JP2004504802A - 骨粗鬆症の診断および療法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.発明の背景
骨粗鬆症
1993年、当時国立衛生研究所の所長であったBermadine Healy,MDが骨粗鬆症を”女性の主な疾患のひとつ”と定義した。骨粗鬆症性骨折に伴う合併症は、心臓病、癌および脳卒中に続いて65歳過ぎの女性の第4の主要な死因である。それは米国では廃疾の主因であり、股関節部骨折の最も一般的な原因である。
【0002】
2500万の米国人が骨粗鬆症を罹患しており、そのうち85%は女性である。エストロゲン喪失に起因する閉経後骨粗鬆症であるI型骨粗鬆症は、65歳過ぎの女性の半数以上が罹患し、75歳過ぎの90%もの女性にみられる。厳密に年齢関連性であるII型または老年性骨粗鬆症は、70歳過ぎの男女がいずれも罹患する。男女とも罹患する最も新しい分類であるIII型は薬物誘発性であり、たとえば骨損失を促進することが知られている長期ステロイド療法によるものである。長期ステロイド療法を受ける患者群には、喘息患者(米国では18歳過ぎの700万人)、および慢性関節リウマチまたは他の自己免疫疾患を伴う患者が含まれる。IV型は、慢性関節リウマチなどの原疾患により起きる(集団の1〜2%の有病率)。
【0003】
骨粗鬆症は毎年150万人の骨折の大部分に関係し、医療、社会および介護ホームにおいて100億ドルの経費がかかる廃疾をもたらす。良くても、65歳以上の患者の40%は股関節部骨折後2年も生存しない。
【0004】
1991年、米国女性の3人に1人が50歳以上であった。ベビーブーム世代の子供は1996年にこの年齢になる。現在の傾向では平均的女性は閉経後30年ほど生存するので、この傾向では骨粗鬆症は現代における健康上最大の脅威のひとつになる。
【0005】
生活スタイルが骨粗鬆症発症の要因のひとつであり、骨粗鬆症予防のために健康な骨質量を構築および維持する際の特に重要な要因となりうる。現在、65歳未満の人々は親たちと比べて座位の生活スタイル、不適正な食習慣、アルコールやカフェイン摂取の増加、ならびに骨損失に関連する医療歴の長さが大きい傾向にある。骨粗鬆症の発症には遺伝的素因があることも明らかである(骨粗鬆症の遺伝的要因の考察についてはWO94/03633参照;これを本明細書に援用する)。
【0006】
したがって、骨粗鬆症発症のリスクがきわめて高い個体を早期に同定でき、これによってその個体は適切に生活スタイルを変更するようにカウンセリングを受け、あるいは他の療法処置を行うことができれば、有用であろう。たとえばカルシウム補充や運動は、危険性のある早期年齢段階で採用すれば価値ある予防因子であることが示されている。ホルモン代償療法(HRT)も閉経後に起きる骨粗鬆症に対処するために効果的に用いられている。HRTは、疾患経過の初期に、大きな骨損失が起きる前に用いればきわめて有益となりうる。HRTは著しい副作用の可能性があるので、HRT採用について決定する際には、骨粗鬆症発症のリスクを減らす目的の他の処置と対比して、個人的な骨粗鬆症リスクレベルを女性に知らせるのが有用であろう。
【0007】
以下の公開特許明細書には、骨粗鬆症を診断、モニタリングおよび/または処置するための多様な方法が記載されている:WO94/20615、WO95/01995、WO94/14844、EP93113604、WO/8809457、WO93/11149およびWO/9403633。以下の参考文献には、骨粗鬆症における種々のIL−1遺伝子多型の関連が記載されている:USP5,698,399;Eastell,R.,et al.,(1998)Bone,23(5S):S375;Eastell,R.,et al.and Keen,R.W.,et al.(1998)Bone,23:367−371。
【0008】
IL−1遺伝子クラスターの遺伝学
IL−1遺伝子クラスターは第2染色体の長腕上にあり(2q13)、少なくともIL−1αに対する遺伝子(IL−1A)、IL−1βに対する遺伝子(IL−1B)およびIL−1受容体アンタゴニストに対する遺伝子(IL−1RN)を430Kb領域内に含む(Nicklin,et al.(1994)Genomics,19:382−4)。アゴニスト分子IL−1αおよびIL−1βは有効強い前炎症活性をもち、多くの炎症カスケードの先頭にある。それらの作用はしばしば他のサイトカイン、たとえばIL−6およびIL−8の誘導を介して行われ、白血球の活性化および損傷組織への補給、血管活性物質の局所産生、脳における発熱応答、ならびに肝急性期応答をもたらす。3種類のIL−1分子はすべてI型およびII型IL−1受容体に結合するが、I型受容体のみが細胞内部へ信号を伝達する。これに対し、II型受容体は細胞膜から離れてデコイ受容体として作用する。したがって、受容体アンタゴニストおよびII型受容体の作用はいずれも抗炎症性である。
【0009】
不適正なIL−1産生が、慢性関節リウマチ、炎症性腸障害、乾癬など多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病理において中心的役割を果たす。さらに、IL−1産生率には個体差があり、この変動の一部はIL−1遺伝子座における遺伝学的相異が原因である。したがってIL−1遺伝子は炎症性疾患(大部分は多遺伝子成分を伴う多因子病因をもつ)に対する遺伝学的感受性の一部を判定するための妥当な候補である。
【0010】
IL−1遺伝子クラスター由来の特定の対立遺伝子が特定の疾患状態に関連することは知られている。たとえばIL−1RN(VNTR)対立遺伝子2(USP5,698,399)およびIL−1RN(VNTR)対立遺伝子1(Keen,R.W.,et al.(1998)Bone,23:367−371)が骨粗鬆症に関連すると報告されている。さらに、IL−1RN(VNTR)対立遺伝子2は、糖尿病における腎障害(Blakemore,et al.(1996)Hum.Genet.97(3):369−74)、脱毛症(Cork,et al.(1995)J.Invest.Dermatol.104(5 Supp.):15S−16S;Cork,et al.(1996)Dermatol.Clin.14:671−8)、グレーブズ病(Blakemore,et al.(1995)J.Clin.Endocrinol.,80(1):111−5)、全身性エリテマトーデス(Blakemore,et al.(1994)Arthritis Rheum.,37:1380−85)、硬化性苔癬(Clay,et al.(1994)Hum.Genet.94:407−10)、および潰瘍性大腸炎(Mansfield,et al.(1994)Gastroenterol.,106(3):637−42)に関連すると報告されている。
【0011】
さらに、マーカー−889由来のIL−1A対立遺伝子2およびマーカー+3954由来のIL−1B(TaqI)対立遺伝子2は歯周疾患に関連することが見いだされた(USP5,686,246;Kornman and diGiovine(1998)Ann.Periodont.,3:327−38;Hart and Kornman(1997)Periodontol 2000,14:202−15;Newman(1997)Compend.Contin.Educ.Dent.,18:881−4;Kornman,et al.(1997)J.Clin.Periodontol,24:72−77)。マーカー−889由来のIL−1A対立遺伝子2は、若年性慢性関節炎、特に慢性虹彩毛様体炎に関連することも見いだされた(McDowell,et al.(1995)Arthritis Rheum.,38:221−28)。IL−1Bのマーカー+3954由来のIL−1B(TaqI)対立遺伝子2は、DR3/4患者の乾癬およびインスリン依存性糖尿病に関連することも見いだされた(diGiovine,et al.(1995)Cytokine,7:606;Pociot,et al.(1992)Eur.J.Clin.Invest.,22:396−402)。さらに、IL−1RN(VNTR)対立遺伝子1は、糖尿病性網膜障害に関連することが見いだされた(USSN09/037472およびPCT/GB97/02790参照)。さらに、IL−1RN(VNTR)対立遺伝子2は、北米および欧州由来のコーカソイド集団における潰瘍性大腸炎に関連することが見いだされた(Mansfield,J.,et al.,(1994)Gastroenterology,106:637−42)。興味深いことに、この関連は民族的に関連のあるアシュケニジム系ユダヤ人の集団内で特に強い(WO97/25445)。
【0012】
