ES2261239T3 - Diagnostico y terapia para la osteoporosis. - Google Patents
Diagnostico y terapia para la osteoporosis.Info
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Abstract
Procedimiento para determinar si un sujeto hembra ha desarrollado o se encuentra predispuesta a desarrollar osteoporosis, que comprende identificar los alelos IL-1A (+4845) y/o IL-1RN (+2018) de la hembra, en el que la presencia del alelo 2 de IL-1A (+4845) y/o el alelo 1 de IL-1RN (+2018) indica que el sujeto hembra ha desarrollado o se encuentra predispuesta a desarrollar osteoporosis.
Description
Diagnóstico y terapia para la osteoporosis.
En 1993, Bernadine Healy, MD, en aquel momento
directora del National Institutes of Health, calificó a la
osteoporosis como "una de las enfermedades principales que afectan
a mujeres". Las complicaciones secundarias a fracturas
osteoporóticas son la cuarta causa más importante de muerte en
mujeres de más de 65 años, por detrás de las enfermedades cardíacas,
el cáncer y el ictus. Se trata de la causa principal de discapacidad
en los Estados Unidos y de la causa más frecuente de fractura de
cadera.
Veinticinco millones de estadounidenses padecen
osteoporosis, de los que el 85% son mujeres. La osteoporosis de tipo
1, que es la osteoporosis postmenopáusica originada por la pérdida
de los estrógenos, afecta a más de la mitad de todas las mujeres de
más de 65 años y se ha detectado hasta en el 90 por ciento de las
mujeres de más de 75 años de edad. La osteoporosis de tipos II o
senil, estrictamente relacionada con la edad, afecta tanto a hombres
como a mujeres, habitualmente de más de setenta años de edad. La de
tipo III, una nueva clase que afecta a ambos sexos, está inducida
por fármacos, por ejemplo por la terapia de largo plazo con
esteroides, que es conocido que acelera la pérdida ósea. Entre los
grupos de pacientes que reciben terapia de largo plazo con
esteroides se incluyen los asmáticos (7 millones de personas de más
de 18 años de edad en los Estados Unidos), así como los pacientes
con artritis reumatoide u otras enfermedades autoinmunológicas. La
de tipo IV está causada por una enfermedad subyacente, tal como la
artritis reumatoide (prevalencia en la población de entre 1% y
2%).
La osteoporosis es responsable de la mayoría de
los 1,5 millones de fracturas óseas que se producen cada año, y que
conducen a discapacidades que suponen un coste de 10.000 millones de
dólares en costes médicos, sociales y de hospitalización. Incluso en
las mejores manos, el 40% de los pacientes de 65 años o más no
sobrevivirán a una fractura de cadera más allá de dos años.
En 1991, una de cada tres mujeres
estadounidenses tenía 50 años o más de edad. La generación del
"baby boom" habrá empezado a añadirse a este grupo de edad a
partir de 1996. Debido a que la mujer, de media, vive unos treinta
años pasada la menopausia, siguiendo la tendencia actual, la
osteoporosis podría llegar a ser una de las mayores amenazas
sanitarias de los tiempos modernos.
El estilo de vida puede ser un factor en la
aparición de la osteoporosis y en particular puede ser un factor
importante para la construcción y mantenimiento de una masa ósea
sana, previniendo la osteoporosis. En la actualidad, las personas de
menos de 65 años presentan una probabilidad mayor que la de sus
padres de haber mantenido un estilo de vida sedentario, malos
hábitos de alimentación, una mayor ingesta de alcohol y de cafeína,
y un historial de más medicación asociada a la pérdida ósea. También
resulta evidente que existe una predisposición genética a
desarrollar la osteoporosis (ver la patente WO 94/03633 para un
comentario de los factores genéticos en la osteoporosis).
Por lo tanto, resultaría útil poder identificar
precozmente aquellos individuos con mayor riesgo de desarrollar
osteoporosis, lo que permitiría emitir recomendaciones
individualizadas a fin de procurar estilos de vida apropiados o que
permitan instituir otras intervenciones terapéuticas. Por ejemplo,
se ha demostrado que los suplementos de calcio y el ejercicio
resultan valiosos factores preventivos si se utilizan a lo largo de
una ventana temprana crítica de edades. La terapia de sustitución de
hormonas (HRT) también se ha utilizado con éxito para combatir la
osteoporosis de aparición posterior a la menopausia. La HRT puede
resultar más beneficiosa si se aplica precozmente durante la
evolución de la enfermedad, antes de la pérdida ósea más importante.
Debido a que la HRT comporta efectos secundarios potencialmente
graves, resultaría útil para las mujeres conocer su nivel individual
de riesgo de osteoporosis en la toma de decisiones sobre la
utilización de HRT frente a otras intervenciones destinadas a
reducir el riesgo de desarrollar osteoporosis.
Las siguientes solicitudes de patente publicadas
describen una diversidad de procedimientos para diagnosticar, seguir
y/o tratar la osteoporosis: WO 94/20615, WO 95/01995, WO 94/14844,
EP 93113604, WO 88/09457, WO 93/11149 y WO 94/03633. Las referencias
siguientes describen la asociación de diversos polimorfismos génicos
de IL-1 a la osteoporosis: la patente U.S. No.
5.698.399; Eastell, R. et al., Bone 23(5S):S375;
Eastell, R. et al. y Keen, R.W. et al., (1998) Bone
23:367-371, 1998. La patente WO 98/54359 da a
conocer un procedimiento para determinar la susceptibilidad de un
paciente a un trastorno inflamatorio que implica detectar la
presencia de una IL-1 (44112332) o haplotipo de
IL-1 (33221461) en una muestra obtenida del
paciente. La patente WO 98/44150 da a conocer un procedimiento para
diagnosticar una predisposición a determinados estados de enfermedad
mediante el cribado para la presencia de un gen de
IL-1RN de tipo salvaje o un gen variante que
contiene 4 repeticiones de una secuencia de 86 pb en el intrón
2.
El grupo génico de IL-1 se
encuentra en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene por lo
menos los genes para IL-1\alpha
(IL-1A), IL-1\beta
(IL-1B) y el antagonista del receptor de
IL-1 (IL-1RN), dentro de una región
de 430 kb (Nicklin et al., Genomics 19:382-4,
1994). Las moléculas agonistas IL-1\alpha e
IL-1\beta presentan una potente actividad
antiinflamatoria y se encuentran al principio de muchas cascadas
inflamatorias. Sus acciones, con frecuencia a través de la inducción
de otras citoquinas, tales como IL-6 y
IL-8, conducen a la activación y reclutamiento de
leucocitos en el tejido dañado, a la producción local de agentes
vasoactivos, a la respuesta febril en el cerebro y a la respuesta de
fase aguda hepática. La totalidad de las tres moléculas de
IL-1 se unen a los receptores de tipo I y de tipo II
de IL-1, pero únicamente el receptor de tipo I
transduce una señal al interior de la célula. Por el contrario, el
receptor de tipo II se desprende de la membrana celular y actúa como
receptor de señuelo. El antagonista de receptor y el receptor de
tipo II, por lo tanto, presentan ambos acciones
antiinflamatorias.
La producción inapropiada de
IL-1 desempeña un papel central en la patología de
muchas enfermedades autoinmunológicas e inflamatorias, incluyendo la
artritis reumatoide, el trastorno intestinal inflamatorio, la
psoriasis y similar. Además, existen diferencias interindividuales
en las tasas de producción de IL-1, y parte de esta
variación puede explicarse por diferencias genéticas en loci génicos
de IL-1. De esta manera, los genes de
IL-1 son candidatos razonables para determinar parte
de la susceptibilidad genética a las enfermedades inflamatorias, la
mayoría de las cuales presenta una etiología multifactorial con un
componente poligénico.
Determinados alelos del grupo génico de
IL-1 es conocido que se encuentran asociados a
estados de enfermedad particulares. Por ejemplo, el alelo 2 de
IL-1RN (VNTR) (patente U.S. No. 5.698.399) y el
alelo 1 de IL-1RN (VNTR) (Keen, R.W. et al.,
Bone 23:367-371, 1998) se ha informado de que se
encuentran asociados a la osteoporosis. Además, se ha informado de
que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) se encuentra
asociado a nefropatía en la diabetes mellitus (Blakemore et
al., Hum. Genet. 97(3):369-74, 1996),
alopecia areata (Cork et al., J. Invest. Dermatol.
104(5 Supp.):15S-16S, 1995; Cork et
al., Dermatol. Clin. 14:671-8, 1996), enfermedad
de Graves (Blakemore et al., Arthritis Rheum.
37:1380-85, 1994), liquen escleroso (Clay et
al., Hum. Genet. 94:407-10, 1994) y colitis
ulcerosa (Mansfield et al., Gastroenterol.
106(3):637-42, 1994).
Además, el alelo 2 de IL-1A
desde el marcador -889 y el alelo 2 de IL-1B (TaqI)
desde el marcador +3954 se ha descubierto que se encuentran
asociados a la enfermedad periodontal (patente U.S. No. 5.686.246;
Kornman y diGiovene, Ann. Periodont. 3:327-38, 1998;
Hart y Kornman, Periodontol. 2000 14:202-15, 1997;
Newman, Compend. Contin. Educ. Dent. 18:881-4, 1997;
Kornman et al., J. Clin. Periodontol.
24:72-77, 1997). El alelo 2 de IL-1A
desde el marcador -889 también se ha descubierto que se encuentra
asociado a la artritis juvenil crónica, particularmente a la
iridociclitis crónica (McDowell et al., Arthritis Rheum.
38:221-28, 1995). El alelo 2 de
IL-1B (TaqI) desde el marcador +3954 de
IL-1B también se ha descubierto que se encuentra
asociado a la psoriasis y a la diabetes dependiente de insulina en
pacientes DR3/4 (diGiovine et al., Cytokine 7:606, 1995;
Pociot et al., Eur. J. Clin. Invest.
22:396-402, 1992). Además, se ha descubierto que el
alelo 1 de IL-1RN (VNTR) se encuentra asociado a la
retinopatía diabética (ver USSN 09/037472 y PCT/GB97/02790). Además,
el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) se ha descubierto que se
encuentra asociado a la colitis ulcerosa en poblaciones caucásicas
de Norteamérica y de Europa (Mansfield, J. et al.,
Gastroenterology 106:637-42, 1994). Resulta
interesante que esta asociación es particularmente fuerte en las
poblaciones étnicamente relacionadas de los judíos ashkenazi (PCT
WO97/25445).
Los procedimientos tradicionales para el cribado
de enfermedades heredables han dependido de la identificación de
productos génicos anormales (por ejemplo la anemia de las células
falciformes) o de un fenotipo anormal (por ejemplo el retraso
mental). Estos procedimientos resultan de utilidad limitada para las
enfermedades heredables de aparición tardía y sin fenotipos
fácilmente identificables, tales como, por ejemplo, la enfermedad
vascular. Con el desarrollo de metodología de cribado genético
simple y económica, en la actualidad resulta posible identificar
polimorfismos que indican una propensión a desarrollar la
enfermedad, incluso cuando la enfermedad es de origen poligénico.
El número de enfermedades que puede cribarse mediante procedimientos
biológicos moleculares continúa creciendo con la creciente
comprensión de la base genética de los trastornos
multifactoriales.
El cribado genético (también denominado
genotipado o cribado molecular) puede definirse en términos amplios
como el ensayo para determinar si un paciente presenta mutaciones
(alelos o polimorfismos) que causan un estado de enfermedad o se
encuentran "ligados" a la mutación causante de un estado de
enfermedad. El ligamiento se refiere al fenómeno de que las
secuencias de ADN que se encuentran próximas entre sí en el genoma
presentan una tendencia a heredarse conjuntamente. Dos secuencias
pueden encontrarse ligadas debido a alguna ventaja selectiva de la
herencia conjunta. Sin embargo, más típicamente, dos secuencias
polimórficas se coheredan debido a la frecuencia relativamente baja
con la que se producen los sucesos de recombinación meiótica dentro
de la región entre los dos polimorfismos. Los alelos polimórficos
coheredados se dice que se encuentran en desequilibrio de ligamiento
entre sí porque, en una población humana dada, tienden a producirse
conjuntamente o no producirse en absoluto en ningún miembro
particular de la población. En efecto, en el caso de que se
encuentren múltiples polimorfismos en una región cromosómica dada en
desequilibrio de ligamiento entre sí, definen un "haplotipo"
genético quasi-estable. Por el contrario, los
sucesos de recombinación que se producen entre dos loci polimórficos
provoca que se separen en dos cromosomas homólogos diferentes. Si se
produce con suficiente frecuencia la recombinación meiótica entre
dos polimorfismos físicamente ligados, los dos polimorfismos
aparentemente se segregarán independientemente y se dice que se
encuentran en equilibrio de ligamiento.
Aunque la frecuencia de recombinación meiótica
entre dos marcadores generalmente es proporcional a la distancia
física entre ellos en el cromosoma, la presencia de "puntos
calientes", así como de regiones de recombinación cromosómica
reprimida, pueden tener como resultado discrepancias entre la
distancia física y la distancia de recombinación entre dos
marcadores. De esta manera, en determinadas regiones cromosómicas,
múltiples loci polimórficos que abarcan un dominio cromosómico
amplio pueden encontrarse en desequilibrio de ligamiento entre sí, y
de esta manera definir un haplotipo genético amplio. Además, donde
se encuentre una mutación causante de enfermedad dentro o en
ligamiento con este haplotipo, pueden utilizarse uno o más alelos
polimórficos del haplotipo como indicador diagnóstico o prognóstico
de la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Esta asociación
entre polimorfismos de otra manera benignos y un polimorfismo
causante de enfermedad se produce si la mutación de enfermedad
surgió en el pasado reciente, de manera que no ha transcurrido
suficiente tiempo para alcanzar el equilibrio a través de sucesos de
recombinación. Por lo tanto, la identificación de un haplotipo
humano que abarque o que se encuentre ligado a un cambio mutacional
causante de enfermedad, sirve como medida predictiva de la
probabilidad de un individuo de haber heredado la mutación causante
de enfermedad. Resulta importante que dichos procedimientos
prognósticos o diagnósticos pueden utilizarse sin necesidad de
identificar o de aislar la lesión real causante de enfermedad. Ello
resulta significativo debido a que la determinación precisa del
defecto molecular implicado en un proceso de enfermedad puede
resultar difícil y laboriosa, especialmente en el caso de
enfermedades multifactoriales, tales como los trastornos
inflamatorios.
En efecto, la correlación estadística entre un
trastorno inflamatorio y un polimorfismo de IL-1 no
indica necesariamente que el polimorfismo causa directamente el
trastorno. Al contrario, el polimorfismo correlacionado puede ser
una variante alélica benigna que se encuentra ligada (es decir, en
desequilibrio de ligamiento) a una mutación causante de trastorno
que ha aparecido en el pasado evolutivo reciente del ser humano, de
manera que no ha transcurrido suficiente tiempo para alcanzar el
equilibrio a través de sucesos de recombinación en el segmento
cromosómico intermedio. De esta manera, para los fines de ensayos
diagnósticos o prognósticos para una enfermedad particular, puede
utilizarse la detección de un alelo polimórfico asociado con la
enfermedad sin consideración de si el polimorfismo se encuentra
directamente implicado en la etiología de la enfermedad. Además, en
el caso de que un locus polimórfico benigno dado se encuentra en
desequilibrio de ligamiento con un locus polimórfico aparentemente
causante de enfermedad, otros loci polimórficos que se encuentran en
desequilibrio de ligamiento con el locus polimórfico benigno también
es probable que también se encuentren en desequilibrio de ligamiento
con el locus polimórfico causante de enfermedad. De esta manera,
estos otros loci polimórficos también resultarán prognósticos o
diagnósticos de la probabilidad de haber heredado el locus
polimórfico causante de enfermedad. En efecto, puede fijarse como
objetivo un haplotipo humano (que describe el patrón típico de
herencia conjunta de alelos de un conjunto de marcadores
polimórficos ligados) para fines diagnósticos tras identificar una
asociación entre una enfermedad o condición particular y un
haplotipo humano correspondiente. De esta manera, puede determinarse
la probabilidad de un individuo de desarrollar una enfermedad o
condición particular mediante la caracterización de uno o más alelos
polimórficos asociados a una enfermedad (o incluso uno o más
haplotipos asociados a una enfermedad) sin determinar o caracterizar
necesariamente la variación genética causativa.
En un aspecto, la presente invención proporciona
nuevos procedimientos para la determinación de si un sujeto hembra
presenta una predisposición a desarrollar osteoporosis de acuerdo
con las reivindicaciones adjuntas.
Los haplotipos de IL-1 pueden
identificarse mediante la detección de cualquiera de los alelos
componentes utilizando cualquiera de entre una diversidad de
técnicas disponibles, entre ellas: 1) llevar a cabo una reacción de
hibridación entre una muestra de ácidos nucleicos y una sonda que es
capaz de hibridarse con el alelo; 2) secuenciar por lo menos una
parte del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforética del
alelo o de fragmentos del mismo (por ejemplo de fragmentos generados
mediante digestión con endonucleasa). El alelo opcionalmente puede
someterse a una etapa de amplificación previamente a la realización
de la etapa de detección. Los procedimientos de amplificación
preferentes se seleccionan de entre el grupo que consiste en: la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de
la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de cadena
(SDA), la clonación, y las variaciones de las mismas (por ejemplo la
PCR-RT y la amplificación específica de alelo). Los
oligonucleótidos necesarios para la amplificación pueden
seleccionarse, por ejemplo, de entre los loci génicos de
IL-1, sea flanqueando el marcador de interés (según
se requiera para la amplificación por PCR) o directamente solapando
el marcador (tal como en la hibridación ASO). En una realización
particularmente preferente, la muestra se híbrida con un conjunto de
cebadores, que hibridan 5' y 3' en una secuencia sentido o
antisentido con el alelo asociado a la enfermedad vascular, y se
somete a una amplificación por PCR.
Un alelo también puede detectarse
indirectamente, por ejemplo mediante el análisis del producto
proteico codificado por el ADN. Por ejemplo, en el caso de que el
marcador en cuestión tenga como resultado la traducción de una
proteína mutante, la proteína puede detectarse mediante cualquiera
de entre una diversidad de procedimientos de detección de proteínas.
Entre estos procedimientos se incluyen la inmunodetección y los
ensayos bioquímicos, tales como el fraccionamiento por tamaños, en
el que la proteína presenta un cambio en el peso molecular aparente
producido por truncado, alargamiento, alteración del plegamiento o
por alteraciones de las modificaciones
post-traduccionales.
En otro aspecto, se dan a conocer kits para
llevar a cabo los ensayos anteriormente indicados. El kit puede
incluir un medio de recolección de muestra de ácidos nucleicos y un
medio para determinar si un sujeto porta por lo menos un alelo que
comprende un haplotipo de IL-1. El kit también puede
contener una muestra de control positiva o negativa o un estándar
y/o un dispositivo algorítmico para evaluar los resultados, y
reactivos y componentes adicionales, incluyendo: reactivos de
amplificación del ADN, ADN polimerasa, reactivos de amplificación de
ácidos nucleicos, enzimas de restricción, tampones, dispositivo de
muestreo de ácidos nucleicos, dispositivo de purificación de ADN,
desoxinucleótidos, oligonucleótidos (por ejemplo sondas y
cebadores), etc.
