不添加(“-”)抗凝剂的情况下，从收集的细胞中细胞制备的最终产物(FP)的产率和稳定性比较
Figure BDA0002380874480000811
在添加和不添加抗凝剂的情况下，对早期凋亡细胞群(细胞批次)进行的另外群体分析比较表明，这些结果具有一致性。
表5：使用和不使用抗凝剂制备的批次之间的细胞群分析比较
Figure BDA0002380874480000812
Figure BDA0002380874480000821
存在或不存在抗凝剂时最终产物细胞的百分比(产率)。与以上表1所示结果相似，表4中显示的数据表明，与没有抗凝剂的冷冻的细胞相比，由在抗凝剂存在下冷冻的细胞制备的早期凋亡细胞对新鲜终产物(FPt0)的平均产率具有有益的影响。仅在冷冻时使用抗凝剂时可观察到有益效果(61.3±2.6％vs 48.4±5.0％)或在冷冻和融化时(56.5±5.2％vs48.4±5.0％)。当仅在解冻时使用抗凝剂时，有益效果不太明显(44.0±8.5％vs 48.4±5.0％)。这些是非高甘油三酯样品。
抗凝剂对聚集的影响。在这3个非高甘油三酯样品或21个其他样品中均未观察到细胞聚集(数据未显示)。但是，在其他41个没有使用抗凝剂的非高甘油三酯样品中(数据未显示)，有10个(24.4％)轻度聚集，而5个(12.2％)重度聚集。因此，抗凝剂可以完全避免细胞聚集。
抗凝剂对稳定性的影响。使用或不使用抗凝剂制备的新鲜FP在2-8℃保存24小时，以确定在制备过程中添加ACDhep是否会损害FP的稳定性。储存24小时后对细胞取样，并在细胞计数中计算产率。与表1所示的延长时间段(长达72小时)的结果相似，表4显示，仅在冷冻状态下使用抗凝剂时，可以维持并观察到有益效果(59.8±2.1％vs 47.5±4.7％)，或者冷冻和解冻(56.4±5.3％vs 47.5±4.7％)。当仅在融化时添加抗凝剂时，有益效果不太明显(42.4±6.1％vs 47.5±4.7％)。这些都是非高甘油三酯样品。这些结果表明，在所有处理中，FP储存24小时后细胞损失最少，对冷冻和解冻过程中用抗凝剂处理的细胞具有明显的优势。仅在冷冻期间用抗凝剂处理的细胞的平均损失为2.3±3.2％，而无抗凝剂的细胞的平均损失为1.9±3.3％，仅解冻后为3.0±4.7，而无抗凝剂的为1.9±3.3％，当细胞用ACDhep同时冷冻和解冻时，与0.2±0.4％相比，无抗凝剂为1.9±3.3。总之，抗凝剂对产率的有益作用至少维持了24小时。
FP的代表性细胞群的特征在下表6中示出。
表6：由在冷冻(“F”)和解冻(“Tha”)过程中添加(“+”)或不添加(“-”)抗凝剂收集的细胞制备的新鲜(t0)FP的细胞群的表征。*
Figure BDA0002380874480000831
*所有批次均使用含有抗凝剂的介质诱导凋亡。
表6的结果显示了在冷冻和解冻时使用或不使用抗凝剂制备的最终产物(FP)的细胞特征。对批次取样，对单个核标记物染色，并通过流式细胞仪分析以确定每个样品中的细胞分布，并检查抗凝剂的添加是否影响细胞群。如表5所示，在冷冻或解冻时，在有或没有抗凝剂的情况下制备的细胞群中均未检测到显著差异。处理之间新鲜FP中的T细胞平均数(CD3+细胞)为62.3±1.2％，而冷冻前为62.9±1.1％；处理之间的平均B细胞群(CD19+细胞)为8.3±2.5％，而冷冻前为3.1±0.8％；处理之间的平均自然杀伤细胞群(CD56+细胞)为9.5±0.7％，而冷冻前为12.9±0.5％；处理之间的平均单个核群(CD14+细胞)为13.8±0.5％，而冷冻前为17.5±0.3％；新鲜FP中的平均粒细胞数目(CD15+细胞)为0.0％，而冷冻时为0.35±0.2％。
还检查了早期凋亡群的效价(potency)。
表7：在冷冻(“F”)和解冻(“Tha”)过程中，由添加(“+”)或不添加(“-”)抗凝剂的细胞制成的新鲜(t0)FP的功效分析。
Figure BDA0002380874480000841
表7中所示的结果来自进行效价测定，以测定每种终产物在用(LPS)刺激后增强未成熟树突状细胞(iDC)中耐受性状态的能力。通过评估与早期凋亡细胞群相互作用和导致LPS上调的不同处理相互作用后，iDC上的共刺激分子HLA-DR和CD86表达的下调来确定致耐受性作用。分析在DCsign+细胞上进行。结果表示，与LPS诱导的成熟相比，与早期凋亡细胞群相互作用后，加入LPS后成熟延迟的百分比。实验测试了使用或不使用抗凝剂制备的新鲜FP(t0)的效价。表7中给出的结果表明，用或不用抗凝剂制备的凋亡细胞以剂量依赖的方式增强了两种共刺激标记的耐受性。
本文产生的早期凋亡细胞来自非高甘油三酯样品。即使在供体血浆中甘油三酯含量高的情况下，也产生了稳定的早期凋亡细胞的这种一致高的产率(例如，参见国际公开号WO2014/087408的实施例12和13以及美国申请公开号USUS-2015-0275175-A1)。注意，未将抗凝剂添加到用于配制最终早期凋亡细胞剂量的PBS介质中。
总结
这项研究的目的是产生稳定、高产率的早期凋亡细胞群。使用抗凝剂的理由是，在甘油三酯含量高的患者中首先出现聚集体，而在其他患者中有很大一部分出现聚集体。这里关注的是美国专利号US6,489,311中的公开内容，即使用抗凝剂防止细胞凋亡。
简而言之，在对细胞的组成、生存力、稳定性和凋亡性质产生最小影响的情况下，当添加抗凝剂时，最终产物中收集的细胞至少有10-20％的数目(产率)显著改善。在这项研究中，产率增加了13％，这表示在受控条件下产率增加了26.8％，但在实际GMP条件下，高达33％，然后可以在单次收集中产生更多的细胞数目增加。该效果至关重要，因为它可以避免来自供体的第二次血液采血。
该效果是令人惊讶的，因为预期的影响预计是轻微聚集体的溶解。据推测，用抗凝剂解冻细胞会减少聚集体的数目。这些聚集体形成时最终会导致大量细胞损失。洗涤后立即收集的细胞在没有抗凝剂的情况下冷冻，并显示在融化时形成聚集体。此外，在没有抗凝剂的情况下冷冻并重悬于含有抗凝剂的介质中的细胞中也检测到高水平的聚集体。在冷冻和重悬含抗凝剂的细胞中均未见到聚集体。总之，得出结论，在冷冻和细胞凋亡诱导期间添加抗凝剂非常重要，并且似乎没有对细胞群中早期细胞凋亡的诱导产生负面影响。
