CN1863928A - 骨质疏松的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

描述了骨质疏松的诊断和治疗，其是基于对患者IL－1的单倍体型和基因型模式的鉴别。

Description

骨质疏松的诊断和治疗

发明领域

本发明涉及鉴别由于基因原因易发生骨质疏松或骨质疏松相关状况或疾病的患者的方法。

发明背景

在1993年，骨质疏松由国家卫生研究院(the NationalInstitutes of Health)的院长Bernadine Healy，MD确定为“女性的主要疾病之一”。骨质疏松性骨折后的并发症是65岁以上女性死亡的第四大原因，仅次于心脏病，癌症和中风。在美国它是残疾的主要原因，也是髋部骨折的最常见原因。

二十五万美国人患有骨质疏松，其中85％是女性。I型骨质疏松，即由于雌激素的丧失造成的绝经后骨质疏松，影响了超过一半的65岁以上女性，在90％的75岁以上女性中都有发现。II型或老年骨质疏松是与年龄紧密相关的，通常影响七十岁以上的男性和女性。III型骨质疏松，是最新的分类，能影响两性，是药物诱导的，例如由已知长期类固醇治疗诱导的，会加速骨质疏松。接受长期类固醇治疗的患者群体包括哮喘病患者(在美国18岁以上有七百万患者)以及具有风湿性关节炎或其它自体免疫疾病的患者。IV型是由如风湿性关节炎(1-2％的人群患有)这样的疾病引起的。

每年一百五十万骨折患者中大部分是由骨质疏松造成的，导致残疾，在医疗、社会和家庭护理上花费上百亿美元。甚至是进行最好的护理，65岁或更老的患者中的40％在髋部骨折以后都不会活过两年。

在1991年，每三个美国女性中就有一个是50岁或更大年龄。生育高峰一代在1996年也会进入这个年龄群体。由于按照目前的趋势，女性在绝经后平均能活大约三十年，骨质疏松的威胁是目前时期的最大健康威胁之一。

生活方式是发生骨质疏松的一个因素，特别是建立和维持健康骨量以预防骨质疏松的重要因素。现在，65岁以下的人比他们的父母更可能具有几乎不运动的生活方式，坏的饮食习惯，增加的酒精和咖啡因的摄入，更多的与骨损失相关的药物治疗历史。已明确知道骨质疏松的发生存在基因易感性(参见WO94/03633，其中讨论了骨质疏松中涉及的基因因素，该文通过在此引述而合并于本文)。

因此如果能够早期鉴别那些具有发生骨质疏松的最大危险性的个体是非常有用的，使得这些个体能够得到劝告，适当地改变生活方式或开始其它的治疗性干预。例如，已证明补钙和运动如果在关键的早期阶段进行的话，就是有价值的预防性因素。激素取代疗法(HRT)也已成功用于对抗绝经后骨质疏松的发生。HRT在疾病的早期，在发生大量骨损失之前使用是最好的。由于HRT具有潜在的严重副作用，对女性来说，在决定使用HRT还是其它旨在减少发生骨质疏松的危险性的干预治疗的时候，知道她们个人发生骨质疏松的危险性水平是有用的。

下述公开的专利申请描述了多种诊断，监测和/或治疗骨质疏松的方法：WO94/20615，WO95/01995，WO94/14844，EP93113604，WO/8809457，WO93/11149和WO/9403633。下述参考文献描述了在骨质疏松中不同的IL-1基因多态性的联系：美国专利No.5,698,399；Eastell，R.et al.，(1998)Bone 23(5S)：S375；Eastell，R.et al.and Keen，RW et al.，(1998)Bone 23：367-371。

IL-1基因簇的遗传学

IL-1基因簇位于2号染色体的长臂(2q13)上，在430Kb的区域内至少含有IL-1α(IL-1A)，IL-1β(IL-1B)，和IL-1受体拮抗物(IL-1RN)的基因(Nicklin，et al.(1994)Genomics，19：382-4)。激动剂分子，IL-1α和IL-1β，具有有效的促炎性活性，位于多个炎性级联之首。它们的作用，通常是通过其它细胞因子例如IL-6和IL-8的诱导，导致白细胞在损伤组织中的活化和募集，血管活性剂的原位产生，脑部发热反应和肝急性期反应。所有三种IL-1分子与I型和II型IL-1受体结合，但只有I型受体将信号转导到细胞中。相反，II型受体被细胞膜阻挡，作为是诱饵受体。因此受体拮抗物和II型受体的的作用都是抗炎性的。

IL-1的不恰当的产生在多种自体免疫性和炎性疾病，包括风湿性关节炎，炎性肠失调，牛皮癣等的病理学中都具有重要作用。此外，IL-1产生的速度在个体之间存在固定的差异，某些这种变化可用IL-1基因座上基因差异来解释。因此IL-1基因是用于确定部分对于炎性疾病的基因易感性的适当候选者，所述炎性疾病中的大部分都有包括多个基因在内的多因素的病因。

已知来自IL-1基因簇的特定等位基因与特定的疾病状态有关。例如，已有报道IL-1RN(VNTR)等位基因2(美国专利No.5,698,399)和IL-1RN(VNTR)等位基因1(Keen RW et al.，(1998)Bone 23：367-371)与骨质疏松有关。而且已有报道IL-1RN(VNTR)等位基因2与糖尿病性肾病(Blakemore，et al.(1996)Hum.Genet.97(3)：369-74)，斑秃(Cork，et al.，(1995)J.Invest.Dermatol.104(5Supp.)：15S-16S；Cork et al.(1996)Dermatol Clin14：671-8)，格雷夫氏症(Blakemore，et al.(1995)J.Clin.Endocrinol.80(1)：111-5)，系统性红斑狼疮(Blakemore，et al.(1994)Arthritis Rheum.37：1380-85)，萎缩硬化性苔藓病(Clay，etal.(1994)Hum.Genet.94：407-10)，和溃疡性结肠炎(Mansfield，et al.(1994)Gastoenterol.106(3)：637-42)有关。

此外，已发现来自标记-889的IL-1A等位基因2和来自标记+3954的IL-1B(TaqI)等位基因2与牙周疾病有关(美国专利No.5,686,246；Kornman and diGiovine(1998)Ann Periodont 3：327-38；Hart and Kornman(1997)Periodontol 200014：202-15；Newman(1997)Compend Contin Educ Dent 18：881-4；Kornman etal.(1997)J.Clin Periodontol 24：72-77)。还发现来自标记-889的IL-1A等位基因2与青少年慢性关节炎，特别是慢性虹膜睫状体炎有关(McDowell，et al.(1995)Arthritis Rheum.38：221-28)。还发现来自IL-1B的标记+3954的IL-1B(TaqI)等位基因2与牛皮癣和DR3/4患者的胰岛素依赖的糖尿病有关(di Giovine，et al.(1995)Cytokine 7：606；Pociot，et al.(1992)Eur J.Clin.Invest.22：396-402)。此外，已发现IL-1RN(VNTR)等位基因1与糖尿病性视网膜病有关(参见USSN 09/037472，和PCT/GB97/02790)。而且已发现IL-1RN(VNTR)等位基因2与北美和欧洲的高加索人群的溃疡性结肠炎有关(Mansfield，J.et al.，(1994)Gastroenterology 106：637-42)。有趣的是，这种关联在种族上相关的德裔犹太人人群中更为强烈(PCT WO97/25445)。

基因型筛选

筛选遗传疾病的传统方法依赖于鉴别异常的基因产物(例如镰状细胞性贫血)或异常的表型(例如精神发育迟缓)。这些方法用于晚发性的和表型不易识别的遗传疾病，例如，血管病时具有局限性。现在开发了简单并且花费不多的基因筛选方法，使得有可能鉴别能表明发生疾病的倾向性的多态性，甚至是在所述疾病是多基因成因的时候。随着对多因素失调的基因基础的理解的增加，可通过分子生物学方法筛选的疾病的数量继续增长。

基因筛选(也称为基因分型或分子筛选)，可以被广义地定义为为了确定患者是否具有引起疾病状态的突变或者与引起疾病状态的突变“连锁”的突变(等位基因或多态性)而进行的检测。连锁是指在基因组中相近的DNA序列倾向于在一起被遗传的现象。两个序列的连锁可能是由于共遗传具有一些选择性优势。但是，更典型地，两个多态性序列共遗传是因为在两个多态性之间的区域中相对较少发生减数分裂的重组事件。共遗传的多态性等位基因被称为彼此连锁不平衡因为，在给定的人群中，它们倾向于同时发生或者在任何所述人群的特定成员中根本不发生。实际上，发现在给定的染色体区域上有多个多态性彼此连锁不平衡，它们定义了准稳态的基因“单倍体型”。相反，在两个多态性位点之间发生的重组事件使它们互相分离到不同的同源染色体上。如果两个物理上连锁的多态性之间的减数分裂重组发生的足够频繁，这两个多态性会独立地分离，被称为处于连锁平衡状态。

两个标记之间减数分裂重组的频率通常与它们在染色体上彼此之间的物理距离成比例，“热点”以及染色体重组受到抑制的区域的出现会导致两个标记之间的物理和重组距离出现矛盾。因此，在特定的染色体区域，跨越宽染色体区域的多个多态性位点彼此是连锁不平衡的，因而定义了宽跨度基因单倍体型。而且，如果发现致病突变在此单倍体型内或与此单倍体型连锁，所述单倍体型的一个或多个多态性等位基因可以用于对发生所述疾病的可能性作出诊断性或预测性指示。如果疾病突变是在近期发生的，在其它良性多态性和致病多态性之间发生联系，使得没有充足时间通过重组事件达到平衡。因此鉴别跨越致病突变的变化或与之连锁的人单倍体型，可作为个体遗传该致病突变的可能性的预测性检测。重要的是，这种预测性或诊断性过程可以不用鉴别和分离实际的疾病病变。这是很重要的，因为准确确定疾病涉及的分子缺陷是很困难的以及费力的，特别是对于多因素疾病例如炎性失调。

实际上，炎性失调和IL-1多态性的统计学联系并没有必然表明该多态性直接引起失调。相关的多态性也可能是与人类近期进化过程中出现的没有充足时间通过插入染色体片段中的重组事件获得平衡的致病突变连锁(即连锁不平衡)的良性等位基因变体。因此，为了对特定疾病进行诊断性和预测性检测，可以检测与该疾病相关的多态性等位基因，而不用考虑该多态性是否直接涉及该疾病的病因。而且，如果给定的良性多态性位点与明显的致病多态性位点连锁不平衡，其它与该良性多态性位点连锁不平衡的多态性位点也可能与该致病多态性位点连锁不平衡。因此这些其它多态性位点也可以用于对遗传致病多态性位点的可能性进行预测或诊断。实际上，一旦发现在特定疾病或状况和相应的人单倍体型之间有联系，可以靶定宽跨度人单倍体型(描述了一组连锁的多态性标记的等位基因的共遗传的典型模式)以进行诊断。因此，可以通过表征一个或多个与疾病相关的多态性等位基因来确定个体发生特定疾病或状况的可能性，而不需要确定或表征作为原因的基因变化。

发明简述

本发明提供了一种鉴别具有增加的发生骨质疏松或骨质疏松相关状况或疾病的危险性的患者的基因易感性检测。特别地，本发明提供了一种鉴别具有增加的在绝经后发生骨质疏松相关的脊椎骨折的危险性的女性的基因易感性检测。

一方面，通过在患者中检测骨质疏松相关基因型来确定患者中发生，不发生或易于发生骨质疏松。存在所述基因型表示该患者患有或易于发生骨质疏松。相反，不存在所述基因型表示该患者没有或不易于发生骨质疏松。通过检测骨质疏松相关基因型的存在确定患者中发生骨质疏松，对患者进行补偿所述骨质疏松的治疗使骨质疏松的症状得到减轻。骨质疏松的症状包括例如，由于脊骨变弱导致的身高减少，晚间腿部抽筋，骨头疼痛并脆弱，颈部疼痛，非创伤或外伤引起的颈部不适，腰部脊骨或肌肉持续疼痛，腹部疼痛，牙齿掉落，肋骨疼痛，骨折，像屈身姿势的脊骨变形，和由于背部发生脊椎崩塌导致的脊骨顶部向外突出，疲劳，牙周疾病或脆性指甲。骨质疏松可用本领域已知的方法，例如通过骨密度确定。例如将特定患者的骨密度(BMD)与25岁女性相比。BMD值显著低于25岁女性(统计学上表示为在平均值以下2.5个标准差)则诊断为“骨质疏松的”。如果患者的BMD值小于正常的25岁女性，但是没有达到平均值以下2.5个标准差，则称骨为“osteopenic”(osteopenic是指骨密度降低，但是还没达到骨质疏松)。

骨质疏松相关基因型是例如，(a)IL-1A(+4845)的基因型2.2，IL-1B(-511)的基因型1.1，和IL-1RN(+2018)的基因型1.1；(b)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型2.2；或(c)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型1.2。

另一方面，通过在患者中检测骨质疏松相关的等位基因确定患者中发生，不发生或易于发生骨质疏松。存在所述等位基因表明所述患者患有或易于发生骨质疏松。相反，不存在所述等位基因表明患者没有或不易于发生骨质疏松。骨质疏松相关等位基因是例如，IL-1RN(+2018)等位基因，IL-1A(+4845)等位基因，和IL-1B(-511)。检测一个，两个，三个或更多个等位基因。例如检测IL-1B(-511)和IL-1RN(+2018)。或者检测IL-1A(+4845)等位基因，和IL-1RN(+2018)。所述患者是所述等位基因的纯合体。或者，所述患者是所述等位基因的杂合体。所述患者是女性。所述患者年龄在60岁以上。例如，所述患者年龄在65-90岁之间。所述患者没有使用激素取代疗法。

可用本领域已知的方法检测骨质疏松相关基因型或等位基因。例如通过等位基因特异的寡核苷酸杂交，长度分析，测序，杂交，5’核酸酶消化，单链构象多态性，等位基因特异性杂交，引物特异性延伸或寡核苷酸连接检测。任选地，在检测之前或在检测的时候，对所述核酸样品进行扩增的步骤。

本发明还包括用于确定存在，不存在或易于发生骨质疏松的试剂盒。所述试剂盒含有与IL-1A(+4845)等位基因，IL-1B(-511)等位基因或IL-1RN(+2018)等位基因的5’或3’杂交的第一引物寡核苷酸。所述寡核苷酸的长度是1000，500，250，150，100，50，25，15，10或更少个核苷酸。任选地，所述试剂盒含有分别与所述等位基因的3’或5’杂交使得所述等位基因被扩增的第二引物寡核苷酸。在不同方面，所述试剂盒含有检测手段，扩增手段或对照。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有与发明所属领域的普通技术人员的一般理解相同的含义。虽然在本发明的实践或检测中可以使用与本文所述的类似或等同的方法和材料，下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有的出版物，专利申请，专利，和其它参考文献在此都引入其全文作为参考。如有矛盾，以本文的描述，包括定义为准。此外，所述材料，方法和实施例只是举例说明而不是进行限制。