遺伝子型スクリーニング
遺伝病のスクリーニングのための従来法は、異常な遺伝子生成物(たとえば鎌状赤血球性貧血)または異常な表現型(たとえば精神発達遅滞)の同定に依存していた。これらの方法は、発症の遅い遺伝病および同定しにくい表現型、たとえば血管疾患についての有用性が限られる。簡単で経費の低いスクリーニング法の開発に伴って、現在では疾患が多遺伝子由来のものであっても、疾患発症傾向を指示する多型の同定が可能になった。多因子障害の遺伝学的原理の理解が増すにつれて、分子生物学的方法でスクリーニングできる疾患の数は増加し続けている。
【0013】
遺伝子スクリーニング(遺伝子型決定または分子スクリーニングとも呼ばれる)は、広義には、疾病状態の原因となる変異または疾病状態の原因となる変異に”連関した”変異(対立遺伝子または多型)を患者がもつかを判定するための試験と定義できる。連関(linkage)とは、ゲノム内で近接しているDNA配列が一緒に遺伝する傾向をもつ現象を表す。2つの配列は、同時遺伝に何らかの選択的利点があるため連関する可能性がある。しかし、より一般的には、2つの多型配列が同時遺伝するのは、それら2つの多型間の領域内に減数分裂組換え事象の起きる相対頻度が比較的低いためである。同時遺伝する多型性対立遺伝子は互いに連関非平衡(linkage disequilibrium)状態にあると言われる。特定のヒト集団においては、その集団の特定のメンバーにそれらが両方とも一緒に起きるか、あるいは全く起きない傾向があるからである。事実、特定の染色体領域内の複数の多型が互いに連関非平衡状態にあることが認められた場合、それらは準安定遺伝子”ハプロタイプ”となる。これに対し、2つの多型遺伝子座間に組換え事象が起きると、それらは別個の相同染色体上に分離される。2つの物理的に連関した多型の間に減数分裂組換えが十分な頻度で起きると、それら2つの多型は分離独立すると考えられ、連関平衡状態にあると言われる。
【0014】
2つのマーカー間の減数分裂組換えの頻度は一般に染色体上のそれらの物理的距離に比例するが、”ホットスポット”および染色体組換え抑制領域の出現により2つのマーカー間の物理的距離と組換え距離の間に不一致が生じる可能性がある。したがって特定の染色体領域においては、幅広い染色体ドメインに及ぶ複数の多型遺伝子座が互いに連関非平衡状態にあり、このため広域遺伝子ハプロタイプとなる可能性がある。さらに、病因性変異がこのハプロタイプ内にあるか、またはそれと連関していることが認められた場合、そのハプロタイプの1以上の多型性対立遺伝子をその疾患の発症傾向の診断または予後判定の指標として利用できる。普通は良性である多型と病因性多型のこの関連は、その疾患が最近発症した場合に起きる。このため、組換え事象により平衡に達するのに十分な時間が経過していない。したがって、病因性変異を含むかまたは連関するヒトハプロタイプの同定は、個体にその病因性変異が遺伝している可能性を推定する尺度として役立つ。重要な点は、そのような予後判定法または診断法は実際の病因病変部を同定および摘出する必要なしに利用できる点である。疾病過程に関与する分子欠損の正確な判定は、炎症性障害のような多因子疾患の場合は特に困難であり、労力を要するので、これは重要である。
【0015】
実際には、炎症性障害とIL−1多型の統計的相関性は必ずしもその多型がその障害の直接の原因であることを示すものではない。むしろ、相関する多型は、ヒトの進化において最近起きたため介在染色体セグメントにおける組換え事象により平衡に達するのに十分な時間が経過していない障害誘発性変異に連関する(すなわちこの変異と非平衡状態にある)良性の対立遺伝子変異である可能性がある。したがって、特定の疾患の診断および予後アッセイのために、その疾患に関連する多型性対立遺伝子が疾患の病因に直接関与するかをどうか考慮せずに、多型の検出を利用することができる。さらに、特定の良性多型遺伝子座が見掛け上の病因性多型遺伝子座と連関非平衡状態にある場合、その良性多型遺伝子座と連関非平衡状態にあるさらに他の多型遺伝子座が病因性多型遺伝子座と連関非平衡状態にある可能性もある。したがって、これら他の多型遺伝子座もその病因性多型遺伝子座が遺伝している可能性の予後判定または診断となる。実際に、特定の疾患または状態と対応するヒトハプロタイプとの関連性が認められると、広域ヒトハプロタイプ(一組の連関多型マーカーの対立遺伝子の同時遺伝の典型的パターンを表すもの)を診断のためにターゲティングすることができる。したがって、原因となる遺伝子変異を必ずしも判定または解明しなくても、1以上の疾病関連多型性対立遺伝子(または1以上の疾病関連ハプロタイプ)の解明により、個体が特定の疾患または状態を発症する可能性を判定することができる。
【0016】
2.発明の概要
1態様において本発明は、女性対象が骨粗鬆症を発症する素因を有するかどうかを判定するための新規な方法およびキットを提供するものであって、該女性のIL−1ハプロタイプパターンを同定することを含み、その際、ハプロタイプパターン1の存在は該女性が閉経初期年間に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し、ハプロタイプパターン2の存在は該女性が閉経後に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示す。
【0017】
IL−1ハプロタイプパターンは、下記の利用できる多様な技術を用いて成分対立遺伝子のいずれかを検出することにより同定できる:1)核酸試料とその対立遺伝子にハイブリダイズしうるプローブとのハイブリダイゼーション反応を実施する;2)対立遺伝子の少なくとも一部の配列を決定する;または3)対立遺伝子もしくはそのフラグメント(たとえばエンドヌクレアーゼ消化により生成したフラグメント)の電気泳動移動度を測定する。対立遺伝子に所望により検出工程実施前に増幅工程を施すこともできる。好ましい増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、連鎖置換増幅(SDA)、クローニング、およびこれらの変法(たとえばRT−PCRおよび対立遺伝子特異的増幅)よりなる群から選択される。増幅に必要なオリゴヌクレオチドは、たとえば目標マーカーをフランキングするか(PCR増幅に必要であるように)またはマーカーに直接オーバーラップする(ASOハイブリダイゼーションの場合のように)IL−1遺伝子座内から選択できる。特に好ましい態様においては、試料を血管疾患関連対立遺伝子に対するセンスまたはアンチセンス配列の5’側および3’側にハイブリダイズする一組のプライマーとハイブリダイズさせ、そしてPCR増幅する。
【0018】
対立遺伝子をそのDNAがコードするタンパク質生成物の分析により間接的に検出することもできる。たとえば当該マーカーが変異タンパク質を翻訳する場合、そのタンパク質を多様なタンパク質検出法のいずれかにより検出できる。そのような方法には、免疫検出試験および生化学的試験、たとえばタンパク質がトランケーション、延長、フォールディングの変化、または翻訳後修飾の変化により見掛け分子量の変化を伴う場合にはサイズ分画法が含まれる。
【0019】
他の態様において本発明は、前記アッセイを実施するためのキットに関する。キットには、核酸試料採集手段、および対象がIL−1ハプロタイプを含む少なくとも1つの対立遺伝子を保有するかどうかを判定するための手段が含まれる。キットは、結果を判定するための陽性もしくは陰性対照試料、あるいは標準品および/またはアルゴリズムデバイス、ならびに他の試薬および成分、たとえばDNA増幅試薬、DNAポリメラーゼ、核酸増幅試薬、制限酵素、緩衝液、核酸サンプリング用具、DNA精製用具、デオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチド(たとえばプローブおよびプライマー)などを含むこともできる。
【0020】
上記のように、対照は陽性または陰性対照であってよい。さらに対照試料は、用いる対立遺伝子検出法の陽性(または陰性)生成物を含むこともできる。たとえば対立遺伝子検出法がPCR増幅法、続いてサイズ分画法である場合、対照試料は適切なサイズのDNAフラグメントを含むことができる。同様に、対立遺伝子検出法が変異タンパク質の検出を伴う場合、対照試料は変異タンパク質の試料を含むことができる。しかし、対照試料は被験物質を含むことが好ましい。たとえば対照はゲノムDNA試料、またはIL−1遺伝子クラスターのクローン化した部分であってよい。ただし、被験試料がゲノムDNAである場合、対照試料は好ましくはゲノムDNAの高度精製試料である。
【0021】