进一步测试了早期凋亡细胞的回收，例如，出于稳定性的目的，在2–8℃储存24小时后测试，在此期间，无论制备条件如何，测量的平均细胞损失率为3–4.7％，对于含有抗凝剂的细胞进行冷冻和融化后的细胞具有良好的结果(FP储存24小时后细胞损失0.2±0.4％)，表明在冷冻和融化过程中添加抗凝剂至关重要，但一旦最终配制，早期凋亡细胞群是稳定。延长的时间点研究表明这种稳定性至少为72小时。
在冷冻和/或解冻阶段添加抗凝剂不会显著影响FP产物的细胞凋亡和生存力以及细胞组成。从各种特征测得的值相似，表明ACDhep不会改变早期凋亡细胞的特征，最终产物满足≥40％凋亡细胞的接受标准。
用于测试凋亡细胞功效的测定是基于未成熟树突状细胞(iDC)，DC特征在于功能，如吞噬作用、抗原呈递和细胞因子产生。
选择HLA-DR(II类MHC)膜分子和共刺激分子CD86作为标记，以检测抗原呈递细胞(APC)的致耐受作用。使用流式细胞仪，在LPS刺激后，以及在使用或不使用抗凝剂并使用LPS刺激的早期凋亡细胞群的存在下，测量iDC上HLA-DR和CD86表达的变化。早期凋亡细胞群以1:2、1:4和1:8的iDC:早期凋亡细胞群的递增比率提供给DC。如表6所示，表明早期凋亡细胞群以剂量依赖性方式增强了刺激DC的致耐受性作用，在冷冻和凋亡诱导下用抗凝剂制备的早期凋亡细胞群的结果稍好。
综上，得出的结论是，在冷冻和凋亡介质中添加抗凝剂对于提高细胞回收和避免由于聚集而造成的大量细胞损失，以及在许多情况下避免来自供体的第二轮单血浆分离置换非常重要。结果表明，所有细胞均符合经过验证的FP的接受标准，表明添加抗凝剂不会损害FP。
实施例2：凋亡细胞处理对非实体瘤模型的影响
目的：为了测试凋亡细胞对癌症广泛扩散而不在局部或受局限的非实体瘤模型的影响，以确定凋亡细胞对癌症生存的功效。
方法：
Raji细胞
Raji细胞购自ECACC(目录号：85011429)，并在完全培养基(补充有10％H.I.FBS，1％Glutamax，1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中常规培养，并维持3x105–3x106细胞/ml的浓度。
如实施例1所述制备凋亡细胞。产生的早期凋亡细胞是至少50％的膜联蛋白V阳性细胞和少于5％PI阳性的细胞。
非实体(弥漫性)肿瘤模型
在实验的第1天，SCID小鼠接受了105个Raji细胞的单次IV注射。对照组的SCID小鼠接受了单次盐水溶液IV注射。(测试了3个同生群；使用Raji细胞在2个同生群中诱导了白血病，并维持了1个同生群作为对照。)
实体瘤模型
在实验的第1天，SCID小鼠接受105个Raji细胞的单次IP注射，其中对照组将接受IP盐水溶液的单次IP注射。
凋亡细胞处理
在一项初步研究中，小鼠在注入Raji细胞后6天接受早期凋亡细胞的输注。在随后的研究中，来自上述白血病同生群之一的小鼠在输注Raji细胞后6天开始接受3次早期凋亡细胞(30x106个细胞)的输注。
结果
SCID小鼠没有T细胞，因此没有治疗就没有能力从白血病中恢复过来。
令人惊讶的是，在初步研究中，如图2所示，与未接受凋亡细胞的小鼠(无APO)相比，Raji输注后6天的凋亡细胞输注(APO)在注射CD19+Raji的SCID中显著延长了无肿瘤死亡。
在白血病(无APO)同生群中，接受Raji细胞的小鼠中有70％生存了整个生命，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠中则有94％(总计n＝51只动物，p<0.001)。如预期的那样，100％的对照小鼠在其预期寿命内生存(图3A)。在白血病同生群中，接受Raji细胞且没有凋亡细胞的小鼠中有9％生存多达预期寿命的12％，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠中则有47％(图3B)。没有接受Raji细胞也没有凋亡细胞的小鼠生存超过预期寿命的30％，而同时接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠则为41％(图3C)。没有接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠获得完全缓解，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠为10％(图3D)。
结论：
凋亡细胞输注的施用维持并增加了白血病小鼠的寿命，其中在某些情况下，施用早期凋亡细胞的小鼠获得完全缓解(图2和3A-3D)。
实施例3：凋亡细胞和抗CD20 mAb联合处理对弥漫性肿瘤模型的影响
目的：测试施用早期凋亡细胞和抗CD20 mAb的组合对弥漫性(非实体)肿瘤模型的影响，其中癌症广泛扩散且不在局部或受局限，以确定这种组合疗法对患者生存的功效。
Raji细胞，凋亡细胞，非实体(弥漫性)肿瘤模型，实体瘤模型和凋亡细胞处理如以上实施例2中所述。
抗CD20单克隆抗体
可商购的抗CD20 mAb购自Roche。
抗CD20 mAb处理
小鼠接受5mg抗CD20 mAb的IV输注。
凋亡细胞和抗CD20 mAb联合处理
从施用Raji细胞后第6天开始，小鼠接受3次IV输注，每次输注30x106个凋亡细胞。此外，小鼠接受5mg抗CD20 mAb的IV输注。
结果