本发明的其它特征和优点将在下述的详细描述和权利要求中明显体现。

附图简述

图1例示两种不同的基因单倍体型模式。

图2显示了骨质疏松性非脊骨骨折的危险。

图3显示了骨质疏松性髋部骨折的危险。

图4显示了骨质疏松性腕部骨折的危险。

图5显示了非脊骨骨折的危险。

发明详述

本发明是基于发现了与增加的发生骨质疏松或骨质疏松相关状况或疾病例如脊椎骨折的危险性相关的基因型。相应地，本发明提供了鉴别在绝经期间或之后具有增加的发生骨质疏松相关脊椎骨折的危险性的女性的基因易感性检测。

本文中进行的基因分析是针对增加的脊椎变形与基因多态性的发生的关系，其中包括白介素-1A(IL-1A)，白介素-1B(IL-1B)，和白介素-1RN(IL-1RN)基因的特定等位基因，以及维生素D受体(VDR)，胶原1A1(COL1A1)，雌激素受体(ER)，和甲状旁腺激素受体(PTHR)基因的等位基因。通过研究绝经后女性的基因多态性对基因对于骨折发生和骨密度降低速度的影响进行的研究可用于评估使用基因检测鉴别高危险性个体以实施预防性治疗的临床实用性。

本研究的一个目的是确定多个基因的特定变化是否可以用来预测患有绝经后脊椎骨折的女性的危险性。所研究的一个特定的基因家族是IL-1基因家族。下面总结了在骨新陈代谢和绝经后骨折危险中涉及IL-1基因的理论依据。绝经后骨质疏松表征为绝经后开始的骨组织逐渐丧失，可能在从绝经开始之时起15-20年内导致骨折(2-4)。虽然其它贡献因子，例如骨骼发育的“峰值骨量”，年龄相关的骨损失和骨质也是后来发生骨折危险的重要决定因素，骨再吸收的激素依赖性增长以及在绝经后第一个5到10年中加速的骨量损失是最重要的致病因素(2-4)。

有证据表明雌激素能通过阻断骨髓和骨细胞产生促炎性因子防止骨损失(3)。有许多报道都证明自然的或手术性的绝经会增加IL-1和TNF的血液，骨髓，和单核细胞水平(2，3)。体外研究也证明雌激素能够抑制这些细胞因子的产生。在细胞微环境中细胞因子产生增加的主要后果是破骨细胞生成增加，破骨细胞寿命增长导致破骨细胞库扩张(3)。此外，细胞因子产生增加导致成熟的破骨细胞活性增加，IL-1和TNFα也是公认的骨形成的抑制因子(2)。而且，IL-1和TNFα也是其它细胞因子，例如调节破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的IL-6，M-CSF，和GM-CSF的可能诱导子(3)。因此，对于破骨细胞形成，IL-1和TNFα可被视为诱导能刺激造血破骨细胞前体的“下游因子”的分泌所必需的“上游”细胞因子。这种级联机制确保了IL-1和TNFα水平的微小变化会导致破骨细胞产生的巨大变化。

IL-1的特异性内源竞争性抑制剂，即IL-1受体拮抗物(IL-1ra)，与IL-1β有26％的氨基酸序列同源性，与表达IL-1受体的细胞结合，亲和性几乎与IL-1β相同，但是完全没有IL-1激动剂活性(5)。

IL-1诱导破骨细胞生成和破骨细胞活性的特定生物学证据的实例来自于有关缺乏I型IL-1受体表达的小鼠对IL-1不敏感的报道(6)。这些小鼠得到保护，不因卵巢切除而导致骨损失，因此证明IL-1通过IL-1受体所起的作用是骨中雌激素缺乏的效果的主要调节剂(6)。本研究中一个重要的发现就是缺少IL-1受体不会改变假手术小鼠的骨量，因此证明在雌激素充足的小鼠中IL-1对于维持正常的骨重建不是必需的(6)。在一项相关的研究中，Kimbell et al.(7)报道了能阻断IL-1和IL-1β的功能活性的IL-1ra的输入具有与雌激素相同的骨防护效果。

在骨新陈代谢中涉及IL-1，IL-1β和IL-1ra的大量生物学证据支持了有关在IL-1基因簇中具有一个或多个引起这些基因表达改变的单核苷酸多态性(SNP)的猜想。增加的IL-1A和IL-1B基因的转录或翻译或减少的IL-1RN基因的转录或翻译或者甚至是由于所述基因的编码区内的SNP引起的单个氨基酸取代导致的细胞因子(IL-1，IL-1β或IL-1ra)的轻微改变会破坏正常骨更新所需细胞因子的微妙平衡。IL-1和/或IL-1β的过量产生或者IL-1ra的产生不足会导致在携带这些等位基因的特定个体中激活骨再吸收系统。这些IL-1基因的等位基因的不良效果在绝经后特别明显，这是由于没有了雌激素对于IL-1基因表达的抑制作用。

定义

为方便起见，下面给出了说明书，实施例，和附加的权利要求中使用的特定术语和短语的含义。

术语“等位基因”是指在不同的多态性区域上发现的不同的序列变体。例如，IL-1RN(VNTR)具有至少五个不同的等位基因。所述序列变体可以是单个或多个碱基的变化，包括但不限于插入，缺失，或取代，或者可以是可变数目的序列重复。

术语“等位基因模式”是指在一个或多个多态性区域上一个等位基因或多个等位基因的特性。例如，等位基因模式可以由多态性位点的单个等位基因组成，对于IL-1RN(VNTR)等位基因1，其等位基因模式是在IL-1RN基因座的VNTR具有IL-1RN等位基因1的至少一个拷贝。或者，等位基因模式可以由单个多态性位点的纯合或杂合状态组成。例如，IL1-RN(VNTR)等位基因2，2的等位基因模式是有IL-1RN的VNTR标记的第二等位基因的两个拷贝，相应于纯合IL-RN(VNTR)等位基因2状态。或者，等位基因模式可以由在多于一个多态性位点的等位基因的特性组成。

本文所用的术语“抗体”意指结合试剂，包括能特异地与IL-1多肽反应的完整抗体或其结合片段。抗体可以用传统方法片段化，并用与上述完整抗体相同的方式检测所述片段的效用。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab)₂片段。得到的F(ab)₂片段可以进行处理以还原二硫键，产生Fab片段。本发明的抗体进一步包括具有由所述抗体的至少一个CDR区域决定的与IL-1B多肽有亲和力的双特异性的，单链的，和嵌合的和人源化的分子。

“生物学活性”或“生物活性”或“活性”或“生物学功能”可互换使用，为本文的目的其是指直接或间接由IL-1多肽(无论是其天然构象或变性构象)，或其任何亚序列行使的效应或抗原性功能。生物学活性包括与靶肽，例如IL-1受体结合。可以通过直接影响IL-1多肽调节IL-1的生物活性。或者可以通过调节IL-1多肽的水平，例如通过调节IL-1基因的表达调节IL-1的生物活性。

本文所用的术语“IL-1多肽的生物活性片段”是指全长IL-1多肽的片段，其中所述片段特异地模仿或拮抗野生型IL-1多肽的活性。所述生物活性片段优选地是能与白介素受体相互作用的片段。

术语“异常活性”，用于指多肽例如IL-1的活性，指与野生型或天然多肽活性不同的或是与健康个体中的多肽活性不同的活性。多肽的活性可以因为比它的天然对应物的活性更强而是异常的。或者活性也可以因为与它的天然对应物相比更弱或没有而是异常的。异常活性也可以是活性的改变。例如异常多肽可以与不同的靶肽相互作用。细胞可以由于编码IL-1基因座多肽的IL-1基因座基因过表达或表达不足而具有异常的IL-1活性。

“细胞”，“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可互换使用，不仅指特定的患者细胞，而且还指这种细胞的子代或可能的子代。由于在后代中可能因突变或环境影响而发生特定的改变，这种子代可能实际上与母细胞不相同，但是仍然包括在本文的所述术语的范围内。

“嵌合体”，“嵌合物”，“嵌合哺乳动物”等，是指至少在它的某些含有基因组的细胞中具有敲除或敲入构建体的转基因哺乳动物。

术语“对照”或“对照样品”指任何适合于所使用的检测方法的样品。对照样品可以含有所用的等位基因检测技术的产物或者要检测的物质。进一步，所述对照可以是正对照或是负对照。作为实施例，如果等位基因检测技术是PCR扩增，然后进行长度分离，对照样品可以包括适当长度的DNA片段。同样地，如果等位基因检测技术包括突变蛋白的检测，对照样品可以包含突变蛋白样品。但是，优选对照样品含有要检测的物质。例如，对照可以是基因组DNA样品或克隆的IL-1基因簇的一部分。但是，如果要检测的样品是基因组DNA，对照样品优选是高度纯化的基因组DNA样品。

术语“基因的破坏”和“靶定破坏”或任何类似的短语是指与基因的野生型拷贝相比，对天然DNA序列进行位点特异性阻断，以防止该基因在细胞中表达。该阻断可以通过基因缺失，插入或改变，或其任意组合形成。

本文所用的术语“单倍体型”意指以统计学显著的水平(P_corr＜0.05)作为一个群组(连锁不平衡)一起遗传的一组等位基因。本文所用的短语“IL-1单倍体型”指IL-1基因座的单倍体型。IL-1炎性或促炎性单倍体型指能指示增加的激动活性和/或减少的拮抗活性的单倍体型。

本文所用的术语“IL-1基因簇”和“IL-1基因座”包括位于2号染色体的2q13区域或其附近的所有核酸，至少包括IL-1A，IL-1B和IL-1RN基因和任何其它连锁序列。(Nicklin et al.，Genomics 19：382-84，1994)。本文所用的术语“IL-1A”，“IL-1B”，和“IL-1RN”是指分别编码IL-1，IL-1，和IL-1受体拮抗物的基因。IL-1A，IL-1B，和IL-1RN的基因入藏登记号分别是X03833，X04500，和X64532。

“IL-1功能性突变”是指IL-1基因簇内的突变，其导致基因型改变(即影响IL-1基因或蛋白的功能)。实例包括：IL-1A(+4845)等位基因2，IL-1B(+3954)等位基因2，IL-1B(+6912)等位基因2，和IL-1RN(+2018)等位基因2。

“IL-1X(Z)等位基因Y”是指特定的等位基因形式，称为Y，发生在基因X中的IL-1基因座多态性位点，其中X是IL-1A，B，或RN，位于核苷酸Z处或其附近，其中核苷酸Z相对于主要转录起始位点，即特定的IL-1基因X的核苷酸+1编号。本文所用的术语“IL-1X等位基因(Z)”是指核苷酸Z处或其附近的基因X中的IL-1多态性位点的所有等位基因。例如，术语“IL-1RN(+2018)等位基因”是指标记+2018处的IL-1RN基因的另一种形式。“IL-1RN(+2018)等位基因1”是指IL-1RN基因的一种形式，其中在有义链的+2018位置含有胞嘧啶(C)。Clay et al.，Hum.Genet.97：723-26，1996.“IL-1RN(+2018)等位基因2”是指IL-1RN基因的一种形式，其中在正链的+2018位置含有胸腺嘧啶(T)。当患者具有两个相同的IL-1RN等位基因的时候，所述患者称为纯合的，或者具有纯合状态。当患者具有两个不同的IL-1RN等位基因的时候，所述患者称为杂合的，或者具有杂合状态。术语“IL-1RN(+2018)等位基因2，2”是指纯合IL-1RN(+2018)等位基因2状态。相反，术语“IL-1RN(+2018)等位基因1，1”是指纯合IL-1RN(+2018)等位基因1状态。术语“IL-1RN(+2018)等位基因1，2”是指杂合等位基因1和2状态。

本文所用的“IL-1相关的”是指包括与人2号染色体(2q12-14)上的人IL-1基因座基因相关的所有基因。其包括了位于2号染色体(2q13-14)的人IL-1基因簇的IL-1基因，包括：编码白介素-1α的IL-1A基因，编码白介素-1β的IL-1B基因，和编码白介素-1受体拮抗物的IL-1RN(或IL-1ra)基因。进一步这些IL-1相关基因包括位于人2号染色体(2q12)的I型和II型人IL-1受体基因，以及位于小鼠1号染色体上19.5cM位置的它们的小鼠同源序列。白介素-1α，白介素-1β，和白介素-1RN非常相关，它们都与IL-1I型受体结合，但是只有白介素-1α和白介素-1β是能激活IL-1I型受体的激动剂配体，而白介素-1RN是天然存在的拮抗剂配体。当术语“IL-1”用于基因产物或多肽的时候，它是指人2号染色体(2q12-14)上的白介素-1基因座编码的所有基因产物以及它们的其它种的相应同源物或其功能性变体。因此术语IL-1包括能促进炎性反应的分泌多肽，例如IL-1α和IL-1β，以及能拮抗炎性反应的分泌多肽，例如IL-1受体拮抗物和IL-1II型(诱饵)受体。

“IL-1受体”或“IL-1R”是指能结合IL-1基因座编码的配体和/或从其转导信号的不同的细胞膜结合蛋白。该术语可用于任何能结合白介素-1(IL-1)分子的蛋白，它们作为哺乳动物质膜蛋白的天然构象大概在将IL-1提供的信号向细胞转导中起重要作用。如本文所用的，该术语包括具有IL-1结合活性或信号转导活性的天然蛋白的类似物。实例包括美国专利No.4,968,607中所述的人和鼠IL-1受体。术语“IL-1核酸”是指编码IL-1蛋白的核酸。

“IL-1多肽”和“IL-1蛋白”包括含有由图1，2，和3所示的IL-1基因组DNA序列，或其片段，和其同源物编码的氨基酸序列，包括激动剂和拮抗剂多肽。

“增加的危险”是指与在不携带特定多态性等位基因的人群成员中的疾病或状况发生的频率相比，在携带特定多态性等位基因的个体中疾病或状况的发生有统计学较高的频率。

本文所用的术语“相互作用”包括在分子间有可检测到的联系或关系(例如生物化学相互作用)，例如实质上蛋白和蛋白，蛋白和核酸，核酸和核酸以及蛋白和小分子或核酸和小分子的相互作用。

本文所用的术语“分离的”用于核酸，例如DNA或RNA时，分别指与天然来源的大分子中存在的其它DNA，或RNA分离的分子。例如，编码患者IL-1多肽之一的分离的核酸优选包括在基因组DNA中天然地紧邻IL-1基因侧翼的不超过10千碱基(kb)的核酸序列，更优选是不超过5kb的这种天然存在的侧翼序列，最优选是少于1.5kb的这种天然存在的侧翼序列。本文所用的术语分离的还指当用重组DNA技术产生的时候，基本上不含细胞物质，病毒物质，或培养基的，当用化学合成的时候，基本上不含化学前体物质或其它化学物质的核酸或肽。而且，“分离的核酸”包括不以片段的形式天然存在的并且不以天然状态存在的核酸片段。本文所用的术语“分离的”还指从其它细胞蛋白分离的多肽，包括纯化的和重组的多肽。