Tal como se ha descrito anteriormente, el
control puede ser un control positivo o negativo. Además, la muestra
de control puede contener los productos positivos (o negativos) de
la técnica de detección de alelo utilizada. Por ejemplo, en el caso
de que la técnica de detección de alelo sea la amplificación por
PCR, seguido de fraccionamiento por tamaño, la muestra de control
puede comprender fragmentos de ADN del tamaño apropiado. De la misma
manera, en el caso de que la técnica de detección de alelo implique
la detección de una proteína mutada, la muestra de control puede
comprender una muestra de proteína mutada. Sin embargo, resulta
preferente que la muestra de control comprenda el material que debe
someterse a ensayo. Por ejemplo, los controles pueden ser una
muestra de ADN genómico o una parte clonada del grupo génico de
IL-1. Sin embargo, preferentemente la muestra de
control es una muestra altamente purificada de ADN genómico en la
que la muestra que debe someterse a ensayo es de ADN
genómico.
genómico.
Los oligonucleótidos presentes en dicho kit
pueden utilizarse para la amplificación de la región de interés o
para la hibridación directa de oligonucleótidos específicos de alelo
(ASO) con los marcadores en cuestión. De esta manera, los
oligonucleótidos pueden flanquear el marcador de interés (tal como
se requiere para la amplificación por PCR) o solapar directamente el
marcador (tal como en la hibridación ASO).
La información obtenida utilizando los ensayos y
kits descritos en la presente memoria (solos o junto con información
sobre otro defecto genético o factor ambiental que contribuye a la
osteoporosis) resulta útil para determinar si un sujeto no
sintomático ha desarrollado, o es probable que desarrolle, la
enfermedad o estado particular. Además, la información puede
permitir un enfoque más particularizado en la prevención de la
aparición o de la progresión de la enfermedad o estado. Por ejemplo,
esta información puede permitir al médico clínico prescribir más
efectivamente una terapia que trate la base molecular de la
enfermedad o estado.
En todavía un aspecto adicional, se dan a
conocer procedimientos para el tratamiento o la prevención de la
osteoporosis en un sujeto mediante la administración al sujeto de un
agente terapéutico apropiado de la invención. En todavía otro
aspecto, se dan a conocer ensayos in vitro o in vivo
para cribar compuestos de ensayo para identificar terapéuticos para
el tratamiento o la prevención del desarrollo de la osteoporosis. En
una realización, el ensayo comprende poner en contacto una célula
transfectada con una mutación causativa ligada operablemente a un
promotor apropiado, con un compuesto de ensayo y determinar el nivel
de expresión de una proteína en la célula en presencia y en ausencia
del compuesto de ensayo. En una realización preferente, la mutación
causativa tiene como resultado una producción reducida de
antagonista de receptor de IL-1, y la producción
incrementada del antagonista de receptor de IL-1 en
presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto es un
agonista de la actividad antagonista del receptor de
IL-1. En otra realización preferente, la mutación
causativa tiene como resultado la producción incrementada de
IL-1\alpha o de IL-1\beta, y la
producción reducida de IL-1\alpha o de
IL-1\beta en presencia del compuesto de ensayo
indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de
IL-1\alpha o de IL-1\beta. En
otra realización, la invención se caracteriza por animales
transgénicos no humanos y su utilización en la identificación de
antagonistas de la actividad de IL-1\alpha o de
IL-1\beta, o de agonistas de la actividad de
IL-1Ra.
Se proporcionan otras realizaciones y ventajas
de la invención en la descripción detallada y reivindicaciones
siguientes.
La fig. 1 muestra dos patrones diferentes de
haplotipo genético.
La fig. 2 es un gráfico que muestra el riesgo de
fracturas osteoporóticas no espinales.
La fig. 3 es un gráfico que muestra el riesgo de
fracturas osteoporóticas de cadera.
La fig. 4 es un gráfico que muestra el riesgo de
fracturas osteoporóticas de muñeca.
La fig. 5 es un gráfico que muestra el riesgo de
fracturas no espinales.
Por conveniencia, a continuación se proporciona
el significado de determinados términos y expresiones utilizados en
la especificación, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
El término "alelo" se refiere a las
diferentes variantes de secuencia que se encuentran en diferentes
regiones polimórficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR)
presenta por lo menos cinco alelos diferentes. Las variantes de
secuencia pueden ser cambios únicos o múltiples de bases,
incluyendo, aunque sin limitación, inserciones, supresiones o
sustituciones, o pueden ser un número variable de repeticiones de
secuencia.
La expresión "patrón alélico" se refiere a
la identidad de un alelo o alelos en una o más regiones
polimórficas. Por ejemplo, un patrón alélico puede consistir en un
solo alelo en un sitio polimórfico, tal como para el alelo 1 de
IL-1RN (VTNR), que es un patrón alélico que presenta
por lo menos una copia del alelo 1 de IL-1RN en el
VNTR o los loci génicos de IL-1RN. Alternativamente,
un patrón alélico puede consistir de un estado homocigótico o
heterocigótico en un único sitio polimórfico. Por ejemplo, el alelo
2,2 de IL1-RN (VTNR) es un patrón alélico en el que
existen dos copias del segundo alelo en el marcador VTNR de
IL-1RN que corresponden al estado homocigótico del
alelo 2 de IL-RN (VNTR). Alternativamente, el patrón
alélico puede consistir en la identidad de alelos en más de un sitio
polimórfico.
El término "anticuerpo" tal como se utiliza
en la presente memoria pretende referirse a un agente de unión que
incluye un anticuerpo completo o un fragmento de unión del mismo que
es específicamente reactivo con un polipéptido IL-1.
Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas
convencionales y los fragmentos cribarse para su utilidad de la
misma manera descrita anteriormente para los anticuerpos completos.
Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)_{2}
mediante el tratamiento de un anticuerpo con pepsina. El fragmento
F(ab)_{2} resultante puede tratarse para reducir los
puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la
presente invención además pretende incluir las moléculas
biespecíficas, de cadena única y quiméricas y humanizadas con
afinidad para un polipéptido IL-1B proporcionada por
como mínimo una región CDR del anticuerpo.
Las expresiones "actividad biológica" o
"bioactividad" o "actividad" o "función biológica",
que se utilizan intercambiablemente, para los fines de la presente
memoria se refieren a un efector o función antigénica llevada a cabo
directa o indirectamente por un polipéptido IL-1 (en
su confirmación nativa o desnaturalizada) o por cualquier
subsecuencia del mismo. Entre las actividades biológicas se incluyen
la unión a un péptido diana, por ejemplo un receptor
IL-1. Puede modularse una bioactividad
IL-1 afectando directamente a un polipéptido
IL-1. Alternativamente, puede modularse una
bioactividad de IL-1 mediante la modulación del
nivel de un polipéptido IL-1, tal como mediante la
modulación de la expresión de un gen de IL-1.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "fragmento bioactivo de un polipéptido
IL-1" se refiere a un fragmento de un polipéptido
IL-1 de longitud completa, en el que el fragmento
imita o antagoniza específicamente la actividad de un polipéptido
IL-1 de tipo salvaje. El fragmento bioactivo
preferentemente es un fragmento capaz de interaccionar con un
receptor de interleuquina.
La expresión "una actividad aberrante", tal
como se aplica a una actividad de un polipéptido tal como
IL-1, se refiere a una actividad que difiere de la
actividad del polipéptido de tipo salvaje o nativo, o que difiere de
la actividad del polipéptido en un sujeto sano. Una actividad de un
polipéptido puede ser aberrante debido a que es más fuerte que la
actividad de su contrapartida nativa. Alternativamente, una
actividad puede ser aberrante debido a que es más débil, o se
encuentra ausente, en comparación con la actividad de su
contrapartida nativa. Una actividad aberrante también puede ser un
cambio de una actividad. Por ejemplo, un polipéptido aberrante puede
interaccionar con un péptido diana diferente. Una célula puede
presentar una actividad IL-1 aberrante debido a la
sobreexpresión o infraexpresión de un locus génico de
IL-1 codificante de un polipéptido de locus
IL-1.
"Células", "células huésped" o
"células huésped recombinantes" son expresiones que se utilizan
intercambiablemente en la presente memoria para referirse no sólo a
la célula particular de la invención, sino también a la progenie o a
la progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden
producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas
debido a mutaciones o a influencias ambientales, la progenie de
hecho puede no ser idéntica a la célula progenitora, aunque todavía
se incluyen dentro del alcance de la expresión tal como se utiliza
en la presente memoria.
Las expresiones "quimera", "mosaico",
"mamífero quimérico" y similares se refieren a un mamífero
transgénico con un constructo knockout o knockin en por lo menos
algunas de sus células que contienen genoma.
Las expresiones "control" o "muestra de
control" se refieren a cualquier muestra que resulte apropiada
para la técnica de detección utilizada. La muestra de control puede
contener los productos de la técnica de detección de alelo utilizada
o el material que debe someterse a ensayo. Además, los controles
pueden ser controles positivos o negativos. A título de ejemplo, en
el caso de que la técnica de detección de alelo sea la amplificación
por PCR, seguida del fraccionamiento por tamaño, la muestra de
control puede comprender fragmentos de ADN de un tamaño apropiado.
De la misma manera, en el caso de que la técnica de detección de
alelo implique la detección de una proteína mutada, la muestra de
control puede comprender una muestra de una proteína mutada. Sin
embargo, resulta preferente que la muestra de control comprenda el
material que debe someterse a ensayo. Por ejemplo, los controles
pueden ser una muestra de ADN genómico o una parte clonada del grupo
génico de IL-1. Sin embargo, en el caso de que la
muestra que debe someterse a ensayo sea de ADN genómico, la muestra
de control preferentemente es una muestra altamente purificada de
ADN genómico.
Las expresiones "disrupción de un gen" y
"disrupción dirigida" o cualquier expresión similar se refiere
a la interrupción específica de sitio de una secuencia nativa de ADN
para prevenir la expresión de dicho gen en la célula en comparación
con la copia de tipo salvaje del gen. La interrupción puede estar
causada por supresiones, inserciones o modificaciones del gen, o por
cualquier combinación de los mismos.
El término "haplotipo" tal como se utiliza
en la presente memoria pretende referirse a un conjunto de alelos
que se heredan conjuntamente como grupo (se encuentran en
desequilibrio de ligamiento) a niveles estadísticamente
significativos (p_{corr} < 0,05). Tal como se utiliza en la
presente memoria, la expresión "un haplotipo de
IL-1" se refiere a un haplotipo en los loci de
IL-1. Un haplotipo de IL-1
inflamatorio o proinflamatorio se refiere a un haplotipo que es
indicativo de actividades agonistas incrementadas y/o antagonistas
reducidas.
Las expresiones "grupo génico de
IL-1" y "loci de IL-1" tal
como se utilizan en la presente memoria incluyen todo el ácido
nucleico en la región 2q13 del cromosoma 2 o próximo a la misma,
incluyendo por lo menos los genes IL-1A,
IL-1B e IL-1RN y otras secuencias
ligadas (Nicklin et al., Genomics 19:382-84,
1994). Los términos "IL-1A",
"IL-1B" e "IL-1RN" tal
como se utilizan en la presente memoria se refieren a los genes que
codifican para IL-1, IL-1 y el
antagonista de receptor de IL-1, respectivamente.
Los números de acceso de los genes para IL-1A,
IL-1B e IL-1RN son X03833, X04500 y
X64532, respectivamente.
La expresión "mutación funcional de
IL-1" se refiere a una mutación dentro del grupo
génico de IL-1 que resulta en un fenotipo alterado
(es decir, afecta a la función de un gen o proteína de
IL-1). Entre los ejemplos se incluyen: el alelo 2 de
IL-1A (+4845), el alelo 2 de IL-1B
(+3954), el alelo 2 de IL-1B (+6912) y el alelo 2 de
IL-1RN (+2018).
La expresión "alelo Y de
IL-1X(Z)" se refiere a una forma alélica
particular, denominada Y, que se produce en un sitio polimórfico del
locus de IL-1 en el gen X, en el que X es
IL-1A, B o 1RN y se encuentra posicionado en el
nucleótido Z o próximo al mismo, en el que el nucleótido Z está
numerado respecto al sitio de inicio transcripcional principal, que
es el nucleótido +1, del gen X particular de IL-1.
Tal como se utiliza adicionalmente en la presente memoria, la
expresión "alelo (Z) de IL-1X" se refiere a
todos los alelos de un sitio polimórfico de IL-1 en
el gen X posicionado en o cerca del nucleótido Z. Por ejemplo, la
expresión "alelo de IL-1RN (+2018)" se refiere
a las formas alternativas del gen IL-1RN en el
marcador +2018. La expresión "alelo 1 de IL-1RN
(+2018)" se refiere a formas del gen IL-1RN que
contienen una citosina (C) en posición +2018 de la cadena sentido.
(Clay et al., Hum. Genet. 97:723-26, 1996).
La expresión "alelo 2 de IL-1RN (+2018)" se
refiere a una forma del gen IL-1RN que contiene una
timina (T) en posición +2018 de la cadena positiva. Cuando un sujeto
presenta dos alelos IL-1RN idénticos, el sujeto se
dice que es homocigótico, o que presenta el estado homocigótico.
Cuando un sujeto presenta dos alelos de IL-1RN
diferentes, el sujeto se dice que es heterocigótico o que presenta
el estado heterocigótico. La expresión "alelo 2,2 de
IL-1RN (+2018)" se refiere al estado homocigótico
de alelo 2 de IL-1RN (+2018). A la inversa, la
expresión "alelo 1,1 de IL-1RN (+2018)" se
refiere al estado homocigótico de alelo 1 de IL-1RN
(+2018). La expresión "alelo 1,2 de IL-1RN
(+2018)" se refiere al estado heterocigótico de alelo 1 y alelo
2.
La expresión "relacionado con
IL-1" tal como se utiliza en la presente memoria
pretende incluir todos los genes relacionados con los genes del
locus de IL-1 humano en el cromosoma humano 2 (2q
12-14). Entre estos se incluyen los genes
IL-1 del grupo génico de IL-1 humano
situados en el cromosoma 2 (2q 13-14), que incluyen:
el gen IL-1A que codifica la
interleuquina-1\alpha, el gen
IL-1B que codifica la
interleuquina-1\beta y el gen
IL-1RN (o IL-1ra) que codifica el
antagonista de receptor de interleuquina 1. Además, entre estos
genes relacionados con IL-1 se incluyen los genes de
receptor de IL-1 humano de tipo I y de tipo II
situados en el cromosoma humano 2 (2q12) y sus homólogos de ratón
situados en el cromosoma 1 de ratón en la posición 19,5 cM. La
interleuquina-1\alpha, la
interleuquina-1\beta y la
interleuquina-1RN se encuentran relacionadas en la
medida en que todas se unen a los receptor de IL-1
de tipo I, sin embargo únicamente la
interleuquina-1\alpha y la
interleuquina-1\beta son ligandos agonistas que
activan los receptores de IL-1 de tipo I, mientras
que la interleuquina-1RN es un ligando antagonista
de origen natural. La expresión "IL-1"
utilizada en referencia a un producto génico o polipéptido, pretende
referirse a todos los productos génicos codificados por el locus de
la interleuquina-1 en el cromosoma humano 2 (2q
12-14) y sus homólogos correspondientes de otras
especies o variantes funcionales de los mismos. De esta manera, el
término IL-1 incluye los polipéptidos secretados que
promueven una respuesta inflamatoria, tales como
IL-1\alpha e IL-1\beta, así como
un polipéptido secretado que antagoniza las respuestas
inflamatorias, tales como el antagonista del receptor de
IL-1 y el receptor (señuelo) de la
IL-1 de tipo II.
Las expresiones "receptor de
IL-1" o "IL-1R" se refieren
a diversos receptores proteicos unidos a la membrana celular capaces
de unirse y/o de transducir una señal de un ligando codificado por
un locus de IL-1. Las expresiones resultan
aplicables a cualquiera de las proteínas capaces de unirse a
moléculas de interleuquina-1 (IL-1)
y, en su configuración nativa como proteínas de la membrana
plasmática de mamíferos, presumiblemente desempeñan un papel en la
transducción de señales proporcionadas por IL-1 a
una célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión
incluye análogos de proteínas nativas con actividad de unión a
IL-1 o de transducción de señales. Entre los
ejemplos se incluyen los receptores de IL-1 humanos
y receptores descritos en la patente U.S. No. 4.968.607. La
expresión "ácido nucleico de IL-1" se refiere a
un ácido nucleico que codifica una proteína
IL-1.
Las expresiones "polipéptido
IL-1" y "proteína IL-1"
pretenden abarcar a los polipéptidos que comprenden la secuencia
aminoácida codificada por las secuencias de ADN genómico de
IL-1 mostradas en las figuras 1, 2 y 3, o fragmentos
de las mismas, y los homólogos de las mismas, e incluye polipéptidos
agonistas y antagonistas.
La expresión "riesgo incrementado" se
refiere a una frecuencia estadísticamente más elevada de aparición
de la enfermedad o estado en un individuo que porta un alelo
polimórfico particular en comparación con la frecuencia de aparición
de la enfermedad o estado en un miembro de una población que no
porta el alelo polimórfico particular.
El término "interaccionar" tal como se
utiliza en la presente memoria pretende incluir las relaciones o
asociaciones detectables (por ejemplo las interacciones bioquímicas)
entre moléculas, tales como las interacciones
proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, ácido
nucleico-ácido nucleico y proteína-molécula pequeña
o ácido nucleico-molécula pequeña en estado
natural.
El término "aislado" tal como se utiliza en
la presente memoria con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN
o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADNs o ARNs,
respectivamente, que se encuentran presentes en la fuente natural de
la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado codificante
de uno de los polipéptidos IL-1 de la invención
preferentemente incluye no más de 10 kilobases (kb) de secuencia de
ácido nucleico que de manera natural flanquea inmediatamente el gen
IL-1 en el ADN genómico, más preferentemente no más
de 5kb de estas secuencias flanqueantes de origen natural, y todavía
más preferentemente menos de 1,5kb de esta secuencia flanqueante de
origen natural. El término aislado tal como se utiliza en la
presente memoria también se refiere a un ácido nucleico o péptido
que se encuentra sustancialmente libre de material celular, material
vírico o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN
recombinante, o precursores químicos u otros compuestos químicos
cuando se sintetiza químicamente. Además, la expresión "ácido
nucleico aislado" pretende incluir fragmentos de ácido nucleico
que no son de origen natural como fragmentos y que no se
encontrarían en el estado natural. El término "aislado" también
se utiliza en la presente memoria para referirse a polipéptidos que
se aíslan de otras proteínas celulares y pretende cubrir tanto
polipéptidos purificados como recombinantes.