接受Raji细胞、Raji细胞+抗CD20 mAb和Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠中有100％活过白血病小鼠的预期寿命，而同时接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠中有86％(n＝28动物总数，p＜0.0002)(图4A)。没有接受Raji细胞的小鼠的生存超过预期寿命的24％，而同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠为29％，接受Raji细胞+抗CD20 mAb或Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠为100％(图4B)。没有接受Raji细胞的小鼠生存超过预期寿命的59％，而同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠为29％，接受Raji细胞+抗CD20 mAb的小鼠为57％，接受Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠为100％(图4C)。没有接受Raji细胞的小鼠生存超过预期寿命的76％，而同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠为29％，接受Raji细胞+抗CD20 mAb的小鼠为14％，接受Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠为85％(图4D)。没有接受Raji细胞或Raji细胞+抗CD20 mAb的小鼠生存超过小鼠预期寿命的100％，而接受Raji细胞+凋亡细胞或Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠为29％(图4E)。
结论：
凋亡细胞输注增加了白血病小鼠的寿命，增加了获得完全缓解的小鼠的数目，并且增强了抗CD20 mAb的治疗效果(图4A-4E)。
实施例4：凋亡细胞下调细胞因子释放综合征(CRS)并增加CAR-T细胞功效
目的：在延长的时间段内测试辐照的早期凋亡细胞对细胞因子和CAR T细胞的细胞毒性的影响。为了证明CD19-CAR T细胞的体内功效。为了证明辐照的早期凋亡细胞和CD19-CAR T细胞的协同作用。
方法：表达CD19的HeLa细胞(ProMab)可以单独使用，也可以与人类巨噬细胞共孵育后用于小鼠的体外和腹膜内实验。Raji被用于体内白血病的诱导。LPS和IFN-g用于触发其他细胞因子释放。针对带有CD19的细胞产生抗肿瘤作用，使用第二代带有CD28的CD19特异性CAR修饰的细胞(购自ProMab或使用Retronectin制备规程或多烯制备规程生产)。在体内(7-AAD流式细胞术)和体外(生存曲线；骨髓和肝脏中的肿瘤负荷，流式细胞术和免疫组织化学)检查细胞毒性测定。CRS是自发发生的，或者是对LPS和IFN-g的应答。评估了小鼠IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-a、IL-9、IL-13、IFN-g、IL-12p70、GM-CSF、TNF-a、MIP-1a、MIP-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R、IL-7和32种人类细胞因子(Luminextechnology,MAPIX system；MILLIPLEX Analyst,Merck Millipore)。评估了小鼠IL-6Ra、MIG(CXCL9)和TGF-β1(Quantikine ELISA,R&D systems)。评估IFN-γ作用(STAT1磷酸化，生物产物)。人巨噬细胞和树突状细胞由单个核产生。一般如上述实施例1中所述产生经辐照的早期凋亡细胞；≥40％的细胞膜联蛋白V阳性；≤15％是PI阳性。
小鼠：在实验的第1天和第2天腹膜内(ip)向SCID-Bg小鼠(雌性，7-8周)注射2次连续剂量的0.25x106 HeLa-CD19细胞。在第9天，小鼠接受ip剂量的10x106 4000rad(cGy)辐照的ApoCell(使用细胞处理系统)和第二天ip剂量的包含0.5x106 CAR-T阳性细胞或2.2x106个CAR-T阳性细胞的10x106CAR-T细胞群。作为对照，小鼠接受10×106个活化的单个核细胞或Mock-T细胞。按照机构IACUC指南，将小鼠饲养在SPF动物设施中。每周对小鼠称重两次，每天监测其临床体征和腹膜炎。终点定义为严重腹膜炎，表现为腹部肿大、紧张、嗜睡、行动不便或呼吸运作(respiratory effort)增加。生存分析根据Kaplan-Meier方法进行。
结果：记录了促炎性细胞因子(包括IL-6、IP-10、TNF-a、MIP-1a、MIP-1β在内)的显著下调(p<0.01)(数据未显示)。IFN-g未下调，但其对巨噬细胞和树突状细胞的作用在磷酸化的STAT1水平被抑制(数据未显示)。IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9在巨噬细胞中的表达降低(数据未显示)。
在使用0.5x106个CAR-T阳性细胞的实验中，每组在第17和21天牺牲2只小鼠。HeLa-CD19处理的小鼠显示腹膜炎，表现为腹膜中的血液蓄积、脾脏肿大和肿瘤位点(数据未显示)。用对照MNC处理的小鼠腹膜中的血液少一点，肿瘤位点也少一些。用CAR-T或CAR-T和经辐照的ApoCell处理的小鼠均无腹膜炎的迹象。该观察结果与图5A所示的生存曲线相关。
在使用2.2x106个CAR-T阳性细胞的实验中，观察到了与减少了四倍的CAR T细胞相同的作用模式(图5B)。CAR-T处理可延长有腹膜HeLa-CD19的小鼠的生存(p＝0.0002)。在该实验中效果更为显著，可能是由于输注的CAR T细胞数目更高(2.2vs 0.5x106个CAR-T阳性细胞)。即使具有更显著和延长的作用，受辐照的早期凋亡细胞也具有协同作用和延长的生存期(p＝0.0032)。在有/无体外辐照的凋亡细胞中，CAR T的E/T比是相当的。令人惊讶地，与单独的CAR疗法相比，在被辐照的凋亡细胞存在下给予的CAR T细胞疗法改善了小鼠的生存，显著且可再现地增加至少12天(p＜0.0032，图5A和5B)。
结论：CAR-T细胞处理可延长腹膜HeLa-CD19细胞小鼠的生存。与单独使用CAR-T细胞处理相比，在CAR-T前一天施用辐照的早期凋亡细胞具有协同作用，并且小鼠生存时间延长了多于10天(p<0.044，对数秩检验)。
