KR20060061350A - 골다공증 진단 및 치료 - Google Patents

골다공증 진단 및 치료 Download PDF

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케니스 콜만
폴 마타
고돈 더블유. 더프
다이크 시몬 반
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인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명에는 대상자의 IL-1 반수체형 및 유전형 패턴의 동정에 기초로 한 골다공증의 진단 및 치료가 기재되어 있다.
골다공증, IL-1 반수체형, IL-1 유전형, IL-1 대립 유전자, IL-1A, IL-1B, IL-1RN

Description

골다공증 진단 및 치료{DIAGNOSTIC AND THERAPEUTICS FOR OSTEOPOROSIS}
본 발명은 일반적으로 골다공증 발현 또는 골다공증 관련 증상 또는 질환의 발현에 대한 유전적 소인을 갖고 있는 대상자를 동정하는 방법에 관한 것이다.
1993년, MD 후에 미국 국립 보건원 (NIH: National Institutes of Health)의 국장이었던 버나딘 힐리 (Bernadine Healy)는 골다공증을 "여성의 주요 질환 중 하나"로 꼽았다. 골다공증 골절 후 합병증은 65 세를 넘는 여성들의 주요 사망 원인 중 심장 질환, 암 및 뇌졸중 다음으로 네 번째이다. 이는 미국에서 장해의 주요 원인이고, 고관절 골절의 가장 흔한 원인이다.
2천 5백만 명의 미국인들이 골다공증을 앓고 있으며, 이들 중 85 %가 여성이다. 에스트로겐 손실로부터 유래하는 폐경 후 골다공증인 타입 1 골다공증은 모든 65 세를 넘는 여성들 중 반이 넘은 여성들에게 영향을 미치고, 75 세를 넘는 여성들 중 90 %에서 검출되었다. 엄격하게 연령과 관련이 있는 타입 II 또는 노인성 골다공증은 통상 70 세를 넘는 남성 및 여성 양쪽 모두에 영향을 미친다. 남성 및 여성 양쪽 모두에 영향을 미치는 가장 최근 분류된 타입 III는 골 손실을 가속화하는 것으로 알려진 예를 들면, 장기 스테로이드 요법에 의한 약물 유발성이다. 장기 스테로이드 요법을 받는 환자군은 천식 (미국에서는 18 세를 넘는 연령대에 7 백만), 뿐만 아니라 류머티스성 관절염 또는 다른 자가면역 질환을 갖는 환자를 포함한다. 타입 IV는 내재하는 질환, 예를 들면 류머티스성 관절염 (인구 중 1-2 %)에 의해 유발된다.
골다공증은 의료적, 사회적 및 요양 비용으로 100억 달러의 비용이 드는 장해를 일으키는 1.5 백만의 골절 다수를 담당한다. 심지어 최상의 치료 하에서도, 65 세 이상의 환자 중 40 %는 고관절 골절 후 2년을 생존하지 못한다.
1991년, 세 명의 미국인 여성 중 한 명은 50 세 이상이었다. 1996년에는 베이비붐 세대가 이 연령군에 속하게 된다. 현 추세를 따르면 평균적인 여성들은 폐경 후에도 30 년을 살기 때문에, 골다공증 위협은 현대의 가장 큰 건강상 위협들 중 하나가 된다.
생활 양식은 골다공증의 발병의 요인일 수 있고, 특히 골다공증을 예방하는 건강한 골 질량을 형성하고 유지하는 데 중요한 인자일 수 있다. 현재, 65 세 미만의 사람들은 그들의 부모보다 앉아서 일하는 생활 양식, 나쁜 식습관, 증가된 알코올 및 카페인 섭취, 및 골 손실과 관련된 더 많은 약물 치료 이력을 갖기 쉽다. 또한, 골다공증의 발현에 대한 유전적 소인이 존재한다는 것도 분명하다 (골다공증의 유전적 요인 논의에 대해 WO 94/03633을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용됨).
따라서, 골다공증 발현의 위험이 가장 큰 개인들을 조기에 찾아내어 이러한 개인들에게 적절한 생활 양식으로 바꾸거나 또는 다른 치료적 개입을 개시하도록 권고할 수 있는 것이 유용할 것이다. 예를 들면, 칼슘 보충 및 운동은 중요한 조기 연령 윈도우 동안 사용되는 경우 유익한 예방 인자인 것으로 밝혀졌다. 또한, 호르몬 대체 요법 (HRT)은 폐경 후 골다공증 발생과 싸우도록 성공적으로 사용되었다. HRT를 주요 골 손실이 발생하기 전 질환 과정 조기에 사용하는 경우 가장 크게 이익을 얻을 수 있다. HRT는 잠재적으로 심각한 부작용을 갖기 때문에, HRT 대 골다공증 발현의 위험을 감소시키는 것을 목표로 하는 다른 개입들의 사용에 관하여 결정하는 경우, 여성들이 골다공증에 대한 그들의 개인적인 위험 수준을 아는 것이 유용할 것이다.
하기 공개된 특허 출원들은 골다공증을 진단, 모니터링 및/또는 치료하는 다양한 방법들을 기재하고 있다: WO 94/20615, WO 95/01995, WO 94/14844, EP 93113604, WO/8809457, W0 93/11149 및 WO/9403633. 하기 참고 문헌들은 골다공증에서 다양한 IL-1 유전자 다형성 (polymorphism)의 관련성을 기재하고 있다: 미국 특허 제 5,698,399호; 문헌[Eastell, R. et al., (1998) Bone 23 (5S): S375; Eastell, R. et al. and Keen, RW et al., (1998) Bone 23: 367-371].
IL-1 유전자 클러스터 (cluster)의 유전적 특징
IL-1 유전자 클러스터는 염색체 2 (2q13)의 긴 아암 (arm) 상에 존재하고, 430 Kb의 영역 내에 적어도 IL-1α (IL-1A), IL-1β (IL-1B) 및 IL-1 수용체 길항제 (IL-1RN)에 대한 유전자들을 함유한다 (문헌[Nicklin, et al. (1994) Genomics, 19: 382-4] 참조). 작동제 분자인 IL-1α 및 IL-1β는 강력한 염증 후 활성을 갖고, 많은 염증 케스케이드의 헤드에 존재한다. 종종 다른 시토킨들, 예를 들면 IL-6 및 IL-8의 유도를 통한 그들의 작용은 백혈구의 활성화 및 손상된 조직으로의 동 원, 혈관 작용제의 국부 생산, 뇌에서의 고열 반응 및 간 급성 병기 반응을 일으킨다. 세 가지 모두의 IL-1 분자들은 타입 I IL-1 수용체 및 타입 II IL-1 수용체에 결합하지만, 오직 타입 I 수용체만이 신호를 세포의 내부로 형질도입시킨다. 반대로, 타입 II 수용체는 세포막으로부터 탈락되고 유인 수용체로서 작용한다. 따라서, 상기 수용체 길항제 및 타입 II 수용체 양쪽 모두는 그들의 작용에서 항염증성을 갖는다.
IL-1의 부적절한 생산은 류머티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선 등을 비롯한 많은 자가면역 및 염증 질환의 병리학에서 중점적인 역할을 한다. 또한, IL-1의 생산율에는 안정적인 개인차가 존재하고, 이러한 일부 변화는 IL-1 유전자 유전자좌에서 유전적 차이에 의해 설명될 수 있다. 따라서, IL-1 유전자는 대부분이 다유전자성 성분을 갖는 다수의 발병원인을 갖는 염증 질환에 대한 유전적 감수성의 일부를 결정하는 데 합당한 후보이다.
IL-1 유전자 클러스터로부터의 특정한 대립 유전자들이 특정 질환 상태와 관련된 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, IL-1RN (VNTR) 대립 유전자 2 (미국 특허 제 5,698,399호 참조) 및 IL-1RN (VNTR) 대립 유전자 1 (문헌[Keen RW et al., (1998) Bone 23: 367-371] 참조)은 골다공증과 관련된 것으로 보고되었다. 또한, IL-1RN (VNTR) 대립 유전자 2는 당뇨병에서의 신증 (문헌[Blakemore, et al. (1996) Hum. Genet. 97 (3): 369-74] 참조), 원형 탈모증 (문헌[Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104 (5 Supp.): 15S-16S; Cork et al. (1996) Dermatol Clin 14: 671-8] 참조), 그레이브씨병 (문헌[Blakemore, et al. (1995) J. Clin. Endocrinol. 80 (1): 111-5] 참조), 전신 홍반성 루푸스 (문헌[Blakemore, et al. (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85] 참조), 경피성 태선 (문헌[Clay, et al. (1994) Hum. Genet. 94: 407-10] 참조) 및 궤양성 직장염 (문헌[Mansfield, et al. (1994) Gastoenterol. 106 (3): 637-42] 참조)과 관련된 것으로 보고되었다.
또한, 마커 (marker)-889로부터의 IL-1A 대립 유전자 2 및 마커 +3954로부터의 IL-1B (TaqI) 대립 유전자 2는 치주 질환과 관련된 것으로 발견되었다 (미국 특허 제 5,686,246호; 문헌[Kornman and di Giovine (1998) Ann Periodont 3: 327-38; Hart and Kornman (1997) Periodontol 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend Contin Educ Dent 18: 881-4; Kornman et al. (1997) J. Clin Periodontol 24: 72-77] 참조). 또한, 마커-889로부터의 IL-1A 대립 유전자 2는 연소기 만성 관절염, 특히 만성 홍채모양체염과 관련된 것으로 발견되었다 (문헌[McDowell, et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28] 참조). 또한, IL-1B의 마커 +3954로부터의 IL-1B (TaqI) 대립 유전자 2는 DR3/4 환자에서 건선 및 인슐린 의존성 당뇨병과 관련된 것으로 발견되었다 (문헌[di Giovine, et al. (1995) Cytokine 7: 606; Pociot, et al. (1992) Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402] 참조). 또한, IL-1RN (VNTR) 대립 유전자 1은 당뇨 망막병증과 관련된 것으로 발견되었다 (USSN 09/037472 및 PCT/GB97/02790 참조). 나아가, IL-1RN (VNTR)의 대립 유전자 2는 북미 및 유럽으로부터의 카프카스인에서의 궤양성 직장염과 관련된 것으로 발견되었다 (문헌[Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42] 참조). 흥 미롭게도, 이 관련성은 특히 인종적으로 관련된 아시케나지 유태인 (Ashkenazi Jews)의 집단 중에서 강하다 (PCT W097/25445).
유전형 스크리닝
유전성 질환의 통상적인 스크리닝 방법은 비정상 유전자 생성물 (예를 들면, 낫 세포 빈혈증) 또는 비정상 표현형 (예를 들면, 정신 지체)의 동정에 의존해왔다. 이들 방법은 후기 발병을 갖는 유전성 질환 및 용이하게 동정할 수 없는 표현형, 예를 들면 혈관 질환에 대해서는 사용이 제한된다. 간단하고 저렴한 유전적 스크리닝 방법론을 개발함으로써, 현재 심지어 질환이 다유전자성 기원인 경우에도 질환을 발현하는 성향을 나타내는 다형성을 찾는 것이 가능하다. 다인성 장애의 유전적 기초에 대한 이해가 증가되면서 분자 생물학적 방법에 의해 스크리닝될 수 있는 다수의 질환은 계속 증가하고 있다.
유전적 스크리닝 (또한, 제노타이핑 (genotyping) 또는 분자 스크리닝으로도 불림)은 환자가 질환 상태를 유발하거나 또는 질환 상태를 유발하는 돌연변이와 "연관"된 돌연변이 (대립 유전자 또는 다형성)를 갖는지 여부를 결정하는 시험으로 넓게 정의될 수 있다. 연관은 게놈 중에 함께 근접한 DNA 서열들이 함께 유전되는 경향을 갖는 현상을 지칭한다. 두 서열은 공-유전 (co-inheritance)의 일부 선택적 이점으로 인해 연관될 수 있다. 그러나, 더욱 전형적으로는, 두 다형성 사이의 영역 내에서 감수분열 재조합 사건이 일어나는 빈도가 상대적으로 적기 때문에 두 다형성 서열은 공-유전된다. 공-유전된 다형성 대립 유전자는 지정된 인간 집단에서, 함께 발생하거나 또는 집단 중 임의의 특정 구성원에서 전혀 발생하지 않는 양쪽 모두의 경향이 있기 때문에 서로 연관 비평형 (linkage disequilibrium)에 있다고 일컬어진다. 실제로, 지정된 염색체 영역에서 다중 다형성이 서로 연관 비평형에 있는 것으로 발견되는 경우, 유사-안정성 유전자 "반수체형"이라 정의한다. 반대로, 두 다형성 유전자좌 사이의 재조합 사건 발생은 이들이 별개의 상동 염색체로 분리되게 한다. 두 물리적으로 연관된 다형성 간의 감수분열 재조합이 충분히 빈번하게 발생하는 경우, 두 다형성은 독립적으로 분리된 것으로 보일 것이고, 이를 연관 평형 (linkage equilibrium)이라 일컫는다.
두 마커 사이의 감수분열 재조합의 빈도는 일반적으로 염색체 상의 이들 간의 물리적 거리에 비례하며, "핫 스폿 (hot spot)", 뿐만 아니라 억제된 염색체 재조합 영역의 발생은 두 마커 사이의 물리적 거리와 재조합 거리 사이의 불일치를 초래할 수 있다. 따라서, 특정한 염색체 영역에서, 넓은 염색체 도메인에 이르는 다중 다형성 유전자좌는 서로 연관 비평형에 있을 수 있기 때문에, 넓은 간격 (broad-spanning) 유전자 반수체형을 정의할 수 있다. 나아가, 질환 유발 돌연변이가 반수체형과의 연관 내 또는 연관 중에서 발견되는 경우, 반수체형 중 하나 이상의 다형성 대립 유전자는 질환의 발현 가능성의 진단 또는 예후 지표로서 사용될 수 있다. 질환 돌연변이가 최근에 발생하여 재조합 사건을 통해 평형이 달성되기에 충분한 시간이 경과하지 않은 경우, 이러한 양호한 다형성과 질환 유발 다형성 사이에 관련성이 발생할 수 있다. 따라서, 질환 유발 돌연변이적 변화에 이르거나 또는 이와 연관된 인간 반수체형의 동정은 개인의 질환 유발 돌연변이가 유전되었을 가능성의 예측 척도로서 작용한다. 중요하게는, 이러한 예후 또는 진단 절차는 실 제 질환 유발 환부의 동정 및 단리를 필요로 하지 않으면서 사용될 수 있다. 이는 특히, 다인성 질환, 예를 들면 염증 장애의 경우, 질환 과정과 관련된 분자 결손의 정확한 결정이 어려울 수 있고 노동력을 요하기 때문에 중요하다.
실제로, 염증 장애와 IL-1 다형성 간의 통계적 상관성은 반드시 다형성이 장애를 직접 유발하는 것이라 시사하지는 않는다. 오히려, 상관된 다형성은 최근 인간 진화에서 발생하여 개입 염색체 절편에서 재조합 사건을 통해 평형이 달성되기에 충분한 시간이 경과하지 않은 장애 유발 돌연변이와 연관된 (즉, 연관 비평형된) 양호한 대립 유전자 변이체일 수 있다. 따라서, 특정 질환에 대한 진단 및 예후 분석시험을 목적으로, 그 질환과 관련된 다형성 대립 유전자의 검출은 다형성이 질환의 병인과 직접적으로 연관되는지 여부에 대해 고려할 필요없이 사용될 수 있다. 나아가, 지정된 양호한 다형성 유전자좌가 분명한 질환 유발 다형성 유전자좌와 연관 비평형되어 있는 경우, 양호한 다형성 유전자좌와 연관 비평형되어 있는 또 다른 다형성 유전자좌들도 질환 유발 다형성 유전자좌와 연관 비평형될 가능성이 높다. 따라서, 이러한 다른 다형성 유전자좌들도 질환 유발 다형성 유전자좌가 유전되었을 가능성의 예후 또는 진단제이게 된다. 실제로, 특정 질환 또는 상태와 대응하는 인간 반수체형 사이에서 관련성을 이끌어낸 후 넓은 간격 인간 반수체형 (연관된 다형성 마커의 세트의 대립 유전자의 공-유전의 전형적 패턴을 설명함)을 진단 목적에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, 반드시 원인이 되는 유전자 변이를 결정하거나 또는 특성화할 필요없이 하나 이상의 질환 관련 다형성 대립 유전자 (또는 심지어 하나 이상의 질환 관련 반수체형)를 특성화함으로써 개인의 특정 질환 또는 상태 발현 가능성을 결정할 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 골다공증 발현 또는 골다공증 관련 증상 또는 질환의 발현에 대한 위험이 높은 대상자를 동정하는 유전적 소인 시험을 제공한다. 특히, 본 발명은 폐경 동안 골다공증 발현 관련된 척추 골절에 대한 위험이 높은 여성을 동정하는 유전적 소인 시험을 제공한다.
한 측면에서, 대상자에서 골다공증 발현의 존재, 부재 또는 그 발현에 대한 소인은 대상자에서 골다공증 관련 유전형을 검출함으로써 결정된다. 유전형의 존재는 대상자가 골다공증 발현을 갖거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있다는 것을 시사한다. 반대로, 유전형의 부재는 대상자가 골다공증 발현을 갖지 않거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있지 않다는 것을 시사한다. 골다공증 관련 유전형의 존재를 검출하고 골다공증을 보상하는 치료제를 대상자에게 투여함으로써 대상자에서 골다공증의 증상이 완화되거나 또는 골다공증의 발현이 제공된다. 골다공증의 증상은 예를 들면, 약해진 척추, 야간 하지 경련, 골통 및 압통으로 인한 신장 손실, 목 통증, 상해 또는 외상으로 인한 것 외의 목의 불편함, 척추 또는 허리 근육의 지속통, 복통, 치아 손실, 늑골 통증, 골절상, 구부정한 자세와 같이 분명해진 척추 변형, 등의 척추 함몰의 결과로 척추의 상부에서 밖으로 향하는 곡선, 피로, 치주 질환 또는 깨지기 쉬운 손톱을 포함한다. 골다공증은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 골 무기질 밀도에 의해 결정된다. 예를 들면, 특정 환자에서의 골 무기질 밀도 (BMD)를 25 세 여성들의 값과 비교한다. 25 세 여성에 대한 평균 아래에 속하는 BMD 값 (통계적으로 평균 아래의 2.5 표준 편차로서 언급됨)을 "골다공증"으로 진단한다. 환자가 정상 25 세 여성 미만의 BMD 값을 갖지만, 평균 아래의 2.5 표준 편차가 아닌 경우, 뼈를 "골감소증"이라 일컫는다 (골감소증은 골 무기질 밀도가 감소되었지만 골다공증만큼 심각하지 않은 것을 의미함).
골다공증 관련 유전형으로는 예를 들면, (a) IL-1A (+4845)에서의 유전형 2.2, IL-1B (-511)에서의 유전형 1.1 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.1; (b) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 2.2; 또는 (c) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.2가 있다.
또 다른 측면에서, 대상자에서 골다공증 발현의 존재, 부재 또는 그 발현에 대한 소인은 대상자에서 골다공증 관련 대립 유전자를 검출함으로써 결정된다. 대립 유전자의 존재는 대상자가 골다공증 발현을 갖거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있다는 것을 시사한다. 반대로, 대립 유전자의 부재는 대상자가 골다공증 발현을 갖지 않거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있지 않다는 것을 시사한다. 골다공증 관련 대립 유전자로는 예를 들면, IL-1RN (+2018) 대립 유전자, IL-1A (+4845) 대립 유전자 및 IL-1B (-511)가 있다. 한 개, 두 개, 세 개 이상의 대립 유전자가 검출된다. 예를 들면, IL-1B (-511) 및 IL-1RN (+2018)이 검출된다. 별법으로, IL-1A (+4845) 대립 유전자 및 IL-1RN (+2018)이 검출된다. 대상자는 대립 유전자에 대해 동질접합성이다. 별법으로, 대상자는 대립 유전자에 대해 이질접합성이다. 대상자는 여성이다. 대상자는 60 세가 넘는다. 예를 들면, 대상자는 65-90 세이다. 대상자는 호르몬 대체 요법을 사용하지 않았다.