El término "knockin" referido a un animal
transgénico se refiere a un animal en el que se ha introducido un
gen modificado en su genoma y en el que el gen modificado puede ser
de origen exógeno o endógeno.
El término "knockout" referido a un animal
transgénico se refiere a un animal en el que se ha producido una
supresión parcial o completa de la expresión de un gen endógeno (por
ejemplo basada en una supresión de por lo menos una parte del gen,
en la sustitución de por lo menos una parte del gen con una segunda
secuencia, en la introducción de codones de parada, en la mutación
de bases que codifican aminoácidos críticos, o en la eliminación de
una unión de intrón, etc.).
La expresión "constructo knockout" se
refiere a una secuencia de ácido nucleico que puede utilizarse para
reducir o para suprimir la expresión de una proteína codificada por
secuencias de ADN endógeno en una célula. En un ejemplo simple, el
constructo knockout comprende un gen, tal como el gen
IL-1RN, con una supresión en una parte crítica del
gen, de manera que la proteína activa no puede expresarse a partir
del mismo. Alternativamente, pueden añadirse varios codones de
terminación al gen nativo, causando la terminación temprana de la
proteína, o puede inactivarse una unión de intrón. En un constructo
knockout típico, se sustituye alguna parte del gen con un marcador
seleccionable (tal como el gen neo) de manera que el gen puede
representarse de la manera siguiente: IL-1RN
5'/neo/IL-1RN 3', en el que IL-1RN5'
e IL-1RN3' se refieren a secuencias genómicas o de
ADNc que se encuentran situadas, respectivamente, corriente arriba o
corriente abajo respecto a una parte del gen IL-1RN
y donde neo se refiere a un gen de resistencia a la neomicina. En
otro constructo knockout, se añade un segundo marcador seleccionable
en una posición flanqueante de manera que el gen puede representarse
como: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, donde TK
es un gen de timidina quinasa que puede añadirse a la secuencia
IL-1RN5' o IL-1RN3' del constructo
situado anteriormente y que además puede seleccionarse negativamente
(es decir, es un marcador seleccionable negativo) en medios
apropiados. Este constructo de dos marcadores permite la selección
de sucesos de recombinación homólogo, que eliminan el marcador TK
flanqueante, separándolos de los sucesos de recombinación no
homóloga, que típicamente conservan las secuencias TK. La supresión
y/o sustitución génica puede ser de los exones, intrones,
especialmente uniones de intrón, y/o de las regiones reguladoras,
tales como promotores.
La expresión "desequilibrio de ligamiento"
se refiere a la coherencia de dos alelos a frecuencias superiores de
las esperadas a partir de las frecuencia separadas de aparición de
cada alelo en una población de control dada. La frecuencia esperada
de aparición de dos alelos que se heredan de manera independiente es
la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del
segundo alelo. Los alelos que co-ocurren a las
frecuencias esperadas se dice que se encuentran en "desequilibrio
de ligamiento". La causa del desequilibrio de ligamiento con
frecuencia no resulta evidente. Puede deberse a la selección de
determinadas combinaciones de alelos o a la mezcla reciente de
poblaciones genéticamente heterogéneas. Además, en el caso de
marcadores que se encuentran muy estrechamente ligados a un gen de
enfermedad, es predecible que se producirá una asociación de un
alelo (o de un grupo de alelos ligados) con el gen de la enfermedad
si la mutación de enfermedad se produjo en el pasado reciente, de
manera que no ha transcurrido suficiente tiempo para alcanzar el
equilibrio mediante sucesos de recombinación en la región
cromosómica específica. Al referirse a patrones alélicos que
comprenden más de un alelo, un primer patrón alélico se encuentra en
desequilibrio de ligamiento con un segundo patrón alélico si todos
los alelos que comprenden el primer patrón alélico se encuentran en
desequilibrio de ligamiento con por lo menos uno de los alelos del
segundo patrón alélico. Un ejemplo de desequilibrio de ligamiento es
el que se produce entre los alelos en los sitios polimórficos de
IL-1RN(+2018) y IL-1RN (VNTR). Los
dos alelos en IL-1RN(+2018) se encuentran en
desequilibrio de ligamiento al 100% con los dos alelos más
frecuentes de IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el
alelo 2.
El término "marcador" se refiere a una
secuencia en el genoma que es conocido que varía entre individuos.
Por ejemplo, el gen IL-1RN presenta un marcador que
consiste en un número variable de repeticiones en tándem (VNTR).
Las expresiones "gen mutado" o
"mutación" o "mutación funcional" se refiere a una forma
alélica de un gen, que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto
que presenta el gen mutado respecto a un sujeto que no presenta el
gen mutado. El fenotipo alterado causado por una mutación puede
corregirse o compensarse mediante determinados agentes. Si un sujeto
debe ser homocigótico para que esta mutación suponga un fenotipo
alterado, la mutación se dice que es recesiva. Si una copia del gen
mutado resulta suficiente para alterar el fenotipo del sujeto, la
mutación se dice que es dominante. Si un sujeto presenta una copia
del gen mutado y presenta un fenotipo que es intermedio entre el de
un sujeto homocigótico y el de un sujeto heterocigótico (para ese
gen), se dice que la mutación es co-dominante.
La expresión "animal no humano" de la
invención incluye mamíferos, tales como roedores, primates no
humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, etc., anfibios, tales como
los miembros del género Xenopus, y aves transgénicas (por
ejemplo pollos, pájaros, etc.). La expresión "animal quimérico"
tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a animales en
los que se encuentra el gen recombinante, o en los que el gen
recombinante se expresa en algunas, aunque no en todas, las células
del animal. La expresión "animal quimérico específico de
tejido" indica que uno de los genes IL-1
recombinantes se encuentra presente y/o se ha expresado o se ha
alterado en algunos tejidos pero no en otros. La expresión
"mamífero no humano" se refiere a cualquier miembro de la clase
Mamifera, excepto al ser humano.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos o a
oligonucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, en
caso apropiado, a ácido ribonucleico (ARN). La expresión también
debe interpretarse que incluye, como equivalentes, los análogos de
ARN o de ADN formado de análogos de nucleótidos (por ejemplo ácidos
nucleicos peptídicos) y según resulte aplicable a la realización que
se describa, a polinucleótidos de cadena única (sentido o
antisentido) y de doble cadena.
La Organización Mundial de la Salud define el
término "osteoporosis" como "...una enfermedad esquelética
sistémica caracterizada por una masa ósea reducida y el deterioro de
la microarquitectura del tejido óseo, con un incremento consecuente
de la fragilidad ósea y la susceptibilidad a la fractura" (WHO
Consensus Development Conference 1993). La definición clínica de
osteoporosis es: una afección en la que la densidad mineral ósea
(BMD) o concentración mineral ósea (BMC) se encuentra en más de
aproximadamente 2,5 desviaciones estándar (SD) por debajo de la
media de mujeres jóvenes sanas. La osteoporosis grave se define como
una BMD o una BMC inferior en más de aproximadamente 2,5 SD de la
media de mujeres jóvenes sanas y la presencia de una o más fracturas
de fragilidad. Debido a que la pérdida ósea no se restringe
estrictamente a sitios específicos, la osteoporosis puede
manifestarse de diversas maneras, incluyendo la pérdida ósea o
incidencia de fractura alveolar, femoral, radial, vertebral o de
muñeca, la pérdida ósea postmenopáusica, la masa ósea severamente
reducida, la incidencia de fractura o la tasa de pérdida ósea.
El término "polimorfismo" se refiere a la
coexistencia de más de una forma de un gen o parte del mismo (por
ejemplo una variante alélica). Una parte de un gen del que existen
por lo menos dos formas diferentes, es decir dos secuencias
nucleótidas diferentes, se denomina "región polimórfica de un
gen". Una secuencia genética específica de una región polimórfica
de un gen es un alelo. Una región polimórfica puede ser un solo
nucleótido, la identidad del cual difiere en diferentes alelos. Una
región polimórfica también puede ser de varios nucleótidos de
longitud.
La expresión "propensión a la enfermedad",
así como "predisposición" o "susceptibilidad" a una
enfermedad, o cualquier expresión similar, significa que
determinados alelos dados a conocer en la presente memoria se
encuentran asociados o son predictivos de la incidencia en un sujeto
del desarrollo de una enfermedad particular (por ejemplo una
enfermedad vascular). De esta manera, los alelos se encuentran
sobre-representados en frecuencia en individuos con
la enfermedad en comparación con los individuos sanos. De esta
manera, estos alelos pueden utilizarse para predecir la enfermedad
incluso en individuos pre-sintomáticos o antes de
que enfermen.
La expresión "molécula pequeña" tal como se
utiliza en la presente memoria pretende referirse a una composición
que presenta un peso molecular inferior a aproximadamente 5 kD y más
preferentemente inferior a aproximadamente 4 kD. Las moléculas
pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, peptidomiméticos,
carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o
inorgánicas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "se híbrida específicamente" o "detecta
específicamente" se refiere a la capacidad de una molécula de
ácido nucleico de hibridarse con por lo menos aproximadamente 6
nucleótidos consecutivos de una muestra de ácidos nucleicos.
La expresión "secuencia reguladora de la
transcripción" es una expresión genérica utilizada a lo largo de
la especificación para referirse a secuencias de ADN, tales como
señales de iniciación, intensificadores y promotores, que inducen o
controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteína
con las que se encuentran operablemente ligadas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "transgén" se refiere a una secuencia de ácidos
nucleicos (codificante, por ejemplo, de uno de los polipéptidos
IL-1, o un transcrito antisentido del mismo) que se
ha introducido en una célula. Un transgén puede ser parcial o
totalmente heterólogo, es decir, foráneo al animal o célula
transgénico en el que se introduce, o ser homólogo de un gen
endógeno del animal o célula transgénico en el que se introduce,
pero que ha sido diseñado para insertarse, o que se inserta, en el
genoma del animal de tal manera que altere el genoma de la célula en
la que se inserta (por ejemplo, se inserta en una localización que
difiere de la del gen natural, o su inserción resulta en un
knockout). Un transgén también puede encontrarse presente en una
célula en la forma de un episoma. Un transgén puede incluir una o
más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro
ácido nucleico, tal como intrones, que pueden resultar necesarios
para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.
La expresión "animal transgénico" se
refiere a cualquier animal, preferentemente a un mamífero no humano,
ave o anfibio, en el que una o más de las células del animal
contienen ácidos nucleicos heterólogos introducidos por medio de la
intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas bien
conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos se introducen en la
célula directa o indirectamente mediante la introducción en un
precursor de la célula, por medio de la manipulación genética
deliberada, tal como mediante microinyección o mediante infección
con un virus recombinante. La expresión manipulación genética no
incluye el cruzamiento clásico, ni la fertilización in vitro,
sino que más bien se refiere a la introducción de una molécula de
ADN recombinante. Esta molécula puede integrarse dentro de un
cromosoma, o puede ser ADN replicante extracromosómicamente. En los
animales transgénicos típicos indicados en la presente memoria, el
transgén causa que las células expresen una forma recombinante de un
polipéptido IL-1, por ejemplo formas agonistas o
antagonistas. Sin embargo, los animales transgénicos en los que el
gen recombinante es silencioso también se contemplan, tal como, por
ejemplo, los constructos FLP o CRE dependientes de recombinasa
descritos posteriormente. Además, la expresión "animal
transgénico" también incluye aquellos animales recombinantes en
los que la disrupción génica de uno o más genes ha sido causada por
la intervención humana, incluyendo técnicas tanto de recombinación
como antisentido. La expresión pretende incluir todas las
generaciones de progenie. De esta manera, se incluye el animal
fundador y la totalidad de la progenie del mismo F1, F2, F3 y de
esta manera sucesivamente.
El término "tratando" tal como se utiliza
en la presente memoria pretende cubrir la curación, así como el
alivio de por lo menos un síntoma de una afección o enfermedad.
El término "vector" se refiere a una
molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido
nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector preferente es un
episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación
extracromosómica. Los vectores preferentes son aquellos capaces de
replicación autónoma y/o de la expresión de ácidos nucleicos a los
que se encuentran ligados. Los vectores capaces de dirigir la
expresión de genes a los que se encuentran operativamente ligados se
denominan en la presente memoria "vectores de expresión". En
general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN
recombinante con frecuencia se encuentran en la forma de
"plásmidos", que se refiere de manera general a bucles
circulares de ADN de doble cadena que, en su forma de vector, no se
encuentran unidos al cromosoma. En la presente especificación, los
términos "plásmido" y "vector" se utilizan
intercambiablemente debido a que el plásmido es la forma de vector
utilizada más frecuentemente. Sin embargo, la invención pretende
incluir otras formas de vector de expresión que sirven funciones
equivalentes y que se convierten en conocidas en la técnica a partir
de la presente invención.
La expresión "alelo de tipo salvaje" se
refiere a un alelo de un gen que, cuando se encuentra presente en
dos copias en un sujeto, resulta en un fenotipo de tipo salvaje.
Pueden existir varios alelos de tipo salvaje diferentes de un gen
específico, debido a que determinados cambios de nucleótidos en un
gen pueden no afectar al fenotipo de un sujeto que presenta dos
copia del gen con los cambios de nucleótidos.
La presente invención se basa, por lo menos en
parte, en la identificación de determinados alelos que se ha
determinado que se asocian (en un grado estadísticamente
significativo) a la pérdida ósea, al riesgo de fractura o a otros
indicadores de osteoporosis. Por lo tanto, la detección de los
alelos puede indicar que el sujeto está desarrollando osteoporosis o
presenta una predisposición a desarrollarla. Sin embargo, debido a
que estos alelos se encuentran en equilibrio de ligamiento con otros
alelos, la detección de estos otros alelos ligados también puede
indicar que el sujeto está desarrollando o está predispuesto a
desarrollar una enfermedad o afección particular. Por ejemplo, el
haplotipo 44112332 comprende el genotipo siguiente:
| alelo 4 del marcador 222/223 de IL-1A |
| alelo 4 del marcador gz5/gz6 de IL-1A |
| alelo 1 del marcador -889 de IL-1A |
| alelo 1 del marcador +3954 de IL-1B |
| alelo 2 del marcador -511 de IL-1B |
| alelo 3 del marcador gaat.p33330 |
| alelo 3 del marcador Y31 |
| alelo 2 de +2018 de IL-1RN |
| alelo 2 del marcador VNTR de IL-1R |
Existen tres otros polimorfismos en un exón
alternativo de IL-1RN (exón 1ic, que produce una
forma intracelular del producto génico) que también se encuentran en
desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 de IL-1RN
(VNTR) (Clay et al., Hum. Genet. 97:723-26,
1996). Entre estos se incluyen: IL-1RN exón 1ic
(1812) (GenBank:X77090 en 1812); el polimorfismo del exón 1ic de
IL-1RN (1868) (GenBank:X77090 en 1868), y el
polimorfismo del exón 1ic de IL-1RN (1887)
(GenBank:X77090 en 1887). Además, todavía otro polimorfismo en el
promotor para la forma intracelular de corte y empalme alternativo
del gen, el polimorfismo Pic (1731) (GenBank:X77090 en 1731) también
se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus
polimórfico de IL-1RN (VNTR). Para cada uno de estos
loci polimórficos, la variante de secuencia del alelo 2 se ha
determinado que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el
alelo 2 del locus de IL-1RN (VNTR) (Clay et
al., Hum. Genet. 97:723-26, 1996).
El haplotipo 33221461 comprende el genotipo
siguiente:
| alelo 3 del marcador 222/223 de IL-1A |
| alelo 3 del marcador gz5/gz6 de IL-1A |
| alelo 2 del marcador -889 de IL-1A |
| alelo 2 del marcador +3954 de IL-1B |
| alelo 1 del marcador -511 de IL-1B |
| alelo 4 del marcador gaat.p3330 |
| alelo 6 del marcador Y31 |
| alelo 1 de +2018 de IL-1RN |
| alelo 1 del marcador VNTR de IL-1RN |
Los individuos con el haplotipo 44112332
típicamente son sobreproductores de las proteínas tanto
IL-1\alpha como IL-1\beta, tras
la estimulación. En contraste, los individuos con el haplotipo
33221461 típicamente son infraproductores de IL-1ra.
Cada haplotipo tiene como resultado una respuesta proinflamatoria
neta. Cada alelo dentro de un haplotipo puede presentar un efecto,
así como un efecto genotípico compuesto. Además, algunas
enfermedades particulares pueden encontrarse asociadas con ambos
patrones de haplotipo.
Además de los patrones alélicos descritos
anteriormente, tal como se describen en la presente memoria, un
experto en la materia podrá identificar con facilidad otros alelos
(incluyendo polimorfismos y mutaciones) que se encuentran en
desequilibrio de ligamiento con un alelo asociado con la
osteoporosis. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de ácido
nucleico de un primer grupo de sujetos sin osteoporosis, así como
ADN de un segundo grupo de sujetos con el trastorno. La muestra de
ácido nucleico seguidamente puede compararse para identificar
aquellos alelos que se encuentran
sobre-representados en el segundo grupo comparado
con el primer grupo, en el que dichos alelos presumiblemente se
encuentran asociados con la osteoporosis. Alternativamente, pueden
identificarse alelos que se encuentran en desequilibrio de
ligamiento con un alelo que se encuentra asociado con la
osteoporosis, por ejemplo mediante genotipado de una gran población
y llevando a cabo análisis estadísticos para determinar qué alelos
aparecen juntos con más frecuencia de lo esperado. Preferentemente
el grupo se selecciona para que esté comprendido por individuos
genéticamente relacionados. Entre los individuos genéticamente
relacionados se incluyen los individuos de la misma raza, del mismo
grupo étnico o incluso de la misma familia. A medida que se
incrementa el grado de asociación genética entre un grupo de control
y un grupo de ensayo, se incrementa el valor predictivo de los
alelos polimórficos que se encuentran situados cada vez más
distantes de un alelo causante de enfermedad. Ello se debe a que ha
pasado menos tiempo evolutivo del necesario para permitir que los
polimorfismos que se encuentran ligados a lo largo de un cromosoma
en una población fundadora se redistribuyan mediante sucesos de
entrecruzamiento genético. De esta manera, pueden desarrollarse
ensayos de genotipado diagnóstico específicos de raza, de etnia e
incluso de familia para la detección de alelos de enfermedad que
surgieron en tiempos cada vez más recientes en la evolución humana,
por ejemplo tras la divergencia de las razas humanas principales,
tras la separación de las poblaciones humanas en grupos étnicos
diferentes, e incluso dentro de la historia reciente de una línea
familiar particular.