このキット中にあるオリゴヌクレオチドは、目標領域を増幅し、または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)を当該マーカーに直接ハイブリダイゼーションさせるために使用できる。したがってオリゴヌクレオチドは、当該マーカーをフランキングするか(PCR増幅に必要であるように)またはマーカーに直接オーバーラップする(ASOハイブリダイゼーションの場合のように)ものであってよい。
【0022】
本明細書に記載するアッセイ法およびキットを用いて得た情報は(それだけで、または骨粗鬆症に関与する遺伝子欠損または環境因子に関する他の情報と組み合わせて)、無症候対象がその疾患または状態を伴うかどうか、あるいは発症する傾向があるかどうかを判定するのに有用である。さらにこの情報から、その疾患または状態の発症または進行を阻止するためのより一般的な処置をとることができる。たとえば、この情報から医師はその疾患または状態の分子的な原理に対処する療法をより効果的に処方することができる。
【0023】
さらに他の態様において本発明は、対象に本発明の適切な療法薬を投与することにより骨粗鬆症を治療または予防する方法に関する。さらに他の態様において本発明は、骨粗鬆症の治療または発症予防に用いる療法薬を同定するために被験化合物をスクリーニングするインビトロまたはインビボアッセイ法を提供する。1態様においてアッセイ法は、適切なプロモーターに機能可能な状態に結合した原因変異により形質転換した細胞を被験化合物と接触させ、被験化合物の存在下および不存在下での細胞におけるタンパク質発現レベルを測定する。好ましい態様においては、原因変異はIL−1受容体アンタゴニストの産生を減少させるものであり、被験化合物の存在下でのIL−1受容体アンタゴニストの産生増加はその化合物がIL−1受容体アンタゴニスト活性のアゴニストであることを指示する。他の好ましい態様においては、原因変異はIL−1αまたはIL−1βの産生を増加させるものであり、被験化合物の存在下でのIL−1αまたはIL−1βの産生減少はその化合物がIL−1αまたはIL−1β活性のアンタゴニストであることを指示する。他の好ましい態様においては、IL−1αもしくはIL−1β活性のアンタゴニストまたはIL−1Ra活性のアゴニストを同定するためのトランスジェニック非ヒト動物およびその使用に関する。
【0024】
本発明の他の態様および利点を以下の詳細な記述および特許請求の範囲に記載する。
4.発明の詳細な記述
4.1定義
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で用いる特定の用語および句の意味を下記に示す。
【0025】
用語”対立遺伝子(allele)”は、異なる多型領域にみられる異なる配列変異体を表す。たとえばIL−1RN(VNTR)は少なくとも5つの異なる対立遺伝子をもつ。配列変異体は、挿入、欠失もしくは置換を含めた(これらに限定されない)単一もしくは複数の塩基変化、または配列反復数の変動であってもよい。
【0026】
用語”対立遺伝子パターン(allelic pattern)”は、1以上の多型領域における対立遺伝子の同一性を表す。たとえば、対立遺伝子パターンは多型部位のひとつであるIL−1RN(VNTR)対立遺伝子1において単一の対立遺伝子からなっていてもよく、これはIL−1RN遺伝子座のVNTRに少なくとも1コピーのIL−1RN対立遺伝子をもつ対立遺伝子パターンである。あるいは対立遺伝子パターンは単一多型部位におけるホモ接合状態またはヘテロ接合状態のいずれかからなっていてもよい。たとえばIL−1RN(VNTR)対立遺伝子2,2はIL−1RNKVNTRマーカーに2コピーの第2対立遺伝子がある対立遺伝子パターンであり、これはホモ接合性IL−1RN(VNTR)対立遺伝子2状態に対応する。あるいは対立遺伝子は1より多い多型部位において同一の対立遺伝子からなっていてもよい。
【0027】
本明細書中で用いる用語”抗体”は、IL−1ポリペプチドと特異的に反応する結合物質であって、全抗体またはその結合性フラグメントを含めたものを表すものとする。抗体は、常法によりフラグメント化し、それらのフラグメントを全抗体に関して前記に述べたものと同じ方法で有用性についてスクリーニングすることができる。たとえばF(ab)2フラグメントは抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られたF(ab)2フラグメントをジスルフィド橋還元処理してFabフラグメントにすることができる。本発明の抗体にはさらに、IL−1Bポリペプチドに対する親和性が抗体の少なくとも1つのCDR領域により付与された、二特異性、一本鎖、ならびにキメラおよびヒト化分子も含まれるものとする。
【0028】
互換性をもって用いられる”生物学的活性”または”生物活性”または”活性”または”生物学的機能”は、本発明の目的に関して、IL−1ポリペプチド(その天然コンホメーションまたは変性コンホメーションのいずれであってもよい)またはそのいずれかの部分配列によって直接的または間接的になされるエフェクター機能または抗原機能を意味する。生物学的活性には、ターゲットペプチド、たとえばIL−1受容体への結合が含まれる。IL−1生物活性は、IL−1ポリペプチドへの直接作用により調節できる。あるいは、IL−1生物活性は、IL−1ポリペプチドレベルの調節、たとえばIL−1遺伝子発現の調節により調節できる。
【0029】
本明細書中で用いる用語”IL−1ポリペプチドの生物活性フラグメント”は、全長IL−1ポリペプチドのフラグメントであって、野生型IL−1ポリペプチドの活性を特異的に模倣し、またはそれに拮抗するフラグメントを表す。生物活性フラグメントは、好ましくはインターロイキン受容体と相互作用しうるフラグメントである。
【0030】
IL−1などのポリペプチドの活性に適用される用語”異常な活性”は、野生型もしくは天然ポリペプチドの活性と異なる活性、または健常な対象のポリペプチドの活性と異なる活性を表す。ポリペプチドの活性は、その天然カウンターパートの活性より強いため異常である可能性がある。あるいは、活性は、その天然カウンターパートの活性と対比して弱いか、または存在しないため、異常である可能性がある。異常な活性は、活性の変化である可能性もある。たとえば、異常なポリペプチドは異なるターゲットペプチドと相互作用する可能性がある。細胞はIL−1遺伝子座ポリペプチドをコードするIL−1座遺伝子の過剰発現または過少発現のため異常なIL−1活性をもつ可能性がある。
【0031】
”細胞”、”宿主細胞”または”組換え細胞”は、特定の対象細胞だけでなく、その細胞の子孫または潜在子孫をも表すために本明細書中で互換性をもって用いられる用語である。後続世代において変異または環境の影響のため何らかの修飾が起きる可能性があるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、なお本明細書中で用いるこの用語の範囲に含まれる。
【0032】
”キメラ”、”モザイク”、”キメラ哺乳動物”などは、そのゲノム含有細胞の少なくとも一部にノックアウトまたはノックイン構築体を含むトランスジェニック哺乳動物を表す。
【0033】
用語”対照”または”対照試料”は、用いる検出法に適した任意の試料を表す。対照試料には、用いる対立遺伝子検出法の生成物または被験物質を含めることができる。さらに、対照は陽性または陰性対照であってもよい。たとえば対立遺伝子検出法がPCR増幅法、続いてサイズ分画法である場合、対照試料は適切なサイズのDNAフラグメントを含むことができる。同様に、対立遺伝子検出法が変異タンパク質の検出を伴う場合、対照試料は変異タンパク質の試料を含むことができる。しかし、対照試料は被験物質を含むことが好ましい。たとえば対照はゲノムDNA試料または、IL−1遺伝子クラスターのクローン化した部分であってよい。ただし、被験試料がゲノムDNAである場合、対照試料は好ましくはゲノムDNAの高度精製試料である。
【0034】
”遺伝子の破壊(disruption)”および”ターゲティングした破壊”という句またはこれらに類する句は、遺伝子の野生型コピーと比較して細胞におけるその遺伝子の発現を阻止するような、天然DNA配列の部位特異的破壊を表す。破壊は遺伝子に対する欠失、挿入もしくは修飾、またはその任意の組合わせにより引き起すことができる。
【0035】
本明細書中で用いる用語”ハプロタイプ”は、統計的に有意のレベル(pcorr<0.05)でグループとして一緒に(連関非平衡状態で)遺伝する一組の対立遺伝子を表すものとする。本明細書中で用いる句”IL−1ハプロタイプ”は、IL−1遺伝子座におけるハプロタイプを表す。IL−1炎症性または前炎症性ハプロタイプは、アゴニスト活性増大および/またはアンタゴニスト活性低下を示すハプロタイプを表す。