辐照的凋亡细胞输注在处理SCID小鼠中带有CD19的Hela细胞中对CD19特异性CART细胞具有显著的协同作用。在该实施例中，观察到与实施例2和3中给出的结果相似的结果。与实施例2和3相比，通过在本实施例中使用辐照的凋亡细胞，消除了“移植物抗白血病作用”的可能性。因此，这种令人惊讶的协同作用似乎是通过所提供的辐照凋亡细胞介导的。
CRS从多种因素演变而来，包括肿瘤生物学、与单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞的相互作用以及对CAR T细胞效应和扩增的应答。凋亡细胞减少源自先天免疫的促炎性细胞因子，并抑制IFN-γ对单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞的作用，而不会损害IFN-γ水平或CAR-T细胞毒性，并且CAR-T细胞功效显著提高。出乎意料的是，用凋亡细胞处理补充了CAR-T细胞疗法，有效地延长了CAR-T细胞疗法的抗癌作用。
实施例5：ApoCell(早期凋亡细胞)对白血病/淋巴瘤的作用
目的：这里提出的工作具有三个主要目标：(1)从疾病的发作、进展和随后的死亡方面评估ApoCell在白血病-淋巴瘤小鼠模型中的作用；(2)评估ApoCell处理后肿瘤细胞在小鼠白血病-淋巴瘤模型中的分布；(3)评估ApoCell和利妥昔单抗(RtX)在处理SCID-Bg小鼠白血病-淋巴瘤中可能的协同作用。作为实现这些目标的工作的一部分，测量了ApoCell施用后白血病小鼠的生存量度。同样，在用ApoCell处理后测量肿瘤细胞的分布。
方法：
小鼠。向7周龄的雌性SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)静脉内注射每只小鼠0.1×106个Raji细胞。在实验的第5、8和11天，小鼠静脉内接受3剂30×106个ApoCell。对于联合处理，在ApoCell施用后1.5小时，小鼠接受一剂(第8天)RtX(2或5mg/kg；Mabthera,Roche,Basel,Switzerland)。
每天跟进小鼠，每周称重两次。终点定义为死亡或因以下任何一种症状的发展而牺牲：截瘫(下肢麻痹)、从小鼠初始体重减轻20％、嗜睡、行动降低或呼吸运作增加。
生存分析根据Kaplan-Meier方法进行。按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南，将小鼠饲养在无特定病原体(SPF)的动物设施中。
Raji细胞系。该人类Burkitt淋巴瘤细胞系购自欧洲认证的细胞培养物保藏中心(ECACC，目录号：85011429)，并在完全培养基(RPMI-1640，补充有10％热失活的FBS，1％的glutamax，1％的青霉素/链霉素)中常规培养。
ApoCell。基本上，如示例1中所述。简而言之，通过白细胞分离术从健康的合格供体中收集了单个核富集的细胞级分。单血浆分离置换完成后，将细胞洗涤并重悬于含有pH7.4的PlasmaLyteA、5％的人血清白蛋白、10％的二甲亚砜(DMSO)、5％的抗凝柠檬酸葡萄糖溶液fromula A(ACD-A)和0.5U\ml肝素。然后将细胞逐渐冷冻，并转移至液氮中进行长期保存。
为了制备ApoCell，将冻存的细胞解冻，洗涤并重悬于凋亡诱导介质，该介质由补充2mML-谷氨酰胺和10mM肝素的RPMI1640、10％自体血浆、5％ACD-A、0.5U\ml肝素钠和50μg/ml甲泼尼龙组成。然后将细胞在5％CO2在37℃孵育6小时。在孵育结束时，收集细胞，洗涤，并使用细胞处理系统(Fresenius Kabi,Bad Homburg,Germany)重悬于Hartmann溶液。ApoCell在290g在2-8℃离心10分钟，并重悬于Hartmann注射用溶液。使用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI,Medical&Biological Laboratories,Nagoya,Japan)，使用FCSExpress软件确定ApoCell的凋亡和生存力。
流式细胞术。从牺牲的小鼠中收集小鼠脾脏、肝脏和骨髓(如上定义的临床症状恶化后)，并通过流式细胞仪(FACSCalibur,BD,Franklin Lakes,NJ,USA)进行分析，以观察Raji肿瘤的存在(抗CD20)。
结果：
A部分：ApoCell延迟了白血病小鼠的疾病发作以及随后导致的死亡
图24是Kaplan-Meier生存图，显示了3个单独的实验(RPMI组，n＝15；Raji组，n＝23；Raji+ApoCell组，n＝24)。在每个实验中，对雌性SCID-Bg小鼠(7-8周龄)静脉注射0.1×106Raji细胞，对照组注射RPMI。随后，在第5、8和11天，通过静脉内施用(IV)向小鼠施用三剂30×106ApoCell。每天跟进小鼠，每周称重两次。终点被定义为死亡或因以下任何一种症状的发展而牺牲：截瘫(下肢麻痹)、从小鼠初始体重减轻20％、嗜睡、行动降低或呼吸运作增加。实验细节在表11中给出。观察到ApoCell的显著有益作用(p＝0.002，对数秩(Mantel-Cox)检验)。
表11：图A图的实验细节
Figure BDA0002380874480000921
DFS＝无病生存
各个研究的数据显示在图25A-25C中。
如上所述，在施用Raji细胞后，与未处理的小鼠相比，用3剂ApoCell处理的小鼠疾病进展较慢，并且死亡显著晚(p＝0.0020)。
与未处理的小鼠相比，用ApoCell处理的白血病小鼠的症状发作明显延迟，表现出较慢的疾病进展，并且死亡更晚。有趣的是，约有10％的接受Raji细胞和ApoCell施用的小鼠在这种白血病/淋巴瘤模型中没有表现出任何预期的症状特征，并且一直健康直到实验终止(第53或60天)。
ApoCell降低白血病小鼠的肿瘤负荷