El desequilibrio de ligamiento entre dos
marcadores polimórficos o entre un marcador polimórfico y una
mutación causante de enfermedad es un estado metaestable. En
ausencia de presión selectiva o de la reincidencia ligada esporádica
de sucesos mutacionales subyacentes, los polimorfismos finalmente se
disociarán a través de sucesos de recombinación cromosómica, y de
esta manera alcanzarán el equilibrio de ligamiento a lo largo del
curso de la evolución humana. De esta manera, puede incrementarse la
probabilidad de encontrar un alelo polimórfico en desequilibrio de
ligamiento con una enfermedad o condición debido a cambios en por lo
menos dos factores: una menor distancia física entre el marcador
polimórfico y la mutación causante de enfermedad, y un menor número
de generaciones meióticas para la disociación del par ligado. La
consideración de este último factor sugiere que, cuanto más
estrechamente relacionados se encuentren dos individuos, resulta más
probable que compartan un cromosoma parental o región cromosómica
común que contenga los polimorfismos ligados y resulta menos
probable que dicho par ligado se haya disociado por sucesos de
entrecruzamiento meiótico que se producen en cada generación. Como
resultado, cuanto más estrechamente relacionados se encuentran dos
individuos, resulta más probable que se cohereden polimorfismos
considerablemente separados. De esta manera, para los individuos
relacionados por una raza, etnicidad o familia comunes, puede
confiarse en la fiabilidad de loci polimórficos cada vez más
distanciados como indicadores de la herencia de una mutación ligada
causante de enfermedad.
Pueden diseñarse sondas apropiadas para
hibridarse con un gen específico del locus de IL-1,
tales como IL-1A, IL-1B o
IL-1RN, o un gen relacionado. Estas secuencias de
ADN genómico se muestran en las figuras 3, 4 y 5, respectivamente, y
además corresponden a las secuencias SEC ID Nos. 1, 2 y 3,
respectivamente. Alternativamente, estas sondas pueden incorporar
otras regiones del locus genómico relevante, incluyendo secuencias
intergénicas. En efecto, la región IL-1 del
cromosoma 2 humano abarca unos 400.000 pares de bases y, suponiendo
una media de un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) cada 1.000
pares de bases, incluye unos 400 loci de sólo SNPs. Sin embargo,
pueden obtenerse otros polimorfismos, disponibles para la
utilización con la invención inmediata, a partir de diversas
fuentes públicas. Por ejemplo, la base de datos del genoma humano
recoge SNPs intragénicos, puede explorarse según secuencia y hasta
el momento contiene aproximadamente 2.700 entradas
(http://hgbase.interactiva.de). También se encuentra disponible una
base de datos de polimorfismos humanos, mantenida por el
Massachusetts Institute of Technology (base de datos de SNPs de la
MIT, http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/huma/index.html)). A partir de
estas fuentes, pueden encontrarse SNPs además de otros polimorfismos
humanos.
Por ejemplo, el examen de la región
IL-1 del genoma humano en cualquiera de dichas bases
de datos revela que los genes del locus de IL-1 se
encuentran flanqueados por un marcador polimórfico proximal al
centrómero denominado marcador microsatélite AFM220ze3 a 127,4 cM
(centiMorgans) (ver GenBank No. de acceso Z17008) y un marcador
polimórfico distal denominado marcador de anclaje microsatélite
AFM087xal a 127,9 cM (ver GenBank, No. de acceso Z16545). Ambos loci
polimórficos humanos son polimorfismos microsatélite de repetición
del dinucleótido CA y, como tales, muestran un elevado grado de
heterocigosidad en las poblaciones humanas.
Por ejemplo, un alelo de AFM220ze3 genera un
producto de 211 pb de amplificación por PCR que es un cebador 5' de
la secuencia TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (SEC ID No. 4) y un cebador
3' de la secuencia TGGCCTCCAGAAACCTCCAA (SEC ID No. 5). Además, un
alelo de AFM087xal genera un producto de 177 pb de amplificación por
PCR con un cebador 5' de la secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (SEC ID
No. 6) y un cebador 3' de la secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (SEC ID
No. 7). Resultarán evidentes a un experto en la materia cebadores
equivalentes correspondientes a secuencias únicas situadas 5' y 3'
respecto a estos polimorfismos de repetición del dinucleótido CA en
el cromosoma 2 humano. Entre los cebadores equivalentes razonables
se incluyen aquellos que se hibridan dentro de aproximadamente 1 kb
del cebador indicado, y que además presentan cualquier longitud
entre aproximadamente 17 pb y aproximadamente 27 pb. Una directriz
general para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias
genómicas cromosómicas humanas únicas es que posean una temperatura
de fusión de por lo menos aproximadamente 50ºC, en la que puede
estimarse una temperatura de fusión aproximada utilizando la fórmula
T_{melt} = [2 x (nº de A o T) + 4 x (nº de G o C)].
Se encuentran varios otros loci polimórficos
humanos entre estos dos polimorfismos de repetición del dinucleótido
CA y proporcionan dianas adicionales para la determinación de un
alelo prognóstico en una familia o en otro grupo de individuos
genéticamente relacionados. Por ejemplo, el sitio de internet del
National Center for Biotechnology Information
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) lista varios marcadores de
polimorfismo en la región del locus de IL-1 y
proporciona directrices para diseñar cebadores apropiados para la
amplificación y el análisis de estos marcadores.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los
segmentos de nucleótidos de la invención pueden utilizarse por su
capacidad para formar selectivamente moléculas de doble cadena de
cromosoma 2q 12-13 humano o ADNc de esta región, o
proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o de ADNc de
esta región. El diseño de sondas apropiadas para este fin requiere
la consideración de varios factores. Por ejemplo, los fragmentos con
una longitud de entre 10, 15 ó 18 nucleótidos y aproximadamente 20,
o hasta aproximadamente 30 nucleótidos, resultará de particular
utilidad. Las secuencias más largas, por ejemplo de 40, 50, 80, 90,
100, incluso hasta la longitud completa, son todavía más preferentes
para determinadas realizaciones. Las longitudes de oligonucleótidos
de por lo menos aproximadamente 18 a 20 nucleótidos se encuentran
bien aceptadas por los expertos en la materia como suficientes para
permitir una hibridación suficientemente específica para que resulte
útil como sonda molecular. Además, dependiendo de la aplicación
contemplada, puede resultar deseable utilizar condiciones variables
de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la
sonda hacia su secuencia diana. Para las aplicaciones que requieran
una selectividad elevada, típicamente resultará deseable utilizar
condiciones relativamente restrictivas para formar los híbridos. Por
ejemplo, condiciones relativamente poco salinas y/o de temperatura
elevada, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02
M-0,15 M a temperatura de entre aproximadamente 50ºC
y aproximadamente 70ºC. Estas condiciones selectivas pueden tolerar
poca o ninguna falta de correspondencia entre la sonda y el molde o
la cadena diana.
Puede llevarse a cabo la detección o el
seguimiento de otros alelos o de otros indicios de un trastorno en
un sujeto conjuntamente con la detección de los alelos indicados
anteriormente, por ejemplo identificando el grosor de la pared del
recipiente (por ejemplo medida mediante ultrasonidos) o si el sujeto
fuma, bebe, presenta sobrepeso, estrés o realiza ejercicio.
Se encuentran disponibles muchos procedimientos
para detectar alelos específicos en loci polimórficos humanos. El
procedimiento preferente para detectar un alelo polimórfico
específico dependerá, en parte, de la naturaleza molecular del
polimorfismo. Por ejemplo, las diversas formas alélicas del locus
polimórfico pueden diferir por un solo par de bases de ADN. Estos
polimorfismos de un solo nucleótido (o SNPs) son contribuyentes
importantes de la variación genética, comprendiendo aproximadamente
el 80% de todos los polimorfismos conocidos, y su densidad en el
genoma humano se estima que de media es de 1 por cada 1.000 pares de
bases. Los SNPs más frecuentemente son bialélicos, existiendo en
sólo dos formas diferentes (aunque teóricamente son posibles hasta
cuatro formas diferentes de un SNP, correspondientes a las cuatro
bases nucleótidas diferentes que existen en el ADN). Sin embargo,
los SNPs son mutacionalmente más estables que otros polimorfismos,
haciendo que resulten adecuados para estudios de asociación en los
que se utiliza el desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una
variante desconocida para localizar las mutaciones causantes de
enfermedad. Además, debido a que los SNPs típicamente presentan
únicamente dos alelos, pueden genotiparse mediante un simple ensayo
más/menos, sin ninguna medición de longitud, haciendo que resulten
más fáciles de automatizar.
Se dispone de una diversidad de procedimientos
para la detección de la presencia de un alelo polimórfico particular
de único nucleótido en un individuo. Los avances en este campo han
proporcionado un genotipado exacto, fácil y económico a gran escala
de los SNPs. Más recientemente, por ejemplo, se han descrito varias
nuevas técnicas, incluyendo la hibridación dinámica específica de
alelo (DASH), la electroforesis diagonal en gel de microplaca matriz
(MAGDE), la pirosecuenciación, el ligamiento específico de
oligonucleótido, el sistema TaqMan, así como diversas tecnologías de
"chip" de ADN, tales como los chips de SNP de Affymetrix. Estos
procedimientos requieren la amplificación de la región genética
diana, típicamente mediante PCR. Todavía otros procedimientos recién
desarrollados, basados en la generación de moléculas de señal de
tamaño reducido mediante corte y empalme invasivo seguido de
espectrometría de masas o sondas "padlock" inmovilizadas y
amplificación por círculo rodante, podrían eliminar finalmente la
necesidad de PCR. Varios de los procedimientos conocidos en la
técnica para la detección de polimorfismos específicos de nucleótido
único se resumen posteriormente. El procedimiento de la presente
invención se entiende que incluye todos los procedimientos
disponibles.
Se han desarrollado varios procedimientos para
facilitar el análisis de polimorfismos de nucleótido único. En una
realización, el polimorfismo de base única puede detectarse mediante
la utilización de un nucleótido especializado resistente a
exonucleasa, tal como se da a conocer, por ejemplo, en Mundy, C.R.
(patente U.S. No. 4.656.127). De acuerdo con el procedimiento, se
permite que un cebador complementario a la secuencia alélica situada
inmediatamente 3' respecto al sitio polimórfico se hibride con una
molécula diana obtenida de un animal o ser humano particular. Si el
sitio polimórfico en la molécula diana contiene un nucleótido que es
complementario al derivado nucleótido resistente a exonucleasa
particular presente, ese derivado se incorporará en el extremo del
cebador hibridado. Esta incorporación hace que el cebador se
convierta en resistente a exonucleasa, y de esta manera permite su
detección. Debido a que la identidad del derivado resistente a
exonucleasa de la muestra es conocida, el resultado de que el
cebador se haya convertido en resistente a exonucleasas revela que
el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana
era complementario al del derivado nucleótido utilizado en la
reacción. Este procedimiento presenta la ventaja de que no requiere
la determinación de grandes cantidades de datos de secuencia
extraños.
En otra realización de la invención, se utiliza
un procedimiento basado en una solución para la determinación de la
identidad del nucleótido de un sitio polimórfico (Cohen, D. et
al., patente francesa 2.650.840; solicitud PCT No. WO91/02087).
Tal como en el procedimiento de Mundy de la patente U.S. No.
4.656.127, se utiliza un cebador que es complementario a las
secuencias alélicas situadas inmediatamente 3' respecto a un sitio
polimórfico. El procedimiento determina la identidad del nucleótido
de ese sitio utilizando derivados dideoxinucleótido marcados, que,
si son complementarios al nucleótido del sitio polimórfico, se
incorporan en el extremo del cebador.
Un procedimiento alternativo, conocido como
análisis de bits genéticos, o GBA^{TM}, se describe en Goelet, P.
et al. (solicitud PCT No. 92/15712). El procedimiento de
Goelet, P. et al. utiliza mezclas de terminadores marcados y
un cebador que es complementario a la secuencia 3' respecto a un
sitio polimórfico. El terminador marcado incorporado se determina de
esta manera mediante, y complementariamente a, el nucleótido
presente en el sitio polimórfico de la molécula diana bajo
evaluación. En contraste con el procedimiento de Cohen et al.
(patente francesa 2.650.840; solicitud PCT No. WO91/02087), el
procedimiento de Goelet, P. et al. preferentemente es un
ensayo en fase heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana
se inmoviliza en una fase sólida.
Recientemente, se han descrito varios
procedimientos de incorporación de nucleótidos guiados por cebador
para el ensayo de sitios polimórficos en ADN (Komher, J.S. et
al., Nucl. Acids. Res.17:7779-7784, (1989);
Sokolov, B.P., Nucl. Acids Res. 18:3671, (1990); Syvanen, A.-C.
et al., Genomics 8:684-692, (1990);
Kuppuswamy, M.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
88:1143-1147, (1991); Prezant, T.R. et al.,
Hum. Mutat. 1:159-164, (1992); Ugozzoli, L. et
al., GATA 9:107-112, (19929; Nyren, P. et
al., Anal. Biochem. 208:171-175, (1993). Estos
procedimientos difieren de GBA^{TM} en que todos se basan en la
incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre
bases en un sitio polimórfico. En este formato, debido a que la
señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados,
los polimorfismos que se producen en segmentos del mismo nucleótido
pueden resultar en señales que son proporcionales a la longitud del
segmento (Syvanen, A.-C. et al., Amer. J. Hum. Genet.
52:46-59, (1993)).
Para las mutaciones que producen la terminación
prematura de la traducción de la proteína, el ensayo de truncado de
proteína (PTT) ofrece un enfoque diagnóstico eficiente (Roest et
al., Hum. Mol. Genet. 2:1719-21, (1993); van der
Luijt et al., Genomics 20:1-4, (1994). Para
el PTT, inicialmente se aisla ARN de tejido disponible y se
transcribe inversamente, y el segmento de interés se amplifica por
PCR. Los productos de la transcripción inversa por PCR seguidamente
se utilizan como molde para la amplificación por PCR anidado con un
cebador que contiene un promotor de ARN polimerasa y una secuencia
para iniciar la traducción eucariótica. Tras la amplificación de la
región de interés, los motivos únicos incorporados en el cebador
permiten la transcripción y traducción secuenciales in vitro
de los productos PCR. Tras someter a los productos de traducción a
electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida, la aparición de señales de
polipéptido truncado señala la presencia de una mutación que causa
la terminación prematura de la traducción. En una variación de esta
técnica, el ADN (y no el ARN) se utiliza como molde para PCR cuando
la región diana de interés se derivad de un solo exón.
Puede utilizarse cualquier tipo celular o tejido
para obtener muestras de ácidos nucleicos para la utilización en los
diagnósticos descritos en la presente memoria. En una realización
preferente, la muestra de ADN se obtiene de un líquido corporal, por
ejemplo sangre, obtenido mediante técnicas conocidas (por ejemplo
punción de una vena) o saliva. Alternativamente, los ensayos de
ácidos nucleicos pueden llevarse a cabo sobre muestras secas (por
ejemplo pelo o piel). Cuando se utiliza ARN o proteína, las células
o tejidos que pueden utilizarse debe expresar un gen
IL-1.
IL-1.
Los procedimientos diagnósticos también pueden
llevarse a cabo in situ directamente sobre secciones de
tejido (fijadas y/o congeladas) de tejido de paciente obtenido a
partir de biopsias o resecciones, de manera que no resulte necesaria
la purificación de ácidos nucleicos. Pueden utilizarse reactivos
para ácidos nucleicos como sondas y/o cebadores para estos
procedimientos in situ (ver, por ejemplo, Nuovo, G.J., PCR
in situ hybridization: protocols and applications, Raven
Press, NY, 1992).
Además de los procedimientos que se centran
principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico,
también pueden evaluarse perfiles en estos esquemas de detección.
Pueden generarse perfiles de huellas genéticas, por ejemplo,
mediante la utilización de un procedimiento de expresión
diferencial, análisis northern y/o PCR-RT.
Un procedimiento de detección preferido es la
hibridación específica de alelo con sondas que se solapan con una
región de por lo menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio
IL-1 y que presentan aproximadamente 5, 10, 20, 25 ó
30 nucleótidos circundantes a la mutación o región polimórfica. En
una realización preferida de la invención, varias sondas capaces de
hibridarse específicamente con otras variantes alélicas implicadas
en la osteoporosis se unen a un soporte de fase sólida, por ejemplo
un "chip" (que puede sostener aproximadamente 250.000
oligonucleótidos). Los oligonucleótidos pueden unirse a un soporte
sólido mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo la
litografía. El análisis de detección de mutaciones utilizando estos
chips que comprenden oligonucleótidos, también denominado ("series
de sondas de ADN") se describe, por ejemplo, en Cronin et
al., Human Mutation 7:244, (1996). En una realización, un chip
comprende todas las variantes alélicas de por lo menos una región
polimórfica de un gen. A continuación, el soporte de fase sólida se
pone en contacto con un ácido nucleico de ensayo y se detecta la
hibridación con las sondas específicas. De acuerdo con ello, puede
identificarse la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o
más genes en un experimento sencillo de hibridación.
Estas técnicas también pueden comprender la
etapa de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Las
técnicas de amplificación son conocidas por los expertos en la
materia e incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la clonación, la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de
la polimerasa de alelos específicos (ASA), la reacción en cadena de
la ligasa (LCR) y la reacción en cadena anidada de la polimerasa,
replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, J.C. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878,
1990), el sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177,k
1989) y la replicasa Q-Beta (Lizardi, P.M. et
al., Bio/Technology 6:1197, 1988).
Pueden ensayarse productos de amplificación de
una diversidad de maneras, incluyendo el análisis de tamaños, la
digestión de restricción seguido del análisis de tamaños, la
detección de cebadores oligonucleótidos etiquetados específicos en
los productos de reacción, la hibridación de oligonucleótidos
específicos de alelos (ASO), la detección de exonucleasa 5'
específica de alelo, la secuenciación, la hibridación y
similares.
Los medios de detección basados en PCR pueden
incluir la amplificación multiplex de una pluralidad de marcadores
simultáneamente. Por ejemplo, es bien conocida en la técnica la
selección de cebadores para PCR para generar productos PCR que no se
solapen en tamaños y puedan analizarse simultáneamente.
Alternativamente, resulta posible amplificar diferentes marcadores
con cebadores que se marcan diferencialmente y de esta manera puede
detectarse cada uno diferencialmente. Evidentemente los medios de
detección basados en la hibridación permiten la detección
diferencial de múltiples productos PCR en una muestra. Se conocen en
la técnica otras técnicas que permiten análisis multiplex de una
pluralidad de marcadores.
En una realización meramente ilustrativa, el
procedimiento incluye las etapas de: (i) recoger una muestra de
células de un paciente, (ii) aislar ácidos nucleicos (por ejemplo,
genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en
contacto la muestra de ácidos nucleicos con uno o más cebadores que
hibriden específicamente 5' y 3' con por lo menos un alelo de un
haplotipo proinflamatorio IL-1 bajo condiciones en
las que se produzca la hibridación y la amplificación del alelo, y
(iv) detección del producto de amplificación. Esos esquemas de
detección resultan especialmente útiles para la detección de
moléculas de ácido nucleico si estas moléculas se encuentran
presentes en cantidades muy reducidas.