【0036】
本明細書中で用いる用語”IL−1遺伝子クラスター”および”IL−1遺伝子座”は、第2染色体の2q13領域またはその付近のすべての核酸を含み、これには少なくともIL−1A、IL−1BおよびIL−1RN遺伝子、ならびに他の連関配列が含まれる(Nicklin,et al.,Genomics,19:382−84,1994)。本明細書中で用いる用語”IL−1A”、”IL−1B”および”IL−1RN”は、それぞれIL−1α、IL−1βおよびIL−1受容体アンタゴニストををコードする遺伝子を表す。IL−1A、IL−1BおよびIL−1RNの遺伝子寄託番号は、それぞれX03833、X04500およびX64532である。
【0037】
”IL−1機能性変異”は、IL−1遺伝子クラスター内の変異であって、表現型を変化させる(すなわちIL−1遺伝子またはタンパク質の機能に影響を与える)ものを表す。例にはIL−1A(+4845)対立遺伝子2、IL−1B(+3954)対立遺伝子2、IL−1B(+6912)対立遺伝子2およびIL−1RN(+2018)対立遺伝子2が含まれる。
【0038】
本明細書中で用いる用語”IL−1X(Z)対立遺伝子Y”は、遺伝子XのIL−1遺伝子座多型部位にある特定の対立遺伝子形(Yと表示する)を表し、ここでXはIL−1A、BまたはRNであり、ヌクレオチドZはそのIL−1遺伝子Xの主要転写開始部位(これがヌクレオチド+1である)に対して番号を付けられる。さらに、本明細書中で用いる用語”IL−1X対立遺伝子(Z)”は、ヌクレオチドZまたはその付近にある遺伝子X中のIL−1多型部位のすべての対立遺伝子を表す。たとえば用語”IL−1RN(+2018)対立遺伝子”は、マーカー+2018にあるIL−1RN遺伝子の別形態を表す。”IL−1RN(+2018)対立遺伝子1”は、センス鎖の+2018にシトシン(C)を含む形のIL−1RN遺伝子を表す(Clay,et al.,Hum.Genet.,97:723−26,1996)。”IL−1RN(+2018)対立遺伝子2”は、プラス鎖の+2018にチミン(T)を含む形のIL−1RN遺伝子を表す。対象が2つの同一IL−1RN対立遺伝子をもつ場合、その対象はホモ接合体である、またはホモ接合状態にあると言われる。対象が2つの異なるIL−1RN対立遺伝子をもつ場合、その対象はヘテロ接合体である、またはヘテロ接合状態にあると言われる。用語”IL−1RN(+2018)対立遺伝子2,2”は、ホモ接合IL−1RN(+2018)対立遺伝子2状態を表す。これに対し、用語”IL−1RN(+2018)対立遺伝子1,1”は、ホモ接合IL−1RN(+2018)対立遺伝子1状態を表す。用語”IL−1RN(+2018)対立遺伝子1,2”は、ヘテロ接合対立遺伝子1および2状態を表す。
【0039】
本明細書中で用いる”IL−1関連”は、ヒト第2染色体上のヒトIL−1座遺伝子(2q12−14)に関連するすべての遺伝子を含むものとする。これらはヒト第2染色体にあるヒトIL−1遺伝子クラスターのIL−1遺伝子(2q13−14)を含み、これには下記のものが含まれる:インターロイキン−1αをコードするIL−1A遺伝子、インターロイキン−1βをコードするIL−1B遺伝子、およびインターロイキン−1受容体アンタゴニストをコードするIL−1RN(またはIL−1ra)遺伝子。さらに、これらのIL−1関連遺伝子には、ヒト第2染色体上にあるI型およびII型ヒトIL−1受容体遺伝子(2q12)、ならびにマウス第1染色体の位置19.5cM上にあるそれらのマウス相同体が含まれる。インターロイキン−1α、インターロイキン−1βおよびインターロイキン−1RNは、それらがすべてIL−1 I型受容体に結合するほどの関連性をもつが、インターロイキン−1αおよびインターロイキン−1βのみがIL−1 I型受容体を活性化するアゴニストリガンドであり、これに対しインターロイキン−1RNは天然アンタゴニストリガンドである。遺伝子生成物またはポリペプチドに関して用語”IL−1”を用いる場合、それはヒト第2染色体上のインターロイキン−1遺伝子座(2q12−14)によりコードされるすべての遺伝子生成物、および他の種に由来するそれらに対応する相同体またはその機能性変異体を表すものとする。したがって用語IL−1には、炎症反応を促進する分泌ポリペプチド、たとえばIL−1αおよびIL−1β、ならびに炎症反応に拮抗する分泌ポリペプチド、たとえばIL−1受容体アンタゴニストおよびIL−1 II型(デコイ)受容体が含まれる。
【0040】
”IL−1受容体”または”IL−1R”は、IL−1遺伝子座によりコードされるリガンドに結合し、および/またはリガンドからの信号を伝達しうる、種々の細胞膜結合したタンパク質受容体を表す。この用語は、インターロイキン−1(IL−1)分子に結合し、それらの天然構造において哺乳動物細胞膜タンパク質として、IL−1が提示する信号を細胞へ伝達することができるいかなるタンパク質にも適用される。本明細書中で用いるこの用語には、IL−1結合活性または信号伝達活性をもつ天然タンパク質類似体が含まれる。例には、USP4,968,607に記載されるヒトおよびネズミIL−1受容体が含まれる。用語”IL−1核酸”は、IL−1タンパク質をコードする核酸を表す。
【0041】
”IL−1ポリペプチド”および”IL−1タンパク質”は、IL−1ゲノムDNA配列(図1、2および3に示す)またはそのフラグメントおよびその相同体によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するものとし、これにはアゴニストおよびアンタゴニストポリペプチドが含まれる。
【0042】
”リスクが高い”とは、特定の多型対立遺伝子を保有する個体において、その多型対立遺伝子を保有しない集団のメンバーにおけるその疾患または状態の発症頻度と比較して、その疾患または状態の発症頻度が統計的に高いことを表す。
【0043】
本明細書中で用いる用語”相互作用”は、分子間の検出可能な関係または結合(たとえば生化学的相互作用)、たとえばタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、およびタンパク質−小分子、または核酸−小分子間の自然な相互作用を含むものとする。
【0044】
本明細書中で核酸、たとえばDNAまたはRNAに関して用いる用語”単離した”は、それぞれその高分子の天然源中に存在する他のDNAまたはRNAから分離した分子を表す。たとえば被験IL−1ポリペプチドのいずれかをコードする単離した核酸には、好ましくは自然界でゲノムDNA中においてIL−1遺伝子のすぐ周囲にある(フランキングする)10kbを超える核酸配列が含まれず、より好ましくは5kbを超えるそのような天然フランキング配列が含まれず、最も好ましくはそのような天然フランキング配列は1.5kb未満である。本明細書中で用いる単離したという用語は、細胞性物質、ウイルス性物質を実質的に含まず、あるいは組換えDNA法により製造した場合は培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成した場合は前駆物質その他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはペプチドをも表す。さらに、”単離した核酸”は、天然にはフラグメントとして存在しない核酸フラグメントおよび天然状態ではみられない核酸フラグメントを含むものとする。本明細書中で用語”単離した”は、他の細胞性タンパク質から単離したポリペプチドを表すためにも用いられ、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドをいずれも包含するものとする。
【0045】
”ノックイン”トランスジェニック動物は、修飾された遺伝子をそのゲノムに導入した動物を表し、その修飾された遺伝子は外因性または内因性であってよい。
【0046】
本明細書中で用いる用語”ノックアウト”トランスジェニック動物は、内因性遺伝子の発現が部分的または完全に抑制された動物を表す(たとえば少なくとも一部の遺伝子の欠失、少なくとも一部の遺伝子と第2配列の交換、停止コドンの導入、重要なアミノ酸をコードする塩基の変異、またはイントロンジャンクションの除去などに基づく)。
【0047】