골다공증 관련 유전형 또는 대립 유전자는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출된다. 예를 들면, 유전형 또는 대립 유전자는 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 크기 분석, 시퀀싱(sequencing), 혼성화, 5' 뉴클레아제 소화, 단일 가닥 형태 다형성 (single-stranded conformation polymorphism), 대립 유전자 특이적 혼성화, 프라이머 특이적 연장 또는 올리고뉴클레오티드 라이게이션 (ligation) 분석시험에 의해 검출된다. 임의적으로, 검출 전 또는 검출과 함께, 핵산 샘플을 증폭 단계로 처리한다
또한, 골다공증 발현의 존재, 부재 또는 그 골다공증 발현에 대한 감수성을 결정하는 키트가 본 발명에 포함된다. 키트는 5' 또는 3'을 IL-1A (+4845) 대립 유전자, IL-1B (-511) 대립 유전자 또는 IL-1RN (+2018) 대립 유전자에 혼성화하는 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 1000, 500, 250, 150, 100, 50, 25, 15, 10 개 이하인 뉴클레오티드이다. 임의적으로, 키트는 3' 또는 5' 각각을 대립 유전자에 혼성화하여 대립 유전자가 증폭되게 하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 다양한 측면에서, 키트는 검출 수단, 증폭 수단 또는 대조군을 함유한다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으며, 적합한 방법 및 물질을 이하 기재한다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 문헌들은 그들의 전문이 참조 문헌으로 인용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 이를 조절할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 오직 예시를 위한 것이며 이에 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 두 상이한 유전자 반수체형 패턴을 나타내는 도해이다.
도 2는 골다공증성 비척추 골절의 위험을 나타내는 그래프이다.
도 3은 골다공성 고관절 골절의 위험을 나타내는 그래프이다.
도 4는 골다공성 손목 골절의 위험을 나타내는 그래프이다.
도 5는 비척추 골절의 위험을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 관한 상세한 설명
본 발명은 골다공증 발현 또는 골다공증 발현 관련된 증상 또는 질환, 예를 들면 척추 골절의 증가된 위험과 관련된 유전형의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 폐경 동안 또는 폐경 후 골다공증 발현 관련 척추 골절 위험이 증가된 여성을 찾는 유전적 소인 시험을 제공한다.
본 명세서에서 유전적 분석은 그 중에서도, 인터루킨-1A (IL-1A), 인터루킨-1B (IL-1B) 및 인터루킨-1RN (IL-1RN) 유전자의 특정한 대립 유전자, 뿐만 아니라 비타민 D 수용체 (VDR), 콜라겐 1A1 (COL1A1), 에스트로겐 수용체 (ER) 및 부갑상선 호르몬 수용체 (PTHR) 유전자의 대립 유전자를 비롯한 유전자 다형성의 발현과 상관된 증가된 척추 변형의 관련성에 대해 수행된다. 폐경기 후 여성에서 유전자 다형성을 조사함으로써 골절의 발현 및 골 무기질 밀도 감소율에 대한 유전적 영향의 조사는 예방 요법을 표적화하기 위해 고 위험의 개인을 찾는 유전적 시험 사용의 임상적 유용성을 평가하는 데 유용하다.
이 연구의 한 목표는 다양한 유전자에서의 특이적 변이를 여성이 폐경 후 척추 골절을 경험할 위험을 예측하는 데 사용할 수 있는지 결정하는 것이다. 연구된 한 특이적 유전자 족은 IL-1 유전자 족이다. IL-1 유전자의 골 대사 및 폐경기 후 골절 위험 관여에 대한 이론적 설명을 하기 요약한다. 폐경 후 골다공증은 폐경 후 시작되고 폐경의 발병시로부터 15-20 년 이내에 골절을 일으킬 수 있는 골 조직의 진행성 손실에 의해 특성화된다 (2-4). 비록 다른 기여 인자, 예를 들면 골격 성장 "피크 골 질량", 연령 관련 골 손실 및 골 품질도 후속 골절에 대한 위험의 중요한 결정 인자들이지만, 골 흡수에서의 호르몬 의존성 증가 및 폐경 후 첫 5 내지 10 년에서의 가속화된 골 질량 손실이 가장 중요한 병인적 인자인 것으로 보인다 (2-4).
에스트로겐이 골수 및 골 세포에 의한 염증 후 시토킨의 생산을 차단함으로써 골 손실을 예방한다는 점을 시사하는 증거가 존재한다 (3). 다수의 보고들은 자연적 또는 외과 수술적 폐경이 IL-1 및 TNF의 혈액, 골수 및 단구 수치를 증가시킨다는 점을 입증하였다 (2,3). 또한, 시험관내 연구들은 에스트로겐의 이러한 시토킨들의 생산을 억제하는 능력을 입증하였다. 골 미세환경에서 시토킨 생산 증가의 주요 결과는 증가된 파골세포 형성 (osteoclastogenesis)으로 인한 파골세포 풀 (osteoclastic pool)의 연장 및 파골세포 수명의 길이의 증가이다 (3). 또한, 강화된 시토킨 생산은 성숙한 파골세포의 활성을 증가시킨다. 또한, IL-1 및 TNFα는 널리 인식된 골 형성 억제제이다 (2). 더욱이, IL-1 및 TNFα는 파골세포 전구체 세포의 성숙한 파골세포로의 분화를 조절하는 다른 시토킨들, 예를 들면 IL-6, M-CSF 및 GM-CSF의 강력한 유도체이다 (3). 따라서, 파골세포 형성에 대해, IL-1 및 TNFα는 조혈 파골세포 전구체를 자극하는 "하류 인자"의 분리를 유도하는 데 필요한 "상류" 시토킨으로 간주되어야 한다. 이러한 케스케이드 기전은 IL-1 및 TNFα 수치를 소량으로 변화시켜 파골세포 생산을 크게 변화시키도록 보장한다.
IL-1β와 26 % 아미노산 서열 상동성을 갖는 IL-1 수용체 길항제 (IL-Ira)로서 알려진 IL-1의 특이적 내인성 경쟁적 억제제는 IL-1 수용체를 발현하는 세포에 IL-1과 거의 동일한 친화도로 결합하지만, 전체적으로는 IL-1 작동제 활성이 없다 (5).
파골세포 형성 및 파골세포 활성의 IL-1 유도의 특이적 생물학적 증거의 예는 타입 I IL-1 수용체의 발현의 부재로 인해 IL-1에 민감하지 않은 마우스의 보고로부터 비롯된다 (6). 이러한 마우스들은 난소적출술에 의해 유발되는 골 손실에 대해 보호되므로, IL-1 수용체를 통한 IL-1 작용이 뼈 중의 에스트로겐 결핍의 영향의 필수적인 매개체라는 것을 입증한다 (6). 이 연구의 중요한 발견은 IL-1 수용체의 결핍은 겉보기 수술한 (sham-operated) 마우스에서 골 질량을 변화시키지 않으므로, IL-1이 에스트로겐 충만 마우스에서 정상 골 리모델링을 유지시키는 데 필수적이지 않다는 것을 입증하였다는 점이다 (6). 관련 연구에서, 킴벨 (Kimbell) 등 (7)은 IL-1 및 IL-1β의 기능적 활성을 차단하는 IL-1ra의 주입이 에스트로겐의 골 보호 효과 (sparing effect)와 동일한 효과를 갖는다고 보고하였다.
IL-1, IL-1β 및 IL-1ra의 골 대사 관여에 대한 광대한 생물학적 증거는 이들 유전자의 발현을 변화시키는 IL-1 유전자 클러스터 내의 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs)이 존재한다는 가설을 지지한다. IL-1A 및 IL-1B 유전자의 증가된 전사 또는 번역 또는 IL-1RN 유전자 또는 심지어 유전자의 코딩 영역 내의 SNP에 의해 유발되는 단일 아미노산 치환으로 인한 약간 변화된 시토킨 (IL-1, IL-1β 또는 IL-Ira)의 감소된 전사 또는 번역은 정상 골 전환에 필요한 시토킨들의 세밀한 균형을 손상시킬 수 있다. IL-1 및(또는) IL-1β의 과다생산 또는 IL-Ira의 과소생산은 이들 교체 대립 유전자의 담체인 특정한 개인에서 골 흡수 시스템을 활성화시킬 수 있다. IL-1 유전자의 이러한 대립 유전자들의 부정적 효과는 에스트로겐의 IL-1 유전자 발현에 대한 억제 효과의 제거로 인해 폐경 후 특히 명백해질 것이다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부하는 청구 범위에 사용된 특정한 용어 및 구의 의미를 하기에 제공한다.
용어 "대립 유전자"는 상이한 다형성 영역에서 발견되는 상이한 서열 변이체를 지칭한다. 예를 들면, IL-1RN (VNTR)은 5 개 이상의 상이한 대립 유전자들을 갖는다. 서열 변이체는 삽입, 삭제 또는 치환을 포함하며 이에 한정되지 않는 단일 또는 다중 염기 변화일 수 있거나, 또는 가변적 수의 서열 반복일 수 있다.
용어 "대립 유전자 패턴"은 대립 유전자 또는 하나 이상의 다형성 영역에서의 대립 유전자의 동일성을 지칭한다. 예를 들면, 대립 유전자 패턴은 IL-1RN 유전자 유전자좌의 VNTR에서 IL-1RN 대립 유전자 1의 하나 이상의 카피를 갖는 대립 유전자 패턴인 IL-1RN (VNTR) 대립 유전자 1에 대해 다형성 부위에서의 단일 대립 유전자로 이루어질 수 있다. 별법으로, 대립 유전자 패턴은 단일 다형성 부위에서 이질접합성 상태 또는 동질접합성 상태로 이루어질 수 있다. 예를 들면, IL1-RN (VNTR) 대립 유전자 2,2는 동질접합성 IL-RN (VNTR) 대립 유전자 2 상태에 대응하는 IL-1RN의 VNTR 마커에서의 제 2 대립 유전자의 두 카피가 존재하는 대립 유전자 패턴이다. 별법으로, 대립 유전자 패턴은 하나를 초과하는 다형성 부위에서의 대립 유전자의 동일성으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 IL-1 폴리펩티드와 특이적 반응성이 있는 전체 항체 또는 그의 결합 단편을 비롯한 결합제를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체를 통상적인 기술을 사용하여 단편화할 수 있고, 그 단편을 전체 항체에 대해 앞서 설명한 바와 같이 동일한 방식으로 활용을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성되는 F(ab)2 단편을 이황 가교를 감소시키도록 처리하여 Fab 단편을 생산할 수 있다. 또는, 본 발명의 항체는 항체 중 하나 이상의 CDR 영역에 의해 수여되는 IL-1B 폴리펩티드에 대해 친화도를 갖는 이중특이적이고 단일 쇄의 키메라성 인간화 분자를 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 사용할 목적으로 상호교환적으로 사용되는 "생물학적 활성" 또는 "생체 활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 IL-1 폴리펩티드 (그의 고유 변형 또는 변성된 변형이든), 또는 그의 임의의 하위서열 (subsequence)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 수행되는 작동체 또는 항원 기능을 의미한다. 생물학적 활성은 표적 펩티드, 예를 들면, IL-1 수용체에 대한 결합을 포함한다. IL-1 생체 활성은 IL-1 폴리펩티드를 직접 작용시킴으로써 조절될 수 있다. 별법으로, IL-1 생체 활성은 IL-1 폴리펩티드의 수치를 조절함으로써, 예를 들면 IL-1 유전자의 발현을 조절함으로써 조절될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL-1 폴리펩티드의 생체 활성 단편"은 전 길이 IL-1 폴리펩티드의 단편을 지칭하며, 이 단편은 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 모사하거나 또는 길항작용한다. 바람직하게는, 생체 활성 단편은 인터루킨 수용체와 상호작용할 수 있는 단편이다.
폴리펩티드, 예를 들면 IL-1의 활성에 적용되는 용어 "비정상 활성"은 건강한 대상자에서 폴리펩티드의 활성이 다른 야생형 또는 고유 폴리펩티드의 활성과 다른 활성을 지칭한다. 폴리펩티드의 활성은 그의 고유 대응부의 활성보다 강하기 때문에 비정상일 수 있다. 별법으로, 활성은 그의 고유 대응부의 활성에 비해 약하거나 또는 활성이 존재하지 않기 때문에 비정상일 수 있다. 또한, 비정상 활성은 활성이 변할 수 있다. 예를 들면, 비정상 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 IL-1 유전자좌 폴리펩티드를 코딩하는 IL-1 유전자좌 유전자의 과다발현 또는 과소발현으로 인해 비정상 IL-1 활성을 가질 수 있다.
"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 특정 대상자 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어이다. 특정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대들에서 나타날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본 명세서에 사용된 용어의 범위에 포함된다.
"키메라," "모자이크," "키메라성 포유류" 등은 그의 게놈 함유 세포의 적어도 일부에서 녹-아웃 (knock-out) 또는 녹-인 (knock-in) 구조체를 갖는 트랜스제닉 (transgenic) 포유류를 지칭한다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 샘플"은 사용되는 검출 기법에 대해 적절한 임의의 샘플을 지칭한다. 대조군 샘플은 사용되는 대립 유전자 검출 기법 또는 시험되는 물질의 생성물을 함유할 수 있다. 게다가, 대조군은 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 예로써, 대립 유전자 검출 기법이 PCR 증폭 후 크기 분획화인 경우, 대조군 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유사하게, 대립 유전자 검출 기법이 돌연변이된 단백질의 검출을 포함하는 경우, 대조군 샘플은 돌연변이체 단백질의 샘플을 포함할 수 있다. 그러나, 대조군 샘플이 시험되는 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대조군은 게놈 DNA 또는 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분으로 된 샘플일 수 있다. 그러나, 시험되는 샘플이 게놈 DNA인 경우, 대조군 샘플은 바람직하게는 게놈 DNA로 된 고 정제된 샘플이다.
구 "유전자의 붕괴" 및 "표적화된 붕괴" 또는 임의의 유사한 구는 유전자의 야생형 카피에 비해 세포에서 유전자의 발현을 예방하기 위한 고유 DNA 서열의 부위 특이적 단속을 지칭한다. 상기 단속은 유전자 또는 그의 임의의 조합물에 대한 삭제, 삽입 또는 변형에 의해 유발될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "반수체형"은 통계적 유의도 (pcorr < 0.05)에서 군으로서 함께 유전되는 (연관 비평형에 있음) 대립 유전자의 세트를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 구 "IL-1 반수체형"은 IL-1 유전자좌에서의 반수체형을 지칭한다. IL-1 염증 또는 염증 후 반수체형은 증가된 작동제 및(또는) 감소된 길항제 활성을 나타내는 반수체형을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL-1 유전자 클러스터" 및 "IL-1 유전자좌"는 적어도 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자 및 임의의 다른 연관된 서열을 비롯한 염색체 2의 2ql3 영역 또는 근처에서의 모든 핵산을 포함한다 (문헌[Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994] 참조). 본 명세서에 사용된 용어 "IL-1A", "IL-1B", 및 "IL-1RN"은 각각 IL-1α, IL-1β 및 IL-1 수용체 길항제를 코딩하는 유전자를 지칭한다. IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN에 대한 유전자 기탁 번호는 각각 X03833, X04500 및 X64532이다.
"IL-1 기능적 돌연변이"는 표현형을 변환시키는 (즉, IL-1 유전자 또는 단백질의 기능에 영향을 미침) IL-1 유전자 클러스터 내의 돌연변이를 지칭한다. 그 예들은 IL-1A (+4845) 대립 유전자 2, IL-1B (+3954) 대립 유전자 2, IL-1B (+6912) 대립 유전자 2 및 IL-1RN (+2018) 대립 유전자 2를 포함한다.
"IL-1X (Z) 대립 유전자 Y"는 유전자 X (여기서, X는 IL-1A, IL-1B, 또는 IL-1RN이고, 뉴클레오티드 Z (여기서, 뉴클레오티드 Z는 특정 IL-1 유전자 X의 뉴클레오티드 +1인 주요 전사 개시 부위를 기준으로 번호를 매김) 또는 근처에 위치함) 중의 IL-1 유전자좌 다형성 부위에서 발생하는 Y로 명명된 특정 대립 유전자를 지칭한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 "IL-1X 대립 유전자 (Z)"는 뉴클레오티드 Z 또는 근처에 위치한 유전자 X에서 IL-1 다형성 부위의 모든 대립 유전자를 지칭한다. 예를 들면, 용어 "IL-1RN (+2018) 대립 유전자"는 마커 +2018에서 IL-1RN 유전자의 대체 형태를 지칭한다. "IL-1RN (+2018) 대립 유전자 1"은 센스 (sense) 가닥의 위치 +2018에서 시토신 (C)을 함유하는 IL-1RN 유전자의 형태를 지칭한다. 문헌[Clay et al., Hum. Genet. 97: 723-26, 1996]을 참조할 수 있다. "IL-1RN (+2018) 대립 유전자 2"는 플러스 가닥의 위치 +2018에서 티민 (T)을 함유하는 IL-1RN 유전자의 형태를 지칭한다. 대상자가 두 동일한 IL-1RN 대립 유전자를 갖는 경우, 대상자를 동질접합성이라 일컫거나, 또는 동질접합성 상태를 갖는 것으로 일컫는다. 대상자가 두 상이한 IL-1RN 대립 유전자를 갖는 경우, 대상자를 이질접합성이라 일컫거나, 또는 이질접합성 상태를 갖는 것으로 일컫는다. 용어 "IL-1RN (+2018) 대립 유전자 2,2"는 동질접합성 IL-1 RN (+2018) 대립 유전자 2 상태를 지칭한다. 반대로, 용어 "IL-1RN (+2018) 대립 유전자 1,1"은 동질접합성 IL-1 RN (+2018) 대립 유전자 1 상태를 지칭한다. 용어 "IL-1RN (+2018) 대립 유전자 1,2"는 이질접합성 대립 유전자 1 및 2 상태를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "IL-1 관련"은 인간 염색체 2 (2q 12-14) 상에서 인간 IL-1 유전자좌 유전자에 관련된 모든 유전자를 포함하는 의미이다. 이들은 인터루킨-1α를 코딩하는 IL-1A 유전자, 인터루킨-1β를 코딩하는 IL-1B 유전자 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 코딩하는 IL-1RN (또는 IL-Ira) 유전자를 포함하는 염색체 2 (2q 13-14)에 위치한 인간 IL-1 유전자 클러스터의 IL-1 유전자를 포함한다. 나아가, 이들 IL-1 관련 유전자는 인간 염색체 2 (2q12) 상에 위치한 타입 I 및 타입 II 인간 IL-1 수용체 유전자 및 위치 19.5 cM에서 마우스 염색체 1에 위치한 그들의 마우스 동족체를 포함한다. 인터루킨-1α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-1RN은 이들 모두가 IL-1 타입 I 수용체에 결합하는 한 관련되지만, 오직 인터루킨-1α 및 인터루킨-1β만이 IL-1 타입 I 수용체를 활성화하는 작동제 리간드이며, 인터루킨-1RN은 천연 발생의 길항제 리간드이다. 용어 "IL-1"이 유전자 생성물 또는 폴리펩티드에 관하여 사용되는 경우, 인간 염색체 2 (2q 12-14) 상의 인터루킨-1 유전자좌 및 다른 종 또는 그들의 기능적 변이체로부터의 그들의 대응하는 동족체에 의해 코딩되는 모든 유전자 생성물을 지칭하는 의미이다. 따라서, 용어 IL-1은 염증 반응을 촉진하는 분비 폴리펩티드, 예를 들면 IL-1α 및 IL-1β, 뿐만 아니라 염증 반응을 길항 작용하는 분비 폴리펩티드, 예를 들면 IL-1 수용체 길항제 및 IL-1 타입 II (유인) 수용체를 포함한다.
"IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"은 IL-1 유전자좌 코딩된 리간드로부터의 신호에 결합하고(결합하거나) 형질도입시킬 수 있는 다양한 세포막 결합 단백질 수용체를 지칭한다. 상기 용어는 인터루킨-1 (IL-1) 분자를 결합시킬 수 있고, 생각컨대 그들의 고유 배위에서 포유류 세포막 단백질로서, IL-1에 의해 제공된 신호를 세포로 형질도입하는 역할을 하는 임의의 단백질에 적용된다. 본 명세서에 사용된 용어는 IL-1 결합 또는 신호 형질도입 활성의 유사체를 갖는 고유 단백질을 포함한다. 그 예들은 미국 특허 제 4,968,607호에 기재된 인간 및 생쥐 IL-1 수용체를 포함한다. 용어 "IL-1 핵산"은 IL-1 단백질을 코딩하는 핵산을 지칭한다.
"IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 도 1, 2, 및 3에 도시된 IL-1 게놈 DNA 서열 또는 그의 단편 및 그의 동족체에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고 작동제 및 길항제 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의도된다.
"증가된 위험"은 특정 다형성 대립 유전자를 갖지 않는 집단의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비해 특정 다형성 대립 유전자를 갖는 개인에서 통계적으로 질환 또는 상태의 발생 빈도가 더 높은 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "상호작용(하다)"은 분자 간의 검출가능한 상관 관계 또는 관련성 (예를 들면 생화학적 상호작용), 예를 들면 본래 단백질-단백질, 단백질-핵산, 핵산-핵산 및 단백질-소 분자 또는 핵산-소 분자 간의 상호작용을 포함하는 의미이다.
핵산, 예를 들면 DNA 또는 RNA에 관해 본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은 거대분자의 천연 공급원에서 존재하는 각각 다른 DNAs 또는 RNAs로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들면, 대상자 IL-1 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 단리된 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA에서 IL-1 유전자를 천연적으로 즉시 플랭킹 (flanking)하는 10 킬로베이스 (kb) 이하의 핵산 서열, 더욱 바람직하게는 5 kb 이하, 가장 바람직하게는 1.5 kb 미만의 천연적으로 발생하는 플랭킹 서열을 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 단리된은 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 경우 배지, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연적으로 발생하지 않고, 천연 상태에서는 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미이다. 또한, 용어 "단리된"은 다른 세포 단백질로부터 분리된 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 본 명세서에 사용되며, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 양쪽 모두를 포함하는 의미이다.
"녹-인" 트랜스제닉 동물은 그의 게놈으로 변형된 유전자가 도입된 것이고 변형된 유전자가 외인성 또는 내인성 기원일 수 있는 동물을 지칭한다.
"녹-아웃" 트랜스제닉 동물은 내인성 유전자의 발현의 부분적 또는 완전한 억제 (예를 들면, 적어도 일부의 유전자의 삭제, 적어도 일부의 유전자를 제 2 서열로 치환, 정지 코돈의 도입, 중요한 아미노산을 코딩하는 염기의 돌연변이 또는 인트론 (intron) 연접의 제거 등에 기초함)가 존재하는 동물을 지칭한다.
"녹-아웃 구조체"는 세포에서 내인성 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 간단한 예로, 녹-아웃 구조체는 유전자의 중요한 부분이 삭제된 유전자, 예를 들면 IL-1RN 유전자를 포함함으로써 활성 단백질은 그로부터 발현될 수 없다. 별법으로, 다수의 종결 코돈을 고유 유전자에 첨가하여 단백질의 조기 종결을 유발하거나 또는 인트론 연접을 불활성화시킬 수 있다. 전형적 녹-아웃 구조체에서, 유전자의 일부분을 선택가능한 마커 (예를 들면, neo 유전자)로 대체하여 유전자를 다음과 같이 표현할 수 있다: IL-1RN 5'/neo/IL-1RN 3'(여기서, IL-1RN 5' 및 IL-1RN 3'는 IL-1RN 유전자 부분을 기준으로 각각 상류 및 하류인 게놈 또는 cDNA 서열을 지칭하고, neo는 네오마이신 (neomycin) 내성 유전자를 지칭함). 또 다른 녹-아웃 구조체에서, 제 2 선택가능한 마커를 플랭킹 위치에 첨가하여 유전자를 다음과 같이 표현할 수 있다: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK (여기서, TK는 선행 구조체의 IL-1RN 5' 또는 IL-1RN 3' 서열에 첨가될 수 있고, 적절한 배지에서 추가로 선택될 수 있는 (즉, 음성 선택가능한 마커임) 티미딘 키나아제 유전자이다. 이 두 마커 구조체는 전형적으로 TK 서열을 보유하는 비-상동 재조합 사건으로부터 플랭킹 TK 마커를 제거하는 상동 재조합 사건의 선택을 가능케 한다. 유전자 삭제 및(또는) 대체는 엑손, 인트론, 특히 인트론 연접 및(또는) 조절 영역, 예를 들면 프로모터로부터 이루어질 수 있다.
"연관 비평형"은 지정된 대조군 집단에서 각각의 대립 유전자의 별도의 발현 빈도로부터 예측되는 것보다 큰 빈도로 두 대립 유전자의 공-유전을 지칭한다. 독립적으로 유전되는 예측된 두 대립 유전자의 발생 빈도는 제 2 대립 유전자의 빈도를 곱한 제 1 대립 유전자의 빈도이다. 예측된 빈도로 함께 발생하는 대립 유전자는 "연관 비평형"에 있는 것으로 일컬어진다. 연관 비평형의 원인은 종종 불명확하다. 이는 특정한 대립 유전자 조합물 또는 유전적으로 이종 집단의 최근 혼합물의 선택으로 기인할 수 있다. 또한, 질환 유전자에 매우 밀접하게 연관된 마커의 경우, 질환 돌연변이가 최근에 발생하여 특이적 염색체 영역에서 재조합 사건을 통해 평형이 달성되기에 충분한 시간이 경과하지 않은 경우, 대립 유전자 (또는 연관된 대립 유전자의 군)와 질환 유전자의 관련성이 예측된다. 하나를 초과하는 대립 유전자를 포함하는 대립 유전자 패턴을 기준으로 할 때, 제 1 대립 유전자 패턴을 포함하는 모든 대립 유전자가 제 2 대립 유전자 패턴의 대립 유전자 중 하나 이상과 연관 비평형에 있는 경우, 제 1 대립 유전자 패턴은 제 2 대립 유전자 패턴과 연관 비평형에 있다. 연관 비평형의 예로는 IL-1RN (+2018) 및 IL-1RN (VNTR) 다형성 부위에서 대립 유전자 간에 발생하는 것이 있다. IL-1RN (+2018)에서의 두 대립 유전자는 대립 유전자 1 및 대립 유전자 2인 IL-1RN (VNTR)의 두 가장 빈번한 대립 유전자와 100 % 연관 비평형에 있다.
용어 "마커"는 개인들 사이에서 변하는 것으로 공지된 게놈 중의 서열을 지칭한다. 예를 들면, IL-1RN 유전자는 가변적 수의 탠덤 (tandem) 반복 (VNTR)으로 이루어진 마커를 갖는다.
"돌연변이된 유전자" 또는 "돌연변이" 또는 "기능적 돌연변이"는 돌연변이된 유전자를 갖지 않는 대상자에 비해 돌연변이된 유전자를 갖는 대상자의 표현형을 변화시킬 수 있는 유전자의 대립 유전자 형태를 지칭한다. 돌연변이에 의해 유발된 변화된 표현형은 특정한 약제에 의해 보정되거나 또는 보상될 수 있다. 대상자가 변화된 표현형을 갖게 하는 이 돌연변이에 대해 동질접합성이어야 하는 경우, 이러한 돌연변이는 열성으로 일컬어진다. 돌연변이된 유전자 중 한 카피가 대상자의 표현형을 변환시키기 충분한 경우, 이 돌연변이는 우성으로 일컬어진다. 대상자가 돌연변이된 유전자의 한 카피를 갖고 동질접합성 대상자의 것과 이질접합성 대상자의 것 사이의 중간 (상기 유전자의 경우)인 표현형을 갖는 경우, 이 돌연변이는 공우성으로 일컬어진다.
본 발명의 "비-인간 동물"은 포유류, 예를 들면 설치류, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 염소 등, 양서류, 예를 들면 제노푸스속 (Xenopus genus)의 구성원, 및 트랜스제닉 조류 (예를 들면 닭, 새 등)를 포함한다. 용어 "키메라성 동물"은 재조합 유전자가 발견되거나, 또는 재조합 유전자가 동물의 모든 세포가 아닌 일부에서 발현되는 동물을 지칭하는 것으로 본 발명에 사용된다. 용어 "조직-특이적 키메라성 동물"은 재조합 IL-1 유전자 중 하나가 일부 조직에 존재하고(존재하거나) 발현되거나 붕괴되며, 나머지 조직에서는 그렇지 않은 것을 나타낸다. 용어 "비-인간 포유류"는 인간을 제외한 포유류 부류의 임의의 구성원을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산"는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 데옥시리보핵산 (Deoxyribo Nucleic acid; DNA), 및 적절한 경우, 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 등가물로서 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하고, 기재되는 실시양태에 적용되는 것으로서 단일 (센스 또는 안티센스 (antisense)) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
세계 보건 기구 (World Health Organization; WHO)는 용어 "골다공증"을 "... 낮은 골 질량과 뼈의 미세구조 악화로 인해 뼈가 유약해지고 그 결과 골절이 발생하기 쉬운 전신 골격 질환"으로 정의한다 (WHO Consensus Development Conference 1993). 골다공증의 임상적 정의는 골 무기질 밀도 (BMD) 또는 골 무기질 농도 (BMC)가 젊은 건강한 여성 평균 아래의 약 2.5 표준 편차 (SD)보다 큰 상태이다. 심한 골다공증은 젊은 건강한 여성 평균 아래의 약 2.5 SD를 초과하는 BMD 또는 BMC 및 하나 이상의 골다공증성 골절의 존재를 갖는 것으로 정의된다. 골 손실은 엄격하게 특이적 부위에 국한되지 않기 때문에, 골다공증은 폐포, 대퇴부, 요골, 척추 또는 손목에서 골 손실 또는 골절 발생, 폐경 후 골 손실, 심하게 감소된 골 질량, 골절 발생수 또는 골 손실율을 비롯한 다양한 방식으로 나타날 수 있다.
용어 "다형성"은 하나를 초과하는 형태의 유전자 또는 그의 부분 (예를 들면, 대립 유전자 변이체)의 공존을 지칭한다. 이들 중 두 개 이상의 상이한 형태, 즉 두 상이한 뉴클레오티드 서열이 존재하는 유전자의 부분은 "유전자의 다형성 영역"으로 지칭된다. 유전자의 다형성 영역에서의 특이적 유전적 서열은 대립 유전자이다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오티드일 수 있으며, 이의 동일성은 상이한 대립 유전자에서 다르다. 또한, 다형성 영역은 몇몇 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
용어 "질환에 대한 성향," 또한 질환에 대한 "소인" 또는 "감수성" 또는 임의의 유사한 구는 특정한 대립 유전자가 본 명세서에서 대상자의 특정 질환 (예를 들면, 혈관 질환) 발현의 발생수와 관련되거나 이를 예측하는 것으로 밝혀진 것을 의미한다. 따라서, 건강한 개인에 비해 질환을 갖는 개인은 대립 유전자의 빈도가 과도하게 높다. 따라서, 이들 대립 유전자는 심지어 증상전 또는 질환전 개인에서 질환을 예측하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "소 분자"는 약 5 kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만의 분자량을 갖는 조성물을 지칭하는 의미이다. 소 분자는 핵산, 펩티드, 펩티드 유사체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화(하다)" 또는 "특이적으로 검출(하다)"은 핵산 분자가 적어도 대략 6 개의 연속적인 뉴클레오티드의 샘플 핵산과 혼성화할 수 있는 능력을 지칭한다.
"전사 조절 서열"은 이와 작동가능하게 연관된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도하거나 또는 통제하는 DNA 서열, 예를 들면 개시 신호, 인헨서 (enhancer) 및 프로모터를 지칭하는 것으로 명세서 전반에 사용된 일반 명칭이다.
본 명세서에 사용된 용어 "트랜스진 (transgene)"은 세포로 도입된 핵산 서열 (예를 들면, IL-1 폴리펩티드, 또는 이에 대한 안티센스 전사체 중 하나를 코딩함)을 의미한다. 트랜스진은 도입되는 트랜스제닉 동물 또는 세포에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 이형, 즉 외래의 것일 수 있거나 또는 트랜스제닉 동물 또는 세포로 도입되지만 삽입되는 세포의 게놈을 변화시키도록 (예를 들면, 이는 천연 유전자의 것과 상이한 위치에서 삽입되거나 또는 그의 삽입이 녹아웃을 일으킴) 동물의 게놈으로 삽입되도록 설계되거나 또는 삽입되는 트랜스제닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자와 상동성을 갖는다. 또한, 트랜스진은 에피좀 (episome)의 형태로 세포 중에 존재할 수 있다. 트랜스진은 선택된 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 다른 핵산, 예를 들면 인트론을 포함할 수 있다.
"트랜스제닉 동물"은 동물 세포 중 하나 이상이 인간 개입에 의해, 예를 들면 당업계에 공지된 형질전환 기술에 의해 도입된 이형 핵산을 함유하는 임의의 동물, 바람직하게는 비-인간 포유류, 새 또는 양서류를 지칭한다. 고의의 유전자 조작, 예를 들면 미세주사 또는 재조합 바이러스를 사용한 감염에 의해 세포의 전구체로 도입시킴으로써 직접적으로 또는 간접적으로 핵산을 세포에 도입시킨다. 용어 유전자 조작은 종래의 교배 육종, 또는 시험관내 수정을 포함하지 않으며, 오히려 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체 내에서 통합될 수 있거나, 또는 과염색체적으로 복제하는 DNA일 수 있다. 본 명세서에 기재된 전형적 트랜스제닉 동물에서, 트랜스진은 세포가 IL-1 폴리펩티드 중 하나의 재조합 형태, 예를 들면 작동제 형태 또는 길항제 형태를 발현하게 한다. 그러나, 또한, 재조합 유전자가 침묵인 트랜스제닉 동물은 예를 들면, 하기하는 FLP 또는 CRE 재조합 효소 의존성 구조체로서 고려될 수 있다. 더욱이, "트랜스제닉 동물"은 하나 이상의 유전자의 유전자 붕괴가 재조합 기술 및 안티센스 기술 양쪽 모두를 비롯한 인간 개입에 의해 유발되는 재조합 동물도 포함한다. 상기 용어는 모든 자손 세대를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 시조 동물 및 모든 Fl, F2, F3 등, 그들의 자손들이 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료(하는)"는 상태 또는 질환의 하나 이상의 증상을 완화시킬 뿐만 아니라 치료하는 것을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "벡터"는 연관된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 벡터의 한 타입은 에피좀, 즉 과염색체 복제를 할 수 있는 핵산이다. 바람직한 벡터는 핵산을 연관된 것으로 자발적 복제하고(복제하거나) 발현할 수 있는 것들이다. 작동적으로 연관된 유전자의 발현을 지향 (directing)할 수 있는 벡터를 본 명세서에서는 "발현 벡터"로 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 일반적으로 그들의 벡터 형태로 염색체에 결합하지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용되며, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 제공하고, 이하 본 명세서에서 당업계에 공지되는 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "야생형 대립 유전자"는 두 카피에 존재하는 경우 대상자에서 야생형 표현형을 발생시키는 유전자의 대립 유전자를 지칭한다. 유전자에서의 특정한 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드 변화를 갖는 유전자의 두 카피를 갖는 대상자의 표현형에 영향을 미치지 않을 수 있기 때문에 특이적 유전자로 된 몇몇 상이한 야생형 대립 유전자가 존재할 수 있다.
예측 의약
IL-2 대립 유전자 및 반수체형 동정
본 발명은 골 손실, 골절 위험 또는 골다공증 다른 지표와 관련성이 있는 (통계적으로 유의적인 정도로) 것으로 결정된 특정한 대립 유전자의 동정에 적어도 부분적으로 기초한다. 따라서, 대립 유전자의 검출은 대상자가 골다공증을 갖거나 또는 골다공증이 발현되기 쉽다는 것을 시사할 수 있다. 그러나, 이들 대립 유전자가 다른 대립 유전자와 연관 비평형에 있기 때문에, 이러한 다른 연관된 대립 유전자들의 검출도 대상자가 특정 질환 또는 상태를 갖거나 또는 특정 질환 또는 상태가 발현되기 쉽다는 것을 시사할 수 있다. 예를 들면, 44112332 반수체형은 하기 유전형을 포함한다.
IL-1A의 222/223 마커의 대립 유전자 4 IL-1A의 gz5/gz6 마커의 대립 유전자 4 IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 1 IL-1B의 +3954 마커의 대립 유전자 1 IL-1B의 -511 마커의 대립 유전자 2 gaat.p33330 마커의 대립 유전자 3 Y31 마커의 대립 유전자 3
IL-1RN의 +2018의 대립 유전자 2 IL-1A의 +4845의 대립 유전자 1
IL-1R의 VNTR 마커의 대립 유전자 2
또한, IL-1RN 교대 엑손 (유전자 생성물의 세포내 형태를 생산하는 엑손 lic)에서의 세 가지 다른 다형성도 IL-1RN (VNTR)의 대립 유전자 2와 연관 비평형에 있다 (문헌[Clay et al., (1996) Hum Genet 97: 723-26] 참조). 이들은 IL-1RN 엑손 lic (1812) (진뱅크 (GenBank): 1812에서의 X77090; IL-1RN 엑손 lic (1868) 다형성 (진뱅크: 1868에서의 X77090); 및 IL-1RN 엑손 lic(1887) 다형성 (진뱅크: 1887에서의 X77090)을 포함한다. 나아가, 유전자의 교대적으로 스플라이싱된 (spliced) 세포내 형태에 대한 프로모터에서의 또 다른 다형성인 Pic (1731) 다형성 (진뱅크: 1731에서의 X77090)도 IL-1RN(VNTR) 다형성 유전자좌의 대립 유전자 2와 연관 비평형에 있다. 이들 각각의 다형성 유전자좌의 경우, 대립 유전자 2 서열 변이체는 IL-1RN (VNTR) 유전자좌의 대립 유전자 2와 연관 비평형에 있는 것으로 결정되었다 (문헌[Clay et al., (1996) Hum Genet 97: 723-26] 참조).
33221461 반수체형은 하기 유전형을 포함한다.