En una realización preferente del ensayo de la
invención, se identifica el alelo de un haplotipo proinflamatorio
IL-1 mediante alteraciones en los patrones de corte
por enzimas de restricción. Por ejemplo, se aisla ADN de muestra y
de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más
endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de los
fragmentos mediante electroforesis en gel.
En todavía otra realización, puede utilizarse
cualquiera de una diversidad de reacciones de secuenciación
conocidas en la técnica para secuenciar directamente el alelo. Entre
las reacciones de secuenciación ejemplares se incluyen aquéllas
basadas en las técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert, Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 74:560, 1977, o por Sanger (Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977). También se
contempla que pueda utilizarse cualquiera de entre una diversidad de
procedimientos automatizados de secuenciación al llevar a cabo los
ensayos de la invención (ver, por ejemplo, Biotechniques 19:448
1995), incluyendo la secuenciación mediante espectrometría de masas
(ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 94/16101; Cohen et
al., Adv. Chromatogr. 36:127-162, 1996; y
Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol.
38:147-159, 1993). Resultará evidente para un
experto en la materia que, para determinadas realizaciones,
únicamente resulta necesario determinar la aparición de una, dos o
tres de las bases del ácido nucleico. Por ejemplo, puede llevarse a
cabo un carril de A o similar, por ejemplo en el caso de que
únicamente se detecte un ácido nucleico.
En una realización adicional, puede utilizarse
la protección frente a agentes de corte y empalme (tales como una
nucleasa, hidroxilamina o tetraóxido de osmio y con piperidina) para
detectar bases desapareadas en heterodúplex de ARN/ARN o de ARN/ADN
o de ADN/ADN (Myers et al., Science 230:1242, 1985). En
general, la técnica conocida como de "corte y empalme de cadenas
desapareadas" se inicia proporcionando heterodúplex formados
mediante hibridación de ARN o de ADN (marcado) que contienen el
alelo de tipo salvaje y la muestra. Los dúplex de doble cadena se
tratan con un agente que corta y empalma regiones de una cadena del
dúplex, tales como las existentes debido a desapareamientos de pares
de bases entre las cadenas del control y de la muestra. Por ejemplo,
pueden tratarse dúplex de ARN/ADN con ARNasa y los híbridos de
ADN/ADN tratarse con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las
regiones desapareadas. En otras realizaciones, los dúplex de ADN/ADN
o de ARN/ADN pueden tratarse con hidroxilamina o con tetraóxido de
osmio y con piperidina con el fin de digerir las regiones
desapareadas. Tras la digestión de las regiones desapareadas, el
material resultante seguidamente se separa por tamaño en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida para determinar el sitio de la
mutación (ver, por ejemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:4397, 1988; y Saleeba et al., Methods Enzymol.
217:286-295, 1992). En una realización preferente,
el ADN o ARN de control puede marcarse para su detección.
En todavía otra realización, la reacción de
corte y empalme de cadenas desapareadas utiliza una o más proteínas
que reconocen los pares de bases desapareados en ADN de doble cadena
(denominados enzimas de "reparación de ADN desapareado"). Por
ejemplo, el enzima mutY de E. coli corta A en los
desapareamientos G/A y la timidina ADN glucosilasa de las células
HeLa corta T en los desapareamientos G/T (Hsu et al.,
Carcinogenesis 15:1657-1662, 1994). De acuerdo con
una realización ejemplar, una sonda basada en el alelo de un
haplotipo de locus de IL-1 se híbrida con un ADNc o
con otro producto de ADN de una o más células de ensayo. El dúplex
se trata con un enzima de reparación de desapareamientos de ADN y
los productos de corte, si hay, pueden detectarse siguiendo
protocolos de electroforesis y similares (ver, por ejemplo, la
patente U.S. No. 5.459.039).
En otras realizaciones, se utilizan alteraciones
de la movilidad electroforética para identificar un alelo de locus
de IL-1. Por ejemplo, puede utilizarse el
polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) para detectar
diferencias de movilidad electroforética entre ácidos nucleicos
mutantes y de tipo salvaje (Orita et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:2766, 1989; ver también Cotton, Mutat. Res.
285:125-144, 1993; y Hayashi, Genet. Anal. Tech.
Appl. 9:73-79, 1992). Se desnaturalizan y se dejan
renaturalizar fragmentos de ADN de cadena única de muestra y de
alelos de locus de IL-1 de control. La estructura
secundaria de los ácidos nucleicos de cadena única varía según la
secuencia, la alteración resultante de movilidad electroforética
permite la detección de incluso un solo cambio de base. Los
fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas.
La sensibilidad del ensayo puede incrementarse mediante la
utilización de ARN (y no ADN) en el que la estructura secundaria es
más sensible a un cambio de secuencia. En una realización
preferente, el procedimiento de la invención utiliza análisis de
heterodúplex para separar las moléculas de heterodúplex dedoble
cadena basándose en los cambios de movilidad electroforética (Keen
et al., Trends Genet. 7:5, 1991).
En todavía otra realización, el movimiento de
alelos en geles de poliacrilamida que contiene un gradiente de
desnaturalizante se somete a ensayo utilizando electroforesis en gel
en gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al., Nature
313:495, 1985). Cuando se utiliza DGGE como el procedimiento de
análisis, el ADN se modifica para garantizar que no se desnaturaliza
por completo, por ejemplo añadiendo una grapa de GC de
aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alto punto de fusión
mediante PCR. En una realización adicional, se utiliza un gradiente
de temperatura en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante
para identificar las diferencias de movilidad del ADN de control y
de la muestra (Rosenbaum y Reissner, Biophys. Chem. 265:12753,
1987).
Entre los ejemplos de otras técnicas para
detectar alelos se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la
hibridación selectiva de oligonucleótidos, la amplificación
selectiva, o la extensión selectiva de cebadores. Por ejemplo,
pueden prepararse cebadores oligonucleótidos en los que la mutación
conocida o la diferencia de nucleótido (por ejemplo en variantes
alélicas) se sitúa centralmente y después se híbrida con el ADN
diana bajo condiciones que permiten la hibridación únicamente si se
encuentra un apareamiento perfecto (Saiki et al., Nature
324:163, 1986; Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6230, 1989). Estas técnicas de hibridación de oligonucleótidos
específicos de alelos pueden utilizarse para someter a ensayo una
mutación o región polimórfica por reacción cuando los
oligonucleótidos se hibridan con ADN diana amplificado por PCR o con
varias mutaciones o regiones polimórficas diferentes cuando los
oligonucleótidos se unen a la membrana hibridizante y se hibridan
con ADN diana marcado.
Alternativamente, la tecnología de amplificación
específica de alelos que depende de la amplificación selectiva por
PCR puede utilizarse conjuntamente con la presente invención. Los
oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación
específica pueden llevar la mutación o región polimórfica de interés
en medio de la molécula (de manera que la amplificación depende de
la hibridación diferencial) (Gibbs et al., Nucleic Acids Res.
17:2437-2448, 1989) o en el extremo 3' de un
cebador, donde, bajo las condiciones apropiadas, el desapareamiento
puede prevenir o reducir la extensión por la polimerasa (Prossner,
Tibtech. 11:238, 1993). Además, puede resultar deseable introducir
un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para dar
lugar a una detección basada en el corte y empalme (Gasparini et
al., Mol. Cell Probes 6:1, 1992). Se preve que en determinadas
realizaciones, la amplificación también pueda llevarse a cabo
utilizando Taq ligasa para la amplificación (Barany, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:189, 1991). En estos casos, la ligación se
producirá únicamente si existe un apareamiento perfecto en el
extremo 3' de la secuencia 5', haciendo posible detectar la
presencia de una mutación conocida en un sitio específico mediante
la búsqueda de la presencia o ausencia de amplificación.
En otra realización, la identificación de la
variante alélica se lleva a cabo utilizando un ensayo de ligación de
oligonucleótido (OLA), tal como se describe, por ejemplo, en la
patente U.S. No. 4.998.617 y en Landegren, U. et al., Science
241:1077-1080, 1988. El protocolo OLA utiliza dos
oligonucleótidos que están diseñados para poder hibridarse con
secuencias protuberantes de una sola cadena de una diana. Uno de los
oligonucleótidos se encuentra unido a un marcador de separación, por
ejemplo biotinilado, y el otro se encuentra detectablemente marcado.
Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molécula
diana, los oligonucleótidos se hibridarán de manera que sus extremos
serán protuberantes, y crearán un sustrato de ligación. A
continuación, la ligación permite recuperar el oligonucleótido
marcado utilizando avidina, u otro ligando de biotina. Nickerson,
D.A. et al. han descrito un ensayo de detección de ácidos
nucleicos que combina atributos de PCR y de OLA (Nickerson, D.A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:8923-27, 1990). En este procedimiento, se utiliza
PCR para conseguir la amplificación exponencial del ADN diana, que
después se detecta utilizando OLA.
Se han desarrollado varias técnicas basadas en
este procedimiento OLA y pueden utilizarse para detectar alelos de
un haplotipo de locus de IL-1. Por ejemplo, la
patente U.S. No. 5.593.826 da a conocer un OLA que utiliza un
oligonucleótido con un grupo amino 3' y un oligonucleótido
5'-fosforilado para formar un conjugado con un
enlace fosforamidato. En otra variación de OLA descrita en Tobe
et al., Nucleic Acids Res. 24:3728, 1996, la combinación de
OLA con PCR permite el tipado de dos alelos en un solo pocillo de
microtitulación. Mediante el marcaje de cada uno de los cebadores
específicos de alelo con un único hapteno, es decir digoxigenina y
fluoresceína, puede detectarse cada reacción OLA mediante la
utilización de anticuerpos específicos de hapteno que se han marcado
con diferentes informadores enzimáticos, fosfatasa alcalina o
peroxidasa de rábano picante. Este sistema permite la detección de
los dos alelos utilizando un formato de alto rendimiento que conduce
a la producción de dos colores
diferentes.
diferentes.
También se dan a conocer kits para detectar una
predisposición a desarrollar la osteoporosis. Este kit puede
contener uno o más oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos 5'
y 3' que hibridan 5' y 3' con como mínimo un alelo de un haplotipo
del locus de IL-1. Los oligonucleótidos de
amplificación por PCR deben hibridarse separados por 25 a 2.500
pares de bases, preferentemente separados por aproximadamente 100 a
aproximadamente 500 pares de bases, con el fin de producir un
producto PCR de tamaño conveniente para el análisis posterior.
Entre los cebadores particularmente preferentes
para la utilización en el procedimiento diagnóstico de la
invención se incluyen las secuencias SEC ID Nos.
1-6.
El diseño de oligonucleótidos adicionales para
la utilización en la amplificación y detección de alelos
polimórficos IL-1 mediante el procedimiento de la
invención se ve facilitado por la disponibilidad de información
actualizada de secuencia del cromosoma 2q13 humano, que contiene el
locus de IL-1 humano, y de información actualizada
sobre polimorfismos humanos disponibles para este locus. Por
ejemplo, la secuencia de ADN para IL-1A,
IL-1B e IL-1RN se muestra en las
figuras 1 (GenBank No. de acceso X03833), 2 (GenBank No. de acceso
X04500) y 3 (GenBank No. de acceso X64532), respectivamente. Los
cebadores adecuados para la detección de un polimorfismo humano en
estos genes pueden diseñarse fácilmente utilizado esta información
de secuencia y técnicas estándar conocidas en la técnica para el
diseño y optimización de secuencias de cebadores. El diseño óptimo
de estas secuencias de cebador puede conseguirse, por ejemplo,
mediante la utilización de programas de selección de cebadores
disponibles comercialmente, tales como Primer 2.1, Primer 3 o
GeneFisher (ver también Nicklin, M.H.J., Weith, A., Duff, G.W., "A
Physical Map of the Region Encompassing the Human
Interleukin-1\alpha,
Interleukin-1\beta and
Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes",
Genomics 19:382, (1995); Nothwang, H.G. et al., "Molecular
Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster:
Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial
transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13", Genomics
41:370, (1997); Clark et al., Nucl. Acids Res.
14:7897-7914, (1986) (aparece una fe de errata
publicada en Nucleic Acids Res. 15:868, (1987) y en el projecto
Genome Database (GDB) en la URL,
http://www.gdb.org).
http://www.gdb.org).
Para la utilización en un kit, los
oligonucleótidos pueden ser de cualesquiera de entre una diversidad
de composiciones naturales y/o sintéticas, tales como
oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restricción, ADNcs,
ácidos nucleicos peptídicos de síntesis (PNAs) y similares. El kit
de ensayo y el procedimiento también puede utilizar oligonucleótidos
marcados para permitir una fácil identificación en los ensayos.
Entre los ejemplos de marcajes que pueden utilizarse se incluyen los
marcajes radioactivos, enzimas, compuestos fluorescentes,
estreptavidina, avidina, biotina, grupos magnéticos, grupos de unión
a metales, grupos de antígeno o de anticuerpo, y similares.
Opcionalmente, el kit también puede incluir
medios de muestreo de ADN. Los medios de muestreo de ADN son bien
conocidos por el experto en la materia y pueden incluir, aunque sin
limitarse a ellos, sustratos tales como papeles de filtro, el
AmpliCard^{TM} (University of Sheffield, Sheffield, Inglaterra S10
2JF; Tarlow, J.W. et al., J. of Invest. Dermatol.
103:387-389, (1994)) y similares; reactivos de
purificación de ADN, tales como kits Nucleon^{TM}, tampones de
lisis, soluciones de proteinasa y similares; reactivos para PCR,
tales como tampones de reacción 10x, polimerasa termoestable, dNTPs
y similares; y medios de detección de alelos, tales como enzima de
restricción HinfI, oligonucleótidos específicos de alelos, cebadores
oligonucleótidos degenerados para PCR anidada a partir de sangre
seca.
El conocimiento de un alelo particular asociado
con una susceptibilidad a desarrollar osteoporosis, solo o
conjuntamente con información sobre otros defectos genéticos que
contribuyen al mismo estado, permite un ajuste de la prevención o
del tratamiento de acuerdo con el perfil genético del individuo, el
objetivo de la "farmacogenómica". De esta manera, la
comparación del perfil de IL-1 de un individuo con
el perfil de la población para la osteoporosis, permite la selección
o diseño de fármacos o de otros regímenes terapéuticos que se espera
que resulten seguros o eficaces para un paciente particular o
población de pacientes (es decir, un grupo de pacientes con la misma
alteración genética).
Además, la capacidad de centrarse en poblaciones
que previsiblemente manifestarán el máximo beneficio clínico,
basándose en su perfil genético, puede permitir: 1) el
reposicionamiento de fármacos ya comercializados; 2) el rescate de
candidatos farmacológicos cuyo desarrollo clínico ha sido
interrumpido como resultado de limitaciones de seguridad o de
eficacia específicas de determinados subgrupos de pacientes; y 3) un
desarrollo acelerado y menos costoso de la terapia de los candidatos
y un etiquetaje más óptimo de los fármacos (por ejemplo debido a que
la medición del efecto de diversas dosis de un agente sobre la
mutación causativa resulta útil para optimizar la dosis
efectiva).
efectiva).
El tratamiento de un individuo con un agente
terapéutico particular puede someterse a seguimiento determinando el
nivel de proteínas (por ejemplo IL-1\alpha,
IL-1\beta o IL-1Ra), de ARNm y/o
de transcripción. Dependiendo del nivel detectado, puede mantenerse
el régimen terapéutico o ajustarse (incrementarse o reducirse la
dosis). En una realización preferente, la efectividad del
tratamiento de un sujeto con un agente comprende las etapas de: (i)
obtener una muestra de preadministración de un sujeto previamente a
la administración del agente; (ii) detectar el nivel o cantidad de
una proteína, ARNm o ADN genómico en la muestra de
preadministración; (iii) obtener una o más muestras posteriormente a
la administración en el sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión
o de actividad de la proteína, de ARNm o de ADN genómico en la
muestra postadministración; (v) comparar el nivel de expresión o de
actividad de la proteína, del ARNm o del ADN genómico en la muestra
de postadministración, respectivamente; y (vi) alterar la
administración del agente al sujeto de acuerdo con lo anteriormente
expuesto.
Las células de un sujeto también pueden
obtenerse antes y después de la administración de un agente
terapéutico con el fin de detectar el nivel de expresión de genes
aparte del gen de IL-1 para verificar que el agente
terapéutico no incrementa o reduce la expresión de genes que podrían
resultar deletéreos. Ello puede llevarse a cabo, por ejemplo,
mediante la utilización del perfilado transcripcional. De esta
manera, el ARNm procedente de células expuestas in vivo a un
agente terapéutico y el ARNm procedente del mismo tipo de células no
expuestas al agente terapéutico podría transcribirse inversamente e
hibridarse con un chip que contiene ADN procedente de numerosos
genes, para de esta manera comparar la expresión de genes en células
tratadas y no tratadas con el agente terapéutico.
La terapia de la osteoporosis se refiere a
cualquier agente o régimen terapéutico (incluyendo fármacos,
nutracéuticos y medios quirúrgicos) que previene o retrasa el
desarrollo de la osteoporosis en el sujeto o que alivia los síntomas
de la misma. El agente terapéutico puede ser un polipéptido,
peptidomimético, ácido nucleico u otra molécula inorgánica u
orgánica, preferentemente una "molécula de tamaño reducido",
incluyendo vitaminas, minerales y otros nutrientes. Preferentemente
el agente terapéutico puede modular por lo menos una actividad de un
polipéptido IL-1, por ejemplo la interacción con un
receptor, mimetizando o potenciando (agonizando) o inhibiendo
(antagonizando) los efectos de un polipéptido de origen natural. Un
agonista puede ser una proteína de tipo salvaje o un derivado de la
misma que presente por lo menos una bioactividad de, por ejemplo, la
actividad de tipo salvaje de unión al receptor. Un agonista también
puede ser un compuesto que regula positivamente la expresión de un
gen o que incrementa por lo menos una bioactividad de una proteína.
Un agonista también puede ser un compuesto que incrementa la
interacción de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo un
receptor. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o reduce
la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo un
receptor o un agente que bloquea la transducción de señales o el
procesamiento post-traduccional (por ejemplo el
inhibidor del enzima conversor de la IL-1 (ICE)). De
acuerdo con ello, un antagonista preferente es un compuesto que
inhibe o reduce la unión a un receptor y de esta manera bloquea la
activación posterior del receptor. Un antagonista también puede ser
un compuesto que regula negativamente la expresión de un gen o que
reduce la cantidad presente de una proteína. El antagonista puede
ser una forma negativa dominante de un polipéptido, por ejemplo una
forma de un polipéptido que es capaz de interaccionar con un péptido
diana, por ejemplo un receptor, pero que no estimule la activación
del receptor. El antagonista también puede ser un ácido nucleico
codificante de una forma negativa dominante de un polipéptido, un
ácido nucleico antisentido, o un ribozima capaz de interaccionar es
pecíficamente con un ARN. Todavía otros antagonistas son molécula
que se unen a un polipéptido einhiben su acción. Entre estas
moléculas se incluyen péptidos, por ejemplo formas de péptidos diana
que no presentan actividad biológica, y que inhiben la unión a
receptores. De esta manera, estos péptidos se unen al sitio activo
de una proteína e impiden que ésta interaccione con los péptidos
diana. Entre todavía otros antagonistas se incluyen anticuerpos que
interaccionan específicamente con un epítopo de una molécula, de
manera que la unión interfiere con la función biológica del
polipéptido. En todavía otra realización preferente, el antagonista
es una molécula de tamaño reducido, tal como una molécula capaz de
inhibir la interacción entre un polipéptido y un receptor diana.