”ノックアウト構築体”は、細胞において内因性DNA配列によりコードされるタンパク質の発現を低下または抑制するために使用できる核酸配列を表す。簡単な例では、ノックアウト構築体は、遺伝子の重要な部分が欠失し、したがってそれから活性タンパク質が発現し得ない遺伝子、たとえばIL−1RN遺伝子からなる。あるいは多数の終止コドンを天然遺伝子に付加してタンパク質を早期に終止させるか、またはイントロンジャンクションを不活性化することができる。代表的なノックアウト構築体においては、遺伝子の一部を選択性マーカー(たとえばneo遺伝子)と交換し、したがってその遺伝子は下記のように表すことができる:IL−1RN 5’/neo/IL−1RN 3’;ここでIL−1RN 5’およびIL−1RN 3’は、それぞれIL−1遺伝子の一部に対して上流または下流にあるゲノム配列またはcDNA配列を表し、neoはネオマイシン耐性遺伝子を表す。他のノックアウト構築体においては、第2の選択性マーカーをフランキング部分に付加し、したがってその遺伝子は下記のように表すことができる:IL−1RN/neo/IL−1RN/TK;ここでTKはチミジンキナーゼ遺伝子であり、この構築体のIL−1RN 5’側配列またはIL−1RN 3’側配列のいずれに付加することもでき、さらにこれを適切な培地中で負に選択することもできる(すなわち負の選択性マーカー)。この2マーカー構築体により、相同組換え事象を選択することができ、これにより一般にTK配列を保持する非相同組換え事象からフランキングTKマーカーが除かれる。この遺伝子欠失および/または置換は、エキソン、イントロン、特にイントロンジャンクション、および/または調節配列、たとえばプロモーターから行うことができる。
【0048】
”連関非平衡”は、2つの対立遺伝子が、その対照集団における各対立遺伝子の個別の発生頻度から予想されるより高い頻度で同時遺伝することを表す。独立して遺伝する2つの対立遺伝子の予想発生頻度は、第1対立遺伝子の頻度に第2対立遺伝子の頻度を掛けたものである。予想頻度で同時発生する対立遺伝子は”連関非平衡”状態にあると言われる。連関非平衡の原因は分からないことが多い。特定の対立遺伝子組合わせの選択、または遺伝的にヘテロロガスな集団が最近混合したことに起因する可能性がある。さらに、疾病遺伝子にきわめて密接に連関したマーカーの場合、その疾病変異が最近起きたものであってその特定の染色体領域で組換え事象により平衡に達するのに十分な時間が経過していなければ、対立遺伝子(または連関した対立遺伝子のグループ)と疾病遺伝子の関連が想像される。1より多い対立遺伝子からなる対立遺伝子パターンについては、第1対立遺伝子パターンを含むすべての対立遺伝子が少なくとも1つの第2対立遺伝子パターンと連関非平衡状態にあれば、第1対立遺伝子パターンは第2対立遺伝子パターンと連関非平衡状態にある。連関非平衡の例は、IL−1RN(+2018)多型部位とIL−1RN(VNTR)多型部位の対立遺伝子間に起きるものである。IL−1RN(+2018)の2つの対立遺伝子は、IL−1RN(VNTR)の最も頻度の高い2つの対立遺伝子(対立遺伝子1および対立遺伝子2)と100%連関非平衡状態にある。
【0049】
用語”マーカー”は、ゲノム中において個体間で変動することが知られている配列を表す。たとえばIL−1RN遺伝子は個数の変動する縦列反復配列(variable number tandem repeat、VNTR)からなるマーカーをもつ。
【0050】
”変異遺伝子”または”変異”または”機能的変異”は、対立遺伝子形の遺伝子であって、変異遺伝子をもたない対象と比較して変異遺伝子をもつ対象の表現型を変化させうるものを表す。変異により変化した表現型を特定の薬剤で補正または代償することができる。この変異が変化した表現型をもつためにはその対象がホモ接合性でなければならないとすれば、その変異は劣性であると言われる。対象の表現型を変化させるのに1コピーの変異遺伝子で十分であれば、その変異は優性であると言われる。対象が1コピーの変異遺伝子をもち、ホモ接合形対象の表現型とヘテロ接合形対象の表現型の中間の表現型をもつ(その遺伝子に関して)場合、その変異は相互優性(co−dominant)であると言われる。
【0051】
本発明の”非ヒト動物”には、哺乳動物、たとえばげっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギなど、両生類、たとえばアフリカツメガエル(Xenopus)属のメンバー、ならびにトランスジェニック鳥類(たとえばニワトリ、鳥類など)が含まれる。本明細書中で用語”キメラ動物”は、その動物の全部ではなく一部の細胞に組換え遺伝子が存在する動物または組換え遺伝子が発現する動物を表す。用語”組織特異的キメラ動物”は、ある組織においては組換えIL−1遺伝子の1つが存在および/または発現し、あるいは破壊されるが、他の組織ではそうでないことを示す。用語”非ヒト哺乳動物”は、ヒト以外の哺乳動物綱のすべてのメンバーを表す。
【0052】
本明細書中で用いる用語”核酸”は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、たとえばデオキシリボ核酸(DNA)および適切な場合にはリボ核酸(RNA)を表す。この用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体(たとえばペプチド核酸)から調製した、RNAまたはDNAの類似体であって、本明細書に記載する態様に適用できるもの、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖ポリヌクレオチドをも含むと理解すべきである。
【0053】
用語”骨粗鬆症”は、世界保健機構により”...低い骨質量および骨組織の微細構造劣化を特徴とし、結果的に骨脆弱性および骨折しやすさが増す全身性骨格疾患”と定義されている(WHO Consensus Development Conference 1993)。骨粗鬆症の臨床定義は、骨無機質密度(BMD)または骨無機質濃度(BMC)が若い健常な女性の平均より約2.5標準偏差(SD)以上低い状態である。重症の骨粗鬆症は、BMDまたはBMCが若い健常な女性の平均より約2.5SD以上低く、かつ1回以上の脆性骨折があることと定義される。骨損失は特定の部位に厳密に限定されないので、骨粗鬆症は歯槽骨、大腿骨、橈骨、椎骨または手首骨の損失または骨折発生率、閉経後の骨損失、著しい骨質量低下、骨折発生率または骨損失速度を含めたさまざまな形で現われる。
【0054】
用語”多型”は、1より多い形の遺伝子またはその部分(たとえば対立遺伝子変異体)が同時に存在することを表す。少なくとも2つの異なる形(すなわち2つの異なるヌクレオチド配列)がある遺伝子部分を”遺伝子の多型領域”と呼ぶ。遺伝子の多型領域の特定の遺伝子配列は対立遺伝子である。多型領域は、異なる対立遺伝子において同一性が異なる1個のヌクレオチドであってもよい。多型領域はヌクレオチド数個の長さであってもよい。
【0055】
用語”疾患に対する性向”、および疾患に対する”素因”もしくは”罹患しやすさ”またはこれらに類する句は、特定の対立遺伝子が対象における特定の疾患(たとえば血管疾患)の発症率と関連することまたは発症の推定となることが本発明により見いだされたことを意味する。たとえばこれらの対立遺伝子は、健常な個体と比較して疾患を伴う個体に過剰な頻度で存在する。したがって、発症前または罹患前の個体においてすら、これらの対立遺伝子を疾患の推定に利用できる。
【0056】
本明細書中で用いる”小分子”は、約5kD未満、最も好ましくは約4kD未満の分子量をもつ組成物を表すものとする。小分子は核酸、ペプチド、ペプチド模倣体、脂質、または他の有機もしくは無機分子であってよい。
【0057】
本明細書中で用いる用語”特異的にハイブリダイズする”または”特異的に検出する”は、核酸分子が試料核酸の少なくとも約6個の連続ヌクレオチドにハイブリダイズしうることを表す。
【0058】
”転写調節配列”は、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターなど、それらが機能可能な状態で結合したタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するDNA配列を表すために本明細書全体において用いる遺伝学用語である。
【0059】
本明細書中で用いる用語”トランスジーン”は、細胞に導入された核酸配列(たとえばIL−1ポリペプチドの1つ、またはそれのアンチセンス転写体をコードするもの)を意味する。トランスジーンは、それを導入したトランスジェニック動物または細胞に対して一部または全部がヘテロロガス(すなわち外来)であってもよく、それを導入したトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に対して相同であってもよい。ただしトランスジーンは、それを導入する細胞のゲノムを変化させる状態で動物のゲノムに挿入されるように設計され、または挿入される(たとえば天然遺伝子のものと異なる位置に挿入され、あるいはその挿入によりノックアウトが起きる)。トランスジーンは細胞内にエピソームの形で存在してもよい。トランスジーンは、選択した核酸の最適発現に必要な1以上の転写調節配列および他の任意の核酸、たとえばイントロンを含むことができる。