“敲入”转基因动物是指基因组中引入改变的基因的动物，所述改变的基因可以是外源的或是内源的。

“敲除”转基因动物是指其中部分或完全抑制了内源基因表达(例如，通过缺失所述基因的至少一个部分，用第二种序列取代所述基因的至少一部分，引入终止密码子，使编码重要氨基酸的碱基突变，或除去内含子连接)的动物。

“敲除构建体”是指可用于在细胞中减少或抑制由内源DNA序列编码的蛋白的表达的核酸序列。在一个简单的实例中，敲除构建体由基因，例如IL-1RN基因组成，其中所述基因的关键部分中有缺失，使其不能表达活性蛋白。或者，可以向天然基因中加入数个终止密码子以使蛋白提早终止或者使内含子连接失活。在典型的敲除构建体中，基因的某些部分用选择性标记(例如neo基因)取代，以使所述基因描述如下：IL-1RN 5′/neo/IL-1RN 3′，其中IL-1RN 5′和IL-1RN 3′分别指IL-1RN基因的上游和下游的基因组或cDNA序列，neo指新霉素抗性基因。在另一个敲除构建体中，在侧翼位置加入第二种选择标记，以使所述基因描述如下：IL-1RN/neo/IL-1RN/TK，其中TK是胸腺嘧啶激酶基因，其可以加入到前述构建体的IL-1RN5′或IL-1RN3′序列中，可以进一步在适当的介质中再次被选择(即负选择标记)。这种双标记构建体使得可以从通常保留有TK序列的非同源重组事件中选择出去除了侧翼TK标记的同源重组事件。可以在外显子，内含子，特别是内含子连接，和/或调控区域例如启动子中进行基因缺失和/或取代。

“连锁不平衡”是指两个等位基因以比从每个等位基因在给定的控制人群中发生的单独频率预期的频率更高的频率共遗传。独立遗传的两个等位基因发生的预期频率是第一个等位基因的频率加上第二个等位基因的频率。以预期频率共发生的等位基因称为“连锁不平衡”。连锁不平衡的原因不清楚。可能是因为特定等位基因组合的选择，或者近期的遗传上异质的人群的混合。此外，如果标记与疾病基因有紧密联系，如果近期发生疾病突变，预期等位基因(或连锁的等位基因群组)与所述疾病基因相关，使得没有足够的时间通过特定染色体区域上的重组事件获得平衡。当它是指由多于一个等位基因组成的等位基因模式的时候，如果包含第一个等位基因模式的所有等位基因与第二个等位基因模式的至少一个等位基因连锁不平衡，则第一个等位基因模式与第二个等位基因模式连锁不平衡。连锁不平衡的一个实例是发生在IL-1RN(+2018)和IL-1RN(VNTR)多态性位点的等位基因之间。IL-1RN(+2018)处的两个等位基因100％与IL-1RN(VNTR)的两个最频繁出现的等位基因，即等位基因1和等位基因2连锁不平衡。

术语“标记”指基因组中的序列，已知其在个体之间会有变化。例如，IL-1RN基因具有由可变数量的串连重复(VNTR)组成的标记。

“突变基因”或“突变”或“功能性突变”是指基因的等位基因形式，相对于没有该突变基因的患者，其能改变具有突变基因的患者的表型。由突变引起的表型改变可以用特定的试剂进行修正或补偿。如果患者必须对所述突变是纯合体才能具有改变的表型，则所述突变称为隐性的。如果所述突变基因的一个拷贝足以改变患者的表型，则所述突变称为显性的。如果患者具有所述突变基因的一个拷贝，并且具有介于纯合体患者和杂合体患者(对于该基因来说)之间的表型，则所述突变称为共显性的。

本发明的“非人动物”包括动物例如啮齿动物，非人灵长类动物，绵羊，狗，母牛，山羊等，两栖动物，例如爪蟾属的成员，和转基因禽类(例如小鸡，鸟等)。本文所用的术语“嵌合动物”是指其中具有重组基因的动物，或重组基因在该动物的某些细胞但不是所有细胞中表达的动物。术语“组织特异性嵌合动物”是指重组IL-1基因之一在某些组织中而不是其它组织中存在和/或表达或被破坏。术语“非人哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何成员，除了人。

本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸或寡核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)，和，如果合适的话，核糖核酸(RNA)。该术语也可以被理解为包含，作为等同物的，用核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物(例如肽核酸)以及可用于实施方案中的，单链(有义或反义)或双链多核苷酸。

术语“骨质疏松”由世界卫生组织定义为“...一种系统性骨骼疾病，表征为低骨量，骨组织的微结构退化，导致骨脆性增加，易于骨折”(WHO Consensus Development Conference 1993)。骨质疏松的临床定义是一种骨密度(BMD)或骨矿量(BMC)比年轻健康女性的平均值低2.5标准差(SD)以上的状况。严重的骨质疏松定义为具有比年轻健康女性的平均值低2.5SD以上的BMD或BMC并且存在一处或多处脆性骨折。由于骨损失不严格限于特定部位，骨质疏松可表现为多种形式，包括牙槽，股骨，桡骨，脊椎或腕部骨损失或发生骨折，绝经后骨损失，骨量严重减少，发生骨折或骨损失速度。

术语“多态性”是指基因或其部分(例如等位基因变体)有多于一种形式共同存在。具有至少两种不同形式，即两种不同的核苷酸序列的基因的部分称作“基因的多态性区域”。基因的多态性区域处的特定基因序列就是等位基因。多态性区域可以是单个核苷酸，在不同的等位基因中都不同。多态性区域还可以是几个核苷酸长。

术语“疾病的倾向性”，也叫疾病的“倾向性”或“易感性”或任何类似的短语，意指发现特定的等位基因与患者发生特定疾病(例如血管病)相关或可对其进行预测。所述等位基因在患有疾病的个体中与健康个体相比其频率表现过度。因此，这些等位基因可以用于甚至是在有症状前的或患病前的个体中预测疾病。

本文所用的“小分子”是指分子量小于大约5kD，最优选小于大约4kD的成分。小分子可以是核酸，肽，拟肽，碳水化合物，脂类或其它有机或无机分子。

本文所用的术语“特异性杂交”或“特异性检测”指核酸分子的能与样品核酸的至少大约6个连续核苷酸杂交的能力。

“转录调控序列”是在本说明书中通篇使用的通用术语，例如起始信号序列，增强子，和启动子，其能诱导或控制与其可操作地连接的蛋白编码序列的转录。

本文所用的术语“转基因”是指被引入细胞的核酸序列(编码，例如，IL-1多肽之一，或另外的反义转录物)。转基因对于它引入其中的转基因动物或细胞来说可以是部分或完全异源的，即外源的，或者，与它引入其中的转基因动物或细胞的内源基因是同源的，但是被设计成插入到，或被插入到所述动物的基因组中以改变它插入其中的细胞的基因组(例如，它被插入到与天然基因不同的位置，或者它的插入导致基因敲除)。转基因也可以以游离基因的形式存在于细胞中。转基因可以包括一个或多个转录调控序列以及任何其它可能是所选核酸的最佳表达所必需的核酸，例如内含子。

“转基因动物”是指任何动物，优选是非人的哺乳动物，鸟或两栖类动物，其中所述动物的一个或多个细胞含有通过人为干预，例如通过本领域熟知的转基因技术引入的异源核酸。所述核酸通过谨慎的基因操作，例如通过显微注射或用重组病毒感染引入到所述细胞的前体中从而直接或间接地引入到细胞中。术语基因操作不包括传统的杂交育种，或体外受精，而是指引入重组DNA分子。这种分子可能整合到染色体中，或者它可能在染色体外复制DNA。在本文所述的典型的转基因动物中，转基因引起细胞表达IL-1多肽之一的重组形式，例如激动或拮抗形式。但是，也可能得到其中重组基因是沉默的转基因动物，例如，下面所述的FLP或CRE重组酶依赖的构建体。而且，“转基因动物”还包括那些由于人为干预，包括重组和反义技术造成的一个或多个基因被破坏的重组动物。该术语还包括所有的子代。因此，初始动物和所有的F1，F2，F3等，其子代都包括在内。

本文所用的术语“治疗”包括治愈和使状况或疾病的至少一个症状改善。

术语“载体”指能输送与之相连的另一个核酸的核酸分子。优选载体的一种类型是游离体，即能在染色体外复制的核酸。优选的载体是那些能自主复制和/或表达与之相连的核酸的载体。能直接表达与之可操作相连的基因的载体在本文中称为“表达载体”。通常，用于重组DNA技术的表达载体是“质粒”的形式，其通常指处于载体形式时不与染色体结合的环形双链DNA环。在本说明书中，由于质粒是最常使用的载体形式，“质粒”和“载体”可互换使用。但是，本发明还包括具有等同功能的以及后来成为本领域公知的表达载体的其它形式。

术语“野生型等位基因”是指当在患者中存在两个拷贝的时候会导致野生型表型的基因的等位基因。由于基因中特定的核苷酸变化可能不会影响具有所述核苷酸变化的基因的两个拷贝的患者的表型，因此一个特定的基因可能有几种不同的野生型等位基因。

药物预测

鉴别IL-2等位基因和单倍体型

本发明至少部分基于鉴别了已确定为与骨损失，骨折危险或其它骨质疏松指标相关(达到统计学显著的程度)的特定的等位基因。因此，等位基因的检测可指示患者是否患有或易于发生骨质疏松。但是，由于这些等位基因与其它等位基因连锁不平衡，对其它这些连锁的等位基因的检测也可以指示患者是否患有或易于发生特定的疾病或状况。例如，44112332单倍体型含有下述基因型：

IL-1A的222/223标记的等位基因4IL-1A的gz5/gz6标记的等位基因4IL-1A的-889标记的等位基因1IL-1B的+3954标记的等位基因1IL-1B的-511标记的等位基因2gaat.p33330标记的等位基因3Y31标记的等位基因3
	IL-1RN的+2018的等位基因2IL-1A的+4845的等位基因1
IL-1R的VNTR标记的等位基因2

IL-1RN的另一个外显子(外显子lic，其产生胞内形式的基因产物)中的三个其它多态性也与IL-1RN(VNTR)的等位基因2连锁不平衡(Clay et al.，(1996)Hum Genet 97：723-26)。包括：IL-1RN外显子lic(1812)(GenBank：X77090 at 1812)；IL-1RN外显子lic(1868)(GenBank：X77090at 1868)；IL-1RN外显子lic(1887)(GenBank：X77090at 1887)。而且启动子中的另一个产生该基因的另一种剪接的胞内形式的多态性，Pic(1731)多态性(GenBank：X77090 at 1731)，也与IL-1RN(VNTR)多态性位点的等位基因2连锁不平衡。对于这些多态性位点中的每一个，已确定等位基因2的序列变体与IL-1RN(VNTR)基因座的等位基因2连锁不平衡(Clay et al.，(1996)Hum Genet 97：723-26)。

33221461单倍体型含有下述基因型：

IL-1A的222/223标记的等位基因3IL-1A的gz5/gz6标记的等位基因3IL-1A的-889标记的等位基因2IL-1B的+3954标记的等位基因2IL-1B的-511标记的等位基因1gaat.p33330标记的等位基因4Y31标记的等位基因6
	IL-1RN的+2018的等位基因1IL-1A的+4845的等位基因2
IL-1R的VNTR标记的等位基因1

具有44112332单倍体型的个体典型地被刺激后过量产生IL-1α和IL-1β蛋白。相反，具有33221461单倍体型的个体典型地表达IL-1ra不足。每种单倍体型都导致最终的促炎性反应，单倍体型内的每个等位基因都可能具有一种效果，以及复合的基因型效果。此外，特定的疾病可能与两个单倍体型模式都相关。

如本文所述的，除了上述的等位基因模式之外，本领域技术人员容易鉴别与和骨质疏松相关的等位基因连锁不平衡的其它等位基因(包括多态性和突变)。例如，可以从第一组没有骨质疏松的患者中收集核酸样品，以及从第二组患有所述疾病的患者中收集DNA。然后将所述核酸样品进行比较以鉴别那些与第一组相比在第二组中过度表现的等位基因，其中这些等位基因可能与骨质疏松相关。或者，可以通过例如对大量人群进行基因分型，进行统计学分析以确定比预期的更经常一起出现的等位基因，从而鉴别与骨质疏松相关的等位基因连锁不平衡的等位基因。优选地，所选择的群组由遗传上相关的个体组成。遗传上相关的个体包括来自同一个人种，同一个种族，或者甚至同一个家族的个体。随着对照群组和检测群组之间遗传相关性的增加，与致病等位基因更远连锁的多态性等位基因的预测值也更高。这是因为只有较短的进化时间允许在原发人群中在一条染色体上连锁的多态性通过基因交换时间重新分布。因此可以开发人种特异的，种族特异的，甚至家族特异的基因分型检测以检测在人类进化的最近时期，例如在分出主要人种以后，人群分离成不同的种族群体以后，甚至在特定家族系的近期历史时期以内出现的疾病等位基因。

两个多态性标记或一个多态性标记和致病突变之间的连锁不平衡是亚稳态的。如果缺乏选择压力或者基本突变事件的零散的连锁的再发生，所述多态性最终会变的不再与染色体重组事件相关，因此会通过人类进化过程达到连锁平衡。因此随着在至少两个因素：减小的多态性标记和致病突变之间的物理距离，和减少的连锁对的解离可获得的减数分裂代数上的变化，发现与疾病或状况连锁不平衡的多态性等位基因的可能性有可能增加。对后一个因素的探讨提示，两个个体相关越密切，它们越可能具有共同的含有连锁的多态性的母本染色体或染色体区域，该连锁对越不可能通过每一代发生的减数分裂交换事件解连锁。因此，两个个体相关越密切，宽跨度的多态性越可能共遗传。因此，对于因人种，种族或家族相同而相关的个体，可以依据更远距离跨度的多态性位点的可靠性指示连锁的致病突变的遗传。

可以设计与IL-1基因座的特定基因，例如IL-1A，IL-1B或IL-1RN或相关基因杂交的合适探针。这些基因组DNA序列分别如图3，4和5所示，进一步分别相应于SEQ ID No.1，2和3。或者这些探针可以含有相关基因组基因座的其它区域，包括基因间序列。实际上，人2号染色体的IL-1区域跨越大约400,000个碱基对，假定平均每1,000个碱基对有一个单核苷酸多态性，包括单独的大约400个SNP位点。然而可以从不同的公共来源获得其它可用于本发明的多态性。例如，人基因组数据库收集了基因内SNP，可通过序列进行搜索，目前含有大约2,700个条目(http：//base.interactiva.de)。麻省理工学院的人多态性数据库[MITSNP database(http：//www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html)]也是可获得的。从这些资源中可以找到SNP和其它人多态性。