Alternativamente, la molécula de tamaño reducido puede funcionar
como un antagonista mediante la interacción con otros sitios aparte
del sitio de unión al
receptor.
receptor.
Los moduladores de IL-1 (por
ejemplo antagonista de receptor de IL-1\alpha,
IL-1\beta o IL-1) o una proteína
codificada por un gen que se encuentra en desequilibrio de
ligamiento con un gen de IL-1 puede comprender
cualquier tipo de compuesto, incluyendo una proteína, péptido,
peptidomimético, molécula de tamaño reducido o ácido nucleico. Entre
los agonistas preferentes se incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo
codificantes de una proteína IL-1 o un gen que
resulta regulado positiva o negativamente por una proteína
IL-1), proteínas (por ejemplo proteínas
IL-1 o una proteína que resulta regulada positiva o
negativamente por la misma) o una molécula de tamaño reducido (por
ejemplo que regula la expresión o la unión de una proteína
IL-1). Entre los antagonistas preferentes, que
pueden identificarse, por ejemplo, utilizando los ensayos descritos
en la presente memoria, se incluyen los ácidos nucleicos (por
ejemplo el ADN o el PNA de cadena única (antisentido) o de doble
cadena (tríplex) y los ribozimas), proteínas (por ejemplo
anticuerpos) y moléculas de tamaño reducido que actúan suprimiendo o
inhibiendo la transcripción de IL-1 y/o la actividad
de la proteína.
Puede determinarse la toxicidad y la eficacia
terapéutica de dichos compuestos mediante procedimientos
farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales
experimentales, por ejemplo para determinar la LD_{50} (la dosis
letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis
terapéuticamente efectiva para el 50% de la población). La
proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los efectos
terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la
relación LD_{50}/ED_{50}. Los compuestos que muestran índices
terapéuticos elevados resultan preferentes. Aunque pueden utilizarse
compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe procurarse
el diseño de un sistema de administración que dirija estos
compuestos al sitio de los tejidos afectados con el fin de minimizar
el daño potencial a las células no infectadas y, de esta manera,
reduzca los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de ensayos en cultivo
celular y de los estudios animales pueden utilizarse para formular
un intervalo de dosificación en la utilización en seres humanos. La
dosis de estos compuestos se encuentra comprendida preferentemente
en un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la
ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro
de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada
y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto
utilizado en el procedimiento de la invención, la dosis
terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de
ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos
animales para conseguir una concentración circulante en plasma que
incluye la IC_{50} (es decir, la concentración del compuesto de
ensayo que alcance la mitad de la inhibición máxima de los síntomas)
según se determine en cultivo celular. Esta información puede
utilizarse para determinar con más exactitud las dosis útiles en
seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma por ejemplo
mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento.
rendimiento.
Las composiciones para la utilización de acuerdo
con la presente invención pueden formularse de manera convencional
utilizando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente
aceptables. De esta manera, los compuestos y sus sales y solvatos
fisiológicamente aceptables pueden formularse para la administración
mediante, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflado (a través
de la boca o de la nariz) o mediante la administración oral, bucal,
parenteral o rectal.
Para dicha terapia, los compuestos de la
invención pueden formularse para una diversidad de cargas de
administración, incluyendo la administración sistémica y la tópica o
localizada. Las técnicas y formulaciones pueden encontrarse de
manera general en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade
Publishing Co., Easton, PA. Para la administración sistémica,
resulta preferente la inyección, incluyendo la intramuscular,
intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, los
compuestos de la invención pueden formularse en soluciones líquidas,
preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como
solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden
formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse
inmediatamente antes de su utilización. También se incluyen las
formas liofilizadas.
Para la administración oral, las composiciones
pueden adoptar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas
preparadas por medios convencionales con excipientes
farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ligantes (por
ejemplo almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o
hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (por ejemplo lactosa, celulosa
microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por
ejemplo estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por
ejemplo almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes
humectantes (por ejemplo lauril sulfato sódico). Las tabletas pueden
recubrirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Las
preparaciones líquidas para la administración oral pueden adoptar la
forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden
presentarse en forma de producto seco para la constitución con agua
u otro vehículo adecuado previamente a la utilización. Estas
preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales
con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de
suspensión (por ejemplo jarabe de sorbitol, derivados de la celulosa
o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por
ejemplo lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo aceite
de ationd, ésteres aceitosos, alcohol etílico, aceites vegetales
fraccionados); y conservantes (por ejemplo metil o
propil-p-hidroxibenzoatos o ácido
sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales
tamponadoras, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según
resulte
apropiado.
apropiado.
Las preparaciones para la administración oral
pueden formularse convenientemente para proporcionar una liberación
controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, la
composición puede adoptar la forma de tabletas o pastillas
formuladas de manera convencional. Para la administración por
inhalación, los compuestos para la utilización de acuerdo con la
presente invención se administran convenientemente en la forma de
una presentación de pulverizador de aerosol desde paquetes
presurizados o desde un nebulizador, utilizando un propelente
adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede
determinarse proporcionando una válvula para administrar una
cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina
para la utilización en un inhalador o insuflador pueden formularse
conteniendo una mezcla de polvos del compuesto y una base de polvos
adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para la
administración parenteral mediante inyección, por ejemplo mediante
inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para
inyección pueden presentarse en formas de dosis unitaria, por
ejemplo en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante
añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como
suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o
acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como
agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma
de polvos para la reconstitución con un vehículo adecuado, por
ejemplo agua estéril libre de pirógenos, previamente a su
utilización.
Los compuestos también pueden formularse en
composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de
retención, por ejemplo que contienen bases de supositorio
convencionales, tales como manteca de cacao u otros
glicéridos.
glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos también pueden formularse como
preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada
pueden administrarse mediante implante (por ejemplo subcutánea o
intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta
manera, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales
poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una mulsión
en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio iónico, o
derivados escasamente solubles, por ejemplo en forma de sal
escasamente soluble. Entre otros sistemas de administración
adecuados se incluyen microesferas que ofrecen la posibilidad de
administrar fármacos localmente de manera no invasiva a lo largo de
un periodo de tiempo prolongado. Esta tecnología utiliza
microesferas de tamaño precapilar que pueden inyectarse a través de
un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de, por
ejemplo, corazón u otros órganos sin causar inflamación o isquemia.
El agente terapéutico administrado se libera lentamente de estas
microesferas y se incorpora en las células del tejido circundante
(por ejemplo células endoteliales).
La administración sistémica también puede
realizarse por medios transmucosales o transdérmicos. Para la
administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la
formulación agentes penetrantes apropiados a la barrera a permear.
Estos agentes penetrantes son conocidos generalmente en la técnica e
incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, sales
biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden utilizarse
detergentes para facilitar la permeación. La administración
transmucosal puede ser a través de pulverizadores nasales o mediante
supositorios. Para la administración tópica, los oligómeros de la
invención se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas, tal
como se conocen generalmente en la técnica. Puede utilizarse una
solución de lavado localmente para tratar una lesión o inflamación
con el fin de acelerar la curación.
Las composiciones pueden presentarse, si se
desea, en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener
una o más formas de dosificación unitaria que contienen el
ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lámina
de metal o de plástico, tal como un paquete blíster. El paquete o
dispositivo dispensador puede acompañarse con instrucciones para la
administración.
Basándose en la identificación de mutaciones que
causan o contribuyen al desarrollo de la osteoporosis, la invención
incluye además ensayos basados en células o libres de células para
la identificación de agentes terapéuticos. En una realización, se
incuba una célula que expresa un receptor de IL-1, o
un receptor de una proteína codificada por un gen que se encuentra
en desequilibrio de ligamiento con un gen de IL-1
situada en la superficie externa de su membrana celular, en
presencia de un compuesto de ensayo únicamente o en presencia de un
compuesto de ensayo y de otra proteína, y se detecta la interacción
entre el compuesto de ensayo y el receptor, o entre la proteína
(preferentemente una proteína etiquetada) y el receptor, por ejemplo
mediante la utilización de un microfisiómetro (McConnell et
al., Science 257:1906, 1992). Se detecta una interacción entre
el receptor y el compuesto de ensayo o la proteína con el
microfisiómetro en forma de cambio en la acidez del medio. Este
sistema de ensayo proporciona de esta manera un medio para
identificar los antagonistas moleculares que, por ejemplo, funcionan
interfiriendo en las interacciones
proteína-receptor, así como los agonistas
moleculares que funcionan, por ejemplo, activando un
receptor.
receptor.
Los ensayos celulares o libres de células
también pueden utilizarse para identificar compuestos que modulan la
expresión de un gen de IL-1 o un gen en
desequilibrio de ligamiento con el mismo, modular la traducción de
un ARNm, o que modulan la estabilidad de un ARNm o proteína. De
acuerdo con ello, en una realización, una célula que es capaz de
producir un IL-1, u otra proteína, se incuba con un
compuesto de ensayo y se mide la cantidad de proteína producida en
el medio celular y se compara con la producida a partir de una
célula que no se ha puesto en contacto con el compuesto de ensayo.
La especificidad del compuesto frente a la proteína puede
confirmarse mediante diversos análisis de control, por ejemplo
midiendo la expresión de uno o más genes de control. En particular,
este ensayo puede utilizarse para determinar la eficacia de los
compuestos antisentido, ribozimas y tríplex.
Los ensayos libres de células también pueden
utilizarse para identificar compuestos capaces de interaccionar con
una proteína, modificando de esta manera la actividad de la
proteína. Este compuesto puede, por ejemplo, modificar la estructura
de una proteína, afectando de esta manera a su capacidad para unirse
a un receptor. En una realización preferente, los ensayos libres de
células para identificar estos compuestos consisten esencialmente en
una mezcla de reacción que contiene una proteína y un compuesto de
ensayo, o una biblioteca de compuestos de ensayo en presencia o en
ausencia de una pareja de unión. Un compuesto de ensayo puede ser,
por ejemplo, una derivado de una pareja de unión, por ejemplo un
péptido diana biológicamente inactivo o una molécula de tamaño
reducido.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, un
ensayo ejemplar de cribado de la presente invención incluye las
etapas de poner en contacto una proteína o fragmento funcional de la
misma con un compuesto de ensayo o biblioteca de compuesto de
ensayo, y detectar la formación de complejos. Para los fines de
detección, la molécula puede marcarse con un marcador específico y
el compuesto de ensayo o biblioteca de compuestos de ensayos
marcarse con un marcador diferente. La interacción de un compuesto
de ensayo con una proteína o fragmento de la misma puede detectarse
entonces determinando el nivel de los dos marcajes tras una etapa de
incubación y una etapa de lavado. La presencia de dos marcajes tras
la etapa de lavado es indicativa de una interacción.
También puede identificarse una interacción
entre moléculas mediante la utilización de BIA en tiempo real
(Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB), que
detecta resonancia de plasmón superficial (SPR), un fenómeno óptico.
La detección depende de cambios en la concentración másica de
macromoléculas en la interfase bioespecífica, y no requiere ningún
marcaje de los interactantes. En una realización, puede
inmovilizarse una biblioteca de compuestos de ensayo sobre una
superficie de detección, por ejemplo, que forma una pared de una
celda de microflujo. A continuación, se hace fluir continuamente
sobre la superficie del sensor una solución que contiene la proteína
o un fragmento funcional de la misma. Un cambio en el ángulo de
resonancia según se muestra en un registro de señales indica que se
ha producido una interacción. Esta técnica se describe
adicionalmente, por ejemplo, en BIAtechnology Handbook, de
Pharmacia.
Otro ensayo ejemplar de cribado de la presente
invención incluye las etapas de: (a) formar una mezcla de reacción
que incluye: (i) una IL-1 u otra proteína, (ii) un
receptor apropiado, y (iii) un compuesto de ensayo; y (b) detectar
la interacción de la proteína y el receptor. Un cambio
estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) en la
interacción de la proteína y el receptor en presencia del compuesto
de ensayo, comparado con la interacción en ausencia del mismo,
indica que se trata de un antagonista potencial (inhibidor). Los
compuestos de este ensayo pueden ponerse en contacto
simultáneamente. Alternativamente, puede ponerse en contacto en
primer lugar una proteína con un compuesto de ensayo durante un
periodo de tiempo apropiado, después de lo cual se añade el
receptor a la mezcla de reacción. La eficacia del compuesto puede
evaluarse generando curvas de dosis-respuesta a
partir de los datos obtenidos utilizando diversas concentraciones
del compuesto de ensayo. Además, también puede llevarse a cabo un
ensayo de control para proporcionar una línea de base para la
comparación.
Puede detectarse la formación de complejo entre
una proteína y un receptor mediante una diversidad de técnicas. La
modulación de la formación de complejos puede cuantificarse
utilizando, por ejemplo, proteínas marcadas detectablemente, tales
como proteínas o receptores marcadas radioactivamente, marcadas
fluorescentemente o marcadas enzimáticamente, mediante inmunoensayo
o mediante detección cromatográfica.
Típicamente resulta deseable movilizar la
proteína o el receptor para facilitar la separación de complejos y
formas no acomplejadas de una o ambas proteínas, así como para
permitir la automatización del ensayo. La unión de proteína y
receptor puede conseguirse en cualquier recipiente adecuado para
contener los reactivos. Entre los ejemplos se incluye placas de
microtitulación, probetas de ensayo y tubos de microcentrifugación.
En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que
añada un dominio que permita que la proteína se una a una matriz.
Por ejemplo, las proteínas de fusión
glutatión-S-transferasa pueden
adsorberse sobre perlas de glutatión-sefarosa
(Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación
derivatizadas con glutatión, que seguidamente se combinan con el
receptor, por ejemplo un receptor marcado con ^{35}S, y el
compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba bajo condiciones que
conducen a la formación de complejos, por ejemplo bajo condiciones
fisiológicas de sal y pH, aunque pueden resultar deseables
condiciones ligeramente más restrictivas. Tras la incubación, las
perlas se lavan para eliminar cualquier marcaje no unido, y la
matriz se inmoviliza y se determina directamente el marcaje
radioactivo (por ejemplo se introducen las perlas en solución de
centelleo) o en el sobrenadante tras disociar los complejos.
Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz,
separarse mediante SDS-PAGE, y cuantificarse el
nivel de proteína o de receptor en la fracción de perlas en el gel
utilizando técnicas electroforéticas estándar, tales como las
descritas en los ejemplos adjuntos. También se encuentran
disponibles otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices
para la utilización en el ensayo de la invención. Por ejemplo, puede
inmovilizarse la proteína o el receptor mediante conjugación de
biotina o de estreptavidina. También puede hacerse que animales
transgénicos identifiquen los agonistas y antagonistas, o que
confirmen la seguridad y la eficacia de un candidato a agente
terapéutico. Entre los animales transgénicos de la invención pueden
incluirse animales no humanos que contienen una mutación causativa
de restenosis bajo el control de un promotor endógeno apropiado o
bajo el control de un promotor
heterólogo.
heterólogo.
Los animales transgénicos también pueden ser
animales que contienen un transgén, tal como un gen informador, bajo
el control de un promotor apropiado o fragmento del mismo. Estos
animales resultan útiles, por ejemplo, para identificar fármacos que
modulan la producción de una proteína IL-1, tal como
mediante modulación de la expresión génica. Los procedimientos para
la obtención de animales transgénicos no humanos son bien conocidos
en la técnica. En las realizaciones preferentes, la expresión de la
mutación causativa se restringe a subconjuntos específicos de
células, tejidos o estadios del desarrollo utilizando, por ejemplo,
secuencias que actúan en cis que controlan la expresión en el
patrón deseado. En la presente invención, esta expresión en mosaico
de una proteína puede resultar esencial para muchas formas de
análisis de linaje y adicionalmente puede proporcionar un medio para
evaluar los efectos de, por ejemplo, el nivel de expresión que
podría alterar gravemente el desarrollo en parches de tamaño
reducido de tejido dentro de un embrión aparte de ello, normal. Con
este fin, pueden utilizarse secuencias reguladoras específicas de
tejido y secuencias reguladoras condicionales para controlar la
expresión de la mutación en determinados patrones especiales.
Además, pueden proporcionarse patrones temporales de expresión
mediante, por ejemplo, sistemas de recombinación condicional o
secuencias reguladoras de la transcripción en procariotas. Los
expertos en la materia conocen técnicas genéticas que permiten la
expresión de una mutación que puede regularse mediante la
manipulación genética in vivo específica de sitio.
La totalidad de los animales transgénicos de la
presente invención incluyen dentro de una pluralidad de sus células,
un transgén mutado causativo de la presente invención que altera el
fenotipo de la "célula huésped". En una realización
ilustrativa, el sistema de recombinasa Cre/loxP del
bacteriófago P1 (Lakso et al., PNAS
89:6232-6236, 1992; Orban et al., PNAS
89:6861-6865, 1992) o el sistema recombinasa FLP de
Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al.,
Science 251:1351-1355, 1991; publicación PCT
WO 92/15694) puede utilizarse para generar sistemas de recombinación
genética in vivo específicos de sitio. La recombinasa Cre
cataliza la recombinación específica de sitio de una secuencia
diana intermedia situada entre las secuencias loxP. Las
secuencias loxP son secuencias de repetición de nucleótidos
de 34 pares de bases a las que se une la recombinasa Cre y que
resultan necesarias para la recombinación genética mediada por la
recombinasa Cre. La orientación de las secuencias loxP
determina si la secuencia diana intermedia se extrae o se invierte
en presencia de la recombinasa Cre (Abremski et al., J.
Biol. Chem. 259:1509-1514, 1984), catalizando la
extracción de la secuencia diana cuando las secuencias loxP
se orientan como repeticiones directas, y cataliza la inversión de
la secuencia diana cuando las secuencias loxP se orientan
como repeticiones
invertidas.
invertidas.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la
recombinación genética de la secuencia diana depende de la expresión
de la recombinasa Cre. La expresión de la recombinasa puede
regularse con elementos promotores sometidos a control regulado, por
ejemplo específico de tejido, específico de estadio del desarrollo,
inducible o reprimible con agentes añadidos externamente. Este
control regulado resulta en la recombinación genética de la
secuencia diana únicamente en células en las que la expresión de
recombinasa se encuentra mediada por el elemento promotor. De esta
manera, la activación de la expresión del transgén mutado causativo
puede regularse a través del control de la expresión de la
recombinasa.