如上所述，随着临床症状的恶化牺牲后，收集感兴趣的器官用于分析，即肝脏、脾脏和骨髓。通过流式细胞术分析这些靶器官的细胞中是否存在人类肿瘤细胞(Raji细胞的CD20呈阳性)。
以下数据(表12)描述了上述3个实验中牺牲小鼠的靶器官中平均百分比细胞群。可以在后面的表13-18中找到每个实验中单个小鼠的值。
表12：脾脏，骨髓和肝脏中肿瘤人口的平均百分比(流式细胞仪)
Figure BDA0002380874480000931
体内实验011
骨髓、脾脏和肝脏中CD20+细胞的FACS分析：
在第60天牺牲时，一只接受三剂ApoCell的小鼠是健康的。
收集肝脏、脾脏和骨髓细胞，并通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD)分析人CD20-FITC(Biolegend，目录号302206)；mIgG1-FITC(Biolegend，目录号400110)的存在。
体内实验019
FACS分析骨髓、脾脏和肝脏中的肿瘤细胞：
从临床恶化后牺牲的小鼠中收集小鼠的脾脏、肝脏和骨髓细胞，如方法所定义，并通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD)分析是否存在人CD20(FITC)。
脾脏、骨髓和肝脏的分析结果示于下表13-15中。
表13：脾脏
Figure BDA0002380874480000932
Figure BDA0002380874480000941
表14：骨髓
Figure BDA0002380874480000942
表15：肝脏
Figure BDA0002380874480000943
Figure BDA0002380874480000951
体内实验023
通过流式细胞术确定的CD20肿瘤细胞在脾脏、骨髓和肝脏中的表达(％)。从牺牲的小鼠中收集小鼠脾脏、肝脏和骨髓(按照方法所述在临床恶化后)，并通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD)分析是否存在人类CD20(FITC)。下表16-18显示了各只小鼠的脾脏、骨髓和肝脏的结果。
表16：脾脏
Figure BDA0002380874480000952
Figure BDA0002380874480000961
表17：骨髓
Figure BDA0002380874480000962
表18：肝脏
Figure BDA0002380874480000971
初步结论：总之，在小鼠器官中的肿瘤分布与在生存图中看到的有益效果相关，并且在处理小鼠的骨髓和肝脏中显著降低。
B部分：ApoCell和利妥昔单抗(RtX)在处理白血病/淋巴瘤中的协同作用
接下来，通过在两个实验中评估RtX和ApoCell对白血病小鼠的联合作用，检查了ApoCell处理是否与白血病/淋巴瘤的其他常规处理具有协同作用。
目的：测量rtx和ApoCell施用后白血病小鼠的生存，以及检测白血病小鼠骨髓、肝脏和脾脏中的肿瘤细胞。
结果：
在治疗白血病小鼠中ApoCell与rtx协同作用
方法：以下工作是对联合疗法实验(ApoCell和rtx)中获得的结果的代表性描述。简而言之，给雌性SCID-Beige小鼠静脉注射0.1×106个Raji细胞(所有组中n＝7)。在第5、8和12天，小鼠静脉内接受三剂30×106ApoCell。第8天，在注射ApoCell后1.5小时，小鼠接受2或5mg/kg RtX的单次IV剂量。每天跟踪小鼠，每周两次称重。终点定义为死亡或因以下一种或多种症状的发展而牺牲：截瘫(下肢麻痹)、从初始体重减轻20％、嗜睡、行动降低或呼吸运作增加。
结果：
如图26所示，ApoCell具有有益的作用，证实了图24所示的结果。单独使用美罗华(RtX)在2mg和5mg剂量下均具有优于ApoCell的作用，但ApoCell和Rituxan的组合在2mg(p＝0.104)和5mg剂量下均具有协同作用，尽管所见5mg的协同作用未达到统计学意义。小鼠器官中的肿瘤分布与有益作用相关(表19)。
表19：生存分布的统计分析(对数秩(Mantel-Cox)检验)
Figure BDA0002380874480000981
实验结束–第57天
实验结束后，宣布一只小鼠(Raji+RtX2mg/kg+ApoCell)无病。
在另一项实验中测量了2mg RtX剂量的协同作用。如该实验中清楚显示的(图27)，ApoCell和RtX的协同作用再次得到证实(p＝0.01)。
如表20所示，脾脏中没有肿瘤细胞(0.1-0.3代表背景染色)，并用作对照。相反，骨髓和肝脏是肿瘤的靶。分别通过ApoCell和RtX处理后，骨髓和肝脏中的肿瘤细胞数目减少(使用CD20标记物测量的Rajji细胞)，并且将两者结合使用时获益增加；对于Raji+rtx(2mg/Kg)+ApoCell，p＝0.0034(**)；对于Raji+rtx(5mg/Kg)+ApoCell，p＝0.0031(**)。如预期的那样，RtX显著降低了白血病小鼠靶器官中的肿瘤负荷。有趣的是，单独用ApoCell进行处理可使那些器官中的肿瘤细胞减少到与常规RtX疗法相当的水平。
表20：脾脏，骨髓和肝脏中的平均肿瘤细胞数目(流式细胞仪)
Figure BDA0002380874480000991
结论：总之，生存图(图24、图26和图27)清楚地说明了ApoCell和Rtx的有益作用以及ApoCell和RtX的组合的协同作用。值得注意的是，当常规RtX处理与ApoCell联合使用时，无论RtX剂量如何，生存时间均显著增加，表明两种疗法均具有强大的协同作用。支持临床的观察是骨髓和肝脏中肿瘤细胞数目的减少(表12)。
出乎意料的是，ApoCell制备物对白血病小鼠模型中的疾病进展和生存具有显著有益的作用，而与任何其他处理方法无关。在Kaplan-Meier分析中，有10–20％的小鼠生存时间延长(图24，图26和图27)，并且减轻了肝脏和骨髓中的肿瘤细胞负荷。此外，将ApoCell和RtX联合施用时，具有明显的协同作用，进一步延迟了疾病的发作和进展，并提高了生存。