IL-1A의 222/223 마커의 대립 유전자 3 IL-1A의 gz5/gz6 마커의 대립 유전자 3 IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 2 IL-1B의 +3954 마커의 대립 유전자 2 IL-1B의 -511 마커의 대립 유전자 1 gaat.p33330 마커의 대립 유전자 4 Y31 마커의 대립 유전자 6
IL-1RN의 +2018의 대립 유전자 1 IL-LA의 +4845의 대립 유전자 2
IL-1RN의 VNTR 마커의 대립 유전자 1
44112332 반수체형을 갖는 개인은 자극시 전형적으로 IL-1α 및 IL-1β 단백질 양쪽 모두의 과다생산자이다. 반대로, 33221461 반수체형을 갖는 개인은 전형적으로 IL-1ra의 과소생산자이다. 각각의 반수체형은 실 (net) 염증 후 반응을 일으킨다. 반수체형 내의 각각의 대립 유전자들은 하나의 효과, 뿐만 아니라 복합 유전형 효과를 낼 수 있다. 또한, 특정 질환은 반수체형 패턴 양쪽 모두와 관련될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 대립 유전자 패턴 외에도, 당업자는 골다공증과 관련된 대립 유전자와 연관 비평형에 있는 다른 대립 유전자 (다형성 및 돌연변이 포함)를 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들면, 골다공증이 없는 제 1 대상자 군으로부터의 핵산 샘플, 뿐만 아니라 장애를 갖는 제 2 대상자 군으로부터의 DNA를 수집할 수 있다. 그 다음, 핵산 샘플을 비교하여 제 1 군에 비해 제 2 군에서 과다하게 발현된 대립 유전자를 동정할 수 있으며, 여기서 생각컨대 이러한 대립 유전자는 골다공증과 관련된다. 별법으로, 골다공증과 관련된 대립 유전자와 연관 비평형에 있는 대립 유전자는 예를 들면, 큰 집단을 제노타이핑하고 통계적 분석을 수행하여 어느 대립 유전자가 예측했던 것보다 일반적으로 함께 나타나는지 결정함으로써 동정될 수 있다. 바람직하게는, 군은 유전적으로 관련된 개인을 포함하도록 선택된다. 유전적으로 관련된 개인은 동일한 인종, 동일한 인종 군, 또는 심지어 동일한 족으로부터의 개인을 포함한다. 대조군과 시험군 사이의 유전적 관련도가 증가함에 따라, 질환 유발 대립 유전자와 더 멀리 연관된 다형성 대립 유전자의 예측 값도 증가한다. 이는 짧은 진화 시간이 도과하여 시조 집단 중에서 염색체를 따라 연관된 다형성이 유전적 교차 사건을 통해 재분배되도록 하기 때문이다. 따라서, 인종-특이적, 인종-특이적 및 심지어 족-특이적 진단 제노타이핑 분석시험은 인간 진화의 훨씬 더 근대, 예를 들면, 주요 인간 인종의 분기 후, 인간 집단의 별개의 인종 군으로의 분리 후, 및 심지어 특정 대의 최근 역사 내에서 발생한 질환 대립 유전자의 검출을 가능케 하도록 개발될 수 있다.
두 다형성 마커 간의 연관 비평형 또는 한 다형성 마커와 질환 유발 돌연변이 간의 연관 비평형은 준안정 상태에 있다. 기초 돌연변이 사건의 산발성 연관 재발 (reoccurrence) 또는 선택적 압력의 부재로, 다형성은 결국 염색체 재조합 사건에 의해 관련이 없게 되어 인간 진화 과정을 통해 연관 평형에 이르게 된다. 따라서, 질환 또는 상태와 연관 비평형에 있는 다형성 대립 유전자를 발견할 가능성은 다음의 두 개 이상의 인자의 변화로 증가할 수 있다: 다형성 마커와 질환 유발 돌연변이 간의 물리적 거리 감소, 연관된 쌍의 해리에 이용가능한 감수분열 세대의 수 감소. 후자의 요인의 고려는, 두 개인이 더욱 밀접하게 관련될수록, 이들은 연관된 다형성을 함유하는 공통 모 염색체 또는 염색체 영역을 공유하기 더 쉽고, 이 연관된 쌍이 감수분열 교차 사건이 발생하는 각 세대를 통해 비연관되는 것은 더욱 어려워질 것이라는 점을 제시한다. 그 결과, 두 개인이 더욱 밀접하게 관련될수록 널리 이격된 다형성이 공-유전될 수 있을 가능성이 더 높아진다는 것이다. 따라서, 공통 인종, 민족 또는 족에 의한 개인 관련의 경우, 훨씬 더 멀리 이격된 다형성 유전자좌의 신뢰도는 연관된 질환 유발 돌연변이의 유전의 지표에 의존할 수 있다.
IL-1 유전자좌의 특이적 유전자, 예를 들면 IL-1A, IL-IB 또는 IL-1RN 또는 관련 유전자와 혼성화하도록 적절한 프로브를 설계할 수 있다. 이들 게놈 DNA 서열을 도 3, 4 및 5에 각각 도시하며, 이들은 또한 각각 서열 번호 1, 2 및 3에 대응한다. 별법으로, 이들 프로브는 유전자간변화 (intergenic) 서열을 비롯한 관련 있는 게놈 유전자좌의 다른 영역을 혼입할 수 있다. 실제로, 인간 염색체 2의 IL-1 영역은 길이가 일부 400,000 개의 염기쌍에 달하고, 한 단일 뉴클레오티드 다형성의 평균을 매 1,000 개의 염기쌍으로 가정하면, 일부 400 개의 SNPs 유전자좌를 단독으로 포함한다. 또한, 본 발명과 함께 사용하기에 이용가능한 다른 다형성은 다양한 공공 공급처로부터 입수가능하다. 예를 들면, 인간 게놈 데이터베이스는 유전자내변화 (intragenic) SNPs를 수집하고, 서열에 의해 검색되며, 현재 대략 2,700 개의 입력 정보를 함유하고 있다 (http://base.interactiva.de). 또한, 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 (Massachusetts Institute of Technology) (MIT SNP 데이터베이스에서 관리되는 인간 다형성 데이터베이스도 이용가능하다 (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html)). 이러한 공급처로부터 SNPs, 뿐만 아니라 다른 인간 다형성을 발견할 수 있다.
예를 들면, 이들 데이터베이스 중 임의의 하나에서 인간 게놈의 IL-1 영역의 조사는 IL-1 유전자좌 유전자가 127.4 cM에서 미세위성 (microsatellite) 마커 AFM220ze3으로 명명된 센트로머 근위 다형성 마커 설계ated at (centiMorgans) (진뱅크 기탁 번호 Z17008 참조) 및 127.9 cM에서 미세위성 앵커 (anchor) 마커 AFM087xal로 명명된 원위 다형성 마커 (진뱅크 기탁 번호 Z16545 참조)에 의해 플랭킹된다는 것을 밝혀낸다. 이들 인간 다형성 유전자좌는 양쪽 모두 CA 디뉴클레오티드 반복 미세위성 다형성이므로 인간 집단에서 고도의 이형접합을 나타낸다. 예를 들면, AFM220ze3의 한 대립 유전자는 서열 TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (서열 번호 4)의 5' 프라이머 및 서열 TGGCCTCCAGAAACCTCCAA (서열 번호 5)의 3' 프라이머를 갖는 211 bp PCR 증폭 생성물을 생성한다. 나아가, AFM087xal의 한 대립 유전자는 서열 GCTGATATTCTGGTGGGAAA (서열 번호 6)의 5' 프라이머 및 서열 GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (서열 번호 7)의 3' 프라이머를 갖는 177 bp PCR 증폭 생성물을 생성한다. 이들 인간 염색체 2 CA 디뉴클레오티드 반복 다형성에 대해 5' 및 3'에 발생하는 유니크 서열에 대응하는 등가의 프라이머는 당업자에게 명확히 이해될 것이다. 합당한 등가의 프라이머는 약 1 kb의 선정된 프라이머 내에서 혼성화하고, 또한 어디에서든지 길이가 약 17 bp 내지 약 27 bp인 것들을 포함한다. 유니크 인간 염색체 게놈 서열 증폭용 프라이머를 지정하는 일반적인 지침은 이들이 약 50 ℃ 이상의 융점을 갖고, 근사 융점이 식 Tmelt = [2 x (A 또는 T의 수) + 4 x (G 또는 C의 수)]을 사용하여 추정될 수 있다는 것이다.
다수의 다른 인간 다형성 유전자좌들이 이들 두 CA 디뉴클레오티드 반복 다형성 사이에서 발생하고, 유전적으로 관련된 개인의 족 또는 다른 군에서 예후 대립 유전자의 결정에 대한 추가의 표적을 제공한다. 예를 들면, 네쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) 웹사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)는 IL-1 유전자좌의 영역 중에서 다수의 다형성 마커를 나열하며, 이들 마커의 증폭 및 분석용으로 적절한 프라이머를 선정하는 데 안내를 제공한다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 절편은 그들의, 인간 염색체 2 q 12-13 또는 cDNAs의 상보적 신장을 갖는 이중체 분자를 그 영역으로부터 선택적으로 형성하거나 또는 이 영역으로부터 DNA 또는 cDNA 증폭용 프라이머를 제공하는 능력에 사용될 수 있다. 이러한 목적의 적절한 프로브의 설계는 다수의 인자를 고려할 것을 필요로 한다. 예를 들면, 10, 15, 또는 18 개의 뉴클레오티드 내지 약 20 개, 또는 약 30 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단편이 특히 유용할 것이다. 긴 서열, 예를 들면, 40, 50, 80, 90, 100 개, 심지어 전 길이까지의 긴 서열들이 특정한 실시양태의 경우 훨씬 더 바람직하다. 약 18 내지 20 개 뉴클레오티드 이상의 올리고뉴클레오티드의 길이는 당업자에게 분자 프로브로서 유용하기 위해 충분히 특이적으로 혼성화하기에 충분한 것으로 받아들여질 것이다. 나아가, 고려되는 적용 분야에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 정도의 선택성을 달성하는 혼성화의 상태 변화를 사용하고자 할 것이다. 높은 선택성을 필요로 하는 적용 분야의 경우, 전형적으로 비교적 엄격한 상태를 사용하여 혼성체를 형성하고자 할 것이다. 예를 들면, 비교적 저염 및(또는) 고온 상태, 예를 들면 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 0.02 M-0.15 M NaCl에 의해 제공되는 상태가 있다. 이러한 선택적 상태는 거의 견디지 못하고, 존재하는 경우 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이를 미스매치 (mismatch)시킨다.
다른 대립 유전자 또는 장애의 다른 징후는 예를 들면, 혈관벽 두께 (예를 들면 초음파에 의해 측정)를 알아냄으로써, 또는 대상자가 흡연하는지, 음주하는지, 과체중인지, 스트레스를 받거나 또는 운동하는지 여부를 알아냄으로써 상기한 대립 유전자의 검출과 함께 대상자에서 검출하거나 또는 모니터링할 수 있다.
대립 유전자의 검출
인간 다형성 유전자좌에서 특이적 대립 유전자를 검출하는 데 많은 방법들이 이용가능하다. 특이적 다형성 대립 유전자를 검출하는 바람직한 방법은 부분적으로는 다형성의 분자 특성에 의존하게 된다. 예를 들면, 다형성 유전자좌의 다양한 대립 유전자 형태는 DNA의 단일 염기쌍에 의해 달라질 수 있다. 모든 공지된 다형성의 일부 80 %를 포함하는 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성 (또는 SNPs)은 유전자 변이에 대한 주요 기여체이며, 인간 게놈에서의 그들의 밀도는 1,000 개의 염기쌍 당 평균 1인 것으로 추정된다. SNPs는 (비록 DNA에서 발생하는 네 가지 상이한 뉴클레오티드 염기에 대응하는 SNP의 네 가지 이하의 상이한 형태가 이론적으로 가능하지만) 오직 두 상이한 형태의 이대립 유전자 (biallele)가 가장 빈번하게 발생한다. 그럼에도 불구하고, SNPs는 다른 다형성보다 돌연변이로 더욱 안정하여, 이들을 관련성 연구들에 사용하기 적합하게 하며, 여기서 마커와 미지의 변이체 사이의 연관 비평형은 질환 유발 돌연변이를 맵핑 (mapping)하는 데 사용된다. 또한, SNPs는 전형적으로 오직 두 개의 대립 유전자를 갖기 때문에, 길이 측정보다는 보다 자동화되기 쉬운 간단한 플러스/마이너스 분석시험에 의해 제노타이핑될 수 있다.
다양한 방법들이 개인의 특정 단일, 뉴클레오티드 다형성 대립 유전자의 존재를 검출하는 데 이용가능하다. 이 분야에서의 진보는 정확하고 용이하고 저렴한 대규모 SNP 제노타이핑을 제공하였다. 가장 최근, 예를 들면, 동적 대립 유전자-특이적 혼성화 (dynamic allele-specific hybridization; DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동 (microplate array diagonal gel electrophoresis; MADGE), 피로시퀀싱 (pyrosequencing), 올리고뉴클레오티드-특이적 라이게이션, 테크만 (TaqMan) 시스템, 뿐만 아니라 다양한 DNA "칩" 기술, 예를 들면 에피메트릭스 (Affymetrix) SNP 칩을 비롯한 몇몇 신규한 기술들이 설명되었다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의한 표적 유전적 영역의 증폭을 필요로 한다. 침입 분절 (invasive cleavage) 후 질량 분석기 또는 고정화된 패드록 (immobilized padlock) 프로브 및 롤링-서클 (rolling-circle) 증폭에 의한 작은 신호 분자의 발생에 기초한 또 다른 새로 개발된 방법은 결국 PCR의 필요성을 제거할 수 있다. 특이적 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 몇몇 당업계에 공지된 방법을 하기에 요약한다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
몇몇 방법이 개발되어 단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하였다. 한 실시양태에서, 단일 염기 다형성은 예를 들면, 먼디 (Mundy), C. R. (미국 특허 제 4,656,127호 참조)에 기재된 바와 같이 특수화된 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 다형성 부위에 대해 바로 3'의 대립 유전자 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 얻어진 표적 분자를 혼성화하게 한다. 표적 분자 상의 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 함유한다면, 그 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단에 혼입되게 된다. 이러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성을 갖게 하여 그의 검출를 가능하게 한다. 샘플의 엑소뉴클레아제 내성 유도체의 동일성이 공지되어 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 내성을 갖게 되는 것을 발견하는 것은 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드가 이 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 뉴클레오티으에 상보적이라는 것을 밝혀낸다. 이 방법은 다량의 외래의 서열 데이터를 결정할 것을 필요로 하지 않는다는 이점을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 용액-기재의 방법은 다형성 부위의 뉴클레오티드의 동일성을 결정하는 데 사용된다. 코헨 (Cohen), D. 등 (프랑스 특허 제 2,650,840호; PCT 출원 W091/02087)의 문헌을 참조할 수 있다. 미국 특허 제 4,656,127호의 먼디 방법에서와 같이, 다형성 부위에 대해 바로 3'의 대립 유전자 서열에 상보적인 프라이머가 사용된다. 상기 방법은 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적인 것이 프라이머 말단으로 혼입되게 되는 경우 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 그 부위의 뉴클레오티드의 동일성을 결정한다.
제너틱 비트 어넬리시스 (Genetic Bit Analysis) 또는 GBATM으로 알려진 별법의 방법이 지오레트 (Goelet), P. 등 (PCT 출원 92/15712)에 의해 기재되어 있다. 지오레트, P. 등의 방법은 표지된 종결제 및 다형성 부위에 대해 서열 3'에 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 따라서, 혼입되는 표지된 종결제는 평가되는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적이며 이러한 뉴클레오티드에 의해 결정된다. 코헨 등의 방법 (프랑스 특허 제 2,650,840호; PCT 출원 W091/02087)과 반대로, 지오레트, P. 등의 방법은 바람직하게는 이종 상 분석시험이며, 여기서 프라이머 또는 표적 분자는 고체상에 고정화된다.
최근, DNA에서 다형성 부위를 분석시험하는 몇몇 프라이머-안내된 뉴클레오티드 혼입 절차들이 기재되었다 (문헌[Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18: 3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al., Genomics 8: 684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 88: 1143-1147(1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)] 참조). 이들 방법은 모두가 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존하여 다형성 부위에서 염기들 사이를 식별한다는 점에서 GBATM과 상이하다. 이러한 형식에서, 신호가 혼입되는 다수의 데옥시뉴클레오티드에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드의 런 (run)에서 발생하는 다형성은 런의 길이에 비례하는 신호를 제공할 수 있다 (문헌[Syvanen, A. -C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52: 46-59 (1993)] 참조).
단백질 번역 조숙한 종결을 생성하는 돌연변이의 경우, 단백질 절단 시험 (protein truncation test; PTT)은 유효한 진단 접근을 제공한다 (문헌[Roest, et. al., (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 1719-21; van der Luijt, et. al., (1994) Genomics 20: 1-4] 참조). PTT의 경우, RNA를 먼저 이용가능한 조직으로부터 단리시키고, 역전사하고, 해당 절편을 PCR에 의해 증폭시킨다. 그 다음, 역 전사 PCR의 생성물을 RNA 중합효소 프로모터 및 진핵 번역 개시용 서열을 함유하는 프라이머와 이중 (nested) PCR 증폭에 대한 주형으로 사용한다. 해당 영역의 증폭 후, 프라이머로 혼입된 유니크 모티프 (motif)는 PCR 생성물의 순차적인 시험관내 전사 및 번역이 일어나게 한다. 번역 생성물의 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시, 절단된 폴리펩티드의 출현은 번역의 조숙한 종결을 일으키는 돌연변이를 신호 전달한다. 이 기법의 변이에서, DNA (RNA와는 대조적으로)는 해당 표적 영역이 단일 엑손으로부터 유도되는 경우 PCR 주형으로 사용된다.
임의의 세포 타입 또는 조직이 본 명세서에 기재된 진단에 사용하기 위한 핵산 샘플을 얻는 데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, DNA 샘플은 공지된 기술 (예를 들면, 정맥천자) 또는 침에 의해 얻어진 체액, 예를 들면, 혈액으로부터 얻어진다. 별법으로, 핵산 시험을 건조 샘플 (예를 들면 모발 또는 피부) 상에서 수행할 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용하는 경우, 사용될 수 있는 세포 또는 조직은 IL-1 유전자를 발현해야 한다.
또한, 진단 절차는 핵산 정제가 불필요하게 되도록 생검 또는 절제로부터 얻은 환자 조직의 조직 섹션 (고정된 및(또는) 동결된)에 대해 직접 현장에서 수행할 수 있다. 핵산 시약은 이러한 현장 절차에 대해 프로브 및(또는) 프라이머로서 사용될 수 있다 (예를 들면, 문헌[Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY] 참조).
한 핵산 서열의 검출에 대해 앞서 초점을 맞춘 방법 외에, 프로파일은 이러한 검출 계획에서도 평가될 수 있다. 핑거프린트 프로파일을 예를 들면, 발현량 감별 (differential display) 절차, 노던 (Northern) 분석 및(또는) RT-PCR을 사용함으로써 생성시킬 수 있다.
바람직한 검출 방법은 IL-1 염증 후 반수체형의 하나 이상의 대립 유전자의 프로브 중첩 영역을 사용하고, 돌연변이 또는 다형성 영역 주변에 약 5, 10, 20, 25, 또는 30 개의 뉴클레오티드를 갖는 대립 유전자 특이적 혼성화이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 골다공증과 관련된 다른 대립 유전자 변이체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 몇몇 프로브를 고체상 지지체, 예를 들면, "칩" (약 250,000 개까지의 올리고뉴클레오티드를 지탱함)에 부착시킨다. 올리고뉴클레오티드는 리소그래피 (lithography)를 비롯한 다양한 방법에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 또한, "DNA 프로브 어레이"로도 명명되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이들 칩을 사용한 돌연변이 검출 분석은 예를 들면, 문헌[Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 칩은 유전자의 하나 이상의 다형성 영역의 모든 대립 유전자 변이체를 포함한다. 그 다음, 고체상 지지체는 시험 핵산과 접촉하고, 특이적 프로브에 대한 혼성화가 검출된다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 다수의 대립 유전자 변이체의 동일성은 간단한 혼성화 실험으로 확인될 수 있다.
또한, 이들 기술은 분석 전 핵산을 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. 당업자이게 공지된 증폭 기술은 클로닝, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 특이적 대립 유전자 (ASA)의 중합효소 연쇄 반응, 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 이중 중합효소 연쇄 반응, 자립 (self sustained) 서열 복제 (문헌[Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878] 참조), 전사 증폭 시스템 (문헌[Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177] 참조), 및 Q-베타 리플리카아제 (Q-Beta Replicase) (문헌[Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197] 참조)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
크기 분석, 제한 소화 후 크기 분석, 반응 생성물에서 특이적 테깅된 (tagged) 올리고뉴클레오티드 프라이머 검출, 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 혼성화, 대립 유전자 특이적 5' 엑소뉴클레아제 검출, 시퀀싱, 혼성화 등을 포함하는 다양한 방식으로 증폭 생성물을 분석시험할 수 있다.
PCR 기초 검출 수단은 동시에 다수의 마커의 다중 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들면, 크기가 중첩되지 않고 동시에 분석될 수 있는 PCR 생성물을 생성하도록 PCR 프라이머를 선택하는 것이 당업계에 공지되어 있다. 별법으로, 별도로 표지되어 각각 별도로 검출될 수 있는 프라이머를 사용하여 상이한 마커를 증폭시키는 것이 가능하다. 물론, 혼성화 기초 검출 수단은 샘플에서 다중 PCR 생성물을 차별적으로 검출할 수 있게 한다. 다른 기술들이 당업계에 공지되어 있어 다수의 마커의 다중 분석이 가능하다.