La utilización del sistema de recombinasa
Cre/loxP para regular la expresión de un transgén mutado
causativo requiere la construcción de un animal transgénico que
contenga transgenes codificantes tanto de la recombinasa Cre como de
la proteína de la invención. Los animales que contienen tanto la
recombinasa Cre y el transgén mutado causativo de restenosis pueden
obtenerse mediante la construcción de animales "doblemente"
transgénicos. Un procedimiento conveniente para obtener estos
animales es cruzar dos animales transgénicos cada uno de los cuales
contiene un transgén.
Pueden proporcionarse transgenes condicionales
similares utilizando secuencias promotoras procarióticas que
requieren proteínas procarióticas que deben expresarse
simultáneamente con el fin de facilitar la expresión del transgén.
Se proporcionan promotores ejemplares y las proteínas procarióticas
trans-activadores correspondientes en la patente
U.S. No. 4.833.080.
Además, la expresión de los transgenes
condicionales puede inducirse por procedimientos génicos similares a
terapia en los que un gen que codifica la proteína transactivadora,
por ejemplo una recombinasa o una proteína procariótica, se
administra en el tejido y se provoca que se exprese, tal como de una
manera específica de un tipo celular. Mediante este procedimiento,
el transgén podría permanecer en letargo hasta la adultez, hasta su
"activación" al introducir el transactivador.
En una realización ejemplar, los "animales
transgénicos no humanos" de la invención se producen mediante la
introducción de transgenes en la línea germinal del animal no
humano. Pueden utilizarse células diana embrionarias en diversos
estadios del desarrollo para introducir los transgenes. Se utilizan
diferentes procedimientos dependiendo del estadio del desarrollo de
la célula diana embrionaria. La línea o líneas específicas de
cualquier animal utilizado para la práctica de la presente invención
se seleccionan por su buena salud general, buenos rendimientos de
embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión, y buena forma
reproductiva. Además, el haplotipo es un factor significativo. Por
ejemplo, cuando deben producirse ratones transgénicos, con
frecuencia se utilizan cepas tales como las líneas C57BL/6 o FVB
(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Son cepas preferentes aquellas
con los haplotipos H-2^{b},
H-2^{d} o H-2^{q}, tales como
C57BL/6 o DBA/1. La línea o líneas utilizadas para la práctica de la
presente invención pueden ser ellas mismas transgénicas y/o pueden
ser knockouts (es decir, obtenidas de animales en los que se han
suprimido parcial o totalmente uno o más genes).
En una realización, el constructo transgén se
introduce en un embrión de único estadio. El cigoto es la mejor
diana para la microinyección. En el ratón, el pronúcleo masculino
alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro que
permite la inyección reproducible de 1-2 pl de
solución de ADN. La utilización de cigotos como diana para la
transferencia génica presenta una ventaja importante en que en la
mayoría de casos, el ADN inyectado se incorporará en el gen huésped
antes de su primera división (Brinster et al., PNAS
82:4438-4442, 1985). Como consecuencia, todas las
células del animal transgénica portarán el transgén incorporado.
Ello también se reflejará en general en la transmisión eficiente del
transgén a la progenie del fundador debido a que el 50% de las
células germinales contendrán el transgén.
Normalmente, los embriones fertilizados se
incuban en medios adecuados hasta que aparecen los pronúcleos.
Aproximadamente en este momento, la secuencia nucleótida que
comprende el transgén se introduce en el pronúcleo femenino o
masculino tal como se ha descrito anteriormente. En algunas
especies, tal como el ratón, resulta preferente el pronúcleo
masculino. Resulta más preferente que el material genético exógeno
se añada al ADN masculino de complemento del cigoto previamente a su
procesamiento por el núcleo del óvulo o el pronúcleo femenino del
cigoto. Se cree que el núcleo del óvulo o el pronúcleo femenino
liberan moléculas que afectan al complemento de ADN masculino ,
quizás mediante sustitución de las protaminas del ADN masculino por
histonas, facilitando de esta manera la combinación de los
complementos de ADN femenino y masculino para formar el cigoto
diploide. De esta manera, resulta preferente que el material
genético exógeno se añada al complemento masculino de ADN o a
cualquier otro complemento de ADN previamente a que se vea afectado
por el pronúcleo femenino. Por ejemplo, se añade el material
genético exógeno al pronúcleo masculino temprano tan pronto como
resulte posible después de la formación del pronúcleo masculino, que
es cuando los pronúcleos masculino y femenino se encuentran bien
separados y se encuentran situados cerca de la membrana celular.
Alternativamente, puede añadirse el material genético exógeno al
núcleo del esperma tras inducir que inicie su descondensación. El
esperma que contiene el material genético exógeno seguidamente puede
añadirse al óvulo o puede añadirse el esperma descondensado al óvulo
añadiendo los constructos de transgén tan pronto como resulte
posible posteriormente.
La introducción de la secuencia nucleótida del
transgén en el embrión puede llevarse a cabo por cualquier medio
conocido de la técnica tal como, por ejemplo, la microinyección, la
electroporación o la lipofección. Tras la introducción de la
secuencia nucleótida del transgén en el embrión, éste puede
incubarse in vitro durante cantidades variables de tiempo, o
reimplantarse en el huésped sustitutivo, o ambos. La incubación
in vitro hasta la madurez se encuentra dentro del alcance de
la presente invención. Un procedimiento común es incubar los
embriones in vitro durante aproximadamente 1 a 7 días,
dependiendo de la especie, y después reimplantarlos en el huésped
sustitutivo.
Para los fines de la presente invención un
cigoto es esencialmente la formación de una célula diploide que es
capaz de desarrollarse en un organismo completo. Generalmente el
cigoto comprende un huevo que contiene un núcleo formado, natural o
artificialmente, por la fusión de dos núcleos haploides de un gameto
o gametos. De esta manera, los núcleos de los gametos deben ser
naturalmente compatibles, es decir, unos que resulten en un cigoto
viable capaz de diferenciarse y desarrollarse hasta formar un
organismo funcional. Generalmente, resulta preferente un cigoto
euploide. Si se obtiene un cigoto aneuploide, el número de
cromosomas no debe variar en más de uno con respecto al número
euploide del organismo del que se ha originado cualquiera de los dos
gametos.
Además de consideraciones biológicas similares,
las físicas también rigen la cantidad (por ejemplo el volumen) de
material genético exógeno que puede añadirse al núcleo del cigoto o
al material genético que forma una parte del núcleo del cigoto. Si
no se extrae material genético, la cantidad de material genético
exógeno que puede añadirse se encuentra limitada por la cantidad que
puede absorberse sin resultar físicamente disruptiva. Generalmente,
el volumen de material genético exógeno insertado no excede
aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de la adición no
deben ser tan grandes que destruyan físicamente la viabilidad del
cigoto. El límite biológico del número y diversidad de las
secuencias de ADN variará dependiendo del cigoto particular y de las
funciones del material genético exógeno, y resultarán fácilmente
evidentes para el experto en la materia, debido a que el material
genético, incluyendo el material genético exógeno, del cigoto
resultante debe ser biológicamente capaz de iniciar y de mantener la
diferenciación y el desarrollo del cigoto para formar un organismo
funcional.
\newpage
El número de copias de los constructos de
transgén que se añaden al cigoto depende de la cantidad total de
material genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que
se produzca la transformación genética. En teoría, sólo se requiere
una copia; sin embargo, generalmente se utilizan numerosas copias,
por ejemplo 1.000 a 20.000 copias del constructo de transgén, con el
fin de garantizar que una copia es funcional. Respecto a la presente
invención, con frecuencia existirá una ventaja en disponer de más de
una copia funcional de cada una de las secuencias insertadas de ADN
exógeno en el incremento de la expresión fenotípica de la secuencia
de ADN exógeno.
Puede utilizarse cualquier técnica que permita
la adición del material genético exógeno en el material genético de
los núcleos con la condición de que no resulte destructiva para la
célula, para la membrana nuclear o para otras estructuras celulares
o genéticas existentes. El material genético exógeno preferentemente
se inserta en el material genético de los núcleos mediante
microinyección. La microinyección de células y de estructuras
celulares es conocida y se utiliza en la técnica.
La reimplantación se consigue utilizando
procedimientos estándar. Habitualmente, se anestesia el huésped
sustitutivo, y los embriones se insertan en el oviducto. El número
de embriones implantado en un huésped particular varía según
especie, pero habitualmente es comparable al número de progenie que
produce la especie naturalmente.
La progenie transgénica del huésped sustitutivo
puede cribarse para la presencia y/o expresión del transgén mediante
cualquier procedimiento adecuado. El cribado con frecuencia se
consigue mediante análisis de transferencia southern o northern
utilizando una sonda que es complementaria a por lo menos una parte
del transgén. El análisis de transferencia western utilizando un
anticuerpo contra la proteína codificada por el transgén puede
utilizarse como alternativa o como procedimiento adicional para el
cribado para la presencia del producto del transgén. Típicamente se
prepara ADN a partir de tejido de la cola y se analiza mediante
transferencia southern o PCR para identificar el transgén.
Alternativamente, los tejidos o células que se cree que expresan en
transgén a los niveles más elevados se someten a ensayo para la
presencia y expresión del transgén utilizando análisis southern o
PCR, aunque puede utilizarse cualquier tejido o tipo celular para
este análisis.
Entre los procedimientos alternativos o
adicionales para evaluar la presencia del transgén se incluyen,
aunque sin limitarse a ellos, ensayos bioquímicos adecuados, tales
como los ensayos enzimáticos y/o inmunológicos, las tinciones
histológicas para marcadores o actividades enzimáticas particulares,
análisis de citometría de flujo, y similares. El análisis de la
sangre también puede resultar útil para detectar la presencia del
producto del transgén en la sangre, así como para evaluar el efecto
del transgén sobre los niveles de diversos tipos de células
sanguíneas y otros constituyentes de la sangre.
La progenie de los animales transgénicos puede
obtenerse cruzando el animal transgénico con una pareja adecuada, o
mediante fertilización in vitro de huevos y/o de esperma
obtenidos del animal transgénico. En el caso de que se lleve a cabo
el cruzamiento con una pareja, ésta puede ser transgénica o no y/o
un knockout; en el caso de que sea transgénica, puede contener el
mismo transgén o uno diferente, o ambos. Alternativamente, la pareja
puede ser una línea parental. En el caso de que se utiliza la
fertilización in vitro, el embrión fertilizado puede
implantarse en un huésped sustitutivo o incubarse in vitro, o
ambos. Mediante la utilización de cualquiera de los procedimientos,
puede evaluarse la progenie para la presencia del transgén
utilizando procedimientos descritos anteriormente, u otros
procedimientos
apropiados.
apropiados.
Los animales transgénicos producidos de acuerdo
con la presente invención incluyen material genético exógeno.
Además, en estas realizaciones, la secuencia se une al elemento de
control transcripcional, por ejemplo un promotor, que
preferentemente permite la expresión del producto del transgén en un
tipo específico de célula.
También puede utilizarse la infección
retrovírica para introducir el transgén en un animal no humano. El
embrión no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro
hasta la etapa de blastocito. Durante este tiempo, los blastómeros
pueden ser dianas para la infección retrovírica (Jaenich, R.,
PNAS 73:1260-1264, 1976). La infección
eficiente de los blastómeros se consigue mediante tratamiento
enzimático para eliminar la zona pelúcida (Manipulating the Mouse
Embryo, editores Hogan (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, 1986). El sistema de vector vírico utilizado
para introducir el transgén típicamente es un retrovirus defectivo
en replicación que porta el transgén (Jahner et al.,
PNAS 82:6927-6931, 1985; Van der Putten et
al., PNAS 82:6148-6152, 1985). La
transfección se obtiene fácil y eficientemente mediante el cultivo
de los blastómeros sobre una monocapa de células productoras de
virus (Van der Putten, supra; Stewart et al., EMBO
J. 6:383-388, 1987). Alternativamente, la
infección puede llevarse a cabo en una etapa posterior. El virus o
las células productoras de virus pueden inyectarse en el blastocele
(Jahner et al., Nature 298:623-628,
1982). La mayoría de los fundadores serán mosaicos para el transgén
debido a que la incorporación se produce únicamente en un
subconjunto de las células que formaron el animal transgénico no
humano. Además, el fundador puede contener diversas inserciones
retrovíricas del transgén en diferentes posiciones en el genoma que
generalmente se segregarán en la progenie. Además, también resulta
posible introducir transgenes en la línea germinal mediante
infección retrovírica intrauterina del embrión a media gestación
(Jahner et al., supra,
1982).
1982).
Un tercer tipo de célula diana para la
introducción de transgén es la célula madre embrionaria (ES). Las
células ES se obtienen de embriones previos a la implantación
cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans et
al., Nature 292:154-156, 1981; Bradley
et al., Nature 309:255-258, 1984; Gossler
et al., PNAS 83:9065-9069, 1986; y Robertson
et al., Nature 322:445-448, 1986). Los
transgenes pueden introducirse eficientemente en las células ES
mediante transfección de ADN o mediante transducción mediada por
retrovirus. Estas células ES transformadas seguidamente pueden
combinarse con blastocitos procedentes de un animal no humano. Las
células ES después colonizan el embrión y contribuyen a la línea
germinal del animal quimérico resultante. Para una revisión ver
Jaenisch, R., Science 240:1468-1474,
1988.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como
limitativos en modo alguno.
La práctica de la presente invención utiliza, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales que se
encuentran comprendidos dentro de los conocimientos del experto en
la materia. Estas técnicas se explican por completo en la
literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2a edición, Sambrook, Fritsch y Maniatis, editores, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II
(D.N: Glover et al., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J:
Gait editor, 1984); patente U.S. No. 4.683.195; patente U.S. No.
4.683.202 y Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins,
editores, 1984).
Ejemplo
1
Se genotipó para marcadores genotípicos en el
grupo génico de IL-1 una cohorte de 1.071 sujetos
participantes del estudio Study of Osteoporotic Fractures, de la
University of California at San Francisco Association, utilizando
técnicas conocidas en la técnica.
Los resultados del genotipado se muestran en la
Tabla 1A. La Tabla 1B presenta los resultados de un estudio hawaiano
de la osteoporosis, que se describe adicionalmente después.
A. Estudio de la UCSF de las fracturas
osteoporóticas (n = 1.071 mujeres caucásicas)
| Genotipo | IL-1A (4845) | IL-B (3954) | IL-1B (-511) | IL-1RN (2018) |
| 1.1 | 516 (48,2%) | 633 (59,1%) | 442 (41,3%) | 551 (51,4%) |
| 1.2 | 450 (42%) | 377 (35,2%) | 496 (46,3%) | 434 (40,5%) |
| 2.2 | 104 (9,7%) | 60 (5,6%) | 132 (12,3%) | 85 (7,9%) |
| ausente | 1 | 1 | 1 | 1 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B. Estudio de osteoporosis de Hawaii (n = 208
mujeres japonesas-estadounidenses)
| Genotipo | IL-1A (4845) | IL-B (3954) | IL-1B (-511) | IL-1RN (2018) |
| 1.1 | 169 (82%) | 186 (89,4%) | 60 (29%) | 190 (91,3%) |
| 1.2 | 35 (17%) | 22 (10,6%) | 103 (49,8%) | 18 (8,7%) |
| 2.2 | 2 (1%) | - (0%) | 44 (21,3%) | - (0%) |
| ausente | 2 | - - | 1 | - - |
En la cohorte de control muestreada
aleatoriamente de 626 sujetos, se habían producido 185 fracturas no
espinales. Se utilizaron estos sujetos para el análisis de las
"fracturas no espinales".
| Fractura de | Fractura | Fractura de | Cohorte | |||||
| cadera | vertebral | muñeca | ||||||
| Casos | Controles | Casos | Controles | Casos | Controles | |||
| (n=216) | (n=575) | (n=183) | (n=588) | (n=216) | (n=512) | (n=626) | ||
| IL-1A | 1.1 | 106 | 283 | 88 | 287 | 100 | 254 | 308 |
| (+4845) | (49%) | (49%) | (48%) | (49%) | (46%) | (50%) | (49%) | |
| 1.2 | 96 | 237 | 78 | 240 | 93 | 213 | 257 | |
| (44%) | (41%) | (43%) | (41%) | (43%) | (42%) | (41%) | ||
| 2.2 | 14 | 55 | 17 | 61 | 23 | 45 | 61 | |
| (7%) | (10%) | (9%) | (10%) | (11%) | (66%) | (10%) | ||
| IL-1B | 1.1 | 133 | 336 | 109 | 340 | 123 | 299 | 365 |
| (+3954) | (61%) | (58%) | (59%) | (58%) | (57%) | (58%) | (58%) | |
| 1.2 | 75 | 199 | 67 | 207 | 82 | 180 | 219 | |
| (35%) | (35%) | (37%) | (35%) | (38%) | (35%) | (35%) | ||
| 2.2 | 8 | 40 | 7 | 41 | 11 | 3 | 42 | |
| (4%) | (7%) | (4%) | (7%) | (5%) | (7%) | (7%) | ||
| IL-1B | 1.1 | 98 | 230 | 82 | 228 | 92 | 203 | 247 |
| (-511) | (45%) | (40%) | (45%) | (39%) | (43%) | (40%) | (40%) | |
| 1.2 | 87 | 275 | 77 | 291 | 98 | 246 | 303 | |
| (40%) | (48%) | (42%) | (49%) | (45%) | (48%) | (48%) | ||
| 2.2 | 31 | 70 | 24 | 67 | 26 | 63 | 76 | |
| (15%) | (12%) | (13%) | (12%) | (12%) | (12%) | (12%) | ||
| IL-1RN | 1.1 | 116 | 294 | 95 | 304 | 110 | 264 | 322 |
| (+2018) | (54%) | (51%) | (52%) | (52%) | (51%) | (52%) | (51%) | |
| 1.2 | 83 | 239 | 73 | 246 | 81 | 215 | 262 | |
| (38%) | (42%) | (40%) | (42%) | (37%) | (42%) | (42%) | ||
| 2.2 | 17 | 42 | 15 | 38 | 25 | 33 | 42 | |
| (8%) | (7%) | (8%) | (6%) | (12%) | (6%) | (7%) | ||
| *Incluye 185 sujetos con fractura no espinal. |
Tal como se muestra en la Tabla 2, el alelo 2 de
IL-1A (+4845) se encuentra asociado con un
incremento del riesgo de fracturas no espinales. Además, el alelo 2
de IL-1B (+3954) se encuentra asociado con un
incremento estadísticamente significativo en el riesgo de fracturas
no espinales. En contraste, el alelo 2 de IL-1RN
(+2018) se encuentra asociado con una reducción significativa del
riesgo de fractura no espinal. El alelo 2 de IL-1A
(+4845) se encuentra asociado con un incremento de las fracturas de
muñeca, aunque no estadísticamente significativo (RR = 1,8; IC al
95% = 1,0 a 3,5). En la cohorte total, el alelo 2 se encontraba
asociado con un incremento del riesgo de fracturas de muñeca. Este
efecto desaparece cuando se excluyen los usuarios de HRT.