实施例6：凋亡细胞和CAR-T细胞联合处理对实体瘤模型的影响
目的：检验CAR-T细胞疗法对人腹膜实体瘤模型的影响，并评估凋亡细胞输注对CAR T细胞疗法抗癌作用的任何可能的协同作用。
方法
HeLa-CD19细胞系：表达CD19的HeLa细胞购自ProMab(ProMab，USA，目录号：PM-Hela-CD19)。为了跟踪体内肿瘤的生长，用pLenti-PGK-V5-Luc-Neo(Addgene，USA，质粒#21471)稳定转导HeLa-CD19，并通过流式细胞仪分选出单个克隆，并用500μg/ml G418(Sigma-Aldrich,USA，目录号A1720-1G)作为选择剂培养。该细胞系稳定且连续地在PGK启动子下表达萤火虫luc基因。通过PCR验证基因组整合，通过阳性克隆的流式细胞仪和生物发光成像(BLI)验证表达。
在补充有10％FBS(Gibco，Thermo Fisher Scientific，South America，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号：35050-038)和100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号15140-122)的RPMI1640(Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA，目录号31870-025)中培养细胞，称为“完全培养基”。HeLa-CD19培养基进一步补充了1μg/ml嘌呤霉素(Sigma-Aldrich，USA，目录号P9620)作为标准培养期间的选择性抗生素。
为了进行生物发光成像，给小鼠腹腔注射150mg/kg XenoLightD-荧光素(PerkinElmer，USA，目录号122799)，并用4％异氟烷麻醉。注射后十分钟，使用CaliperIVIS-Kinetics(PerkinElmer，USA)和LivingImage软件v4.2(PerkinElmer，USA)捕获生物发光。
CD19-CAR-T细胞：使用Ficoll梯度从健康供体的外周血中分离出新鲜的单个核细胞(MNC)级分。然后将细胞逐渐冷冻并保存在液氮中直至使用。解冻后，洗涤细胞，并按照制造商的说明分别以1:2的珠:细胞比率装入CD28+CD3+珠(Miltenyi biotech)。然后在300U/ml重组人IL-2(rhIL-2，Peprotech)存在下将细胞孵育3天。在MNC感染前48小时，使用JetPrime试剂(Polyplus，114-01)以2:1的JetPrime：DNA比率用第三代CD19-CAR质粒(CreativeBiolabs)转染293个Lenti-X细胞(Clontech-Takara，632180)。感染前24小时，未处理的24孔板(SPL，BN30006)根据制造商的说明书用7.5ug/cm2的Retronectin(Takara-Clontech，T100A)包被。在感染当天，使用0.45um过滤器(Millipore)过滤从转染的293Lenti-X细胞中收集的含病毒上清液，并根据制造商说明转移至包被Retronectin的平板中(每孔0.75ml病毒上清液)。然后将活化的T细胞添加到平板中(每孔0.5x106个细胞)，并以290g离心。然后将板在潮湿的培养箱中孵育60小时。孵育后，收集细胞，使用胰蛋白酶分离残留的贴壁细胞。将细胞用补充有2.5％Hepes缓冲剂(Lonza)的Hank平衡盐溶液(HBSS，Biological industries)洗涤两次。将细胞在300U/ml rhIL-2的存在下重新接种，并每48小时用含有300U/ml rhIL-2的新鲜培养基稀释至1.0x106的浓度。感染后第12天，分别用CD28+CD3+珠分别以1:2的珠:细胞比率活化细胞。将细胞再孵育两天，然后在感染后第14天(以RPMI方式)注射到动物中，每只动物总共10x106个细胞。用没有抗CD19区的质粒制备Mock-T细胞(Mock-T)作为CAR-T细胞，并注射作为对照。PCR和EGFR(Erbitux，Merck)表达用于转导功效。体外细胞毒性测定用于CAR T细胞的功能性测试。
凋亡细胞：通过白细胞分离术从健康的合格的人类供体中收集单个核富集的细胞级分，并通过如本文实施例1中提供的方法和如本文中产生的经γ辐照的凋亡细胞(2000-6000rad辐照)进行制备。在该实例中使用的被辐照的凋亡细胞被认为是“架上的(over theshelf)”(OTS)，其中供体和受体不一定是HLA匹配的。在一些实施方案中，对于本文使用的方法，供体和受体HLA不匹配。在一些实施方案中，对于本文使用的方法，供体和受体是HLA匹配的。如本文所述，使用膜联蛋白V和PI染色(MBL，MA，USA)确定凋亡细胞的凋亡和生存力。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色和珠刺激显示缺乏增殖。
CFSE染色：用RPMI 1640使细胞达到终浓度10x106细胞/mL，并在室温(RT)用5μMCFSE染色10分钟，并轻轻倾斜以避开光线。在孵育结束时间之后，用完全的FBS使染色停止反应1分钟。然后将细胞洗涤两次以去除过量的CFSE染料。
细胞接种：用培养基(RPMI1640和Biotarget，补充由2mML-谷氨酰胺，10mM Hepes，10％热失活的FBS和100U/mL重组人IL-2)使细胞浓度达到1x106个细胞/mL。然后将细胞以1:3的细胞:珠的比率接种到24孔板中，每孔1mL，含或不含CD3+CD28+负载珠。将平板在存在5％CO2的培养箱中(Enlivex设备号ENX01051)进行培养。
样品分析：每48小时，通过流式细胞仪对每种制备物进行取样、计数和分析，以获取细胞数和CFSE染色。用培养基将浓度超过1.5×106个细胞/mL的制备物稀释至1×106个细胞/mL。用培养基更新液处理不超过1.5x106个细胞/mL的制备物(弃去0.3mL的培养基并添加新鲜的培养基)。整个8天共进行了4个测试点。