例如，在这些数据库中的任何一个中对人基因组的IL-1区域的检查表明IL-1基因座基因的侧翼是叫做微卫星标记AFM220ze3 at 127.4 cM的着丝粒近端的多态性标记(centiMorgans)(参见GenBank Acc.No.Z17008)以及称为微卫星锚定标记AFM087xal at 127.9cM的远端多态性标记(参见GenBank Acc.No.Z16545)。这些人多态性位点都是CA二核苷酸重复微卫星多态性，在人群中表现出高度的杂合性。例如，AFM220ze3的一个等位基因用序列为TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC(SEQ ID No.4)的5’引物和序列为TGGCCTCCAGAAACCTCCAA(SEQ ID No.5)的3’引物，产生211bp的PCR扩增产物。进一步，AFM087xal的一个等位基因用序列为GCTGATATTCTGGTGGGAAA(SEQ ID No.6)的5’引物和序列为GGCAAGAGCAAAACTCTGTC(SEQ IDNo.7)的3’引物，产生177bp的PCR扩增产物。相应于这些人2号染色体CA二核苷酸重复多态性的5’和3’的独特序列的等同引物对于本领域技术人员来说是显而易见的。适当的等同引物包括那些在指定引物的大约1kb内杂交的引物，进一步是任何位置的长度为大约17bp到大约27bp的引物。用于扩增独特的人染色体的基因组序列的引物设计的一般原则是其具有至少大约50℃的熔解温度，其中用公式T_熔解＝[2×(A或T的#)+4×(G或C的#)]估计近似的熔解温度。

有多个其它人多态性位点发生在这两个CA二核苷酸重复多态性之间，这为确定一个家族中或其它遗传上相关的个体群组中的预测的等位基因提供了其它靶。例如，国家生物技术信息中心的网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)上列出了IL-1基因座区域中的多个多态性标记，并提供了用于扩增和分析这些标记的适当引物的设计原则。

相应地，本发明的核苷酸片段的应用可以利用它们能与人染色体2q 12-13的互补延长链或该区域的cDNA形成双分子的能力，或者它们能提供扩增该区域的DNA或cDNA的引物的能力。为此目的设计合适的引物需要考虑多种因素。例如，长度为10，15，或18个核苷酸到大约20个，或到大约30个核苷酸的片段特别有用。较长的序列，例如40，50，80，90，100，甚至是全长序列，对于特定的实施方案来说是更优选的。至少大约18到20个核苷酸长的寡核苷酸的长度为本领域技术人员所接受，因为其足以进行充分的特异性杂交，因而能用作分子探针。而且，根据本发明，可以使用不同的杂交条件获得探针与靶序列之间的不同的选择性。对于要求有高选择性的应用来说，典型地使用相对严谨的条件形成杂交。例如，相对低的盐浓度和/或相对高的温度条件，例如条件为0.02M-0.15M的NaCl，大约50℃到大约70℃的温度。这种选择性条件几乎不会在探针和模板或者靶链之间产生错配。

可以在检测上述等位基因的时候一同检测或监测其它等位基因或疾病的其它标志，例如，确定血管壁厚度(例如用超声波测量)，或者患者是否抽烟，喝酒，超重，有压力或进行锻炼。

等位基因的检测

许多方法都可以用来检测人多态性位点上的特定等位基因。检测特定多态性等位基因的优选方法部分取决于所述多态性的分子性质。例如，所述多态性位点的不同等位基因形式的差别可能是所述DNA的单个碱基对。这种单核苷酸多态性(或SNP)是基因变化的主要形式，包括所有已知多态性的80％。它们在人基因组中的密度估计是平均每1,000个碱基对中有1个。SNP通常是双等位基因，只有两种不同的形式(虽然理论上可能是SNP有四种不同的形式，相应于DNA中四种不同的核苷酸碱基)。不过，从突变上来说SNP比其它多态性更稳定，这使得它们更适用于用于定位致病突变的对标记和未知变体之间的连锁不平衡的关联研究。此外，由于SNP典型地仅有两个等位基因，它们可以通过简单的加/减检测，而不用进行长度测量以确定其基因型，这使得它们更容易实现自动化。

有多种方法可用于检测个体中特定单核苷酸多态性等位基因的存在。该领域中的进展已提供了准确，简单，并且便宜的大规模SNP基因分型方法。最近，例如，已描述了几种新技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)，微板阵列对角线凝胶电泳(MADGE)，高温测序，寡核苷酸特异性连接，TaqMan系统以及各种DNA“芯片”技术例如Affymetrix SNP芯片。这些方法要求扩增靶基因区域，通常是通过PCR。还有其它新开发的方法，其是基于通过侵入性的切割，然后用质谱或固定化padlock探针和滚环扩增产生小信号分子，这可能最终会导致不再需要进行PCR。几种本领域公知的检测特定单核苷酸多态性的方法总结如下。本发明的方法理解为包括了所有可获得的方法。

已开发了几种方法使得更容易对单核苷酸多态性进行分析。在一个实施方案中，可以使用专门的抗核酸外切酶的核苷酸，如例如Mundy，C.R.的文献(美国专利No.4,656,127)中公开的，检测单碱基多态性。根据该方法，使与紧邻多态性位点3’的等位基因序列互补的引物与从特定动物或人获得的靶分子杂交。如果靶分子上的多态性位点含有与存在的特定的抗核酸外切酶的核苷酸衍生物互补，那么所述衍生物会掺入到杂交引物的末端。这种掺入使得所述引物可抵抗核酸外切酶，因此可以进行检测。由于样品的抗核酸外切酶的衍生物是已知的，发现所述引物能抵抗核酸外切酶说明靶分子的多态性位点上存在的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物的核苷酸互补。该方法的优点在于它不需要测定大量的无关序列数据。

在本发明的另一个实施方案中，使用基于溶液的方法确定多态性位点的核苷酸。Cohen，D.et al.(法国专利2,650,840；PCT申请No.WO91/02087).如美国专利No.4,656,127中Mundy的方法所述，使用与紧邻多态性位点3’的等位基因序列互补的引物。该方法用标记的双脱氧核苷酸衍生物确定该位点的核苷酸，如果该标记的双脱氧核苷酸衍生物与所述多态性位点的核苷酸互补，就会掺入所述引物的末端。

另一个方法，就是Genetic Bit Analysis或者GBA^TM如Goelet，P.et al.(PCT申请No.92/15712)所述。Goelet，P.et al.的方法使用标记终止子的混合物和与多态性位点的3’的序列互补的引物。掺入的标记终止子通过与待评价的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸互补来确定。与Cohen et al.(法国专利2,650,840；PCT申请No.WO91/02087)的方法相反，Goelet，P.et al.的方法优选是异质相检测，其中引物或靶分子固定于固相上。

近来，已经描述了几种用于检测DNA中多态性位点的引物指导的核苷酸掺入方法(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids.Res.17：7779-7784(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.18：3671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 8：684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：1143-1147(1991)；Prezant，T.R.et al.，Hum.Mutat.1：159-164(1992)；Ugozzoli，L.et al.，GATA 9：107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208：171-175(1993))。这些方法与GBA^TM的不同之处在于它们都依靠标记脱氧核苷酸的掺入以辨别多态性位点的碱基。在这种情况下，由于信号与掺入的脱氧核苷酸的数量成比例，在相同核苷酸组上发生的多态性可以导致信号与该组的长度成比例(Syvanen，A.-C.，et al.，Amer J.Hum.Genet.52：46-59(1993))。

对于那些使蛋白质的翻译过早终止的突变，蛋白质截断检测(PTT)提供了有效的诊断方法(Roest，et.al.，(1993)Hum.Mol.Genet.2：1719-21；van der Luijt，et.al.，(1994)Genomics 20：1-4)。在PTT方法中，先从可获得的组织中分离RNA并反转录，然后用PCR扩增感兴趣的区段。然后用反转录PCR的产物作为模板进行巢式PCR扩增，引物含有RNA聚合酶启动子和能起始真核翻译的序列。扩增了感兴趣的区段以后，掺入到引物中的独特的基序使得可以继续进行体外转录和PCR产物的翻译。将翻译产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳，出现截断的多肽表示存在导致翻译过早终止的突变。在这项技术的一个变形中，当感兴趣的靶区域来自单个外显子的时候，用DNA(相对于RNA)作为PCR模板。

可以使用任何细胞类型或组织获得用于本文所述的诊断中的核酸样品。在一个优选的实施方案中，所述DNA样品得自于体液，例如，通过已知方法获得的血液(例如静脉穿刺)，或唾液。或者，可以对干燥样品(例如头发或皮肤)进行核酸检测。当使用RNA或蛋白质的时候，可使用的细胞或组织必须表达IL-1基因。

也可以直接对得自于活组织检查或切除得到的患者组织的组织部分(固定化的和/或冷冻的)实施原位诊断方法，而不需要进行核酸纯化。在这种原位方法中可使用核酸试剂作为探针和/或引物(参见，例如，Nuovo，G J.，1992，PCR in situ hybridization：protocols and applications，Raven Press，NY)。

除了主要用于检测一个核酸序列的方法，在这些检测方案中还可以对概况进行评估。例如可以通过使用差异显示方法，Northern分析和/或RT-PCR产生指纹概况。

优选的检测方法是用与IL-1促炎性单倍体型的至少一个等位基因的区域重叠，并具有突变或多态性区域周围的大约5，10，20，25，或30个核苷酸的探针进行的等位基因特异性杂交。在本发明的优选实施方案中，几个能够特异地与其它骨质疏松中涉及的等位基因变体杂交的探针与固相支持物，例如“芯片”(其能支持大约250,000个寡核苷酸)相连。寡核苷酸可以通过多种方法，包括平版印刷与固相支持物相连。用这些含有寡核苷酸的芯片，也称作“DNA探针阵列”进行突变检测分析如例如Croninet al.(1996)Human Mutation 7：244中所述。在一个实施方案中，芯片含有基因的至少一个多态性区域的所有等位基因变体。然后使所述固相支持物与检测核酸接触，检测其与特定探针的杂交。相应地，一个或多个基因的多个等位基因变体可以通过简单的杂交实验鉴定。

这些技术还包含在分析之前扩增所述核酸的步骤。扩增技术是本领域技术人员公知的，包括但不限于克隆，聚合酶链式反应(PCR)，特定等位基因的聚合酶链式反应(ASA)。连接酶链式反应(LCR)，巢式聚合酶链式反应，自激序列复制(Guatelli，J.C.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)，转录扩增系统(Kwoh，D.Y.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)和Q-Beta复制酶(Lizardi，P.M.et al.，1988，Bio/Technology 6：1197)。

扩增产物可以用多种方式检测，包括长度分析，限制性酶切然后分析片段长度，检测反应产物中特定的标记(tagged)寡核苷酸引物，等位基因特异的寡核苷酸(ASO)杂交，等位基因特异的5’外切酶检测，测序，杂交等。

基于PCR的检测方法包括对多个标记同时进行多元扩增。例如，本领域公知要选择PCR引物以产生在长度上不重叠并可同时进行分析的PCR产物。或者，可以用进行了不同标记(labeled)的引物扩增不同的标记(marker)，从而可以分别检测。当然，基于杂交的检测方法使得可以对样品中的多个PCR产物分别检测。其它对多个标记进行多元分析的技术是本领域公知的。

在仅为举例说明的实施方案中，所述方法包括下述步骤：(i)收集患者细胞样品，(ii)从样品的细胞中分离核酸(例如基因组，mRNA或二者)，(iii)使所述核酸样品与一个或多个能在所述等位基因发生杂交和扩增的条件下与IL-1促炎性单倍体型的至少一个等位基因的5’或3’特异性杂交的一个或多个引物接触，以及(iv)检测扩增产物。这些检测方案特别可用于检测存在量特别低的核酸分子。

在患者检测的优选实施方案中，通过限制性酶切模式的改变鉴别IL-1促炎性单倍体型的等位基因。例如，分离样品和对照DNA，扩增(任选地)，用一种或多种限制性内切酶消化，用凝胶电泳确定片段长度。

在另一个实施方案中，可以用本领域公知的多种测序反应中的任何一种直接对等位基因进行测序。示例性的测序反应包括那些基于Maxim and Gilbert((1977)Proc.Natl Acad Sci USA 74：560)或Sanger(Sanger et al(1977)Proc.Nat.Acad.Sci USA 74：5463)的技术的。当进行患者检测(参见，例如Biotechniques(1995)19：448)，包括用质谱进行测序(参见，例如PCT出版物WO94/16101；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36：127-162；和Griffin et al.(1993)Appl Biochem Biotechnol 38：147-159)的时候，可以使用多种自动测序方法中的任何一种。在特定的实施方案中，在测序反应中需要确定的是核酸碱基的仅仅一个、两个或三个的出现。例如，可以进行A-track等，例如，其中只有一个核酸被检测。

在另一个实施方案中，可以使用防止切割试剂(例如核酸酶，羟胺或四氧化锇和哌啶)作用的保护作用检测RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA异质双链中的错配碱基(Myers，et al.(1985)Science 230：1242)。通常，“错配切割”技术先是提供通过使含有野生型等位基因的(标记的)RNA或DNA与样品杂交形成的异质双链。用切割例如由于对照和样品链之间的碱基对错配而存在的双链体的单链区域的试剂处理双链的双链体。例如，可用RNase处理RNA/DNA双链体，用S1核酸酶处理DNA/DNA杂交体以酶解错配的区域。在其它实施方案中，可以用羟胺或四氧化锇以及哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区域。错配区域被消化以后，将得到的物质在变性聚丙酰胺凝胶上根据长度分离，以确定突变的位点。参见，例如Cotton et al(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 85：4397；和Saleeba et al(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在优选的实施方案中，可以标记对照DNA或RNA以进行检测。

在另一个实施方案中，错配切割反应使用一个或多个能识别双链DNA的错配碱基对的蛋白质(所谓的“DNA错配修复”酶)。例如，E.coli的mutY酶切割G/A错配的A，HeLa细胞的胸腺嘧啶DNA糖基化酶切割G/T错配的T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis 15：1657-1662)。根据示例性的实施方案，基于IL-1基因座单倍体型的等位基因的探针与检测细胞的cDNA或其它DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理所述双链体，可用电泳方法等检测切割产物，如果有的话。参见，例如，美国专利No.5,459,039。

在其它实施方案中，可用电泳迁移率的改变鉴别IL-1基因座等位基因。例如，可用单链构象多态性(SSCP)检测突变的和野生型核酸的电泳迁移率的差异(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 86：2766，还可参见Cotton(1993)Mutat Res 285：125-144；和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9：73-79)。样品和对照IL-1基因座等位基因的单链DNA片段变性并且可以再复性。单链核酸的二级结构根据序列而不同，得到的电泳迁移率的改变甚至可检测到单个碱基的改变。DNA片段可被标记或者可用标记的探针检测。用RNA(胜于DNA)可增加所述检测的灵敏度，其中二级结构对序列变化更为敏感。在优选的实施方案中，主体方法用异质双链分析根据电泳迁移率的改变分离双链异质双链分子(Keen et al.(1991)Trends Genet 7：5)。