El incremento del riesgo de fracturas muestra un
efecto de dosis de gen para el alelo 2 de IL-1A
(+4845) y para IL-1B (+3954). En particular, cuantas
más copias del alelo 2, mayor es el efecto. La reducción del riesgo
de fracturas también muestra un efecto de dosis génica para el alelo
2 de IL-1RN (+2018). Específicamente, cuantas más
copias del alelo 2, mayor es el efecto. Tal como se muestra en la
Tabla 3A, estas asociaciones eran ciertas para la cohorte con
exclusión de los usuarios de HRT. Tal como se muestra en la Tabla
3B, las asociaciones se mantienen, aunque no tan fuertes, cuando se
considera la cohorte total, incluyendo los usuarios de HRT. Por otra
parte, las fracturas de cadera y las fracturas espinales
vertebrales, aparentemente no se encuentran asociadas con ninguno de
los marcadores genéticos de IL-1.
Fractura no espinal, RH (IC al
95%)
| no ajustado | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1B (+4845) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,0 (0,7, 1,4) | 1,0 (0,7, 1,4) | |
| 2,2 | 1,4 (0,8, 2,5) | 1,6 (0,9, 2,8) | |
| IL-1B (+3954) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,1 (0,8, 2,5) | 1,3 (0,9, 2,8) | |
| 2,2 | 1,8 (1,0, 3,3) | 2,0 (1,1, 3,8)# | |
| IL-1RA (+2018) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 0,9 (0,6, 1,3) | 0,8 (0,6, 1,2) | |
| 0,4 (0,2, 1,0) | 0,4 (0,2, 0,9)# |
Fractura de muñeca, RH (IC al
95%)
| no ajustado | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1B (+4845) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,2 (0,8, 1,7) | 1,1 (0,7, 1,7) | |
| 1,8 (0,9, 3,4) | 1,8 (1,0, 3,5) | ||
| * \begin{minipage}[t]{155mm}ajustado según edad, BMI modificado, número de años desde la menopausia, tabaquismo y consumo de alcohol actuales, utilización de ERT, utilización de diuréticos tiazo, estado de salud según el propio paciente y diabetes \alm{1} p<0,05 frente a tipo 1,1. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fractura no espinal, RH (IC al
95%)
| no ajustado | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1A (+4845) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,0 (0,7, 1,3) | 0,9 (0,7, 1,3) | |
| 2,2 | 1,2 (0,8, 2,0) | 1,3 (0,8, 2,1) | |
| IL-1B (+3954) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,2 (0,9, 1,6) | 1,3 (0,9, 1,7) | |
| 2,2 | 1,4 (0,8, 2,3) | 1,4 (0,8, 2,4) | |
| IL-1RA (+2018) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 0,9 (0,7, 1,2) | 0,9 (0,6, 1,2) | |
| 2,2 | 0,5 (0,2, 1,0) # | 0,5 (0,2, 1,0)# |
Fractura de muñeca, RH (IC al
95%)
| no ajustado | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1A (+4845) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 1,1 (0,8, 1,5) | 1,1 (0,8, 1,6) | 1,1 (0,8, 1,5) |
| 2,2 | 1,3 (0,8, 2,2) | 1,3 (0,8, 2,2) | 1,3 (0,7, 2,2) |
| IL-1RA (+2018) | |||
| 1,1 | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) | 1,0 (REF) |
| 1,2 | 0,9 (0,6, 1,2) | 0,9 (0,6, 1,2) | 0,9 (0,6, 1,2) |
| 2,2 | 1,8 (1,04, 3,0) # | 1,9 (1,1, 3,2) # | 1,9 (1,1, 3,3)# |
| * \begin{minipage}[t]{155mm}ajustado según edad, BMI modificado, número de años desde la menopausia, tabaquismo y consumo de alcohol actuales, utilización de HRT, utilización de diuréticos tiazo, estado de salud según el propio paciente y diabetes \alm{1} p<0,05 frente a tipo 1,1.\end{minipage} | |||
Se midió la densidad mineral ósea (BMD) en el
hueso calcáneo, en el radio distal, en la cadera total, en el cuello
femoral y en la columna. El análisis se ajustó según edad, índice
mineral óseo (BMI), estatus menopáusico y factores de estilo de
vida. Tal como se muestra en las Tablas 4A y 4B, el alelo 2 de
IL-1B (+3954) se encuentra asociado a BMD
significativamente más elevada en el hueso calcáneo, se incluyan los
usuarios de HRT o no (p<0,05 para la tendencia; p<0,05 para el
genotipo [2,2] frente al genotipo [1,1]).
El alelo 2 de IL-1B (-511) se
encontraba significativamente asociado a una BMD más baja en el
hueso calcáneo en la cohorte total, incluyendo los usuarios de HRT
(p<0,05 para la tendencia; p<0,05 para el genotipo [2,2]
frente al genotipo [1,1]). El alelo 2 de IL-1B
(-511) se encontraba asociado a una tendencia hacia una BMD más baja
en el hueso calcáneo tras excluir los usuarios de HRT. No se
observaron patrones consistentes de asociación entre los genotipos
IL-1 y BMD en los otros sitios.
\vskip1.000000\baselineskip
(n =
1.070)
\vskip1.000000\baselineskip
| BMD calcánea media\mathit{(g/cm^{2})} | |||
| no ajustada | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1B (+3954) | |||
| 1,1 | 0,39 (0,005) | 0,39 (0,004) | 0,40 (0,004) |
| 1,2 | 0,40 (0,006) | 0,40 (0,005) | 0,40 (0,005) |
| 2,2 | 0,43 (0,014)+,# | 0,42 (0,012)+,# | 0,42 (0,012)+,# |
| IL-1B (-511) | |||
| 1,1 | 0,41 (0,006) | 0,41 (0,005) | 0,41 (0,005) |
| 1,2 | 0,39 (0,005)# | 0,40 (0,005) | 0,39 (0,005)# |
| 2,2 | 0,39 (0,011)+,# | 0,39 (0,009)+ | 0,39 (0,009)+,# |
\vskip1.000000\baselineskip
| BMD calcánea media\mathit{(g/cm^{2})} | |||
| no ajustada | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1B (+3954) | |||
| 1,1 | 0,39 (0,005) | 0,39 (0,004) | 0,40 (0,004) |
| 1,2 | 0,40 (0,006) | 0,40 (0,005) | 0,40 (0,005) |
| 2,2 | 0,43 (0,014)+,# | 0,42 (0,012)+,# | 0,42 (0,012)+,# |
| IL-1B (-511) | |||
| 1,1 | 0,41 (0,006) | 0,41 (0,005) | 0,41 (0,005) |
| 1,2 | 0,39 (0,005)# | 0,40 (0,005) | 0,39 (0,005)# |
| 2,2 | 0,39 (0,011)+,# | 0,39 (0,009)+ | 0,39 (0,009)+,# |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| BMD calcánea media\mathit{(g/cm^{2})} | |||
| no ajustada | ajuste según edad/BMI | ajuste múltiple* | |
| IL-1B (+3954) | |||
| 1,1 | 0,39 (0,005) | 0,39 (0,005) | |
| 1,2 | 0,40 (0,007) | 0,39 (0,007) | |
| 2,2 | 0,43 (0,016)+ | 0,43 (0,016) | |
| IL-1B (-511) | |||
| 1,1 | 0,40 (0,006) | 0,40 (0,006) | |
| 1,2 | 0,40 (0,006) | 0,40 (0,006) | |
| 2,2 | 0,38 (0,011) | 0,38 (0,011) | |
| * \begin{minipage}[t]{155mm} ajustado según edad, BMI modificada, número de años desde la menopausia, tabaquismo y consumo de alcohol actuales, utilización de ERT, utilización de diuréticos tiazolidina, estado de salud según el propio paciente y diabetes \end{minipage} | |||
| + p (tendencia) < 0,05 | |||
| # p<0,05 frente al tipo 1,1. |
La tasa de pérdida ósea se midió en la cadera
total, en el cuello femoral y en el hueso calcáneo. Tal como se
muestra en las Tablas 5A y 5B, el alelo 2 de IL-1B
(-511) se encuentra asociado con una tasa más elevada de pérdida
ósea en la cadera total (p<0,05 para la tendencia), para la
cohorte total y para la cohorte con exclusión de los usuarios de
HRT. El genotipo [2,2] de IL-1B (-511) se encuentra
asociado a una tendencia hacia una tasa de pérdida ósea más elevada
en el hueso calcáneo. El alelo 2 de IL-1B (-511) se
encuentra asociado a una tendencia hacia una tasa más elevada de
pérdida ósea en el cuello femoral. Se observó un efecto de dosis
génica para la tasa de pérdida ósea en la cadera para el alelo 2 de
IL-1B (-511). Se observó una asociación similar,
aunque no significativa, para la tasa de pérdida ósea en el cuello
femoral. Estos resultados fueron similares al incluir los usuarios
de HRT (Tabla 5A) o tras excluirlos (Tabla 5B) del análisis.
Se genotiparon para marcadores genotípicos en el
grupo génico de IL-1, 100 participantes en el
estudio Hawaii Osteoporosis Study que presentaban fracturas y 100
participantes que no presentaban fracturas. Se presentan los
resultados en la Tabla 1B. Los participantes en el estudio eran
todos mujeres japonesas-estadounidenses con edades
comprendidas entre los 80 y mediados de la década de los ochenta
años. Se analizaron los datos clínicos siguientes: fracturas de
espina y no espinales, incluyendo y excluyendo las ovariectomías,
contenido mineral óseo (BMC) en el radio distal y proximal, y hueso
calcáneo, incluyendo y excluyendo los sujetos que habían sido
ovariectomizados. El análisis se ajustó según edad, BMI y duración
del periodo de uso de estrógenos.
El alelo 2 de IL-1A (-4845) se
encuentra fuertemente asociado con un incremento en el número de
fracturas espinales y no espinales (p<0,018), con independencia
de si se incluían o no los sujetos con o sin ovariectomías.
El alelo 2 de IL-1B (-511) se
encontraba asociado con una reducción en BMC del radio distal
(p<0,024). El alelo 2 de IL-1RN (+2018) se
encontraba asociado con una reducción del BMC del hueso calcáneo
(p<0,022).
Papel de la etnicidad. La distribución de
genotipos en el grupo génico de IL-1 es muy
diferente para los estadounidenses con antepasados caucasianos y
para los japoneses-estadounidenses, muchos de los
cuales en este estudio específico eran inmigrantes de primera
generación. Se han encontrado patrones de distribución claramente
diferentes para otros grupos étnicos, principalmente:
Chinos (frecuencia muy baja de alelo 2 de
IL-1RN (+2018) y de IL-1B
(+3954));
Estadounidenses-africanos
(patrón similar a la población japonesa); y
Hispanos (patrón similar al de los caucasianos
europeos. Esto es específicamente cierto para los hispanos con
antepasados europeos. Sin embargo, el patrón no es muy diferente
para los hispanos mejicanos con antepasados europeos).
Por lo tanto, el genotipo de
IL-1RN (+2018) podría no reflejar con exactitud el
patrón y respuesta biológicos. IL-1B (-511) podría
ser un indicador más exacto para este haplotipo y patrón genotípico
específicos. De manera similar, IL-1B (+3954) podría
no ser un marcador exacto para el patrón haplotipo.
IL-1A (-4954) podría ser un indicador más exacto
para este haplotipo y patrón genotípico específicos.
Riesgo de fractura: El alelo 2 de
IL-1A (+4845) y el alelo 2 de IL-1B
(+3954) se encontraban asociados con un incremento del riesgo de
fractura. Esto apunta a una asociación con el haplotipo 1 (ver la
figura 3). La BMD calcánea se encontraba asociada con el alelo 2 de
IL-1B (+3954) (haplotipo 1).
El haplotipo 1 resultaba en niveles y
bioactividad incrementados de IL-1a y de
IL-1b, aunque niveles normales de antagonista de
receptor de IL-1.
Tasa de pérdida ósea: La tasa de pérdida
ósea se asocia con el alelo 2 de IL-1B (-511)
(haplotipo 2). El haplotipo 2 resulta en niveles normales de
IL-1, pero reducidos de antagonista de receptor de
IL-1. El resultado neto es un incremento de la
actividad biológica y respuesta de IL-1.
Densidad mineral ósea. La BMD (o BMC) se
asocia con el alelo 2 de IL-1B (-511) o de
IL-1RN (+2018) (haplotipo 2) en el hueso calcáneo y
en el radio distal.
El incremento de BMD en el hueso calcáneo se
asocia con el haplotipo 2. La BMD en otros sitios no se encontraba
significativamente asociada con marcadores de IL-1
en este estudio, lo que puede estar provocado porque las
particularidades de la población de estudio resultaron en una falta
de potencia del análisis estadístico. Otras cuestiones que podrían
desempeñan un papel en el estudio de la población de la University
of California, San Francisco, son: mejor estado de salud, mejor
nivel de educación, participación en el estudio y un estatus
socioeconómico más elevado.
El proceso de remodelado óseo se encuentra
regulado por varios factores, entre ellos: metabolismo óseo, tasa de
pérdida ósea, masa ósea máxima, factores de estilo de vida,
genética, utilización de fármacos de prescripción y masa corporal.
Las fracturas osteoporóticas son el punto final de un complejo
proceso de remodelado óseo, pérdida ósea y envejecimiento. El
remodelado óseo y, de esta manera, la probabilidad de desarrollar
osteoporosis y fracturas osteoporóticas se encuentra regulado por
diferentes procesos biológicos en diferentes etapas del ciclo vital.
En los primeros 5 a 10 años posteriores a la aparición de la
menopausia se experimenta la pérdida ósea más rápida debido a la
reducción de los niveles de estrógenos y al incremento de los
niveles y actividad de IL-1. En esta etapa, la
formación y activación incrementadas de los osteoclastos (debido a
los niveles incrementados de IL-1) regula el proceso
de remodelado ósea. El incremento de los niveles de
IL-1 en los primeros 5 a 10 años después de la
menopausia podría ser más importante que los niveles de antagonista
de receptor de IL-1. Aproximadamente 10 años después
de la menopausia, se enlentece la tasa de pérdida ósea, debido a un
cambio en la biología del remodelado óseo. En esta etapa, la
formación reducida de osteoblastos constituye la fuerza reguladora
del remodelado óseo. Los niveles reducidos de antagonista de
receptor de IL-1 podrían formar un factor más
importante en años postmenopáusicos posteriores en la regulación de
la magnitud de la pérdida ósea.
El haplotipo 1 se asocia con un incremento de
los niveles y bioactividad de IL-1a y de
IL-1b, pero con niveles normales de antagonista de
receptor de IL-1. Las mujeres con haplotipo 1 es
probable que experimenten una mayor pérdida ósea durante sus
primeros años de menopausia que las mujeres con haplotipo 2. Las
mujeres con haplotipo 1, de esta manera, es más probable que
experimenten fracturas en cualquier etapa vital, si no se aplican
medidas preventivas o un tratamiento.
Las mujeres con haplotipo 2 es probable que
experimenten más pérdida ósea más tarde en la vida y pueden ser más
susceptibles a experimentar fracturas más tarde en la vida,
específicamente fracturas asociadas con la osteoporosis relacionada
con la edad. Por lo tanto, los sujetos con haplotipo 2 que producen
constitutivamente menos IL-1ra que los sujetos con
haplotipo 1, experimentarán mayor pérdida ósea y una formación
reducida de hueso en la etapa postmenopáusica tardía de su vida.
Basándose en la hipótesis descrita
anteriormente, se infiere que los datos informados por Keen et
al. (1998), "Allelic variation in the
interleukin-1 receptor antagonist gene is associated
with early postmenopausal bone loss at the spine", (Bone 23 (4),
367-371): una asociación entre el alelo [1] del VNTR
en IL-1R y la pérdida ósea postmenopáusica temprana,
sugieren que los sujetos que presentan el alelo [1] del VNTR de
hecho portan el haplotipo 1. Debido a que todos los sujetos en este
estudio se encontraban dentro de los 5 años posteriores a la
aparición de la menopausia, su pérdida ósea se encontraba regulada
por los niveles y actividad incrementados de IL-1 y
no por los niveles incrementados o reducidos de
IL-1ra. Debido a que únicamente se determinó el VNTR
de IL-1RN, se alcanzó la conclusión errónea de que
el alelo 1 de VNTR de IL-1R era importante en los
cambios de densidad ósea y que era el factor predictivo principal de
pérdida ósea y de riesgo de fractura osteoporótica.
Claims (7)
1. Procedimiento para determinar si un sujeto
hembra ha desarrollado o se encuentra predispuesta a desarrollar
osteoporosis, que comprende identificar los alelos
IL-1A (+4845) y/o IL-1RN (+2018) de
la hembra, en el que la presencia del alelo 2 de
IL-1A (+4845) y/o el alelo 1 de
IL-1RN (+2018) indica que el sujeto hembra ha
desarrollado o se encuentra predispuesta a desarrollar
osteoporosis.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además identificar los alelos IL-1B
(+3954) y/o IL-1B (-511) de la hembra, en la que la
presencia del alelo 2 de IL-1B (+3954) y/o el alelo
2 de IL-1B (-511) indica que el sujeto hembra
presenta o se encuentra predispuesta a desarrollar osteoporosis.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que
comprende identificar los alelos IL-1A (+4845),
IL-1RN (+2018), IL-1B (+3954) e
IL-1B (-511) de la hembra, en el que la presencia
del haplotipo 1 (alelo 2 de IL-1A +4845; alelo 2 de
IL-1B +3954; alelo 1 de IL-1B -511;
y alelo 1 de IL-1RN +2018) indica que la hembra es
susceptible de una mayor pérdida ósea y/o de un riesgo incrementado
de fratura durante los primeros años de menopausia; y la presencia
de haplotipo 2 (alelo 1 de IL-1A +4845; alelo 1 de
IL-1B +3954; alelo 2 de IL-1B -511;
y alelo 2 de IL-1RN +2018) indica que la hembra es
susceptible de una mayor pérdida ósea y/o de un riesgo incrementado
de fractura tras la menopausia.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de identificación
se selecciona de entre el grupo que consiste en:
- a)
- hibridación de oligonucleótidos específica de alelo;
- b)
- análisis por tamaño;
- c)
- secuenciación;
- d)
- hibridación;
- e)
- digestión con nucleasa 5';
- f)
- polimorfismo de conformación de cadena única;
- g)
- hibridación específica de alelo;
- h)
- extensión específica de cebador; y
- j)
- ensayo de ligación de oligonucleótido
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho análisis por tamaño viene precedido por una digestión
con enzima de restricción.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que previamente o conjuntamente
con la identificación, la muestra de ácidos nucleicos se somete a
una etapa de amplificación.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha predisposición a la osteoporosis comprende una
predisposición a padecer una fractura no espinal.
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