【0060】
本明細書中で用いる用語”トランスジェニック動物”は、その動物の1以上の細胞がヒトの介入(たとえば当技術分野で周知のトランスジェニック法)により導入されたヘテロロガス核酸を含む動物(好ましくは非ヒト哺乳動物)、鳥類または両生類を表す。核酸は細胞に直接導入され、あるいは間接的に、細胞前駆体への導入、意図的な遺伝子操作、たとえばマイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染により導入される。遺伝子操作という用語は古典的な雑種形成またはインビトロ受精を含まず、組換えDNA分子の導入を表す。この分子は染色体に組み込むことができ、あるいは染色体外で複製するDNAであってもよい。本明細書に記載する一般的なトランスジェニック動物においては、トランスジーンが細胞にIL−1ポリペプチドの1つの組換え形、たとえばアゴニスト形またはアンタゴニスト形を発現させる。しかし組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物、たとえば後記のFLPまたはCRE組換え酵素依存性構築体も考慮される。さらに、”トランスジェニック動物”には、ヒトの介入(組換え法およびアンチセンス法のいずれも含まれる)により1以上の遺伝子の遺伝子破壊が起きた組換え動物も含まれる。この用語は、すべての子孫世代を含むものとする。したがって、創始動物、およびそのすべてのF1、F2、F3などの子孫が含まれる。
【0061】
本明細書中で用いる用語”治療”は、状態または疾患の少なくとも1つの症状の治癒または軽減を含むものとする。
本明細書中で用いる用語”ベクター”は、それが結合している他の核酸を伝達しうる核酸分子を表す。1タイプの好ましいベクターはエピソーム、すなわち染色体外複製しうる核酸である。好ましいベクターは、それらが結合している核酸を自己複製および/または発現しうるものである。それらが機能可能な状態で結合している遺伝子の発現を指令しうるベクターを、本明細書において”発現ベクター”と呼ぶ。一般に組換えDNA法に利用できる発現ベクターは、しばしば”プラスミド”の形である。これは一般に環状二本鎖DNAループを表し、それらのベクターの形では染色体に結合しない。プラスミドは最も一般的に用いられる形のベクターであるから、本明細書において”プラスミド”および”ベクター”は互換性をもって用いられる。ただし本発明は、同等な機能をもち、当技術分野において今後既知になる他の形の発現ベクターを含むものとする。
【0062】
用語”野生型対立遺伝子”は、対象において2コピーで存在した場合に野生型表現型を生じる遺伝子の対立遺伝子を表す。遺伝子におけるあるヌクレオチド変化がそれらのヌクレオチド変化をもつ2コピーの遺伝子を有する対象の表現型に影響を与えないこともあるので、特定の遺伝子の幾つかの異なる野生型対立遺伝子がありうる。
【0063】
4.2.医薬の推定
4.2.1.IL−1対立遺伝子およびハプロタイプの同定
本発明は、少なくとも一部は、骨損失、骨折のリスクその他、骨粗鬆症の指標に関連する(統計的に有意な程度に)と判定された特定の対立遺伝子の同定に基づく。したがってこれらの対立遺伝子の検出は、その対象が骨粗鬆症を伴うかまたは発症する素因をもつことの指標となりうる。ただしこれらの対立遺伝子は他の対立遺伝子と連関非平衡状態にあるので、そのような他の対立遺伝子の検出も、その対象が特定の疾患または状態を伴うかまたは発症する素因をもつことの指標となりうる。たとえば44112332ハプロタイプは下記の遺伝子型を含む:
IL−1Aの222/223マーカーの対立遺伝子4
IL−1Aのgz5/gz6マーカーの対立遺伝子4
IL−1Aの−889マーカーの対立遺伝子1
IL−1Bの+3954マーカーの対立遺伝子1
IL−1Bの−511マーカーの対立遺伝子2
gaat.p33330マーカーの対立遺伝子3
Y31マーカーの対立遺伝子3
IL−1RNの+2018の対立遺伝子2
IL−1RのVNTRマーカーの対立遺伝子2
IL−1RNオータナティブエキソン(エキソンlic;細胞内形の遺伝子生成物を産生する)における他の3つの多型もIL−1RN(VNTR)の対立遺伝子2と連関非平衡状態にある(Clay,et al(1996)Hum.Genet.,97:723−26)。これらには下記のものが含まれる:IL−1RNエキソンlic(1812)(GenBank:X77090の1812);IL−1RNエキソンlic(1868)多型(GenBank:X77090の1868);およびIL−1RNエキソンlic(1887)多型(GenBank:X77090の1887)。オータナティブスプライシングされた細胞内形遺伝子のプロモーターにおけるさらに他の多型Pic(1731)多型(GenBank:X77090の1731)もIL−1RN(VNTR)多型遺伝子座の対立遺伝子2と連関非平衡状態にある。これらの多型遺伝子座それぞれについて、対立遺伝子2配列変異体はIL−1RN(VNTR)遺伝子座の対立遺伝子2と連関非平衡状態にあると判定された(Clay,et al(1996)Hum.Genet.,97:723−26)。
【0064】
33221461ハプロタイプは下記の遺伝子型を含む:
IL−1Aの222/223マーカーの対立遺伝子3
IL−1Aのgz5/gz6マーカーの対立遺伝子3
IL−1Aの−889マーカーの対立遺伝子2
IL−1Bの+3954マーカーの対立遺伝子2
IL−1Bの−511マーカーの対立遺伝子1
gaat.p33330マーカーの対立遺伝子4
Y31マーカーの対立遺伝子36
IL−1RNの+2018の対立遺伝子1
IL−1RNのVNTRマーカーの対立遺伝子1
44112332ハプロタイプをもつ個体は、刺激されるとIL−1αおよびIL−1βタンパク質の両方を一般に過剰産生する。これに対し33221461ハプロタイプをもつ個体は一般にIL−1raを過少産生する。各ハプロタイプは、刺激されると正味IL−1αおよびIL−1βタンパク質産生を生じる。これに対し33221461ハプロタイプをもつ個体は一般にIL−1raを過少産生する。各ハプロタイプは正味で前炎症反応を生じる。ハプロタイプ内の各対立遺伝子は1効果、および複合遺伝子型効果をもつ。さらに、特定の疾患は両ハプロタイプパターンと関連をもつ可能性がある。
【0065】
本明細書に記載するように、当業者は前記対立遺伝子パターンのほかに、骨粗鬆症に関連する対立遺伝子と連関非平衡状態にある他の対立遺伝子(多型および変異を含む)を容易に同定できる。たとえば骨粗鬆症を伴わない第1群の対象からの核酸試料、およびを障害を伴う第2群の対象からのDNAを採集する。次いで核酸試料を比較して、第1群と比較して第2群に過剰発現している対立遺伝子を同定する。その際、そのような対立遺伝子は骨粗鬆症に関連すると推定される。あるいは、たとえば大集団の遺伝子型を決定し、統計的分析を実施して、どの対立遺伝子が予想より多く一緒に出現するかを判定することにより、骨粗鬆症に関連する対立遺伝子と連関非平衡状態にある対立遺伝子を同定することができる。好ましくは、この群は、遺伝的に関係のある個体からなるように選択される。遺伝的に関係のある個体には、同一人種、同一民族、さらには同一家族に由来する個体が含まれる。対照群と被験群の間の遺伝的関係の程度が高いほど、病因性対立遺伝子との連関がより離れた多型対立遺伝子の推定値も高くなる。これは、経過した進化時間は、創始集団の染色体に連関した多型が遺伝子交差事象により再分布しうる時間より短いからである。こうして、ヒトの進化においてかなり最近、たとえば主な人種が分化した後、ヒト集団が別個の民族に分離した後、さらには特定の家系の最近の歴史内に生じた疾病対立遺伝子を検出しうる、人種特異的、民族特異的、さらには家族特異的な診断用遺伝子型アッセイ法を開発することができる。
【0066】
2つの多型マーカー間または1つの多型マーカーと病因性変異の間の連関非平衡は準安定状態である。原因となる変異事象の選択圧または散在連関型再出現(sporadic linked reoccurrence)が無い場合、多型はヒトの進化の過程で結果的に染色体組換え事象により解離し、これにより連関平衡に達するであろう。したがって、疾患または状態と連関非平衡状態にある多型対立遺伝子を見いだす可能性は、少なくとも2つの要因の変化に伴って、すなわち多型マーカーと病因性変異の物理的距離が短いほど、および連関対の解離に使われる減数分裂世代数が少ないほど、高まるであろう。後者の要因を考慮すると、2個体が近縁であるほど、それらが親染色体または連関多型を含む親染色体領域を共有する可能性は高まり、この連関対が各世代で起きる減数分裂乗換え事象により連関解除する可能性は少なくなることが示唆される。その結果、2個体が近縁であるほど、距離の離れた多型が同時遺伝する可能性が高まる。したがって、共通の人種、民族または家族という関連性をもつ個体については、距離のかなり離れた多型の信頼性を連関病因性変異の遺伝の指標として信頼できる。