단순히 예시적인 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 환자로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, (ii) 상기 샘플의 세포로부터 핵산 (예를 들면, 게놈, mRNA 또는 양쪽 모두)을 단리시키는 단계, (iii) 상기 핵산 샘플을, 대립 유전자의 혼성화 및 증폭이 일어나도록 하는 상태 하에서 5' 및 3'을 IL-1 염증 후 반수체형 중 하나 이상의 대립 유전자에 특이적으로 혼성화시키는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계, 및 (iv) 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함한다. 이들 검출 계획은 이러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다.
대상자 분석시험의 바람직한 실시양태에서, IL-1 염증 후 반수체형의 대립 유전자는 제한 효소 분절 패턴에서의 변화에 의해 식별된다. 예를 들면, 샘플 및 대조군 DNA는 단리되고, 증폭되고 (임의적으로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 소화되고, 단편 길이 크기가 겔 전기영동에 의해 결정된다.
또한 또다른 실시양태에서, 당업계에 공지된 임의의 다양한 시퀀싱 반응을 직접 서열 대립 유전자에 사용할 수 있다. 예시적인 시퀀싱 반응은 맥심 (Maxim) 및 길버트 (Gilbert) (문헌[(1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74: 560] 참조) 또는 산저 (Sanger) (문헌[Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74: 5463] 참조)에 의해 개발된 기술에 기초한 것들을 포함한다. 또한, 질량 분석기에 의한 시퀀싱 (예를 들면, PCT 공보 WO 94/16101; 문헌[Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36: 127-162; and Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: 147-159] 참조)을 포함하는 대상자 분석시험(예를 들면, 문헌[Biotechniques (1995) 19: 448] 참조)을 수행하는 경우, 임의의 다양한 자동화된 시퀀싱 절차를 사용할 수 있다는 점이 고려된다. 특정한 실시양태의 경우, 시퀀싱 반응에서 오직 하나, 두 개 또는 세 개의 핵산 염기의 발생만을 결정할 것을 필요로 한다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 오직 하나의 핵산만이 검출되는 경우, 예를 들면, A-트랙 (A-track) 등을 수행할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 분절제 (예를 들면, 뉴클레아제, 피페리딘을 사용한 히드록실아민 또는 사산화오스뮴)로부터의 보호를 사용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 이형접합자에서 미스매칭된 염기를 검출할 수 있다 (문헌[Myers, et al. (1985) Science 230: 1242] 참조). 일반적으로, "미스매치 분절" 기술은 야생형 대립 유전자를 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 샘플과 혼성화함으로써 형성된 이형접합자를 제공함으로써 출발한다. 이중 가닥 이중체를 예를 들면, 대조군과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미스매치로 인해 존재하는 이중체의 단일 가닥 영역을 분절하는 약제로 처리한다. 예를 들면, RNA/DNA 이중체를 RNase로 처리하고 DNA/DNA 혼성체를 S1 뉴클레아제로 처리하여 효소적으로 미스매칭된 영역을 소화시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 미스매칭된 영역을 소화시키기 위해 DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중체를 피페리딘을 사용한 히드록실아민 또는 사산화오스뮴으로 처리할 수 있다. 그 다음, 미스매칭된 영역의 소화 후, 생성되는 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기로 분리하여 돌연변이의 부위를 결정한다. 예를 들면, 문헌[Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85: 4397; and Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295]을 참조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대조군 DNA 또는 RNA를 검출을 위해 표지화할 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 미스매치 분절 반응은 이중 가닥 DNA에서 미스매칭된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질 (소위 "DNA 미스매치 보수 (repair)" 효소)을 사용한다. 예를 들면, 대장균의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 분절시키고, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실라아제는 G/T 미스매치에서 T를 분절시킨다 (문헌[Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662] 참조). 예시적인 실시양태에 따라, IL-1 유전자좌 반수체형의 대립 유전자 기초의 프로브는 시험 세포(들)로부터의 cDNA 또는 다른 DNA 생성물에 혼성화된다. 이중체는 DNA 미스매치 보수 효소로 처리되고, 존재하는 경우, 분절 생성물은 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,459,039호를 참조할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전기영동 이동도에서의 변화를 사용하여 IL-1 유전자좌 대립 유전자를 동정하게 된다. 예를 들면, 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP)을 사용하여 돌연변이체와 야생형 핵산 간의 전기영동 이동도 차이를 검출할 수 있다 (문헌[Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86: 2766] 참조, 또한, 문헌[Cotton (1993) Mutat Res 285: 125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73-79] 참조). 샘플의 단일 가닥 DNA 단편 및 대조군 IL-1 유전자좌 대립 유전자를 변성시키고, 복원시킨다. 단일 가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 변화하고, 전기영동 이동도에서 생성되는 변화는 심지어 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편을 표지화하거나 또는 표지된 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 분석시험의 감도는 (DNA보다는) RNA를 사용함으로써 강화될 수 있으며, 여기서 2차 구조는 서열 중 변화에 더 민감하다. 바람직한 실시양태에서, 대상자 방법은 전기영동 이동도 변화를 기준으로 이형접합자 분석을 사용하여 이중 가닥 이형접합자 분자를 분리한다 (문헌[Keen et al. (1991) Trends Genet 7: 5] 참조).
또한 또 다른 실시양태에서, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔에서의 대립 유전자의 이동을 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE)을 사용하여 분석시험하였다 (문헌[Myers et al. (1985) Nature 313: 495] 참조). DGGE를 분석 방법으로 사용하는 경우, 예를 들면, PCR에 의한 고 용융 GC-풍부 DNA의 대략 40 bp의 GC 클램프 (clamp)에 의해 DNA는 완전히 변성되지 않게끔 변형될 것이다. 추가의 실시양태에서, 변성제 구배 대신에 온도 구배를 사용하여 대조군 및 샘플 DNA의 이동도에서의 차이를 확인한다 (문헌[Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265: 12753] 참조).
대립 유전자를 검출하는 다른 기술의 예는 선택적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 선택적 증폭, 또는 선택적 프라이머 연장을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 공지된 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이가 (예를 들면, 대립 유전자 변이체 중에) 중심에 위치한 다음, 오직 완벽한 매치가 발견되는 경우에만 혼성화하는 상태 하에서 표적 DNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다 (문헌[Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86: 6230] 참조). 이러한 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 기술은, 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭된 표적 DNA 또는 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형성 영역에 혼성화된 경우, 올리고뉴클레오티드가 혼성화 막에 부착되고, 표지화된 표적 DNA와 혼성화된 경우, 반응 당 하나의 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험하는 데 사용될 수 있다.
별법으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립 유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적 증폭에 대한 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 분자 중심에서 (증폭이 차별적인 혼성화에 의존하도록) (문헌[Gibbs et al (1989) Nucleic acids Res. 17: 2437-2448] 참조) 또는 한 프라이머의 맨 끝 3' 말단 (여기서, 적절한 상태 하에서, 미스매치는 중합효소 연장을 방지하거나 또는 연장할 수 있음) (문헌[Prossner (1993) Tibtech 11: 238] 참조)에서 해당 돌연변이 또는 다형성 영역을 가질 수 있다. 또한, 돌연변이의 영역에 신규한 제한 부위를 도입하여 분절-기초 검출을 생성하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌[Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6: 1] 참조). 특정한 실시양태에서 증폭용 Taq 리가아제를 사용하여 증폭을 또한 수행할 수 있을 것으로 예상된다 (문헌[Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189] 참조). 이러한 경우, 오직 증폭의 존재 또는 부재를 찾음으로써 특이적 부위에서 공지된 돌연변이의 존재흘 검출하는 것을 가능하게 하는 5' 서열의 3' 말단에서 완벽한 매치가 존재하는 경우에만 라이게이션이 발생하게 된다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들면, 미국 특허 제 4,998,617호 및 문헌[Landegren, U. et al.((1988) Science 241: 1077-1080)]에 기재된 바와 같이, 대립 유전자 변이체의 동정을 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석시험 (OLA)을 사용하여 수행한다. OLA 프로토콜은 표적의 단일 가닥의 접하는 서열과 혼성화할 수 있도록 설계된 두 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 중 하나는 분리 마커, 예를 들면 바이오티닐화된 것에 연결되고, 나머지 하나는 검출가능하게 표지된다. 정확한 상보적 서열이 표적 분자에서 발견된 경우, 올리고뉴클레오티드는 그들의 종결부가 접하고 라이게이션 기질을 생성하도록 혼성화할 것이다. 그 다음, 아비딘 (avidin), 또는 또 다른 바이오틴 리간드을 사용하여 라이게이션하여 표지된 올리고뉴클레오티드를 회수한다. 닉커슨 (Nickerson), D. A. 등은 PCR 및 OLA의 속성을 조합한 핵산 검출 분석시험을 기재하였다 (문헌[Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8923-27] 참조). 이 방법에서, PCR을 사용하여 표적 DNA의 지수 함수 증폭을 얻은 다음, OLA를 사용하여 검출한다.
이 OLA 방법에 기초한 몇몇 기술들이 개발되었고, IL-1 유전자좌 반수체형의 대립 유전자를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,593,826호는 3'-아미노기 및 5'-인산화된 올리고뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 포스포르아미데이트 (phosphoramidate) 연결을 갖는 공액체를 형성하는 OLA를 개시하고 있다. 문헌[Tobe et al.((1996) Nucleic acids Res 24: 3728)]에 기재된 OLA의 또 다른 변이에서, OLA이 PCR과 조합되면 단일 미세역가 웰 (microtiter well) 중에서 두 대립 유전자를 타이핑할 수 있다. 각각의 대립 유전자-특이적 프라이머를 유니크 합텐 (hapten), 즉, 디곡시게닌 (digoxigenin) 및 플루오레세인 (fluorescein)으로 표식함으로써, 각각의 OLA 반응은 상이한 효소 리포터 (reporter), 알랄리성 포스파테아제 (phosphatase) 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)로 표지된 합텐 특이적 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이 시스템은 두 상이한 색상이 생산되게 하는 고 처리량 형식을 사용한 두 대립 유전자의 검출을 가능케 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 골다공증을 발현하는 소인을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 IL-1 유전자좌 반수체형의 하나 이상의 대립 유전자에 대해 5' 및 3'을 혼성화하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 비롯한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 후속 분석을 위해 편리한 크기의 PCR 생성물을 생성하기 위해 PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 25 내지 2500 개의 염기쌍, 바람직하게는 약 100 내지 약 500 개의 염기쌍을 혼성화시켜야 한다.
본 발명의 진단 방법에 사용하기에 특히 바람직한 프라이머는 서열 번호 1-7을 포함한다.
본 발명의 방법에 의한 IL-1 다형성 대립 유전자 증폭 및 검출에 사용되는 추가의 올리고뉴클레오티드의 설계는 인간 IL-1 유전자좌를 함유하는 인간 염색체 2ql3으로부터의 업데이트된 서열 정보 및 이 유전자좌에 이용가능한 업데이트된 인간 다형성 정보 양쪽 모두를 이용할 수 있음으로써 용이해질 수 있다. 예를 들면, IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN에 대한 DNA 서열은 진뱅크 기탁 번호 X03833 2, 진뱅크 기탁 번호 X0450 및 진뱅크 기탁 번호 X64532를 각각 포함한다. 이들 유전자에서 인간 다형성의 검출용으로 적합한 프라이머를 이 서열 정보 및 프라이머 서열의 설계 및 최적화로 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 용이하게 설계할 수 있다. 이러한 프라이머 서열의 최적 설계는 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 프라이머 선택 프로그램, 예를 들면 프라이머 2.1, 프라이머 3 또는 진피셔 (GeneFisher)를 사용함으로써 달성될 수 있다 (또한, 문헌[Nicklin M. H. J., Weith A. Duff G. W.,"A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1α, interleukin-1β, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995); Nothwang H. G., et al. "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2ql3" Genomics 41: 370 (1997); Clark, et al. (1986) Nucl. Acids. Res., 14: 7897-7914 (문헌[Nucleic acids Res., 15: 868 (1987)] 및 URL http://www.gdb.org의 게놈 데이터베이스 (Genome Database; GDB) 프로젝트에 공개된 오자가 나타난 것으로 보임)] 참조).
키트에서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 임의의 다양한 자연적 및/또는 합성 조성물, 예를 들면 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 단편, cDNAs, 합성 펩티드 핵산 (PNAs) 등일 수 있다. 또한, 분석시험 키트 및 방법은 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석시험에서의 동정을 용이하게 할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예는 방사선-표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자기 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등을 포함한다.
임의적으로, 또한, 키트는 DNA 분취 수단도 포함할 수 있다. DNA 분취 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 기질, 예를 들면 여과지, 엠플리카드 (AmpliCard)TM (University of Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, JW, et al., J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)) 등; DNA 정제 시약, 예를 들면 뉴클레오 (Nucleo) 키트, 용균 완충제, 단백질 분해효소 용액 등; PCR 시약, 예를 들면 1O x 반응 완충제, 열안정성 중합효소, dNTPs 등; 및 대립 유전자 검출 수단, 예를 들면 HinfI 제한 효소, 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드, 건조된 혈액으로부터 이중 PCR에 대한 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
약물유전체학
골다공증 발현에 대한 감수성과 관련된 특정 대립 유전자에 대한 지식은 단독으로 또는 동일한 조건에 기여하는 다른 유전적 결함에 대한 정보와 함께 "약물유전체학"의 목표인 개인의 유전적 프로파일에 따른 예방 또는 치료의 상업화 (customization)가 가능하게 한다. 따라서, 개인의 IL-1 프로파일을 골다공증에 대한 집단 프로파일에 비교하여 안전한 것으로 예측되고 특정 환자 또는 환자 집단 (즉, 동일한 유전자 변이를 갖는 환자의 군)에 효능이 있는 약물 또는 다른 치료 요법을 선택하거나 또는 설계할 수 있게 한다.
또한, 유전적 프로파일에 기초한 최고의 임상적 이익을 나타낼 것으로 예측된 표적 집단에 대한 능력은 1) 기존의 시판되는 약물의 재위치화; 2) 안전성 또는 효능 제한의 결과로 이의 임상적 개발이 끊겼으며 환자 아군-특이적인 약물 후보의 구출 (rescue); 및 3) 후보 치료제의 가속화된 비용이 적게 드는 개발 및 보다 최적의 약물 표지화 (예를 들면, 원인이 되는 돌연변이 상에 다양한 용량의 약제의 효과를 측정하는 것이 유효한 용량을 최적화하는 데 유용하기 때문)를 가능하게 할 수 있다.
단백질 (예를 들면, IL-1α, IL-1β 또는 IL-IRa), mRNA 및(또는) 전사 수치를 결정함으로써 특정 치료제를 사용한 개인의 치료를 모니터링할 수 있다. 그 다음, 검출되는 수치에 따라, 치료 요법을 유지시키거나 조정 (용량의 증가 또는 감소)할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대상자에 대한 약제 투여의 유효성은 (i) 약제를 투여하기 전 대상자로부터 투여전 (preadministration) 샘플을 얻는 단계; (ii) 상기 투여전 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 수치 또는 양을 검출하는 단계; (iii) 대상자로부터 하나 이상의 투여후 (post-administration) 샘플을 얻는 단계; (iv) 상기 투여후 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수치를 검출하는 단계; (v) 상기 투여전 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 투여후 샘플에서 대응하는 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 경우와 각각 비교하는 단계; 및 (vi) 따라서, 대상자에 대한 약제의 투여를 변화시키는 단계를 포함한다.
또한, 대상자의 세포를 치료제의 투여 전후에 얻어 IL-1 유전자 이외의 유전자의 발현 수치를 검출함으로써 치료제가 유해할 수 있는 유전자의 발현을 증가시키지 않거나 또는 감소시키는 지를 확인할 수 있다. 이는 예를 들면, 전사 프로파일링 방법을 사용함으로써 행해질 수 있다. 따라서, 생체내에서 치료제에 노출된 세포로부터의 mRNA 및 치료제에 노출되지 않은 동일한 타입의 세포로부터의 mRNA를 역 전사시키고, 다수의 유전자로부터 DNA를 함유하는 칩에 혼성화함으로써 치료제로 처리된 세포 및 치료제로 처리되지 않은 세포의 유전자의 발현을 비교할 수 있다.
골다공증 치료제
골다공증 치료제는 대상자에서 골다공증의 증상을 예방하거나 또는 이의 발현을 늦추거나 또는 경감시키는 임의의 약제 또는 치료 요법 (약제 (제약상), 건강보조식품 및 외과 수술적 수단을 포함)을 지칭한다. 치료제는 폴리펩티드, 펩티드 유사체, 핵산 또는 다른 무기 또는 유기 분자, 바람직하게는 비타민, 무기질 및 다른 영양분을 비롯한 "소 분자"일 수 있다. 바람직하게는, 치료제는 천연적으로 발생하는 폴리펩티드의 효과를 모사하거나 또는 증강 (작동제화) 또는 억제 (길항작용)함으로써 IL-1 폴리펩티드의 하나 이상의 활성, 예를 들면 수용체와의 상호작용을 조절할 수 있다. 작동제는 야생형 단백질 또는 야생형의 하나 이상의 생체 활성, 예를 들면, 수용체 결합 활성을 갖는 그의 유도체일 수 있다. 또한, 작동제는 유전자의 발현을 상향조절하거나 또는 단백질의 하나 이상의 생체 활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. 또한, 작동제는 폴리펩티드와 또 다른 분자, 예를 들면 수용체와의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 단백질과 또 다른 분자 사이의 상호작용, 예를 들면, 신호 형질도입 또는 번역 후 처리를 차단하는 수용체 또는 약제 (예를 들면, IL-1 전환 효소 (ICE) 억제제)를 억제하거나 또는 감소시키는 화합물일 수 있다. 따라서, 바람직한 길항제는 수용체에 대한 결합을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 수용체의 후속 활성화을 차단하는 화합물이다. 또한, 상기 길항제는 유전자의 발현을 하향조절하거나 또는 존재하는 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수 있다. 상기 길항제는 폴리펩티드, 예를 들면, 표적 펩티드, 예를 들면 수용체와 상호작용할 수 있지만, 수용체의 활성화를 촉진하지 않는 폴리펩티드의 형태의 우성 음성 형태일 수 있다. 또한, 상기 길항제는 폴리펩티드, 안티센스 핵산, 또는 RNA와 특이적으로 상호결합할 수 있는 리보자임의 우성 음성 형태를 코딩하는 핵산일 수 있다. 또한, 다른 길항제들은 폴리펩티드에 결합하고 그의 작용을 억제하는 분자이다. 이러한 분자는 펩티드, 예를 들면 생물학적 활성을 갖지 않고, 수용체에 대한 결합을 억제하는 표적 펩티드의 형태를 포함한다. 따라서, 이러한 펩티드는 단백질의 활성 부위에 결합하고 표적 펩티드와 상호작용하는 것을 방지한다. 또한, 다른 길항제들은 결합이 폴리펩티드의 생물학적 기능을 방해하도록 분자의 에피토프 (epitope)와 특이적으로 상호작용하는 항체를 포함한다. 또한, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 길항제는 소 분자, 예를 들면 폴리펩티드와 표적 수용체 간의 상호작용을 억제할 수 있는 분자이다. 별법으로, 소 분자는 수용체 결합 부위 외의 부위와 상호작용함으로써 길항제로서 기능할 수 있다.