FACS亚群分析：通过流式细胞仪(LSR-II，BD)评估腹膜细胞的以下标记物和同种型对照：mMHC-II-PE(12-5321)、mCD19-FITC(11-0193)、mCD11c-PE-Cy5.5(35-0114)、mF4/80-eFlour450(48-4801)、mCD11b-APC-eFlour780(47-0112)、rIgG2b-PE(12-4031)、rIgG2a-FITC(11-4321)、亚美尼亚仓鼠IgG-PE-Cy5.5(35-4888)、rIgG2a-eFlour450(48-4801)、rIgG2b-APC-eFlour780(47-4031)、hCD19-APC(17-0198)和mIgG1-APC(17-4714)(eBiosciences)。巨噬细胞亚群的表征根据Ghosn(PNAS 2010)February 9,2010.107(6)2568-2573和Casado et al.(PlosOne 2011)published July 22,2011进行。
简而言之，将非CD19、非CD11c腹膜细胞按其CD11b和F4/80的表达分为大腹膜巨噬细胞(LPM)–F4/80高CD11bpos、小腹膜巨噬细胞(SPM)–F4/80低CD11bpos和粒细胞(Gra)–F4/80低CD11bneg(Ghosn等(2010同上)。Casado等(2011同上)描述相同的巨噬细胞亚群但略有不同–非CD19、非CD11c、F4/80阳性细胞被其MHC-II和F4/80表达分为LPM–F4/80高MHC-IIneg、SPM-F4/80低MHC-IIpos、Gra-F4/80低MHC-IIneg。
Figure BDA0002380874480001021
细胞因子分析：通过Luminex细胞因子分析测试了人类或小鼠的细胞因子。定制多重试剂盒购自eBioscience(Vienna,Austria)或R&D Systems(Minneapolis,USA)。
对于腹膜内实体瘤模型，在实验的第1天和第2天给SCID-Bg小鼠腹膜内(ip)注射连续2剂的0.25x106个人HeLa-CD19-荧光素酶细胞。在第9天，小鼠还接受了10×106个人凋亡细胞(如上所述，2000-6000rad辐照)或媒介物。在第10天使用10x106 CD19-CAR-T(第三代)细胞或Mock-T细胞。每周对小鼠称重两次，每天监测其临床体征和腹膜积液。在一些实验中，进行预先牺牲以表征细胞和巨噬细胞亚群谱。保留其余小鼠用于生存分析。生存终点是根据严重腹膜积液的分数定义的，表现为腹部增大和紧张、活动性降低或呼吸运作增加。这些临床发现与腹膜中HeLa细胞的大量积累有关。生存分析根据Kaplan-MeierLogrank统计检验进行。
结果
在该模型中，小鼠生存约30±5天(27-37天)，死于腹膜腔内实体瘤的形成以及随后血性腹膜液积聚和临床恶化。模拟处理显示实体瘤无显著改善或小鼠生存无显著变化(34±4天；范围30-38)。单独的CAR T细胞疗法可将小鼠生存显著改善至55±11(范围34-76，p<0.05)。但是，当小鼠接受凋亡细胞和CAR T细胞的共同施用时，与单独的CAR T细胞相比，生存进一步显著提高，达到70±20天(范围48-90，P<0.05)。此外，2/10小鼠在150天内无病(实验结束)。图12A(代表5个独立实验)显示了在对照和处理条件下腹膜实体瘤Hela-CD19的生存曲线。图12B示出了通过体内成像系统(IVIS)可视化的肿瘤进展，代表了用于图12A的生存曲线的结果。最早在第15天即可看到肿瘤的扩散情况(Hela-CD19-Luc)，而用CAR处理的小鼠直到第43天才显示出任何肿瘤扩散。当小鼠获得凋亡细胞时，大多数小鼠直到第50天才显示出肿瘤扩散，并且肿瘤尺寸(见相关比例尺)明显更小，如生存曲线所反映(图12A)。
如所讨论的，嵌合抗原R受体(CAR)T细胞疗法是一种新颖且创新的免疫疗法。CAR-T细胞是经过基因工程改造的T细胞，带有MHC独立的特异性抗原受体和共刺激分子，可以活化对癌症特异性抗原的免疫应答。该疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出了优异的疗效，但在血液系统和非血液系统的实体瘤中均无法达到相似的疗效。失败的可能原因可能是缺乏抗原、运输不畅以及敌对的肿瘤微环境。在此，证明了CAR T细胞疗法对SCID小鼠的人腹膜实体瘤模型的作用，其中凋亡细胞输注对CAR T细胞疗法的抗癌作用具有协同作用。
尽管本文中已图示和描述了本文中公开的某些特征，但本领域技术人员现在将想到许多修改、替换、改变和等同物。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本文所公开的真实精神内的所有此类修改和改变。

Claims (28)

1.一种治疗、预防对象中的癌症或肿瘤，抑制对象中的癌症或肿瘤的生长，延缓疾病进展，降低肿瘤负荷，或降低对象中的癌症或肿瘤的发病率或其任意组合的方法，其包括给所述对象施用包含早期凋亡细胞群的组合物的步骤，其中与未施用早期凋亡细胞群的对象相比，所述方法治疗、预防所述对象中的癌症或肿瘤，抑制所述对象中的癌症或肿瘤的生长，延缓疾病进展，降低肿瘤负荷，或降低所述对象中的癌症或肿瘤的发病率，或降低最小残留疾病、增加缓解、增加缓解持续时间、降低肿瘤复发率、防止所述肿瘤或所述癌症的转移、或降低所述肿瘤或所述癌症的转移率或其任意组合。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症或肿瘤的尺寸或生长速率或其组合降低，或者其中所述对象的生存增加，或其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述早期凋亡细胞群包含
a.单个核富集的细胞群；或
b.稳定超过24小时的凋亡群；或
c.缺乏细胞聚集的凋亡群；或