在另一个实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测等位基因在含有变性剂梯度的聚丙酰胺凝胶上的移动(Myers etal.(1985)Nature 313：495)。当用DGGE做为分析方法的时候，要对DNA进行修饰以确保它不会完全变性，例如通过PCR加入大约40bp的高熔解点的富含GC的DNA的GC clamp。在另一个实施方案中，使用温度梯度代替变性试剂梯度鉴别对照和样品DNA的迁移率的差别(Rosenbaum and Reissner(1987)BiophysChem 265：12753)。

用于检测等位基因的其它方法的实例包括但不限于，选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增，或选择性引物延伸。例如，可以制备其中已知的突变或核苷酸差异(例如等位基因变体)位于中心的寡核苷酸引物，然后使之与靶DNA在只有存在完全配对才发生杂交的条件下杂交(Saiki et al.(1986)Nature 324：163)；Saiki etal(1989)Proc.Natl Acad.Sci USA 86：6230)。这种等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可用来检测每个反应中的一个突变或多态性区域，其中当所述寡核苷酸连接于杂交膜上并且与标记的靶DNA杂交的时候，所述寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或多种不同的突变或多态性区域杂交。

或者，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可与本发明一起使用。用做特异性扩增的引物的寡核苷酸可以在该分子的中心(以使扩增依赖于差异杂交)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)，或在一个引物的3’末端，其在适当的条件下可以防止错配或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech11：238)，携带感兴趣的突变或多态性区域。此外，可以向突变区域中引入新的限制性位点，以进行基于切割的检测(Gasparini et al(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。在特定的实施方案中，还可以用Taq连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：189)。在这种情况下，只有在5’序列的3’端完全配对的条件下才发生连接，这使得可以通过检查是否存在扩增检测特定位点上已知突变的存在。

在另一个实施方案中，用寡核苷酸连接检测(OLA)鉴别等位基因变体，如美国专利No.4,998,617和Landegren，U.etal.((1988)Science 241：1077-1080)中所述。OLA方法使用两个能与靶的单链的相邻序列杂交的寡核苷酸。寡核苷酸中的一个与分离标记，例如生物素化的标记相连，另一个可检测地进行标记。如果在靶分子中发现精确的互补序列，所述寡核苷酸会杂交以使它们的末端相邻，产生连接底物。连接使得可以用抗生物素蛋白，或另一个生物素配体回收标记的寡核苷酸。Nickerson，D.A.et al.描述了一种综合了PCR和OLA的特性的核酸检测方法(Nickerson，D.A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8923-27)。在此方法中，用PCR实现对靶DNA的指数扩增，然后用OLA检测。

已开发了几种基于此OLA方法的技术，它们可以用于检测IL-1基因座单倍体型的等位基因。例如，美国专利No.5,593,826公开了一种OLA，其使用具有3’氨基基团和5’磷酸化寡核苷酸的寡核苷酸形成具有氨基磷酸酯键的结合物。在Tobe et al.((1996)Nucleic Acids Res 24：3728)描述的另一种OLA的变形中，OLA与PCR组合使得能在单个微量滴定孔中对两个等位基因定型。通过用独特的半抗原，即毛地黄毒苷和荧光素标记每个等位基因特异的引物，可以用不同的酶报告子，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记半抗原特异的抗体从而检测每个OLA反应。该系统使得可以用能产生两种不同颜色的高通量的形式检测两个等位基因。

本发明的另一个实施方案是检测发生骨质疏松的易感性的试剂盒。所述试剂盒可以含有一个或多个寡核苷酸，包括与IL-1基因座单倍体型的至少一个等位基因的5’和3’杂交的5’和3’寡核苷酸。PCR扩增寡核苷酸用25到2500个碱基对的杂交分开，优选用大约100到大约500个碱基对的杂交分开，以产生适宜大小的PCR产物，以进行后续分析。

可用于本发明的诊断方法的特别优选的引物包括SEQ ID No.1-7。

更新的人染色体2q13-其中含有人IL-1基因座，的序列信息和更新的该基因座的人多态性信息使得更容易设计用于用本发明的方法扩增和检测IL-1多态性等位基因的其它寡核苷酸。例如，IL-1A，IL-1B和IL-1RN的DNA序列分别包括GenBankAccession No.X038332，GenBank Accession No.X0450和GenBank Accession No.X64532。可以用这些序列信息和本领域公知的设计和最优化引物序列的标准技术方便地设计合适的用于检测这些基因中的人多态性的引物。例如可以用商业可获得的引物选择程序例如Primer 2.1，Primer 3或GeneFisher获得最优设计的引物序列(参见，Nicklin M.H.J.，Weith A.Duff G W.，″APhysical Map of the Region Encompassing the HumanInterleukin-1α，interleukin-1β，and Interleukin-1 ReceptorAntagonist Genes″Genomics 19：382(1995)；Nothwang H.G.，et al.″Molecular Cloning of the Interleukin-l gene Cluster：Constructionof an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Mapin the Region of Chromosome 2q13″Genomics 41：370(1997)；Clark，et al.(1986)Nucl.Acids.Res.，14：7897-7914[publishederratum appears in Nucleic Acids Res.，15：868(1987)和theGenome Database(GDB)project at the URL http：//www.gdb.org)。

用于试剂盒的时候，寡核苷酸可以是多种天然和/或合成组合物例如合成的寡核苷酸，限制性片段，cDNA，合成的肽核酸(PNA)等中的任何一种。所述检测试剂盒和方法还可以使用标记的寡核苷酸使得容易进行检测鉴定。可用的标记的实例包括放射性标记，酶，荧光化合物，抗生物素蛋白链菌素，抗生物素蛋白，生物素，磁性组分，金属结合组分，抗原或抗体组分等。

所述试剂盒，任选地，还可包括DNA取样手段。DNA取样手段是本领域技术人员公知的，包括但不限于底物，例如滤纸，AmpliCard^TM(University of Sheffield，Sheffield，England S10 2JF；Tarlow，JW，et al.，J.of Invest.Dermatol.103：387-389(1994))等；DNA纯化试剂例如Nucleon^TM试剂盒，溶解试剂，蛋白酶溶液等；PCR试剂，例如10x反应缓冲液，热稳定聚合酶，dNTPs等；和等位基因检测手段例如HinfI限制酶，等位基因特异的寡核苷酸，干血的巢式PCR的简并寡核苷酸引物。

药物基因组学

与发生骨质疏松的易感性相关的特定等位基因的知识，单独或与其它引起所述状况的遗传缺陷的信息一起，使得可以根据个体基因情况定制预防或治疗方法，这是“药物基因组学”的目标。因此，将骨质疏松的个体的IL-1情况与群体情况比较使得可选择或设计对特定的患者或患者群体(即一组具有相同基因改变的患者)安全有效的药物或其它治疗方案。

此外，根据基因情况靶定有最高的临床有效性的群体的能力使得可以：1)重新定位已经市场化的药物；2)重新考虑由于安全性和有效性的限制其临床开发已被停止的药物候选物；以及3)加速地和低成本地开发候选治疗方法和更佳的药物标记(例如，由于对不同剂量的试剂对成因突变的效果的测定可用于最优化有效剂量)。

用特定治疗方法对个体的治疗可以通过测定蛋白(例如IL-1α，IL-1β，或IL-1Ra)，mRNA和/或转录水平监测。根据检测到的水平，然后可以保持或调整(增加或减少剂量)所述治疗方案。在一个优选的实施方案中，对用试剂治疗患者的效果的评价包括下述步骤：(i)在给予所述试剂之前从患者获得给药前样品；(ii)检测给药前样品中蛋白质，mRNA或基因组DNA的水平或量；(iii)从患者获得一个或多个给药后样品；(iv)检测给药后样品中蛋白质mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；(v)分别比较给药前样品中的蛋白质mRNA或基因组DNA的表达水平或活性和给药后样品中的相应蛋白质mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；以及(vi)相应地改变所述试剂对所述患者的给药。

还可以在给予治疗剂之前和之后获得患者的细胞以检测除IL-1基因以外的基因的表达水平以证明所述治疗剂不会增加或减少可能是有害的基因的表达。这可以例如通过转录分型方法实现。因此，体内暴露于治疗剂的细胞的mRNA和来自相同类型细胞的没有暴露于所述治疗剂的mRNA可以被反转录并与含有多种基因的DNA的芯片杂交，从而比较用所述治疗剂处理的细胞和没有用所述治疗剂处理的细胞中的基因表达。

骨质疏松疗法

骨质疏松疗法指能预防或延迟患者发生骨质疏松或减轻其症状的任何试剂或治疗方案(包括药物，营养医疗品和外科手段)。所述治疗剂可以是多肽，拟肽，核酸或其它无机或有机分子，优选是“小分子”包括维生素，矿物质和其它营养剂。优选所述治疗剂可以通过模仿或加强(激动)或抑制(拮抗)天然存在的多肽的作用，调节IL-1多肽的至少一种活性，例如与受体的相互作用。激动剂可以是野生型蛋白或它的具有野生型的至少一个生物活性，例如受体结合活性的衍生物。激动剂还可以是能上调基因表达或增加蛋白的至少一种生物活性的化合物。激动剂还可以是能增加多肽和另一个分子，例如受体的相互作用的化合物。拮抗剂可以是能抑制或减少蛋白和另一个分子，例如受体或能阻断信号传导或翻译后处理的试剂(例如，IL-1转换酶(ICE)抑制剂)的相互作用的化合物。相应地，优选的拮抗剂是能抑制或减少与受体的结合并因此而阻断后续的受体激活的化合物。拮抗剂还可以是能下调基因表达或能减少存在的蛋白的量的化合物。拮抗剂可以是多肽的显性抑制形式，例如多肽的能与靶肽，例如受体相互作用，但不能促进所述受体激活的形式。所述拮抗剂还可以是编码多肽的显性抑制形式的核酸，反义核酸，或能特异地与RNA相互作用的核糖酶。还有其它拮抗剂是能与多肽结合并抑制其作用的分子。这种分子包括，例如靶肽的没有生物学活性的，能抑制与受体的结合的形式。因此，这些多肽会与蛋白质的活性位点结合并防止它与靶肽相互作用。其它拮抗剂包括能与分子的表位特异地相互作用的抗体，其结合会干扰所述多肽的生物学功能。在另一个优选的实施方案中，所述拮抗剂是小分子，例如能抑制多肽和靶受体之间的相互作用的分子。或者，所述小分子可以起到与除了受体结合位点以外的位点相互作用的拮抗剂的作用。

IL-1(例如IL-1α，IL-1β或IL-1受体拮抗物)由与IL-1基因连锁不平衡的基因编码的蛋白质的调节剂或可以含有任何类型的化合物，包括蛋白质，肽，拟肽，小分子，或核酸。优选的激动剂包括核酸(例如编码IL-1蛋白的或被IL-1蛋白上调或下调的基因)，蛋白质(例如IL-1蛋白质或因此而上调或下调的蛋白质)或小分子(例如调节IL-1蛋白的表达或结合的)。优选的拮抗剂，例如，可以用本文所述的检测方法鉴别的，包括核酸(例如单链(反义)或双链(三链)DNA或PNA和核糖酶)，蛋白质(例如抗体)和能抑制IL-1转录和/或蛋白活性的小分子。

有效剂量

这些化合物的毒性和治疗效力可以用细胞培养物或试验动物的标准药物方法测定，例如测定LD₅₀(对群体的50％致命的剂量)和Ed₅₀(对群体的50％治疗有效的剂量)。毒性效果和治疗效果的剂量比值是治疗指数，可以表示成LD₅₀/ED₅₀的比值。优选的是表现出高治疗指数的化合物。虽然表现出毒性副作用的化合物也可以使用，但应当注意要设计能将该化合物靶定到病变组织位点的递送系统以将对未感染的细胞可能具有的损伤减至最小，从而减小副作用。

由细胞培养物检测和动物研究获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ED50在内并且几乎没有毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。所述剂量可以在这个范围内变化，取决于所使用的剂量形式和所使用的给药方式。对于用于本发明的方法的任何化合物，最初可以根据细胞培养物检测估计治疗有效量。可以用动物模型确定剂量以获得包括在细胞培养物中测定的IC50(即具有对症状最大抑制的一半的效果的检测化合物浓度)在内的循环质膜浓度范围。该信息可以用于更精确地确定用于人的有用剂量。质膜中的水平可以通过例如高效液相色谱测定。

制剂和使用

用于本发明的组合物可以按照传统方式用一种或多种生理学可接受的载体或赋形剂配制。因此，所述化合物和其生理学可接受的盐和溶剂化物可以配制成通过，例如，注射，吸入或吹入(通过嘴或鼻子)或口服，经颊，肠胃外或直肠给药的形式。

为了进行治疗，本发明的化合物可以配制成多种给药负荷的形式，包括系统性和局部或定位给药。通常这些技术和制剂可在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA中找到。对于系统性给药，优选注射，包括肌肉内，静脉内，腹膜内，和皮下。对于注射，本发明的化合物可以制成液体溶液，优选用生理学相容的缓冲液例如Hank′s溶液或Ringer′s溶液。此外，所述化合物还可以制成固体形式，在使用前再溶解或重悬。还包括冻干形式。

对于口服给药，所述组合物可以是，例如，通过传统方法用药学可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预凝胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)制成的片剂或胶囊的形式。所述片剂可以用本领域公知的方法包被。口服给药的液体制剂可以是，例如，溶液，淤浆或悬液的形式，或者它们也可以制成干产品，在使用前与水或其它合适的载体混合。这种液体制剂可以通过传统方法用药学可接受的添加剂例如悬浮剂(例如山梨醇淤浆，纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水载体(例如ationd oil，油酯，酒精或分级植物油)；和防腐剂(例如p-羟基安息香酸甲酯或乙酯或山梨酸)制成。如果合适的话，所述制剂还可以含有缓冲盐，调味剂，染色剂和甜味剂。

可以适当的配制口服给药的制剂以控制释放活性化合物。对于经颊给药所述化合物可以是用传统方式配制的片剂或锭剂的形式。对于吸入式给药，用于本发明的化合物可以方便地以压力罐或喷雾器中的气溶胶喷雾的形式递送，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过阀门来确定以递送计算好的量。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以含有所述化合物和适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

所述化合物可以通过注射，例如通过快速浓注或连续输注进行肠胃外给药。注射制剂可以制成例如安瓿瓶或多剂量容器的单位剂量形式，其中加入防腐剂。所述组合物可以是例如悬液，溶液或油状或水相载体乳液的形式，可以含有配制试剂例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以是粉末形式，在使用前和适当的载体，例如无菌无热源水混合。

所述化合物还可以制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠，例如含有传统的栓剂基质例如可可油或其它甘油酯。