【0067】
IL−1遺伝子座の特定の遺伝子、たとえばIL−1A、IL−1BもしくはIL−1RNまたは関連遺伝子にハイブリダイズするのに敵したプローブを設計できる。これらのゲノムDNA配列はそれぞれ図3、4および5に示され、それぞれSEQ ID No.1、2および3に対応する。あるいはこれらのプローブは、関連ゲノム遺伝子座の遺伝子間配列を含めた他の領域を含むことができる。実際に、ヒト第2染色体のIL−1領域はほぼ400,000塩基対に及び、平均して1,000塩基対毎に1つのヌクレオチド多型があると仮定すると、単独でほぼ400SNPの遺伝子座を含む。本発明に利用できるさらに他の多型は種々の刊行物から得られる。たとえばヒトゲノムデータベースが遺伝子間SNPを収集しており、配列により検索でき、現在約2,700のエントリーを含む(http://hgbase.interactiva.de)。マサチュセッツ工科大学が保有するヒト多型データベースも利用できる(MIT SNPデータベース(http://www.genome.wi.mit.edu./SNP/human/index.html))。このような情報源からSNPその他のヒト多型を知ることができる。
【0068】
これらのデータベースでたとえばヒトゲノムのIL−1領域を調べると、IL−1座遺伝子は127.4cM(センチモルガン(centiMorgans))にあるマイクロサテライトマーカーAFM220ze3と表示されるセントロメア近位多型マーカー(GenBank寄託番号Z17008参照)および127.9cMにあるマイクロサテライトアンカーマーカーAFM087xa1と表示される遠位多型マーカー(GenBank寄託番号Z16545参照)によりフランキングされていることが分かる。これらのヒト多型遺伝子座は両方ともCA二塩基反復マイクロサテライト多型であり、したがってヒト集団において高度のヘテロ接合性を示す。たとえばAFM220ze3の1つの対立遺伝子は、配列TGTACCTAAGCCCCACCCTTTAGAGC(SEQ ID No.4)の5’プライマーおよび配列TGGCCTCCAGAAACCTCCAA(SEQ ID No.5)の3’プライマーにより211bpのPCR増幅生成物を生成する。さらに、AFM087xa1の1つの対立遺伝子は、配列GCTGATATTCTGGTGGGAAA(SEQ ID No.6)の5’プライマーおよび配列GGCAAGAGCAAAACTCTGTC(SEQ ID No.7)の3’プライマーにより177bpのPCR増幅生成物を生成する。これらのヒト第2染色体CA二塩基反復多型に対して5’側および3’側にあるユニーク配列に対応する同等なプライマーは当業者に自明であろう。妥当な同等プライマーには、表記したプライマーの約1kb以内にハイブリダイズし、さらに約17〜約27bpのいずれかの長さのものが含まれる。ユニークヒト染色体ゲノム配列の増幅に用いるプライマーを設計するための一般的指針は、それらが少なくとも約50℃の融点をもつことであり、適切な融点は式Tmelt=[2×(AまたはTの個数)+4×(GまたはCの個数)]から推定できる。
【0069】
これらのCA二塩基反復多型間には他の多数のヒト多型遺伝子座があり、家族その他の遺伝的に関連する個体群における予後判定用対立遺伝子を判定するための他のターゲットとなる。たとえば国立バイオテクノロジー情報センターウェブサイト(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)は、IL−1遺伝子座領域にある多数の多型マーカーを挙げており、適切な増幅プライマーの設計およびこれらのマーカーの分析に際しての指針を提供している。
【0070】
したがって、本発明のヌクレオチドセグメントはヒト染色体2q12−13の相補的延長配列またはその領域に由来するcDNAと選択的にデュプレックス分子を形成し、あるいはこの領域に由来するDNAまたはcDNAの増幅のためのプライマーを提供しうるので、有用である。これに適したプローブを設計するには、多数の要因を考慮する必要がある。たとえば10、15または18ヌクレオチドから約20または約30ヌクレオチドまでの長さをもつフラグメントは、特に有用である。より長い配列、たとえば40、50、80、90、100、さらには全長に及ぶものも、特定の態様にはさらに好ましい。十分に特異的にハイブリダイズし、したがって分子プローブとして有用であるには少なくとも約18〜20ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドで十分であることは、当業者に周知である。さらに、予想される用途に応じて、ターゲット配列に対するプローブの種々の選択度を達成するために種々のハイブリダイゼーション条件を用いることが望まれる。高い選択度を必要とする用途には、ハイブリッド形成のために一般に緊縮度が比較的高い条件を用いる必要がある。たとえば比較的低い塩条件および/または高い温度条件、たとえば0.02〜0.15MのNaClにより約50〜約70℃の温度で得られる条件を用いる。そのような選択的条件では、プローブと鋳型またはターゲット鎖との間の不適性塩基対合はほとんど(たとえあったとしても)受け入れられない。
【0071】
対象において前記の対立遺伝子の検出と組み合わせて、他の対立遺伝子または他の障害指標、たとえば血管壁の厚さの確認(たとえば超音波測定)、または対象の喫煙、飲酒、太り過ぎ、ストレスまたは運動状態を検出またはモニターすることができる。
【0072】
4.2.2.対立遺伝子の検出
ヒト多型遺伝子座の特定の対立遺伝子を検出する方法は多数ある。特定の多型対立遺伝子を検出するための好ましい方法は、一部は多型の分子の性質に依存する。たとえば多型遺伝子座の種々の対立遺伝子形は単一のDNA塩基対が異なる場合がある。そのような一ヌクレオチド多型(SNP)は遺伝子変異の主因であり、既知多型全体のほぼ80%を占め、ヒトゲノムにおけるそれらの密度は1,000塩基当たり平均1個と推定されている。SNPはわずか2つの異なる形で起きる二対立遺伝子性である場合が最も多い(理論的には、DNA中にある4個の異なるヌクレオチド塩基に対応して、最高4つの異なる形のSNPの可能性があるが)。それにもかかわらずSNPは他の多型より安定な変異であり、このためマーカーと未知変異体の間の連関非平衡を利用して病因性変異地図を作成する関連研究に適したものとなる。さらに、SNPは一般に2つの対立遺伝子をもつにすぎないので、長さの測定ではなく単純なプラス/マイナスアッセイ法で遺伝子型を決定でき、より自動化に適する。
【0073】
個体において特定の一ヌクレオチド多型性対立遺伝子の存在を検出する方法は多数ある。この分野の進歩により、的確、簡単で安価な大規模SNP遺伝子型決定法が提供された。最も最近では、たとえば動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(DASH)、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動(MADGE)、パイローゼケンチング(pyrosequnching)、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、TaqManシステム、および種々のDNA”チップ”法、たとえばAffymetrix SNPチップを含めた、幾つかの新しい技術が報告された。これらの方法ではターゲット遺伝子領域を一般にPCRにより増幅する必要がある。さらに他の新たに開発された、侵襲開裂による小シグナル分子の形成、続いて質量分析または固定化パッドロック(padlock)プローブおよびローリングサークル増幅に基づく方法は、結果的にPCRの必要性を排除するであろう。特定の一ヌクレオチド多型を検出するための当技術分野で既知の幾つかの方法を以下にまとめる。本発明方法は利用できるすべての方法を含むと理解される。
【0074】