d.单个核凋亡细胞群，其包含的非静止非凋亡活细胞降低，任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制，或任何活的非凋亡细胞的增殖减少，或其任意组合；或
其任意组合，
或其中所述早期凋亡细胞群包含早期凋亡细胞的合并群。
4.权利要求1的方法，其中所述对象是人类对象。
5.权利要求1的方法，其中所述癌症或肿瘤包含实体瘤或非实体瘤，或其中所述癌症或肿瘤包含癌症或肿瘤的转移。
6.权利要求5的方法，其中所述非实体癌症或肿瘤包括造血系统恶性肿瘤、血细胞癌、白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病，或者其中所述实体瘤包括肉瘤或癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing’s瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌或肿瘤、乳腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、前列腺癌或肿瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、宫颈癌或肿瘤、子宫癌或肿瘤、睾丸癌或肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
7.权利要求1的方法，其中所述施用包括单次输注所述早期凋亡细胞群，或者其中所述施用包括多次输注所述凋亡细胞群。
8.权利要求1的方法，其进一步包括给所述对象施用另外的免疫疗法、化学治疗剂或免疫调节剂或其组合，其中在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后施用所述另外的免疫疗法、化学治疗剂或免疫调节剂。
9.权利要求8的方法，其中所述免疫疗法包括施用CAR T细胞。
10.权利要求9的方法，其中与施用CAR T细胞且不施用早期凋亡细胞的对象相比，所述方法提高了所述CAR T细胞的功效。
11.权利要求8的方法，其中所述免疫调节剂包含抗体或其功能片段。
12.权利要求11的方法，其中所述抗体或其功能片段包含利妥昔单抗(RtX)抗体或其功能片段。
13.权利要求1的方法，其中所述方法包括一线疗法或辅助疗法。
14.一种单个核凋亡细胞群，其包含早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述单个核凋亡细胞群包含的：
(a)非静止非凋亡活细胞的百分比降低；
(b)任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或
(c)任何活的非凋亡细胞的增殖减少；
或其任意组合。
15.权利要求14的群，其中所述非静止非凋亡活细胞的降低的百分比小于10％，或其中所述单个核凋亡细胞群不包含活的非凋亡细胞。
16.权利要求14的群，其中所述单个核细胞群选自：淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。
17.权利要求14的群，其中在产生早期凋亡细胞之后辐照所述单个核凋亡细胞群。
18.权利要求17的群，其中所述辐照包含γ辐照、X射线辐照或UV辐照。
19.权利要求17的群，其中与未辐照的凋亡细胞群相比，经辐照的细胞群包含每群百分比降低的非静止非凋亡细胞。
20.一种药物组合物，其包含权利要求14的群和药学上可接受的赋形剂。
21.一种产生单个核凋亡细胞群的方法，所述单个核凋亡细胞群包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合，所述方法包括以下步骤：
(a)获得外周血单个核富集的细胞群；
(b)将所述单个核富集的细胞群在包含抗凝剂的冷冻介质中冷冻；
(c)使所述单个核富集的细胞群解冻；
(d)在包含最终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂的凋亡诱导孵育介质中孵育所述单个核富集的细胞群；
(e)将所述单个核富集的细胞群在施用介质中重悬；以及
(f)使所述单个核富集的细胞群失活，其中所述失活在步骤(e)后发生，
其中所述方法产生单个核凋亡细胞群，其包含的非静止非凋亡活细胞的百分比降低；任何活的非凋亡细胞的细胞活化受抑制；或任何活的非凋亡细胞的增殖减少；或其任意组合。
22.权利要求21的方法，其中所述失活步骤包括在所述单个核凋亡细胞制备物内降低非静止非凋亡细胞的百分比，抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或减少任何活的非凋亡细胞的增殖，或其任意组合。
23.权利要求21的方法，其中所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至约10％，或其中所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至约0％。
24.权利要求21的方法，其中所述单个核富集的细胞群选自淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。
25.权利要求21的方法，其中所述孵育持续约2-12小时。
26.权利要求21的方法，其中所述步骤(f)使所述单个核富集的群失活包括抑制或消除免疫应答，抑制或消除细胞的交叉反应性，或降低或消除T细胞受体活性，并且其中所述群包含百分比降低的非静止非凋亡活细胞；细胞活化抑制的任何活的非凋亡细胞；或增殖减少的任何活的非凋亡细胞；或其任意组合，或其中所述步骤(f)失活包括辐照步骤(e)中产生的单个核富集的凋亡细胞群。
27.权利要求26的方法，其中所述辐照包括γ辐照、X射线辐照或UV辐照。
28.权利要求26的方法，其中所述辐照包括大约10-80格雷单位(Gy)。
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