除了前述制剂，所述化合物还可以制成长效制剂。这种长期作用制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给药。因此，例如，所述化合物可以用适当的聚合物或疏水物质(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或制成难溶衍生物，例如难溶的盐。其它合适的递送系统包括微球，它提供了在较长时间中局部非侵害性地递送药物的可能性。该技术使用前毛细管大小的微球，其可以通过冠状导管注射到例如心脏或其它器官的选定部分，而不会引起炎症或缺血。所给予的治疗剂缓慢地从这些微球中释放，并被周围组织细胞(例如内皮细胞)吸收。

系统性给药还可以是穿过粘膜或穿过表皮的方法。对于穿过粘膜的或穿过表皮的给药，在制剂中使用适于要穿过的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域公知的，包括，例如，用于穿过粘膜给药的胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，可以用去垢剂促进渗透。穿过粘膜的给药可以是通过鼻喷雾或使用栓剂。对于局部给药，本发明的寡聚体制成本领域公知的软膏剂，油膏剂，凝胶，或霜剂。洗液可以局部使用以治疗伤口或炎症，加速愈合。

如果需要的话，所述组合物可以置于包装或分配器装置中，其包括含有所述活性成分的一种或多种单位剂量形式。所述包装例如可以包括金属或塑料箔，例如薄膜包装。所述包装或分配器装置可以配有使用说明书。

鉴别治疗剂的检测

基于对引起或导致发生骨质疏松的突变的鉴别，本发明进一步描述了用于鉴别治疗剂的基于细胞的或不含细胞的检测。在一个实施方案中，在其细胞膜的外表面表达IL-1受体，或由与IL-1基因连锁不平衡的基因编码的蛋白质的受体的细胞在单独存在检测化合物的情况下，或在存在检测化合物和另一个蛋白质的情况下进行培育，用例如微生理计(McConnell et al.(1992)Science257：1906)检测所述检测化合物和所述受体之间，或所述蛋白质(优选是标记的蛋白质)和所述受体之间的相互作用。用微生理计检测所述受体和所述检测化合物之间或和所述蛋白质之间的相互作用，测定介质酸化的改变。该检测系统因此提供了鉴别例如能通过干扰蛋白-受体相互作用而发挥作用的分子拮抗剂，以及例如能通过激活受体而发挥作用的分子激动剂的方法。

细胞检测或不含细胞的检测也可用于鉴别能调节IL-1基因或与之连锁不平衡的基因的表达，能调节mRNA的翻译，或能调节mRNA或蛋白质的稳定性的化合物。相应地，在一个实施方案中，能产生IL-1，或其它蛋白质的细胞与检测化合物一起培育，测定细胞培养基中产生的蛋白质的量，并与没有与所述检测化合物接触的细胞产生的量进行比较。所述化合物相对于所述蛋白质的特异性可以通过不同的控制分析确定，例如，检测一个或多个对照基因的表达。特别地，该检测可用于确定反义，核糖酶和三链化合物的效力。

不含细胞的检测还可以用于鉴别能与蛋白质相互作用从而改变所述蛋白质的活性的化合物。这种化合物能，例如改变蛋白质的结构从而影响其与受体结合的能力。在优选的实施方案中，用于鉴别这种化合物的不含细胞的检测基本由含有蛋白质和检测化合物或者一组检测化合物并且含有或不含有结合配体的反应混合物组成。检测化合物可以是，例如结合配体的衍生物，例如生物无活性的靶肽，或小分子。

相应地，本发明的一个示例性筛选检测方法包括使蛋白质或其功能性片段与检测化合物或一组检测化合物接触以及检测复合物的形成的步骤。为检测的目的，所述分子可以用特异的标记进行标记，所述检测化合物可以用不同的标记进行标记。然后可以通过在培育步骤和洗涤步骤之后测定两个标记的水平，检测化合物和蛋白质或其片段的相互作用。洗涤步骤之后存在两个标记表示存在相互作用。

分子间的相互作用还可以用实时BIA(BiomolecularInteraction Analysis，Pharmacia Biosensor AB)鉴别，其可以检测表面胞质团共振(surface plasmon resonance，SPR)，一种光学现象。这种检测依赖于生物特异性界面上物质浓度的变化，不需要对相互作用物进行标记。在一个实施方案中，可将多个检测化合物固定在传感器表面上，例如，形成形成微流量槽的一个壁。然后使含有所述蛋白质或其功能性片段的溶液连续流过传感器表面。信号记录上显示的共振角度的变化表明发生了相互作用。这种技术在例如Pharmacia的BIAtechnology Handbook中有进一步描述。

本发明的另一个示例性筛选检测方法包括下述步骤：(a)形成包括下述物质的反应混合物：(i)IL-1或其它蛋白质，(ii)合适的受体，和(iii)检测化合物；(b)检测所述蛋白质和受体之间的相互作用。相对于不存在所述检测化合物的条件下的相互作用，在存在所述检测化合物的条件下所述蛋白质和受体之间相互作用的统计学显著的变化(增强或抑制)，表明其可能是拮抗剂(抑制剂)。该检测中的各个化合物可以同时进行接触。或者蛋白质可以首先和检测化合物接触适当的时间，然后将受体加入到反应混合物中。所述化合物的效力可以通过用不同浓度的检测化合物获得的数据生成的剂量反应曲线评价。而且，还可以进行控制检测以提供对照基线。

蛋白质和受体之间复合物的形成可通过多种方法检测。复合物的形成的调节可通过，例如，可检测地标记的蛋白质例如放射性标记的，荧光标记的，或酶标记的蛋白质或受体，通过免疫检测，或通过色谱检测进行定量分析。

典型地，可将所述蛋白质或所述受体固定化以便于从一个或全部蛋白质的未复合形式中分离出复合物，并且可使检测自动化。蛋白质和受体的结合可以在任何适于容纳反应物的容器中实现。实例包括微量滴定板，试管，和微型离心管。在一个实施方案中，可以提供其中加入域的融合蛋白以使所述蛋白结合于基质上。例如，谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可以被吸收到谷胱苷肽sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后与受体，例如35S-标记的受体，和检测化合物混合，在有助于复合物形成的条件，例如在盐浓度和pH的生理条件下培育混合物，虽然希望使用更严谨的条件。培育后洗涤珠子以除去未结合的标记，直接测定固定化的和放射性标记的基质(例如置于闪烁体中的珠子)，或者在复合物随后解离后测定上清。或者，可使所述复合物从基质上解离，用SDS-PAGE分离，用标准电泳方法例如附加的权利要求中所述的方法从凝胶上对珠子级分中的蛋白质或受体水平进行定量测定。其它在基质上固定蛋白质的技术也可用于目的物的检测。例如，蛋白质或受体可以利用生物素和抗生物素蛋白链菌素的结合进行固定。还可以用转基因动物鉴别激动剂和拮抗剂或者确定候选治疗剂的安全性和效力。本发明的转基因动物可以包括含有在合适的内源启动子的控制下或者在异源启动子控制下的再狭窄成因突变的非人动物。

所述转基因动物还可以是含有转基因，例如在合适的启动子控制下的报告基因或其片段的动物。这些动物可用于，例如，鉴别能调节IL-1蛋白的产生的药物，例如通过调节基因表达。获得转基因非人动物的方法是本领域公知的。在优选的实施方案中，成因突变的表达限于细胞，组织或发育阶段的特定子集，使用，例如顺式作用序列以希望的模式控制表达。在本发明中，这种蛋白质的嵌合表达对于多种形式的线性分析都是必需的，可另外提供用于评价例如能完全改变其它正常胚胎中的小块组织的发育的表达水平的效果的方法。所以，组织特异性调节序列和条件性调节序列可用于控制特定空间模式中的突变的表达。而且，可以通过，例如，条件性重组系统或原核转录调节序列提供表达的时间模式。使得可以通过体内的位点特异性基因操作调节突变表达的遗传方法是所属领域技术人员公知的。

本发明的转基因动物均在其多个细胞中包括本发明的成因突变转基因，所述转基因改变“宿主细胞”的表型。在示例性的实施方案中，可以用细菌噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统(Laksoet al.(1992)PNAS 89：6232-6236；Orban et al.(1992)PNAS89：6861-6865)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重组酶系统(O′Gorman et al.(1991)Science 251：1351-1355；PCT公开专利WO 92/15694)产生体内位点特异性基因重组系统。Cre重组酶催化位于loxP序列之间的插入靶序列发生位点特异性重组。loxP序列是与Cre重组酶结合的并且是Cre重组酶介导的基因重组所必需的34个碱基对的核苷酸重复序列。loxP序列的方向决定了在存在Cre重组酶的时候介入靶序列是否能被切割或被倒转(Abremski et al.(1984)J.Biol.Chem.259：1509-1514)；当loxP序列是正向重复的时候催化靶序列的切割，当loxP序列是反向重复的时候催化靶序列的倒转。

相应地，靶序列的基因重组依赖于Cre重组酶的表达。重组酶的表达可以由受到调节控制的，例如组织特异性的，发育阶段特异性的，由外加试剂诱导或抑制的启动子元件调控。这种调节控制会导致只在由启动子元件介导重组酶表达的细胞中发生靶序列的基因重组。因此，成因突变转基因的表达的活化可以通过控制重组酶表达来调节。

使用cre/loxP重组酶系统调节成因突变转基因的表达要求构建含有编码Cre重组酶和目的物蛋白的转基因的转基因动物。含有Cre重组酶和再狭窄成因突变转基因的动物可以通过构建“双”转基因动物获得。获得这种动物的一种便利方法是使各自含有一种转基因的两个转基因动物杂交。

类似的条件性转基因可以通过原核启动子序列获得，其要求原核蛋白同时表达以便于表达转基因。示例性的启动子和相应的转移活化原核蛋白在美国专利No.4,833,080中给出。

而且，条件性转基因的表达可以由类似基因治疗的方法诱导，其中编码转移活化蛋白，例如重组酶或原核蛋白的基因被递送到组织中并例如以细胞类型特异性的方式表达。用这个方法，所述转基因可以到成年期都保持沉默，直到通过引入转移激活物“开启”。

在示例性的实施方案中，通过向非人动物的生殖细胞系中引入转基因产生本发明的“转基因非人动物”。不同发育阶段的胚胎靶细胞都可以用于引入转基因。不同方法的使用取决于胚胎靶细胞的发育阶段。用于实施本发明的任何动物的特异性细胞系要选择具有良好健康状态，良好胚胎产生能力，在胚胎中有良好原核可见性，以及具有良好繁殖适合度的。此外，单倍体型也是重要因素。例如，当要产生转基因小鼠的时候，通常使用例如C57BL/6或FVB品系的株(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。优选株是具有H-2b，H-2d或H-2q单倍体型的，例如C57BL/6或DBA/1。用于实施本发明的品系可以本身就是转基因的，和/或可以是敲除的(即从其中一个或多个基因部分或全部被抑制的动物获得的)。

在一个实施方案中，将所述转基因构建体引入到单一发育阶段的胚胎中。接合子是显微注射的最好的靶。在小鼠中，雄性原核达到直径大约为20微米的大小，使得可以进行1-2pl的DNA溶液的繁殖注射。使用接合子作为基因转移的靶有一个主要的优点，就是在大部分情况下，注射的DNA会在首次切割之前掺入到宿主基因中(Brinster et al.(1985)PNAS 82：4438-4442)。结果是转基因动物的所有细胞都携带掺入的转基因。这通常也反映在转基因向原发者的后代的有效传递中，这是由于50％的干细胞都含有所述转基因。

通常，受精的胚胎在适当的介质中培育直至出现原核。在这个时候，如下所述将含有所述转基因的核苷酸序列引入到雌性或雄性原核中。在一些物种例如小鼠中，优选用雄性原核。最优选在被卵细胞核或接合子的雌性原核加工之前将外源基因物质加入到接合子的雄性互补DNA中。认为卵细胞核或雌性原核释放能影响雄性互补DNA的分子，可能是通过用组蛋白替换雄性DNA的精蛋白，从而有利于雌性和雄性互补DNA结合形成二倍体接合子。因此，优选在受到雌性原核影响之前将外源基因物质加入到雄性互补DNA或任何其它互补DNA中。例如，在雄性原核形成之后，这时雄性和雌性原核被分离并且它们都位于细胞膜附近，尽快将外源基因物质加入到早期雄性原核中。或者，在外源基因物质受诱导发生解聚之后加入到精子的核中。可以将含有外源基因物质的精子加入到卵细胞中，或者可以将解聚的精子加入到卵细胞中，然后尽快加入转基因构建体。

可以通过任何本领域已知的方法将转基因核苷酸序列引入到胚胎中，例如，显微注射，电穿孔，脂质体转染。在向所述胚胎中引入转基因核苷酸序列之后，可以在体外将所述胚胎以不同的时间培育，或者再植入代宿主中，或者这两个步骤都进行。体外培育至成熟也在本发明的范围之内。一个通用方法是体外培育胚胎大约1-7天，取决于具体的种，然后将它门再植入代宿主中。

为本发明的目的，接合子必须是形成能发育成完整组织的二倍体细胞。通常，所述接合子由含有通过来自配子的两个单倍体核的天然或人工融合形成的核的卵组成。因此，所述配子核必须是天然相容的，即能生成能分化和发育成功能性组织的存活的接合子。通常，优选整倍体接合子。如果获得了非整倍体接合子，那么相对于产生配体的组织的整倍体数目来说，染色体数目的变化不会超过一。

除了类似的生物学考虑，物理影响也决定了加入到接合子的核中的或是形成接合子核的一部分的基因物质中的外源基因物质的量(例如体积)。如果没有除去基因物质，那么能加入的外源基因物质的量受到能被吸收并且不致引起物理上的破坏的量的限制。通常，插入的外源基因物质不超过大约10pl。加入产生的物理效果必须不致对接合子的成活力造成物理上的破坏。DNA序列的数目和种类的生物学限制取决于特定的接合子和外源基因物质的功能，对于本领域技术人员来说是显而易见的，这是因为得到的接合子的基因物质，包括外源基因物质，必须在生物学上能起始和维持接合子分化和发育成有功能的生物体。

加入到接合子中的转基因构建体的拷贝的数目取决于所加入的外源基因物质的总量，是能使得发生基因转化的量。理论上只需要一个拷贝；但是，通常使用多个拷贝，例如，1,000-20,000个拷贝的转基因构建体，以确保有一个拷贝是起作用的。对于本发明，通常有一个优点，就是插入的外源DNA序列每个都有多于一个起作用的拷贝，以增加外源DNA序列的表型表达。

可以使用任何能将所述外源基因物质加入到核基因物质中的技术，只要它不会破坏细胞，核膜或其它存在的细胞或基因结构。所述外源基因物质优选通过显微注射插入到核基因物质中。细胞的显微注射和细胞结构都是本领域公知公用的。