IL-1 유전자와 연관 비평형에 있는 유전자에 의해 코딩되는 IL-1 (예를 들면IL-1α, IL-1β 또는 IL-1 수용체 길항제) 또는 단백질의 조절제는 단백질, 펩티드, 펩티드 유사체, 소 분자, 또는 핵산을 비롯한 임의의 타입의 화합물을 포함할 수 있다. 바람직한 작동제는 핵산 (예를 들면, IL-1 단백질에 의해 상향조절 또는 하향조절되는 IL-1 단백질 또는 유전자 코딩), 단백질 (예를 들면, 그에 의해 상향조절 또는 하향조절되는 IL-1 단백질 또는 단백질) 또는 소 분자 (예를 들면, IL-1 단백질 발현 또는 결합을 조절하는 것)를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석시험을 사용하여 동정될 수 있는 바람직한 길항제는 IL-1 전사 및(또는) 단백질 활성을 억제하거나 또는 억압하는 작용을 하는 핵산 (예를 들면 단일 (안티센스) 또는 이중 가닥 (삼중체) DNA 또는 PNA 및 리보자임), 단백질 (예를 들면 항체) 및 소 분자를 포함한다.
유효 용량
예를 들면, LD50 (집단 중 50 %에게 치명적인 용량) 및 Ed50 (집단 중 50 %에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하는 경우, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약상 절차에 의해 이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능을 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있지만, 비감염 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위해 영향받은 조직의 부위로 이러한 화합물들을 표적화하는 설계 전달 시스템에 주의를 기울여야 한다.
세포 배양물 분석시험 및 동물 연구로부터 얻은 데이터를 인간에 사용하기 위한 투여량의 범위를 공식화하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 또는 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 존재한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이 범위에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물의 경우, 세포 배양물 분석시험으로부터 먼저 치료적으로 유효한 용량을 추정할 수 있다. 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양물에서 결정된 바와 같이 IC50 (즉, 증상 억제 최대값의 반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 인간의 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용할 수 있다. 혈장 중 수치를 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
제제 및 용도
본 발명에 따라 사용되는 조성물을 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화할 수 있다. 따라서, 상기 화합물 및 그들의 생리학상 허용되는 염 및 용매화물을 예를 들면, 주사, 흡입 또는 통기법 (입 또는 코를 통해) 또는 경구, 볼, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여를 위해 제제화할 수 있다.
이러한 요법의 경우, 전신 및 국소 또는 국소화된 투여를 비롯한 다양한 투여 강도에 대해 본 발명의 화합물을 제제화할 수 있다. 일반적으로, 기술 및 제제는 펜실베니아주 이스톤 소재의 미데 퍼블리싱 캄파니 (Meade Publishing Co.), 레밍톤의 파마슈티칼 사이언시스 (Remmington's Pharmaceutical Sciences)에서 찾을 수 있다. 전신 투여의 경우, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사의 경우, 본 발명의 화합물을 액체 용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예를 들면 한크 (Hank)의 용액 또는 린저 (Ringer)의 용액 중에서 제제화할 수 있다. 또한, 화합물을 고체 형태로 제제화할 수 있고, 사용 직전 재용해시키거나 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 동결건조된 형태도 포함된다.
경구 투여의 경우, 조성물은 제약상 허용되는 부형제, 예를 들면 결합제 (예를 들면, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제 (예를 들면, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예를 들면, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들면, 소듐 라우릴 술페이트)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조되는 예를 들면, 정제 또는 캡슐의 형태를 취한다. 정제는 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 예를 들면, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취하거나 또는 사용전 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성되는 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 제약상 허용되는 첨가제, 예를 들면 현탁제 (예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들면, 아티온드 (ationd) 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물성 기름); 및 방부제 (예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)에 의해 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 또한, 제제는 완충제 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물을 조절 방출하도록 적합하게 제제화될 수 있다. 볼 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취한다. 흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압화된 팩으로부터 제공되는 에어로졸 분사 또는 분무기의 형태로 편리하게 전달된다. 가압화된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계측된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입제 또는 통기제에 사용하기 위해 화합물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 기재, 예를 들면 락토오스 또는 전분을 함유하는 예를 들면, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지를 제제화할 수 있다.
주사, 예를 들면, 일시 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용 화합물을 제제화할 수 있다. 주사용 제제를 방부제를 첨가하여 예를 들면, 앰플 또는 다용량 용기 중에서 단위 투여 형태로 제공할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중에서 현탁액, 용액 또는 에멀션의 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예를 들면 현탁제, 안정화제 및(또는) 분산제를 함유할 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 사용전 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균 초순수와 구성되는 분말 형태로 사용될 수 있다.
또한, 화합물은 예를 들면, 통상적인 좌약 기재, 예를 들면 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 직장 조성물, 예를 들면 좌약 또는 보유 관장제 중에서 제제화될 수 있다.
상기한 제제 외에도, 화합물은 또한 데포 (depot) 제제로 제제화될 수 있다. 이러한 긴 작용 제제는 이식 (예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물을 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 거의 난용성 유도체, 예를 들면, 거의 난용성 염으로서 제제화할 수 있다. 다른 적합한 전달 시스템은 장기간 동안 약물을 국부 비침략적으로 전달할 수 있는 가능성을 제공하는 미세구를 포함한다. 이 기술은 염증 또는 허혈을 일으키지 않고 예를 들면, 심장 또는 다른 기관의 임의의 선택된 부로 관상 카테터를 통해 주사될 수 있는 전모세혈관 크기의 미세구를 사용한다. 투여된 치료제는 천천히 이들 미세구로부터 방출되고, 주위 조직 세포 (예를 들면 내피세포)에 의해 취해진다.
또한, 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적절한 침투제를 제제 중에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 경점막 투여 담즙 염 및 후시드산 유도체를 포함한다.
또한, 계면활성제를 사용하여 투과를 용이하게 할 수 있다. 경점막 투여는 비강 분사를 통해 또는 좌약을 사용하여 이루어질 수 있다. 국소 투여의 경우, 본 발명의 올리고머를 일반적으로 당업계에 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제제화한다. 세척 용액을 국부적으로 사용하여 상해 또는 염증를 치료함으로써 치유를 가속화할 수 있다.
조성물은 필요에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 (dispenser) 장치 중에서 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 포일, 예를 들면 블리스터 팩 (blister pack)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치를 투여 지침에 따라 동반하여 사용할 수 있다.
치료제 동정 분석시험
골다공증의 발현을 일으키거나 또는 이에 기여하는 돌연변이의 동정에 기초하여, 본 발명은 치료제를 동정하는 세포-기초 또는 무세포 분석시험을 추가의 특징으로 한다. 한 실시양태에서, IL-1 수용체, 또는 그의 세포막의 외부 표면에서 IL-1 유전자와 연관 비평형에 있는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포를 단독의 시험 화합물의 존재 하에서 또는 시험 화합물 및 또 다른 단백질의 존재 하에서 인큐베이션하고, 예를 들면, 마이크로피지오메터 (microphysiometer)를 사용함으로써 시험 화합물과 수용체 간의 상호작용 또는 단백질 (바람직하게는 테깅된 단백질)과 수용체 간의 상호작용을 검출한다 (문헌[McConnell et al. (1992) Science 257: 1906] 참조). 수용체와 시험 화합물 또는 단백질 간의 상호작용은 배지의 산도의 변화에 따라 마이크로피지오메터에 의해 검출된다. 따라서, 이 분석시험 시스템은 예를 들면, 단백질-수용체 상호작용을 방해함으로써 기능하는 분자 길항제, 뿐만 아니라 예를 들면, 수용체를 활성화시킴으로써 기능하는 분자 작동제를 동정하는 수단을 제공한다.
또한, 세포 또는 무세포 분석시험을 사용하여 mRNA를 조절하고, mRNA의 번역을 조절하거나, 또는 mRNA 또는 단백질의 안정성을 조절하는, IL-1 유전자 또는 이와 연관 비평형에 있는 유전자의 발현을 조절하는 화합물을 동정할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, IL-1, 또는 다른 단백질을 생산할 수 있는 세포를 시험 화합물을 사용하여 인큐베이션하고, 세포 배지에서 생성된 단백질의 양을 측정하고, 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포로부터 제조된 것과 비교한다. 단백질과 비교한 화합물의 특이성을 다양한 대조군 분석, 예를 들면, 하나 이상의 대조군 유전자의 발현을 측정함으로써 확인할 수 있다. 특히, 이 분석시험을 사용하여 안티센스, 리보자임 및 삼중체 화합물의 효능을 결정할 수 있다.
또한, 무세포 분석시험을 사용하여 단백질과 상호작용하여 단백질의 활성을 변형시킬 수 있는 화합물을 동정할 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들면, 단백질의 구조를 변형시킴으로써 그의 수용체에 결합할 수 있는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 화합물을 동정하는 무세포 분석시험은 필수적으로 결합 파트너의 존재 또는 부재시 단백질 및 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리를 함유하는 반응 혼합물 중에 존재한다. 시험 화합물은 예를 들면, 결합 파트너의 유도체, 예를 들면 생물학적 비활성 표적 펩티드, 또는 소 분자일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 예시적인 스크리닝 분석시험은 단백질 또는 그의 기능적 단편을 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리를 접촉시키고 착물의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출 목적을 위해, 특이적 마커 및 상이한 마커로 표지된 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리를 사용하여 분자를 표지화할 수 있다. 그 다음, 시험 화합물과 단백질 또는 그의 단편의 상호작용은 인큐베이션 단계 및 세척 단계 후 두 표지의 양을 결정함으로써 검출될 수 있다. 세척 단계 후 두 표지의 존재는 상호작용을 나타낸다.
또한, 분자들 간의 상호작용을 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR), 광학적 현상을 검출하는 실시간 BIA (바이오몰레큘러 인터엑션 에널리시스 (Biomolecular Interaction Analysis), 파마시아 바이오센서 아베 (Pharmacia Bio센서 AB))를 사용하여 동정될 수 있다. 검출은 생특이적 계면에서 거대분자의 질량 농도에서의 변화에 의존하고, 상호작용제의 표지화를 필요로 하지 않는다. 한 실시양태에서, 시험 화합물의 라이브러리는 예를 들면, 미세 유동 (micro-flow) 세포의 한 벽을 형성하는 센서 표면 상에 고정화될 수 있다. 그 다음, 단백질 또는 그의 기능적 단편을 함유하는 용액을 연속적으로 센서 표면으로 유동시킨다. 신호 기록 상에 나타나는 공명 각의 변화는 발생한 상호작용을 표시한다. 이 기법은 예를 들면, 파마시아사에 의한 비아테크놀로지 핸드북 (BIAtechnology Handbook)에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 예시적인 스크리닝 분석시험은 (a) (i) IL-1 또는 다른 단백질, (ii) 적절한 수용체, 및 (iii) 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 (b) 단백질 및 수용체의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 시험 화합물의 부재 하에서의 상호작용에 비해 시험 화합물의 존재 하에서의 단백질 및 수용체의 상호작용에서의 통계적으로 유의적인 변화 (증강 또는 억제)는 잠재적 길항제 (억제제)를 표시한다. 이 분석시험의 화합물은 동시에 접촉할 수 있다. 별법으로, 먼저 단백질을 적절한 시간 동안 시험 화합물과 접촉시킨 후, 수용체를 반응 혼합물에 첨가한다. 상기 화합물의 효능은 시험 화합물의 다양한 농도를 사용하여 얻어진 데이터로부터 용량 반응 곡선을 형성시킴으로써 평가될 수 있다. 더욱이, 대조군 분석시험을 수행하여 비교에 대한 기준을 제공할 수도 있다.
단백질과 수용체 사이의 착물 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 착물 형성의 조절은 면멱분석시험 또는 크로마토그래피 검출에 의해 예를 들면, 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들면 방사표지된, 형광 표지된, 또는 효소적으로 표지된 단백질 또는 수용체를 사용하여 정량화될 수 있다.
전형적으로, 단백질 또는 수용체를 고정화하여 단백질의 한쪽 또는 양쪽 모두의 비착화된 형태로부터 착물의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 분석시험의 자동화를 가능케 하는 것이 바람직할 것이다. 단백질 및 수용체의 결합을 시약을 함유하기 적합한 임의의 용기 중에서 수행할 수 있다. 그 예들은 미세역가판, 시험 튜브 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질이 메트릭스에 결합되게 하는 도메인을 첨가시키는 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스퍼라아제 융합 단백질을 글루타티온 세파로오스 비드 (미소우리주 세이트 루이스 소재의 시그마 케미칼 (Sigma Chemical)) 또는 글루타티온 유도화된 미세역가판으로 흡착시킨 다음, 수용체, 예를 들면 35S-표지된 수용체, 및 시험 화합물과 합치고, 혼합물을 약간 더 엄격한 상태가 바람직할 수 있지만 예를 들면, 염 및 pH에 대한 생리학적 상태에서 착물을 형성하는 상태 하에서 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 비드를 세척하여 임의의 비결합된 표지를 제거하고, 매트릭스를 고정화시키고, 방사선표지를 직접 (예를 들면, 섬광체 (scintillant)에 위치한 비드), 또는 착물이 추후 해리된 후 상청액 중에서 결정한다. 별법으로, 착물을 SDS-PAGE에 의해 분리되는 메트릭스로부터 해리시킬 수 있고, 비드 분획물 중에서 발견되는 단백질 또는 수용체의 양을 첨부되는 실시예에 기재된 것과 같은 표준 전기영동 기술을 사용하여 겔로부터 정량화할 수 있다. 또한, 단백질을 메트릭스 상에 고정하는 다른 기술도 대상자에서 분석시험에 사용하기에 이용가능하다. 예를 들면, 단백질 또는 수용체를 바이오틴 및 스트렙타비딘의 공액을 사용하여 고정화시킬 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 제작하여 작동제 및 길항제를 동정하거나 또는 후보 치료제의 안전성 및 효능을 확인할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 적절한 내인성 프로모터의 조절 하에서 또는 이형 프로모터의조절 하에서 재협착의 원인이 되는 돌연변이를 함유하는 비-인간 동물을 포함할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물은 적절한 프로모터 또는 그의 단편의 조절 하에서 트랜스진, 예를 들면 리포터 유전자를 함유하는 동물일 수 있다. 이들 동물은 예를 들면, 유전자 발현을 조절함으로써 예를 들면, IL-1 단백질의 생산을 조절하는 약물을 동정하는 데 유용하다. 트랜스제닉 비-인간 동물을 얻는 방법 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 원인이 되는 돌연변이의 발현은 예를 들면, 원하는 패턴으로의 발현을 조절하는 시스-작용 서열을 사용하는 세포, 조직 또는 발달 단계의 특이적 부분집합 (subset)에 한정된다. 본 발명에서, 단백질의 이러한 모자이크 발현은 많은 형태의 계통 분석에 필수적일 수 있고, 이는 또한 예를 들면, 다른 정상 배아 내의 조직의 작은 패치에서 발달을 전체적으로 변화시킬 수 있는 발현 수치의 영향을 평가는 수단을 제공할 수 있다. 이를 위해, 조직-특이적 조절 서열 및 조건적 조절 서열을 사용하여 특정한 공간 패턴에서 돌연변이의 발현을 조절할 수 있다. 더욱이, 예를 들면, 조건적 재조합 시스템 또는 원핵 전사 조절 서열에 의해 일시적 패턴의 발현을 제공할 수 있다. 돌연변이의 발현을 가능케 하는 유전적 기술은 생체내 부위-특이적 유전자 조작을 통해 조절될 수 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 모든 트랜스제닉 동물은 다수의 그들의 세포 내에 본 발명의 원인이 되는 돌연변이 트랜스진을 포함하며, 여기서 트랜스진은 "숙주 세포"의 표현형을 변화시킨다. 예시적인 실시양태에서, 박테리오파지 P1의 cre/loxP 재조합 효소 시스템 (문헌[Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6236; Orban et al. (1992) PNAS 89: 6861-6865] 참조) 또는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합 효소 시스템 (문헌[O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355]; PCT 공보 WO 92/15694 참조)을 사용하여 생체내 부위-특이적 유전적 재조합 시스템을 생성할 수 있다. Cre 재조합 효소는 loxP 서열 사이에 위치한 개입 표적 서열의 부위-특이적 재조합을 촉매화한다. loxP 서열은 Cre 재조합 효소가 결합하는 34 개의 염기쌍 뉴클레오티드 반복 서열이고, Cre 재조합 효소 매개 유전적 재조합을 필요로 한다. loxP 서열의 배향은 Cre 재조합 효소가 존재하는 경우 개입 표적 서열이 절단되거나 또는 역전되는지에 따라 결정 (문헌[Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514] 참조)되며, loxP 서열이 직접적 반복으로서 배향된 경우 표적 서열의 절단을 촉매화하고, loxP 서열이 역전 반복으로서 배향된 경우 표적 서열의 역전을 촉매화한다.
따라서, 표적 서열의 유전적 재조합은 Cre 재조합 효소의 발현에 의존적이다. 재조합 효소의 발현은 외부로 첨가되는 약제에 의해 유도성이거나 또는 억제성인 조절적인 통제, 예를 들면, 조직-특이적, 발달 단계-특이적인 통제를 받게 되는 프로모터 요소에 의해 조절될 수 있다. 이 조절된 통제는 재조합 효소 발현이 프로모터 요소에 의해 매개되는 세포에서 오직 표적 서열만을 유전적으로 재조합시킨다. 따라서, 원인이 되는 돌연변이 트랜스진의 발현의 활성화는 재조합 효소 발현의 통제를 통해 조절될 수 있다.
원인이 되는 돌연변이 트랜스진의 발현을 조절하는 cre/loxP 재조합 효소 시스템의 사용은 Cre 재조합 효소 및 대상자 단백질 양쪽 모두를 코딩하는 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물의 제작을 필요로 한다. Cre 재조합 효소 및 재협착 원인성 돌연변이 트랜스진 양쪽 모두를 함유하는 동물은 "이중" 트랜스제닉 동물의 제작을 통해 제공될 수 있다. 이러한 동물을 제공하는 편리한 방법은 각각 트랜스진을 함유하는 두 트랜스제닉 동물을 교미시키는 것이다.
트랜스진의 발현을 용이하게 하기 위해 동시에 발현되는 원핵 단백질을 필요로 하는 원핵 프로모터 서열을 사용하여 유사한 조건적 트랜스진을 제공할 수 있다. 예시적인 프로모터 및 대응하는 트란스-활성화 원핵 단백질은 미국 특허 제 4,833,080호에 제공되어 있다.
더욱이, 조건적 트랜스진의 발현은 트란스활성화 단백질, 예를 들면 재조합 효소 또는 원핵 단백질을 코딩하는 유전자가 조직으로 전달되는 유전자 요법 유사 방법에 의해 유도되고, 예를 들면 세포-타입 특이적 방식으로 발현될 수 있다. 이 방법에 의해, 트랜스진 트란스활성화제 도입에 의해 "가동 (turn on)"될 때까지 성인기까지는 침묵될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명의 "트랜스제닉 비-인간 동물"은 비-인간 동물의 생식선으로 트랜스진을 도입시킴으로써 생산된다. 다양한 발달 단계에서의 배아 표적 세포를 사용하여 트랜스진을 도입할 수 있다. 배아 표적 세포의 발단 단계에 따라 상이한 방법을 사용한다. 본 발명을 실시하는 데 사용되는 임의의 동물의 특이적 계통(들)을 일반적인 양호한 건강, 우수한 배아 생산, 배아 중에서의 우수한 전핵 가시도 및 우수한 번식 적응도에 대해 선택한다. 또한, 반수체형도 중요한 인자이다. 예를 들면, 트랜스제닉 마우스가 생산되어야 하는 경우, 균주, 예를 들면 C57BL/6 또는 FVB 세포주 (메인주 바 하버 소재의 잭슨 라보라토리 (Jackson Laboratory))가 종종 사용된다. 바람직한 균주는 H-2b, H-2d 또는 H-2q 반수체형, 예를 들면 C57BL/6 또는 DBA/1을 사용하는 것들이다. 본 발명을 실시하는 데 사용되는 계통(들)은 그 자체로 트랜스제닉일 수 있고(있거나) 녹아웃일 수 있다 (즉, 부분적으로 또는 완전히 억제된 하나 이상의 유전자를 갖는 동물로부터 얻어짐).