可以用标准方法实现重新植入。通常，麻醉代宿主并将胚胎插入到输卵管中。植入到特定宿主中的胚胎的数目随种的不同而不同，但是通常与该种天然产生的后代的数目相当。

可以用任何适当的方法筛选代宿主的转基因后代以检测转基因是否存在和/或表达。通常可用Southern blot或Northern blot分析，用与所述转基因的至少一部分互补的探针进行筛选。可以用由所述转基因编码的蛋白质的抗体进行Western blot分析，作为筛选是否存在转基因产物的替代方法或附加方法。典型地，用尾部组织制备DNA，用Southern分析或PCR分析所述转基因。或者，用Southern分析或PCR对被认为是能以最高水平表达所述转基因的组织或细胞进行检测，以确定所述转基因是否存在和表达，虽然可以使用任何组织或细胞类型进行该分析。

评价是否存在所述转基因的替代的或附加的方法包括，但不限于，合适的生物化学检测，例如酶和/或免疫检测，特定标记或酶活性的组织染色，流式细胞分析等。还可以对血液进行分析以检测在血液中是否存在所述转基因，并评价所述转基因对于不同类型的血细胞和其它血液成分的水平的效果。

可以通过将所述转基因动物和适当的配种动物进行交配，或者通过对从所述转基因动物获得的卵细胞和/或精子进行体外受精，获得所述转基因动物的后代。当与配种动物进行交配的时候，所述配种动物可以是或者可以不是转基因的和/或敲除的；如果是转基因的，它可以含有相同或不同的转基因，或者可以含有二者。或者，所述配体动物可以是母本品系。如果使用体外受精，可以将受精胚胎植入到代宿主中或在体外培育，或二者都进行。使用任何一种方法，都可以用上述的方法，或者其它适当的方法评价在后代中是否存在所述转基因。

根据本发明产生的转基因动物包括外源基因物质。进一步，在这样的实施方案中所述序列与优选使得所述转基因产物在特定类型的细胞中表达的转录控制元件，例如启动子相接。还可以使用逆转录病毒感染将所述转基因引入非人动物中。发育的非人胚胎可以在体外培养至胚泡阶段。在这期间，卵裂球可以作为逆转录病毒的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS 73：1260-1264)。用酶处理除去透明带以获得对卵裂球的有效感染(Manipulating theMouse Embryo，Hogan eds.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于引入所述转基因的病毒载体系统典型地是携带所述转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 82：6927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 82：6148-6152)。通过在单层的产病毒细胞上培养所述卵裂球可容易地和有效地实现转染(Van der Putten，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6：383-388)。或者，可以在更晚的阶段实现感染。可将病毒或产病毒细胞注射到囊胚腔中(Jahner et al.(1982)Nature298：623-628)。大部分初始者对于所述转基因都是嵌合的，因为仅在细胞的子集中发生掺入产生转基因非人动物。而且，初始者可以含有所述转基因在基因组的不同位置的不同逆转录病毒插入，这通常会使后代彼此分开。此外，还可以通过对妊娠中期的胚胎进行子宫内逆转录病毒感染向干细胞系中引入转基因(Jahner et al.(1982)supra)。

用于引入转基因的第三类靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可以从体外培养的植入前胚胎获得并与胚胎融合(Evans et al.(1981)Nature 292：154-156；Bradley et al.(1984)Nature 309：255-258；Gossler et al.(1986)PNAS 83：9065-9069；和Robertson et al.(1986)Nature 322：445-448)。转基因可通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导有效被引入ES细胞中。然后这种转化的ES细胞可以和非人动物的胚泡混合。然后所述ES细胞在所述胚胎中克隆形成最终的嵌合动物的干细胞系。综述参见Jaenisch，R.(1988)Science240：1468-1474。

本发明进一步通过下述实施例进行举例说明，其不应当被理解成是任何形式的限制。本发明的实施应当使用，除非另外指出，本领域技术范围内的传统技术。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，(2nd ed.，Sambrook，Fritsch  and  Maniatis，eds.，Cold  Spring HarborLaboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；美国专利No.4,683,195；美国专利No.4,683,202；和Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.，1984)。

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实施例

             实施例1骨质疏松相关性研究

UCSF相关性研究

将参与San Francisco Association 的the University ofCalifornia的the Study of Osteoporotic Fractures的1,071名患者群体用本领域公知的技术根据IL-1基因簇中的遗传标记进行基因分型。

基因分型的结果如表1A所示。表1B显示了夏威夷人的骨质疏松研究，如下所述。

表1 IL-1基因簇基因型标记的频率计数

A.骨质疏松骨折的UCSF研究(n＝1,071名高加索女性)

基因型	IL-1A(4845)	IL-1B(3954)	IL-1B(-511)	IL-1RN(2018)
					1.11.22.2缺少	516(48.2％)450(42％)104(9.7％)1	633(59.1％)377(35.2％)60(5.6％)1	442(41.3％)496(46.3％)132(12.3％)1	551(51.4％)434(40.5％)85(7.9％)1

B.夏威夷人骨质疏松研究(n＝208名日裔美国女性)

基因型	IL-1A(4845)	IL-1B(3954)	IL-1B(-511)	IL-1RN(2018)
					1.11.22.2缺少	169(82％)35(17％)2(1％)2	186(89.4％)22(10.6％)-(0％)-	60(29％)103(49.8％)44(21.3％)1	190(91.3％)18(8.7％)-(0％)-

在626个患者的随机样本对照人群中，有185个是非脊骨骨折。这些患者用于进行“非脊骨骨折”的分析。

表2.UCSF SOF研究中病例组，对照组和人群样本的基因型频率

		髋部骨折		脊椎骨折		腕部骨折		人群*n＝626)
									病例n＝216)	对照n＝575)	病例n＝183)	对照n＝588)	病例n＝216)	对照n＝512)
		IL-1A(+4845)	1.11.22.2	106(49％)96(44％)14(7％)	283(49％)237(41％)55(10％)	88(48％)78(43％)17(9％)	287(49％)240(41％)61(10％)								100(46％)93(43％)23(11％)	254(50％)213(42％)45(66％)	308(49％)257(41％)61(10％)
IL-1B(+3954)	1.11.22.2							133(61％)75(35％)8(4％)	336(58％)199(35％)40(7％)	109(59％)67(37％)7(4％)	340(58％)207(35％)41(7％)	123(57％)82(38％)11(5％)	299(58％)180(35％)33(7％)	365(58％)219(35％)42(7％)
		IL-1B(-511)	1.11.22.2	98(45％)87(40％)31(12％)	230(40％)275(48％)70(15％)	82(45％)77(42％)24(12％)	228(39％)291(49％)67(13％)								92(43％)98(45％)26(12％)	203(40％)246(48％)63(12％)	247(40％)303(48％)76(12％)
IL-1RN(+2018)	1.11.22.2							116(54％)83(38％)17(8％)	294(51％)239(42％)42(7％)	95(52％)73(40％)15(8％)	304(52％)246(42％)38(6％)	110(51％)81(37％)25(12％)	264(52％)215(42％)33(6％)	322(51％)262(42％)42(7％)

^*包括185个非脊骨骨折的患者

如表2所示，IL-1A(+4845)的等位基因2与非脊骨骨折的危险性的升高有关。此外，IL-1B(+3954)的等位基因2与非脊骨骨折的危险性的统计学显著的升高有关。相反，IL-1RN(+2018)的等位基因2与非脊骨骨折的危险性的显著降低有关。IL-1A(+4845)的等位基因2与腕部骨折的升高有关，虽然不是统计学显著的(RR＝1.8，95％CI＝1.0-3.5)。在全部人群中，等位基因2与腕骨骨折的危险性的升高有关。当排除了HRT使用者之后这种效果也消失了。

骨折的危险性的升高表明IL-1A(+4845)和IL-1B(+3954)的等位基因2有基因剂量效果。特别是，等位基因2的拷贝越多，效果越大。骨折的危险性的降低也表明IL-1RN(+2018)具有基因剂量效果。特别地，等位基因的拷贝数越多，效果越大。如表3A所示，这些关联在排除了HRT使用者的人群中都存在。如表3B所示，当考虑全部人群，包括HRT使用者的时候，也存在这种关联，虽然不是很强烈。另一方面，髋部骨折和脊椎骨骨折没有显示出与任何IL-1基因标记有关系。

表3A：IL-1基因型和骨折，排除了HRT使用者

非脊骨骨折，RH(95％CI)
					未调整的	根据年龄/BMI调整的	多因素调整的*
IL-1B(+4845)1.11.22.2IL-1B(+3954)1.11.22.2IL-1RA(+2018)1.11.2	1.0(REF)1.0(REF)1.0(REF)	1.0(REF)1.0(0.7，1.4)1.4(0.8，2.5)1.0(REF)1.1(0.8，2.5)1.8(1.0，3.3)1.0(REF)0.9(0.6，1.3)0.4(0.2，1.0)	1.0(REF)1.0(0.7，1.4)1.6(0.9，2.8)1.0(REF)1.3(0.9，2.8)2.0(1.1，3.8)#1.0(REF)0.8(0.6，1.2)0.4(0.2，0.9)#
				腕骨骨折，RH(95％CI)
	未调整的	根据年龄/BMI调整的	多因素调整的*
				IL-1B(+4845)1.11.2	1.0(REF)	1.0(REF)1.2(0.8，1.7)1.8(0.9，3.4)	1.0(REF)1.1(0.7，1.7)1.8(1.0，3.5)

^*根据年龄，修正的BMI，绝经后的年数，目前的抽烟和喝酒状况，ERT使用状况，噻唑利尿剂的使用状况，自己报告的健康状况和糖尿病调整

#p＜0.05相对于1.1型

表3B：IL-1基因型和骨折，包括HRT使用者(全部人群)

非脊骨骨折，RH(95％CI)
					未调整的	根据年龄/BMI调整的	多因素调整的*
IL-1A(+4845)1.11.22.2IL-1B(+3954)1.11.22.2IL-1RA(+2018)1.11.22.2IL-1B(+4845)1.11.22.21.3(0.7，2.2)IL-1RA(+2018)1.11.22.2	1.0(REF)1.0(REF)1.0(REF)1.0(REF)1.1(0.8，1.5)1.3(0.8，2.2)1.0(REF)0.9(0.6，1.2)1.8(1.04，3.0)#	1.0(REF)1.0(0.7，1.3)1.2(0.8，2.0)1.0(REF)1.2(0.9，1.6)1.4(0.8，2.3)1.0(REF)0.9(0.7，1.2)0.5(0.2，1.0)#1.0(REF)1.1(0.8，1.6)1.3(0.8，2.2)1.0(REF)0.9(0.6，1.2)1.9(1.1，3.2)#	1.0(REF)0.9(0.7，1.3)1.3(0.8，2.1)1.0(REF)1.3(0.9，1.7)1.4(0.8，2.4)1.0(REF)0.9(0.6，1.2)0.5(0.2，1.0)#1.0(REF)1.1(0.8，1.5)1.0(REF)0.9(0.6，1.2)1.9(1.1，3.3)#

^*根据年龄，修正的BMI，绝经后的年数，目前的抽烟和喝酒状况，ERT使用状况，噻唑利尿剂的使用状况，自己报告的健康状况和糖尿病调整

#p＜0.05相对于1.1型

检测跟骨，远端桡骨，总体髋部，股骨颈和脊骨处的骨密度(BMD)。根据年龄，骨矿指数(BMI)，绝经状态和生活方式因素对该分析进行调整。如表4A和4B所示，无论是包括还是排除HRT使用者，IL-1B(+3954)的等位基因2与跟骨处显著较高的BMD有关(趋势的p＜0.05；基因型[2.2]相对于基因型[1.1]的p＜0.05)。

IL-1B(-511)的等位基因2与包含HRT使用者的全部人群中跟骨处较低的BMD显著相关(趋势的p＜0.05；基因型[2.2]相对于基因型[1.1]的p＜0.05)。当排除了HRT使用者的时候，IL-1B(-511)的等位基因2与跟骨处的较低BMD的趋势相关。在其它位置没有发现IL-1基因型和BMD之间有统一的相关模式。

表4A：IL-1基因型和骨密度

(n＝1,070)

平均跟骨BMD(g/cm2)
					未调整的	根据年龄/BMI调整的	多因素调整的*
IL-1B(+3954)1.11.22.2IL-1B(-511)1.11.22.2	39(.005)40(.006)43(.014)+，#41(.006)39(.005)#39(.011)+，#	39(.004).40(.005).42(.012)+，#41(.005)40(.005).39(.009)+	40(.004)40(.005)42(.012)+，#41(.005)39(.005)#39(.009)+，#

表4B：IL-1基因型和骨密度，排除了HRT使用者

平均跟骨BMD(g/cm2)
					未调整的	根据年龄/BMI调整的	多因素调整的*
IL-1B(+3954)1.11.22.2IL-1B(-511)1.11.22.2		39(005)40(.007)43(.016)+40(.006)40(.006)38(.011)	39(.005)39(.007)43(.016)40(.006)40(.006)38(.011)

^*根据年龄，修正的BMI，绝经后的年数，目前的抽烟和喝酒状况，ERT使用状况，噻唑利尿剂的使用状况，自己报告的健康状况和糖尿病调整

+p(趋势)＜0.05

#p＜0.05相对于1.1型

在总体髋部，股骨颈和跟骨处检测骨损失的速度。如表4A和4B所示，对于全部人群和排除了HRT使用者的人群，IL-1B(-511)的等位基因2与总体髋部骨损失的较高速度有关(趋势的p＜0.05)。IL-1B(-511)的基因型[2.2]与跟骨骨损失趋向于较高速度的趋势有关。对于股骨颈的骨损失速度也观察到类似的，但不是显著的相关性。在该分析中无论是包括(表4A)还是排除了(表4B)HRT使用者，这些结果都是类似的。

夏威夷人骨质疏松研究

在夏威夷骨质疏松研究(Hawaii Osteoporosis Study)中，根据IL-1基因簇中的基因型标记对100个具有骨折的参与者和100个没有骨折的参与者进行基因分型。结果如表1B所示。本研究中的参与者都是八十年代早期到中期的日裔美国女性。分析下面的临床数据：脊骨和非脊骨骨折，包括和排除卵巢切除，远端和近端桡骨，以及跟骨的骨矿量(BMC)，包括和排除卵巢切除的患者。所述分析根据年龄，BMI和使用雌激素的持续时间进行调整。

结果

IL-1A(+4845)的等位基因2与脊骨和非脊骨骨折的数量的增加强烈相关(p＜0.018)，不管是否包括切除或未切除卵巢的患者。

IL-1B(-511)的等位基因2与远端桡骨的BMC的降低有关(p＜0.024)。IL-1RN(+2018)的等位基因2与跟骨的BMC的降低有关(p＜0.022)。

结果讨论

种族的作用 IL-1基因簇中的基因型的分布在高加索祖先的美国人和日裔美国人中非常不同，在此特异性研究中他们中许多都是第一代移民。显然，其它种族群组中也发现有不同的分布模式，尤其是：

中国人(IL-1RN(+2018)和IL-1B(+3954)的等位基因2有非常低的频率)

非裔美国人(模式与日裔人群类似)；以及

西班牙裔的美国人(与欧洲的高加索人的分布模式类似。对于欧洲祖先的西班牙人也是这样的。但是，在墨西哥裔的西班牙人和欧洲祖先的西班牙人中该模式不是非常的不同)。

因此，IL-1RN(+2018)的基因型可能不能准确反映出生物模式和反应。IL-1B(-511)对于该特异的单倍体型和基因型模式可能可以给出更准确的指示。类似地，IL-1B(+3954)可能不是该单倍体型模式的准确标记。IL-1A(+4954)对于该特异的单倍体型和基因型模式可能可以给出更准确的指示。

置折危险 IL-1A(+4845)的等位基因2和IL-1B(+3954)的等位基因2和骨折危险有关。这表明和单倍体型模式1有关(参见图3)。跟骨BMD与IL-1B(+3954)的等位基因2有关(单倍体型模式1)。

单倍体模式1导致增加的IL-1a和IL-1b水平和生物活性，但是只导致正常的IL-1受体拮抗物水平。

骨损失速度 骨损失的速度和IL-1B(-511)的等位基因2(单倍体型模式2)有关，单倍体型模式2导致正常的IL-1水平，但是只导致降低的IL-1受体拮抗物水平。净结果是IL-1生物活性和反应增加。

骨密度 在跟骨，和远端桡骨处，BMD(或BMC)与IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的等位基因2(单倍体型模式2)有关。

跟骨处BMD的增加与单倍体型模式2有关。在本研究中，在其它部位BMD与IL-1标记没有显著的相关性，这可能是由于所研究的人群的特异性造成的，导致在统计学分析中没有结果。在the University of California，San Francisco的研究人群中可能起作用的其它因素包括：更佳的健康，更好的教育，对研究的参与以及更高的社会经济地位。

骨重建的过程受到多种因素的调节，包括：骨代谢，骨损失速度，峰值骨量，生活方式因素，遗传学，处方药物的使用和体重。骨质疏松性骨折位于骨重建，骨损失，和老化的复杂过程的终点。骨重建和因此而发生骨质疏松和骨质疏松性骨折的可能性受到生命循环的不同阶段的不同生物过程的调节。在绝经后的最初5-10年，由于雌激素水平的降低和IL-1水平和活性的增加发生快速骨损失。在这个阶段破骨细胞的形成和活性的增加(由于IL-1水平的增加)使得开始骨重建过程。在绝经后最初的5-10年IL-1水平的增加可能比IL-1受体拮抗物更重要。绝经后大约10年，由于骨重建生物学发生变化，骨损失的速度下降。在这个阶段减少的破骨细胞的形成构成的驱动力落后于骨重建。在绝经后的较晚的时期，在骨损失的量的调节中，减少的IL-1受体拮抗物的水平可能是更重要的因素。

单倍体型模式1与IL-1a和IL-1b水平和生物活性的增加相关，但是只与正常的IL-1受体拮抗物水平相关。具有单倍体型模式1的女性在她们绝经早期比具有单倍体型模式2的女性可能有更多的骨损失。因此当没有采取预防措施或进行治疗的时候，具有单倍体型模式1的女性在生命的任何阶段都更可能发生骨折。

具有单倍体型模式2的女性在生命的晚期可能会有更多的骨损失，在生命的晚期更有可能发生骨折，特别是与年龄相关的骨质疏松有关的骨折。因此，具有单倍体型模式2的患者，其与具有单倍体型模式1的患者相比产生较少的IL-1ra，在其生命的绝经后阶段的晚期会有更多的骨损失和减少的骨形成。

根据上述假说，Keen et al.(1998)(″Allelic variation intheinterleukin-1 receptor antagonist gene is associated with earlypostmenopausal bone loss at the spine″(Bone 23(4)，367-371)：anassociation between allele[1]of the VNTR in IL-1RN and earlypostmenopausal bone loss)中的数据表明具有VNTR的等位基因[1]的患者实际上携带等位基因模式1。由于本研究中所有的患者都是在绝经开始的5年内，他们的骨损失受到增加的IL-1的水平和活性的调节，而不受增加的或减少的IL-1ra水平的调节。由于只测定了IL-1RN的VNTR，有关IL-1RN的VNTR等位基因1在骨密度的变化中起重要作用，并且是骨损失和骨质疏松性骨折发生危险的主要预测者的结论可能是错误的。

        实施例2：脊椎骨折作为骨质疏松的指示

第二项研究使用了参与San Francisco Association的theUniversity of California的the Study of Osteoporotic Fractures的2529名(1,240名是病例，1,289是对照)患者，用本领域公知的技术根据IL-1基因簇中的基因型标记对他们进行基因分型。案例患者选自在基础检查中有X射线照相证明具有一般性脊椎骨折，或在研究过程中有X射线照相证明第一次发生骨折的研究人群。

此外，从研究人群中选出年龄匹配的对照样本。对照患者选择的依据是在研究过程中没有X射线照相证明有脊椎骨折，以及没有任何骨折的记录，包括四肢和肋骨骨折。

用脊椎骨折作为研究骨质疏松的遗传倾向性的终点在上述研究中有特定的优点。髋部和腕部骨折通常需要发生骨质疏松并且还要存在外伤事件，例如身体跌倒。脊椎骨折是骨质疏松的结果，而不需要任何外伤事件，这是由于身体的恒定重量压在脊骨上，当由于骨质疏松导致骨变弱的时候，会导致个体的脊椎骨崩塌。脊椎骨折对于个体来说是不明显的，除非她注意到了身高降低，出现驼背迹象，或者脊椎崩塌碰到神经引起疼痛。为此原因，脊椎骨折的研究必须包括在与个体发现问题无关的定期检查，例如骨质疏松性骨折研究(the Study of Osteoporotic Fractures)中使用的检测方案中对脊骨的X射线照相的精确评估。

选择条件

·年龄65-90

·对于病例组有X射线照相证据表明有脊椎骨折

·对于对照组有X射线照相证据表明没有脊椎骨折并且没有肋骨或四肢骨折的记录。

·收集DNA或全血进行分析

排除条件：

·具有已知新陈代谢性骨疾病的患者

·初始没有骨折但是在检查后3.7年的时间中死亡的患者

在1988-1989年从研究患者收集的全血中获得所述DNA，将5ml的血在3×3英寸的滤纸上进行杂交，干燥并-20℃冷冻储存。

如Kornman et al.(1997)(8)和Cox et al.(1998)(9)所述的进行基因分型。对IL-1A，IL-1B，IL-1RN，VDR，COL1A1，ER，和PTHR基因中的SNP进行基因分型。

数据分析：效力计算

假定900个病例，900个对照，.01的alpha水平，和1.5或2.0的实际优势率(odds ratio)，进行效力的计算。当实际OR是2.0的时候，或者当实际OR是1.5并且对照中的微小等位基因频率是至少5％的时候，可容易地获得统计学的显著性。当对照频率较低的时候，1.5的OR只需要在病例中频率有小量增加(例如，5％的对照频率和7.3％的病例频率)。

除了评价统计学上的显著性之外，本研究的一个重要目的是表征任何基因效果的临床显著性。为此目的，“临床上显著的”意味着危险增加50％，“高度临床上显著的”意味着我们得出这个结论是假定有1％的类型1的错误率。

当实际OR为1.5的时候，有50％都是临床上显著的，除了在低对照等位基因频率的情况下，降低效力以保持所述检测的size。当实际OR是至少2.0的时候，很可能得到高度临床上显著的结果，当微小等位基因频率不小的时候更是如此。实际OR越高效力越大。例如，在OR为2.5的情况下，得到的高度临床上显著的结果在微小等位基因频率≥15％的时候有至少96％的效力，在在微小等位基因频率正好是5％的时候有57％的效力。

用排除了和没有排除具有下述条件的个体的临床数据进行统计学分析：甲状腺激素，噻嗪化物的早先使用，HRT的早先使用，如果可以获得数据的话，合成代谢类固醇，双膦酸酯，SERM或降钙素的早先使用，如果可以获得数据的话，以及同时进行的治疗/预防骨质疏松的治疗。

通过评价基因SNP中的任何一个的等位基因频率在病例组和对照组中是否不同，来检测多态性和骨质疏松之间的关系。为了解释多重检验，每个检测的size设定为.01(Bonferroni校正)。因此，如果99％的置信区间不含有零假设，则标记视为是“统计学显著的”。对于每一个标记，还可以获得优势率(OR)的最大可能性估计并与1.5的预定临床显著值相比较。如果OR的点估计是至少1.5，标记则视为是“临床显著的”，如果OR的较低置信限超过上述限值，则是“高度临床显著的”。在前者的情况下，还需要统计学的显著性。(后者，根据定义，有统计学上的显著性)。

进一步通过检测多态性的组合评价多态性和骨质疏松之间的关系。要分析的一些特定组合包括基因SNP，IL-1A-889，IL-1A+4845，IL-1B-3737，IL-1B-511，IL1B-31，IL-1RN+2018，IL-1RN VNTR，以及其它IL基因和VDR基因，COL1A1基因，ER基因，和PTHR基因处的等位基因。还评价了其它等位基因的组合。这种进一步的评价包括内部标记(基因型分析)和中间标记(组合基因型或单倍体型分析)比较。

按下述共变量进行调整以进一步使分析精确：年龄，抽烟史，BMI，绝经开始的年龄，血清雌激素水平，骨钙素水平，脊椎骨折数据，和BMD的变化。

对基因多态性，已知的和新的多态性的任何组合也应用相同的分析策略。通过在logistic回归模型中增加相互作用条件，评价基因间的协同作用。

结果

为了鉴别可能具有升高的脊椎骨折危险的群组，IL-1⁺定义为由符合下述三个条件之一的个体组成：1)IL-1A(+4845)的基因型2.2，IL-1B(-511)的基因型1.1，IL-1RN(+2018)的1.1基因型，2)IL-1B(-511)的基因型2.2和IL-1RN(+2018)的2.2基因型，或3)IL-1B(-511)的基因型2.2和IL-1RN(+2018)的1.2基因型。研究人群中的百分之十三属于IL-1⁺，那些定义为IL-1⁺的具有较高的脊椎骨折比率(p值＜.05)。在从未使用过雌激素替代疗法的女性中，IL-1⁺的频率在那些没有脊椎骨折的人中是11％，在那些有脊椎骨折的人中是18％(p值＝.0001)。

在颈中评价按年龄和骨密度(BMD)进行的调整。在从未使用过雌激素的人(即非雌激素使用者)中IL-1⁺脊椎骨折的优势率(OR)是1.9(p值＝6×10^-5)。在统计学模型中包含BMD，推定IL-1⁺基因型的效果是脊椎骨折的独立危险因素，这提供的信息多于和超出骨密度提供的信息。

含有IL-1⁺基因型的三个组分中的每一个也可以导致在从未使用过雌激素替代疗法的女性中有统计学显著的脊椎骨折危险。按年龄和BMD进行调整，具有IL-1A(+4845)的基因型2.2，IL-1B(-511)的基因型1.1和IL-1RN(+2018)的1.1基因型的人的OR＝2.2(p-值＝.01)，那些具有IL-1B(-511)的基因型2.2和IL-1RN(+2018)的2.2基因型的人的OR＝2.2(p-值＝.01)，那些具有IL-1B(-511)的基因型2.2和IL-1RN(+2018)的1.2基因型的人的OR＝1.7(p-值＝.01)。

等同方式

由上述对本发明的特定实施方案的详细描述，明显描述了独特的方法。虽然本文中详细公开了特定的实施方案，这只是以实施例的方式进行举例说明，并非要限制后面附加的权利要求的范围。特别地，发明人认为可对本发明进行各种代替，变化，和修饰而不会背离由权利要求定义的本发明的精神和范围。

Claims (21)

1.一种确定在患者中发生，不发生或易于发生骨质疏松的方法，包括

在患者中检测选自下组的骨质疏松相关基因型：

a)IL-1A(+4845)的基因型2.2，IL-1B(-511)的基因型1.1，和IL-1RN(+2018)的基因型1.1；

b)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型2.2；和

c)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型1.2

其中存在所述基因型表明所述患者患有或易于发生骨质疏松，不存在所述基因型表明患者没有或不易于发生骨质疏松。

2.一种确定在患者中发生，不发生或易于发生骨质疏松的方法，包括在患者中检测选自下组的一个或多个等位基因：

IL-1A(+4845)等位基因，IL-1B(-511)，和IL-1RN(+2018)等位基因，其中存在所述等位基因表明所述患者患有或易于发生骨质疏松，不存在所述等位基因表明患者没有或不易于发生骨质疏松。

3.权利要求2的方法，其中检测IL-1A(+4845)等位基因，和IL-1B(-511)。

4.权利要求2的方法，其中检测IL-1B(-511)和IL-1RN(+2018)。

5.权利要求2的方法，其中检测IL-1A(+4845)等位基因，和IL-1RN(+2018)。

6.权利要求2的方法，其中所述患者对所述等位基因是纯合的。

7.权利要求2的方法，其中所述患者对所述等位基因是杂合的。

8.权利要求2的方法，其中所述患者是女性。

9.权利要求2的方法，其中所述患者年龄在大约60岁以上。

10.权利要求2的方法，其中所述患者年龄在大约65岁到大约90岁之间。

11.权利要求2的方法，其中所述骨质疏松包括脊椎骨折。

12.权利要求2的方法，其中所述患者没有使用激素替代疗法。

13.权利要求2的方法，其中所述检测步骤选自下组：

a)等位基因特异的寡核苷酸杂交；

b)长度分析；

c)测序；

d)杂交；

e)5’核酸酶消化；

f)单链构象多态性；

g)等位基因特异性杂交；

h)引物特异性延伸；和

i)寡核苷酸连接检测。

14.权利要求2的方法，其中在检测之前或在检测的时候，对所述核酸样品进行扩增的步骤。

15.一种用于确定存在或易于发生骨质疏松的试剂盒，所述试剂盒含有与选自IL-1A(+4845)，IL-1B(-511)，和IL-1RN(+2018)的等位基因的5’或3’杂交的第一引物寡核苷酸。

16.权利要求15的试剂盒，进一步包括分别与所述等位基因的3’或5’杂交，从而使得所述等位基因被扩增的第二引物寡核苷酸。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述第一引物和所述第二引物与大约50个到大约100个碱基对的区域杂交。

18.权利要求15的试剂盒，进一步包括检测手段。

19.权利要求15的试剂盒，进一步包括扩增手段。

20.权利要求15的试剂盒，进一步包括对照。

21.一种在患者中减轻骨质疏松症状或防止其发生的方法，包括：

a)在所述患者中检测骨质疏松相关基因型的存在，其中所述基因型选自下组：

i)IL-1A(+4845)的基因型2.2，IL-1B(-511)的基因型1.1，IL-1RN(+2018)的基因型1.1；

ii)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型2.2；和

iii)IL-1B(-511)的基因型2.2，和IL-1RN(+2018)的基因型1.2；以及

b)对所述患者进行能补偿所述骨质疏松的治疗。

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