한 실시양태에서, 트랜스진 구조체를 단일 단계 배아로 도입한다. 접합체는 미세주사에 대한 최고의 표적이다. 마우스에서, 수컷 전핵은 1-2 pl의 DNA 용액을 재생가능하게 주사할 수 있는 대략 20 마이크로미터의 크기에 도달한다. 유전자 전이에 대한 표적으로서의 접합체의 사용은 대부분의 경우 주사된 DNA가 제 1 분절 전에 숙주 유전자로 혼입될 것이라는 점에서 주요한 이점을 갖는다 (문헌[Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438-4442] 참조). 결과적으로, 트랜스제닉 동물의 모든 세포는 혼입된 트랜스진을 가질 것이다. 또한, 이는 일반적으로, 배아 세포 중 50 %가 트랜스진을 품을 것이기 때문에 시조의 자손에게 트랜스진을 유효하게 전달하게 할 것이다.
정상 수정된 배아를 전핵이 나타날 때까지 적합한 배지 중에서 인큐베이션한다. 이 무렵, 트랜스진을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하기하는 바와 같이 여성 또는 수컷 전핵으로 도입시킨다. 일부 종에서, 예를 들면 마우스, 수컷 전핵이 바람직하다. 난자 핵 또는 접합체 여성 전핵에 의해 처리되기 전에 접합체의 수컷 DNA 보체에 외인성 유전적 물질을 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 난자 핵 또는 여성 전핵이, 아마도 수컷 DNA의 프로타민을 히스톤으로 대체하여 여성 및 수컷 DNA 보체의 조합을 용이하게 함으로써 이배수체 접합체 형성을 용이하게 함으로써 수컷 DNA 보체에 영향을 미치는 분자를 방출하는 것으로 생각된다. 따라서, 외인성 유전적 물질을 여성 전핵에 의한 영향을 받기 전에 DNA의 수컷 보체 또는 DNA의 임의의 다른 보체에 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 수컷 및 여성 전핵이 잘 분리되고 양쪽 모두 세포막에 근접하여 위치하는 경우인 수컷 전핵의 형성 후 가능한 한 빨리 외인성 유전적 물질을 조기 수컷 전핵에 첨가한다. 별법으로, 외인성 유전적 물질을 탈응축을 하도록 유도한 후 정자의 핵에 첨가할 수 있다. 그 다음, 외인성 유전적 물질을 함유하는 정자를 난자에 첨가할 수 있거나 또는 탈응축된 정자를 그 후 가능한 한 빨리 트랜스진 구조체를 갖는 난자에 첨가할 수 있다.
트랜스진 뉴클레오티드 서열을 배아로 도입시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들면, 미세주사, 전기충격법 (electroporation) 또는 리포펙션 (lipofection)에 의해 달성될 수 있다. 트랜스진 뉴클레오티드 서열을 배아로 도입시킨 후, 배아를 다양한 시간 동안 시험관내 인큐베이션하거나 또는 대리 숙주로 재이식하거나 또는 양쪽 모두일 수 있다. 성숙화를 위한 시험관내 인큐베이션은 본 발명의 범위에 속한다. 한 통상의 방법을 배아를 종에 따라 약 1-7 일 동안 시험관내 인큐베이션한 다음, 이들을 대리 숙주로 재이식하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 접합체는 필수적으로 완전한 유기체로 발현될 수 있는 이배수체 세포를 형성한다. 일반적으로, 접합체는 생식 세포 또는 생식 세포들로부터 두 단배체 핵의 융합에 의해 천연적으로 또는 인공적으로 형성되는 핵을 함유하는 난자를 포함하게 된다. 따라서, 생식 세포 핵은 천연적으로 상용가능한 것들, 즉 분화할 수 있고 기능성 유기체로 발현될 수 있는 생존가능한 접합체를 제공하는 것들이어야 한다. 일반적으로, 정배수체 접합체가 바람직하다. 홀배수체 접합체가 얻어진 경우, 다수의 염색체는 생식 세포가 유래하는 유기체의 정배수체 수에 대해 1을 초과하는 만큼 변하지 않아아 한다.
유사한 생물학적 고려사항 외에도, 물리적 고려사항도 접합체의 핵에 첨가될 수 있거나 또는 접합체 핵의 부분을 형성하는 유전적 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전적 물질의 양 (예를 들면, 부피)을 지배한다. 유전적 물질을 제거하지 않으면, 첨가될 수 있는 외인성 유전적 물질의 양이 물리적으로 붕괴되지 않고 흡수되는 양에 의해 제한된다. 일반적으로, 삽입되는 외인성 유전적 물질의 부피 약 10 피코리터를 초과하지 않는다. 물리적 첨가 효과는 접합체의 생존성을 물리적으로 파괴할 만큼 크지는 않아야 한다. DNA 서열의 수 및 다양성의 생물학적 한계는 특정 접합체 및 외인성 유전적 물질의 기능에 따라 변하게 되며, 생성되는 접합체의 외인성 유전적 물질을 비롯한 유전적 물질이 분화 및 기능적 유기체로의 접합체의 발현을 생물학적으로 개시하고 유지시킬 수 있어야 하기 때문에 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
접합체로 첨가되는 트랜스진 구조체의 카피의 수는 첨가되는 외인성 유전적 물질의 총량에 의존적이고, 유전적 형질전환이 일어나게 할 수 있는 양이게 된다. 이론적으로, 오직 하나의 카피만을 필요로 하지만, 일반적으로는 한 카피가 기능적인지 보장하기 위해 다수의 카피, 예를 들면 1,000-20,000 개의 카피의 트랜스진 구조체를 사용한다. 본 발명의 경우, 종종 하나를 초과하는 기능성 카피의 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열을 가져 외인성 DNA 서열의 표현형 발현을 강화하는 것이 유리할 것이다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포 또는 유전적 구조물에 유해하지 않은 한, 외인성 유전적 물질을 핵 유전적 물질로 첨가할 수 있는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 외인성 유전적 물질을 우선적으로 미세주사에 의해 핵 유전적 물질에 삽입할 수 있다. 세포 및 세포 구조물의 미세주사는 당업계에 공지되어 있고, 당업계에서 사용된다.
표준 방법을 사용하여 재이식을 수행한다. 통상, 대리 숙주를 마취시키고, 배아를 난관에 삽입한다. 특정 숙주로 이식되는 다수의 배아는 종에 따라 다르지만, 통상 천연적으로 생성되는 다수의 후손 종과 동등하게 된다.
대리 숙주의 트랜스제닉 후손을 임의의 적합한 방법에 의한 트랜스진의 존재 및(또는) 발현에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 종종 적어도 일부의 트랜스진에 상보적인 프로브를 사용하여 써던 (Southern) 블롯 또는 노던 블롯 분석에 의해 수행된다. 트랜스진에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 (Western) 블롯 분석은 트랜스진 생성물의 존재에 대한 스크리닝에 대한 별법의 또는 추가적인 방법으로 사용될 수 있다. 전형적으로, DNA는 꼬리 조직으로부터 제조되고, 트랜스진용 써던 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 별법으로, 비록 이 분석에 임의의 조직 또는 세포 타입을 사용할 수 있지만, 트랜스진을 최고의 수치로 발현할 것으로 생각되는 조직 또는 세포를 써던 분석 또는 PCR을 사용하여 트랜스진의 존재 및 발현에 대해 시험한다.
트랜스진의 존재를 평가하는 별법의 또는 추가적인 방법은 적합한 생화학적 분석시험, 예를 들면 효소 및(또는) 면역학적 분석시험, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유세포 분석 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 혈액의 분석도 혈중 트랜스진의 존재 생성물을 검출할 뿐만 아니라 트랜스진의 다양한 타입의 혈액 세포 및 다른 혈액 구성 성분의 수치에 대한 영향을 평가하는 데 유용할 수 있다.
트랜스제닉 동물을 적합한 파트너와 교배시킴으로써, 또는 트랜스제닉 동물로부터 얻어진 난자 및(또는) 정자의 시험관내 수정에 의해 트랜스제닉 동물의 자손을 얻을 수 있다. 파트너와의 교배를 수행하는 경우, 파트너 트랜스제닉 및(또는) 녹아웃이거나 또는 아닐 수 있으며, 이것이 트랜스제닉인 경우, 동일한 트랜스진 또는 상이한 트랜스진, 또는 양쪽 모두를 함유할 수 있다. 별법으로, 파트너는 모체 계통일 수 있다. 시험관내 수정이 사용되는 경우, 수정된 배아를 대리 숙주에 이식하거나 또는 시험관내 인큐베이션하거나, 또는 양쪽 모두일 수 있다. 이 방법들을 사용하여, 상기한 방법 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 트랜스진의 존재에 대해 자손을 평가할 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 트랜스제닉 동물은 외인성 유전적 물질을 포함하게 된다. 게다가, 이러한 실시양태에서, 서열은 바람직하게는 특이적 타입의 세포 중에서 트랜스진 생성물을 발현시키는 전사 통제 요소, 예를 들면 프로모터에 부착되게 된다.
또한, 레트로바이러스 감염을 사용하여 트랜스진을 비-인간 동물로 도입할 수 있다. 발현되는 비-인간 배아를 포배 단계로 시험관내 배양할 수 있다. 이 기간 동안, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적이 될 수 있다 (문헌[Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260-1264] 참조). 유효하게 감염된 할구를 효소적 처리에 의해 얻어 투명대를 제거한다 (문헌[Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986] 참조). 트랜스진으로 도입시키는 데 사용된 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 트랜스진을 갖는 복제-결손 레트로바이러스이다 (문헌[Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148-6152] 참조). 형질감염은 바이러스-생성 세포의 단층 상에서 할구를 배양함으로써 용이하게 및 유효하게 얻어진다 (문헌[Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383-388] 참조). 별법으로, 감염을 후기 단계에서 수행할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생성 세포를 할강에 주입할 수 있다 (문헌[Jahner et al. (1982) Nature 298: 623-628] 참조). 혼입이 오직 트랜스제닉 비-인간 동물을 형성한 세포의 부분집합 중에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조들은 트랜스진에 대한 모자이크가 된다. 게다가, 시조는 일반적으로 후손에서 분리되는 게놈 중의 상이한 위치에서 트랜스진의 다양한 레트로바이러스 삽입을 함유할 수 있다. 또한, 임신중기 (midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 배아 세포주로 트랜스진을 도입시키는 것도 가능하다 (문헌[Jahner et al. (1982) supra] 참조).
트랜스진 도입에 대한 제 3 타입의 표적 세포는 배아 줄기 세포 (ES)이다. ES 세포는 시험관내 배양되고 배아와 융합된 예비이식 배아로부터 얻어진다 (문헌[Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322: 445-448] 참조). 트랜스진은 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스 매개 형질도입에 의해 ES 세포 유효하게 도입될 수 있다. 그 후, 이러한 형질전환된 ES 세포를 비-인간 동물로부터의 포배와 합칠 수 있다. 그 후, ES 세포는 배아를 콜로니화하고, 생성되는 키메라성 동물의 배아 세포주에 기여한다. 검토를 위해, 문헌[Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468-1474]을 참조할 수 있다.
본 발명은 어떠한 방법으로든 제한적으로 것으로 해석되지 않아야 할 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 발명의 실시는 달리 언급이 없으면 당업계의 기술에 속하는 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)]; 미국 특허 제 4,683,195호; 미국 특허 제 4,683,202호; 및 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984)]을 참조할 수 있다.
참고 문헌
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실시예 1 골다공증 관련성 연구
UCSF 관련성 연구
샌프란치스코 협회의 유니버시티 오브 캘리포니아 (University of California)의 골다공증 골절 연구에 참가한 1,071 명의 대상자로 된 코호트 (cohort)를 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 IL-1 유전자 클러스터에서 유전형 마커에 대해 제노타이핑하였다. 제노타이핑의 결과를 하기 표 1A에 제공한다. 하기 표 1B는 하기 추가로 설명되는 하와이인 골다공증 연구의 결과를 제공한다.
[표 1]
IL-1 유전자 클러스터 유전형 마커의 빈도수
A. UCSF 골다공증 골절 연구 (n = 1,071 카프카스인 여성)
Figure 112006009289660-PCT00001
B. 하와이 골다공증 연구 (n = 208 일본계 미국인 여성)
Figure 112006009289660-PCT00002
626 명의 대상자로 된 랜덤 샘플 대조군 코호트에서, 185 명에서 비척추 골 절이 발생하였다. 이 대상자들을 "비척추 골절"의 분석에 사용하였다.
[표 2]
UCSF SOF 연구에서 시험군, 대조군 및 코호트 샘플에서의 유전형 빈도
Figure 112006009289660-PCT00003
표 2에 도시된 바와 같이, IL-1A (+4845)의 대립 유전자 2는 비척추 골절의 위험의 증가와 관련된다. 또한, IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2는 비척추 골절의 위험의 통계적으로 유의적인 증가와 관련된다. 반대로, 2IL-1RN (+2018)의 대립 유전자는 비척추 골절의 위험에서의 현저한 감소와 관련된다. IL-1A (+4845)의 대립 유전자 2는 비록 통계적으로 유의적이지는 않지만 (RR = 1.8, 95 % CI = 1.0-3.5) 손목 골절의 증가와 관련된다. 총 코호트에서, 대립 유전자 2는 손목 골절의 위험의 증가와 관련된다. 이러한 효과는 HRT 사용자를 제외한 경우 사라진다.
골절의 위험의 증가는 IL-1A (+4845) 및 IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2에 대한 유전자-투여 효과를 나타낸다. 특히, 대립 유전자 2의 카피가 많을수록, 효과가 더 크다. 또한, 골절의 위험의 감소는 IL-1RN (+2018)의 대립 유전자 2에 대한 유전자-투여 효과를 나타낸다. 특이적으로, 대립 유전자 2의 카피가 많을수록 효과가 더 크다. 하기 표 3A에 도시된 바와 같이, 이들 관련성은 HRT 사용자의 제외시 코호트에 대해 진실하다. 하기 표 3B에 도시된 바와 같이, HRT 사용자를 포함한 총 코호트를 고려한 경우, 관련성은 강하지는 않지만 유지된다. 한편, 고관절 골절 및 척추성 척추 골절은 임의의 IL-1 유전적 마커와 관련된 것으로는 보이지 않는다.
[표 3A]
HRT 사용자를 제외한 IL-1 유전형 및 골절
비척추 골절, RH (95 % CI)
Figure 112006009289660-PCT00004
* 연령, 변형된 BMI, 폐경 후 년수, 현재 흡연 및 음주 여부, ERT 사용, 티아지드 디우레틱 (thiazide diuretic) 사용, 건강 상태 설문 조사 (self-reported health status) 및 당뇨병에 대한 조정
# 타입 1,1에 대해 p < 0.05
[표 3B]
HRT 사용자를 포함한 (총 코호트) IL-1 유전형 및 골절
비척추 골절, RH (95 % CI)
Figure 112006009289660-PCT00005
* 연령, 변형된 BMI, 폐경 후 년수, 현재 흡연 및 음주 여부, HRT 사용, 티아지드 디우레틱 사용, 건강 상태 설문 조사 및 당뇨병에 대해 조정
# 타입 1,1에 대해 p < 0.05
골 무기질 밀도 (BMD)를 종골, 원위 반경, 고관절, 대퇴부 경부 및 척추에서 측정하였다. 분석을 연령, 골 무기질 지수 (BMI) 폐경 상태 및 생활 양식 인자에 대해 조정하였다. 하기 표 4A 및 표 4B에 도시된 바와 같이, IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2는 HRT 사용자가 포함되든 제외되든 종골에서 현저하게 높은 BMD와 관련된다 (경향 (trend)의 경우 p < 0.05; 유전형 [2.2] 대 유전형 [1.1]의 경우 p < 0.05).
IL-1B (-511)의 대립 유전자 2는 HRT 사용자를 포함하는 총 코호트에서 종골 에서 현저하게 낮은 BMD와 관련된다 (경향의 경우 p < 0.05; 유전형 [2.2] 대 유전형 [1.1]의 경우 p < 0.05). IL-1B (-511)의 대립 유전자 2는 HRT 사용자를 제외한 경우 종골에서 낮은 BMD에 대한 경향과 관련된다. IL-1 유전형과 다른 부위에서의 BMD 사이의 관련성의 일관적인 패턴은 발견되지 않았다.
[표 4A]
IL-1 유전형 및 골 무기질 밀도
Figure 112006009289660-PCT00006
[표 4B]
HRT 사용자를 제외한 IL-1 유전형 및 골 무기질 밀도,
Figure 112006009289660-PCT00007
* 연령, 변형된 BMI, 폐경 후 년수, 현재 흡연 및 음주 여부, ERT 사용, 티아지드 디유레틱 사용, 건강 상태 설문 조사 및 당뇨병에 대해 조정
+ p (경향) < . 05
# 타입 1,1에 대해 p < . 05
골 손실 비율을 고관절, 대퇴부 경부 및 종골에서 측정하였다. 상기 표 4A 및 표 4B에 도시된 바와 같이, IL-1B (-511)의 대립 유전자 2는 총 코호트 및 HRT 사용자를 제외한 코호트의 경우, 총 고관절에서 높은 골 손실 비율 (경향의 경우 p < 0.05)과 관련된다. IL-1B (-511)의 유전형 [2.2]는 종골에서 높은 골 손실 비율에 대한 경향과 관련된다. IL-1B (-511)의 대립 유전자 2는 대퇴부 경부에서 높은 골 손실 비율에 대한 경향과 관련된다. IL-1B (-511)의 대립 유전자 2의 경우 고관절에서 골 손실 비율에 대한 유전자-투여 효과가 존재한다. 상당한 관련성은 없지만 유사한 것이 대퇴부 경부에서 골 손실 비율의 경우 관측된다. 이들 결과는 분석에서 HRT 사용자를 포함하든지 (표 4A) 또는 제외하든지 (표 4B) 유사하다.
하와이인 골다공증 연구
하와이 골다공증 연구에서 골절을 갖는 100 명의 참가자 및 골절을 갖지 않는 100 명의 참가자를 IL-1 유전자 클러스터에서 유전형 마커에 대해 제노타이핑하였다. 그 결과를 표 1B에 제공한다. 상기 연구중의 참가자는 모두 80세 초반 내지 중반의 일본계 미국인 여성이었다. 하기 임상적 데이터를 분석하였다: 난소적출을 포함한 및 제외한 척추 및 비척추 골절, 난소적출을 받은 대상자를 포함한 및 제외한 원위 및 인접 반경에서의 골 무기질 함유량 (BMC) 및 골밀도 (os calcis). 분석 을 연령, BMI 및 에스트로겐 사용 기간에 대해 조정하였다.
결과
난소적출을 한 대상자 또는 난소적출을 하지 않은 대상자가 포함되는지 여부와 무관하게, IL-1A (+4845)의 대립 유전자 2는 다수의 척추 및 비척추 골절에서의 증가와 강하게 관련된다 (p < 0.018).
IL-1B (-511)의 대립 유전자 2는 원위 반경의 BMC에서의 감소와 관련된다 (p < 0.024). IL-1RN (+2018)의 대립 유전자 2는 골에서의 BMC의 감소와 관련된다 (p < 0.022).
연구 결과에 대한 논의
민족의 역할 IL-1 유전자 클러스터 중의 유전형의 분포는 미국인의 경우 카프카스인 조상 및 일본계 미국인과 매우 상이하며, 이 특이적 연구에서 이들 중 다수가 제 1 세대 이주자이다. 다른 인종 군들의 경우 뚜렷하게 상이한 분포 패턴이 두드러지게 관찰되었다:
중국인 (매우 낮은 빈도의 IL-1RN (+2018) 및 IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2);
아프리카계 미국인 (일본인 집단과 유사한 패턴); 및
라틴아메리카 미국인 (유럽계 카프카스인과 유사한 분포 패턴. 이는 유럽계 조상으로부터 유래한 라틴아메리카 미국인에 대해 특히 들어맞는다. 그러나, 상기 패턴은 유럽계 조상을 갖는 멕시코계 라틴아메리카 미국인에서는 그다지 다르지 않다).
따라서, IL-1RN (+2018)의 유전형은 생물학적 패턴 및 반응을 그다지 정확하게 반영하지 못할 수 있다. IL-1B (-511)가 상기 특이적 반수체형 및 유전형 패턴에 대한 더 정확한 지표일 수 있다. 유사하게, IL-1B (+3954)는 반수체형 패턴에 대한 정확한 마커가 아닐 수 있다. IL-1A (+4954)가 상기 특이적 반수체형 및 유전형 패턴에 대한 더 정확한 지표일 수 있다.
골절 위험 IL-1A (+4845)의 대립 유전자 2 및 IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2는 골절 위험의 증가와 관련된다. 이는 반수체형 패턴 1과의 관련성을 지적한다 (도 3 참조). 종골 BMD는 IL-1B (+3954)의 대립 유전자 2와 관련된다 (반수체형 패턴 1).
반수체형 패턴 1은 IL-1a 및 IL-1b 수치 및 생체 활성을 증가시키지만, 정상 IL-1 수용체 길항제 수치를 제공한다.
골 손실 비율 골 손실 비율은 IL-1B (-511)의 대립 유전자 2 (반수체형 패턴 2)와 관련된다. 반수체형 패턴 2는 정상 수치의 IL-1을 제공하지만, IL-1 수용체 길항제의 수치를 감소시킨다. 실제로는 IL-1 생물학적 활성 및 반응의 증가가 나타난다.
골 무기질 밀도 BMD (또는 BMC)는 종골에서, 및 원위 반경에서 IL-1B (-511) 또는 IL-1RN (+2018) (반수체형 패턴 2)의 대립 유전자 2와 관련된다.
종골에서의 BMD의 증가는 반수체형 패턴 2와 관련된다. 다른 부위에서의 BMD는 이 연구에서 IL-1 마커와 그다지 크게 관련되지 않으며, 이는 통계적 분석의 힘을 잃게 하는 연구 집단의 특이사항 (specifics)에 의해 유발될 수 있다. 유니버시 티 오브 캘리포니아, 샌프란치스코 연구 집단에서 담당할 수 있는 다른 사안들로는 더 양호한 건강, 더 우수한 교육, 연구에의 참여 및 높은 사화 경제적 지위가 있다.
골 리모델링 방법은 골 대사, 골 손실 비율, 피크 골 질량, 생활 양식 인자, 유전적 특징, 처방약의 사용 및 체중을 포함하는 다수의 인자에 의해 조절된다. 골다공증 골절은 골 리모델링, 골 손실 및 노화의 복잡한 방법에서의 종점이다. 골 리모델링 및 이에 따른 골다공증 발현 및 골다공증성 (osteoprotic) 골절의 가능성은 생활사의 상이한 단계에서의 상이한 생물학적 방법에 의해 조절된다. 폐경 후 발병 후 15-10 년에, 에스트로겐 수치의 감소 및 IL-1 수치 및 활성의 증가로 인해 가장 빠른 골 손실이 발생하게 된다. 이 단계에서, 파골세포의 증가된 형성 및 활성화 (증가된 IL-1 수치로 인해)는 골 리모델링 방법을 구동시킨다. 폐경 후 발병 후 15-10 년에서의 IL-1 수치의 증가는 IL-1 수용체 길항제의 수치보다 중요할 수 있다. 폐경 후 대략 10 년 동안, 골 리모델링으로 인한 생물학적인 변화로 인해 골 손실 비율은 둔화된다. 이 단계에서, 골모세포의 감소된 형성은 골 리모델링을 떠받치는 구동력을 형성한다. 감소된 수치의 IL-1 수용체 길항제는 폐경 후 후기에서 골 손실량을 조절하는 데에 더 중요한 인자를 형성할 수 있다.
반수체형 패턴 1은 IL-1a 및 IL-1b 수치 및 생체 활성의 증가와 관련되지만, 정상 IL-1 수용체 길항제 수치를 제공한다. 반수체형 패턴 1을 갖는 여성은 반수체형 패턴 2를 갖는 여성에 비해 그들의 전기 폐경기 동안 더 큰 골 손실을 경험하기 쉽다. 따라서, 반수체형 패턴 1을 갖는 여성은 예방책이나 또는 치료를 개시하지 않은 경우 인생의 어느 단계에서도 골절을 경험하기 쉽다.
반수체형 패턴 2를 갖는 여성은 생애 후반에서 더 많은 골 손실을 경험하기 쉬울 것이며, 생애 후반에서 골절, 특히 연령 관련 골다공증과 관련된 골절을 경험하기 쉬울 수 있다. 따라서, 반수체형 패턴 1을 갖는 대상자보다 구성적으로 적은 IL-1ra를 생산하는 반수체형 패턴 2를 갖는 대상자는 그들의 생애의 폐경 후 후기에 더 많은 골 손실 및 감소된 골 형성을 경험할 것이다.
앞서 나타낸 가설을 토대로, 문헌[Keen et al. (1998) ("Allelic variation in the interleukin-1 receptor antagonist gene is associated with early postmenopausal bone loss at the spine" (Bone 23 (4), 367-371): an association between allele [1] of the VNTR in IL-1RN and early postmenopausal bone loss)]에 의해 보고된 데이터는 VNTR의 대립 유전자 [1]를 갖는 대상자들이 실제로 반수체형 패턴 1을 갖는다고 제시하고 있다. 이 연구에서의 모든 대상자들이 폐경의 발병 후 5 년 내에 있기 때문에, 그들의 골 손실은 IL-1ra의 증감된 수치에 의해서가 아니라 IL-1의 증가된 수치 및 활성에 의해 조절된다. 오직 IL-1RN의 VNTR만이 결정되었기 때문에, IL-1RN의 VNTR 대립 유전자 1가 골 밀도에서의 변화에 중요하다는 잘못된 결론에 도달하였으며, 이는 골 손실 및 골다공증 골절 발생 위험에 대한 주 예측자이다.
실시예 2: 골다공증의 적응증으로서의 척추 골절
샌프란치스코 협회의 유니버시티 오브 캘리포니아의 골다공증 골절 연구에 참가한 2529 명의 대상자 (1,240 명의 시험군 및 1,289 명의 대조군)로 된 코호트 를 사용한 제 2 연구를 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 IL-1 유전자 클러스터에서 유전형 마커에 대해 제노타이핑하였다. 기준선 조사에서 널리 퍼진 척추 골절의 방사선 증거 또는 연구 과정 동안 처음으로 골절이 발현된 방사선 증거를 갖는 것에 기초하여 시험군 대상자를 연구 집단으로부터 선택하였다.
또한, 연구 집단으로부터 연령을 맞춘 대조군 샘플을 얻는다. 연구 과정 동안 척추 골절의 임의의 방사선 증거가 없고 부속지 (appendicular) 및 늑골 골절을 포함하는 골 골절이 없는 것에 기초하여 대조군 대상자를 선택하였다.
골다공증에 대한 유전적 소인 연구의 종점으로서 척추 골절의 사용은 앞서 기술한 연구들에 비해 특정한 이점들을 갖는다. 일반적으로, 고관절 및 손목 골절은 양쪽 모두 골다공증의 발현 및 외상 사건, 예를 들면 물리적 낙하의 존재를 필요로 한다. 골이 골다공증으로 인해 약화됨에 따라 척추에 대한 일정한 체중이 개인 척추골을 붕괴시키기 때문에, 척추 골절은 임의의 외상 사건이 발생할 필요없이 골다공증의 결과로서 발생한다. 신장 손실을 인식하고, 구부러진 등 출현이 발현되거나, 또는 척추 붕괴가 신경에 영향을 미치고 통증을 유발하기 전까지, 척추 골절은 개인에게 명확하게 나타나지 않는다. 이러한 이유로 인해, 척추 골절의 연구는 개인의 문제점 인지와는 독립적으로 규칙적인 시간 과정 상에서 취해진 척추의 방사선 사진의 정확한 평가, 예를 들면 골다공증 골절 연구에서 사용되었던 프로토콜을 모니터링하는 것을 포함해야 한다.
포함 기준:
* 연령 65-90 세
* 시험군에 대한 척추 골절의 방사선 증거.
* 척추 골절의 부재 및 대조군에 대해 감소된 늑골 또는 부속지 골절의 부재의 방사선 증거.
* 분석에 대해 수집된 DNA 또는 전체 혈액
제외 기준:
* 공지된 대사성 골 질환을 갖는 환자
* 3.7 년의 추후 검사 과정 동안 사망한, 기준선에서 골절이 없는 환자.
1988-1989 명의 연구 대상자로부터 수집한 전체 혈액으로부터 DNA를 얻었다. 5 ml의 혈액을 3 X 3 인치 여과지 상에서 블로팅하고, 건조시키고, - 20 ℃에서 동결 저장하였다.
문헌[Kornman et al. (1997) (8) and Cox et al. (1998) (9)]에 기재된 바와 같이 제노타이핑을 수행하였다. IL-1A, IL-1B, IL-1RN, VDR, COL1A1, ER 및 PTHR 유전자에서의 SNP를 제노타이핑하였다.
데이터 분석: 출력 (power) 계산
900 명의 시험군, 900 명의 대조군, 알파 수치.01, 및 참된 교차비 (odds ratio) 1.5 또는 2.0을 가정하여 출력 계산을 수행하였다. 참된 OR이 2.0이거나 또는 참된 OR이 1.5이고, 대조군에서의 소수의 대립 유전자 빈도가 5 % 이상인 경우, 통계적 유의성이 용이하게 달성된다. 낮은 대조군 빈도에서, 1.5의 OR은 오직 시험군들 사이 빈도의 적은 증가만을 필요로 한다 (예를 들면, 5 % 대조군 빈도 및 7.3 % 시험군 빈도).
통계적 유의성을 평가하는 것 이외에, 이 연구의 중요한 목표는 임의의 유전적 효과의 임상적 유의성을 특성화하는 것이다. 이러한 목적으로, "임상적으로 유의적인 (significant)"은 위험이 50 % 증가된 것을 의미하고, "매우 임상적으로 유의적인"은 1 % 타입 1 오류율을 가정한 이러한 결론을 도출해낼 수 있는 것을 의미한다.
임상적 유의성은 시험의 크기를 보존하기 위해 출력이 감소되는 경우, 대조군 대립 유전자 빈도에서 1.5의 참된 OR에 대한 시간의 50 %에 의해 달성된다. 참된 OR이 2.0 이상이고, 더욱이 소수의 대립 유전자 빈도가 적지 않은 경우, 매우 임상적으로 유의적인 결과가 발생하기 쉽다. 심지어 참된 OR이 더 높은 경우에도 출력은 더 커질 것이다. 예를 들면, 2.5의 OR에서, 매우 임상적으로 유의적인 결과는 소수의 대립 유전자 빈도 ≥ 15 %에 대해 96 % 이상의 출력 및 정확히 5 %의 소수의 대립 유전자 빈도에 대해 57 % 출력을 사용하는 경우 발생할 것이다.
하기 기준을 갖는 개인들을 포함하고 및 제외하여 통계적 분석에 대한 임상적 데이터를 사용하였다: 갑상선 호르몬, 티아지드의 조기 사용, 데이터가 이용가능한 경우 HRT의 조기 사용, 데이터가 이용가능한 경우 단백 동화 스테로이드, 비스포스포네이트, SERMs 또는 칼시토닌의 조기 사용, 및 골다공증을 치료/예방하는 요법의 동시 사용.
다형성과 골다공증 사이의 관련성을 임의의 유전자 SNP에서의 대립 유전자 빈도가 시험군 및 대조군에서 상이한지 평가함으로써 시험하였다. 다중 시험을 실행하기 위해, 각각의 시험의 크기를 .01 (본페로니 수정 (Bonferroni correction)) 에서 설정한다. 따라서, 99 % 신뢰 구간이 무효 가설을 함유하지 않는 경우 마커를 "통계적으로 유의적인" 것으로 본다. 각각의 마커에 대해, 또한, 교차비 (OR)의 최대 가능성 추정치를 얻고, 1.5의 미리 결정된 임상적으로 유의적인 값과 비교한다. 마커를, OR의 점 추정치가 1.5 이상인 경우 "임상적으로 유의적인" 것으로 보고, OR의 낮은 신뢰 한계가 동일한 시발점을 초과하는 경우 "매우 임상적으로 유의적인" 것으로 본다. 전자의 경우, 통계적 유의성도 요구된다. (후자는 정의에 의해 통계적 유의성을 달성함).
다형성과 골다공증 사이의 관련성을 다형성의 시험 조합물에 의해 추가로 평가하였다. 분석되는 일부 특이적 조합물은 유전자 SNPs, IL-1A-889, IL-1A+4845, IL-1B-3737, IL-1B-511, IL1B-31, IL-1RN+2018, IL-1RN VNTR, 뿐만 아니라 다른 IL 유전자 및 VDR 유전자, COL1A1 유전자, ER 유전자, 및 PTHR 유전자에서의 대립 유전자를 포함한다. 또한, 대립 유전자의 추가적인 조합물을 평가하였다. 이러한 추가의 평가는 마커내 (유전형 분석) 및 마커간 (복합 유전형 또는 반수체형 분석) 비교를 포함한다.
싱기 분석을 하기 공변량: 연령, 흡연 역사, BMI, 폐경의 발병 연령, 혈청 에스트로겐 수치, 오스테오칼신 (osteocalcin) 수치, 척추 골절 데이터, 및 BMD 변화에 대해 조정함으로써 추가로 개량하였다.
동일한 분석 전략을 사용하여 공지된 및 신규한 다형성 양쪽 모두인 유전자 다형성의 임의의 조합물을 제공한다. 유전자들 간의 상승 효과를 로지스틱 회귀 분석 (logistic regression) 모델에 상호작용 조건을 부가함으로써 평가하였다.
결과
잠재적으로 상승된 척추 골절 위험을 갖는 군을 동정하기 위해, IL-1+를 하기 세 가지 상태 중 하나를 충족하는 개인들로 이루어지도록 정하였다: 1) IL-1A (+4845)에서의 유전형 2.2, IL-1B (-511)에서의 유전형 1.1 및 IL-1RN (+2018)에서의 1.1 유전형, 2) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 2.2 유전형, 또는 3) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 1.2 유전형. 연구 집단의 13 %를 IL-1+로 스코어링하고, IL-1+로 분류된 것들은 고율의 척추 골절 (p값 < .05)을 가졌다. 에스트로겐 대체 요법을 사용하지 않았던 여성들에서, IL-1+의 빈도는 척추 골절을 갖지 않는 사람들에서 11 %였고, 척추 골절을 갖는 사람들 사이에서 18 %였다 (p값 = .0001).
연령 및 목에서 평가된 골 무기질 밀도 (BMD)에 대해 조정한 경우, 에스트로겐 비사용자 (즉, 비-에스트로겐 사용자) 사이에서의 IL-1+에 대한 척추 골절의 교차비 (OR)는 1.9였다 (p값 = 6 x 10-5). 통계적 모델에서 BMD의 포함을 제공한 경우, IL-1+ 유전형의 영향이 골 무기질 밀도의 것을 초과하고 넘어서는 정보를 제공하는 척추 골절에 대해 독립적인 위험 인자라고 결론지었다.
또한, IL-1+ 유전형을 포함하는 세 성분들의 각각은 에스트로겐 대체 요법을 전혀 사용하지 않았던 여성에서 척추 골절의 통계적으로 유의적인 위험을 제공한 다. 연령 및 BMD를 조정한 경우, IL-1A (+4845)에서의 유전형 2.2, IL-1B (-511)에서의 유전형 1.1 및 IL-1RN (+2018)의 1.1 유전형을 갖는 사람들은 OR = 2.0 (p값 = .004)을 갖고, IL-1B(-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 2.2 유전형을 갖는 사람들은 OR = 2.2를 갖고 (p값 = .01), IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2 및 IL-1RN (+2018)에서의 1.2 유전형을 갖는 사람들은 OR = 1.7을 가졌다 (p값 = .01).
등가물
본 발명의 특이적 실시양태에 대해 상기한 상세한 설명으로부터, 독특한 방법들이 기재되었다는 점이 명확히 이해되어야 한다. 비록 본 명세서에 특정 실시양태를 상세히 개시하였지만, 이는 오직 설명의 목적으로 이루어진 것이며, 하기 첨부하는 청구 범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 특히, 본 발명자들은 청구 범위에 의해 한정되는 본 발명의 기술 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 치환, 변이 및 변형이 본 발명에 대해 이루어질 수 있다는 점을 고려한다.

Claims (21)

  1. 대상자에서 골다공증 발현의 존재, 부재 또는 그 발현 소인을 결정하는 방법으로서,
    대상자에서,
    a) IL-1A (+4845)에서의 유전형 2.2, IL-1B (-511)에서의 유전형 1.1, 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.1,
    b) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2, 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 2.2, 및
    c) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2, 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 골다공증 관련 유전형을 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서 유전형의 존재는 대상자가 골다공증 발현을 갖거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있다는 것을 시사하고, 유전형의 부재는 대상자가 골다공증 발현을 갖지 않거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있지 않다는 것을 시사하는 것인 방법.
  2. 대상자에서 골다공증 발현의 존재, 부재 또는 그 발현 소인을 결정하는 방법으로서,
    대상자에서 IL-1A (+4845) 대립 유전자, IL-1B (-511) 및 IL-1RN (+2018) 대 립 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 대립 유전자를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서 대립 유전자의 존재는 대상자가 골다공증 발현을 갖거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있다는 것을 시사하고, 대립 유전자의 부재는 대상자가 골다공증 발현을 갖지 않거나 또는 골다공증 발현에 대한 소인을 갖고 있지 않다는 것을 시사하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 IL-1A (+4845) 대립 유전자 및 IL-1B (-511)를 검출하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 IL-1B (-511) 및 IL-1RN (+2018)을 검출하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 IL-1A (+4845) 대립 유전자 및 IL-1RN (+2018)을 검출하는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 대상자가 상기 대립 유전자에 대해 동질접합성인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 대상자가 상기 대립 유전자에 대해 이질접합성인 방 법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 대상자가 여성인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 대상자가 약 60 세를 초과하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 대상자가 약 65 세 내지 약 90 세인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 골다공증은 척추 골절을 포함하는 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 대상자는 호르몬 대체 요법을 사용하고 있지 않는 것인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 검출 단계는
    a) 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화,
    b) 크기 분석,
    c) 시퀀싱,
    d) 혼성화,
    e) 5' 뉴클레아제 소화,
    f) 단일 가닥 형태 다형성(single-stranded conformation polymorphism),
    g) 대립 유전자 특이적 혼성화,
    h) 프라이머 특이적 연장, 및
    i) 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석시험
    으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 검출 전 또는 검출과 함께, 상기 핵산 샘플을 증폭 단계로 처리하는 것인 방법.
  15. IL-1A (+4845), IL-1B (-511) 및 IL-1RN (+2018)으로 이루어진 군으로부터 선택된 대립 유전자에 5' 또는 3'을 혼성화하는 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 골다공증 발현의 존재 또는 그 발현에 대한 감수성을 결정하기 위한 키트.
  16. 제15항에 있어서, 대립 유전자가 증폭될 수 있도록 대립 유전자에 3' 또는 5'을 각각 혼성화하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머는 약 50 개 내지 약 1000 개의 염기쌍의 범위에서 영역에 혼성화하는 것인 키트.
  18. 제15항에 있어서, 검출 수단을 추가로 포함하는 키트.
  19. 제15항에 있어서, 증폭 수단을 추가로 포함하는 키트.
  20. 제15항에 있어서, 대조군을 추가로 포함하는 키트.
  21. 대상자에서 골다공증 증상을 완화하거나 또는 골다공증 발현을 예방하는 방법으로서,
    a) 대상자에서
    i) IL-1A (+4845)에서의 유전형 2.2, IL-1B (-511)에서의 유전형 1.1, IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.1,
    ii) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2, 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 2.2, 및
    iii) IL-1B (-511)에서의 유전형 2.2, 및 IL-1RN (+2018)에서의 유전형 1.2로 이루어진 군으로부터 선택된 골다공증 관련 유전형의 존재를 검출하는 단계, 및
    b) 골다공증을 보상하는 치료제를 상기 대상자에 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
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