一ヌクレオチド多型の分析を促進する幾つかの方法が開発された。1態様においては、特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いて一ヌクレオチド多型を検出することができる;たとえばMundy,C.R.(USP4,656,127)に開示。この方法によれば、多型のすぐ3’側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーを、その動物またはヒトから得たターゲット分子にハイブリダイズさせる。存在するエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドがターゲット分子の多型部位に含まれると、その誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれる。この取込みにより、プライマーはエキソヌクレアーゼ耐性となる。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性は既知であるので、プライマーがエキソヌクレアーゼ耐性になったという所見から、ターゲット分子の多型部位に存在するヌクレオチドは反応に用いたヌクレオチド誘導体のヌクレオチドに相補的であったことが明らかになる。この方法は、大量の無関係なデータを求める必要がないという利点をもつ。
【0075】
本発明の他の方法においては、多型部位のヌクレオチドの同一性を判定するために溶液ベースの方法を用いる;Cohen,D.ら(フランス特許2,650,840;WO91/02087)。USP4,656,127のMundy法と同様に、多型部位のすぐ3’側にある対立遺伝子配列に相補的なプライマーを用いる。この方法では、標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いてその部位のヌクレオチドの同一性を判定する。この誘導体は、多型部位のヌクレオチドに相補的であればプライマーの末端に取り込まれる。
【0076】
Genetic Bit Analysis(GBA、商標)として知られる別法は、Goelet,Pら(WO92/15712)により記載されている。このGoelet,Pらの方法では、標識ターミネーターと多型部位の3’側にある配列に相補的なプライマーとの混合物を用いる。したがって、取り込まれる標識ターミネーターは、評価されるターゲット分子の多型部位に存在するヌクレオチドにより決定され、これに相補的である。Cohenら(フランス特許2,650,840;WO91/02087)の方法と異なり、Goelet,Pらの方法は好ましくは不均一相アッセイであり、プライマーまたはターゲット分子を固相に固定化する。
【0077】
最近、DNA中の多型部位をアッセイするプライマーガイド式ヌクレオチド取込み法が幾つか報告された(Komher,J.S.,et al.,Nucl.Acids Res.,17:7779−7784(1989);Sokolov,B.P.,Nucl.Acids Res.,18:3671(1990);Syvanen,A.−C.,et al.,Genomics,8:684−692(1990);Kuppuswamy,M.N.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88:1143−1147(1991);Prezant,T.R.,et al.,Hum.Mutat.,1:159−164(1992);Ugozzoli,L.,et al.,GATA,9:107−112(1992);Nyren,P.,et al.,Anal.Biochem.,208:171−175(1993))。これらの方法はすべて、多型部位の塩基を識別するのに標識デオキシヌクレオチドの取込みに依存するという点でGBA(商標)と異なる。このような方式では信号は取り込まれたデオキシヌクレオチド数に比例するので、同じ一続きのヌクレオチド中にある多型はその一続きの長さに比例した信号を発することができる(Syvanen,A.−C.,et al.,Amer.J.Hum.Genet.,52:46−59(1993))。
【0078】
タンパク質翻訳を早期に終止させる変異については、タンパク質トランケーション試験(PTT)が効果的な診断法を提供する(Roest,et al.,(1993)Hum.Mol.Genet.,2:1719−21;van der Luijt,et al.(1994)Genomics,20:1−4)。PTTのためには、得られる組織からRNAをまず単離し、逆転写し、目標セグメントをPCRにより増幅させる。次いで、RNAポリメラーゼプロモーターおよび真核細胞翻訳開始のための配列を含むプライマーを用いる入れ子型PCR増幅のための鋳型として、この逆転写PCR生成物を使用する。目標領域の増幅後、プライマーに取り込まれたユニークモチーフにより、PCR生成物の逐次インビトロ転写および翻訳が行われる。翻訳生成物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、トランケートしたポリペプチドが出現すると、翻訳を早期終止させる変異の存在が確認される。この方法の変法では、目標とするターゲット領域が単一エキソンに由来する場合、DNA(RNAではなく)をPCR鋳型として用いる。
【0079】
本明細書に記載する方法に用いる核酸試料を得るためには、任意のタイプの細胞または組織を使用できる。好ましい態様においては、DNA試料を既知の方法(たとえば静脈穿刺)で採取した体液、たとえば血液、または唾液から得る。あるいは、乾いた試料(たとえば毛髪または皮膚)について核酸試験を実施することができる。RNAまたはタンパク質を用いる場合、使用する細胞または組織はIL−1遺伝子を発現しなければならない。
【0080】
診断法は、生検または切除片から得た患者組織の組織切片(固定および/または凍結)について直接にin situ実施することもでき、これによれば核酸精製の必要がない。核酸試薬をこのようなin situ法のプローブおよび/またはプライマーとして使用できる(たとえばNuovo,G.J.,1992,PCR in situ Hybridization:protocols and applications,Raven Press,ニューヨーク参照)。
【0081】
主に核酸配列の検出に注目した方法のほかに、このような検出方式においてプロフィールを評価することもできる。たとえばディファレンシャルディスプレー法、ノーザン分析および/またはRT−PCRにより、フィンガープリントプロフィールを作成することができる。
【0082】
好ましい検出法は対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションであり、これはIL−1前炎症性ハプロタイプの少なくとも1つの対立遺伝子の領域にオーバーラップする、変異または多型領域の周囲約5、10、20、25または30ヌクレオチドを含むプローブを用いる。本発明の好ましい態様においては、再狭窄に関与する他の対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズしうる幾つかのプローブを固相支持体、たとえば”チップ”(約250,000のオリゴヌクレオチドを支持できる)に結合させる。平版印刷を含めた多様な方法でオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させることができる。オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップ(”DNAプローブアレイ”とも呼ばれる)を用いる変異検出分析は、たとえばCronin,et al.(1996)Human Mutation,7:244に記載されている。1態様においては、チップは遺伝子の少なくとも1つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。次いで固相支持体を被験核酸と接触させ、特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、1以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性を1回のハイブリダイゼーション実験で同定できる。
【0083】
これらの方法は分析前に核酸を増幅させる工程を含んでもよい。増幅法は当業者に既知であり、下記のものが含まれるが、これらに限定されない:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、特異的対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(ASA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、入れ子型ポリメラーゼ連鎖反応、自己持続配列複製(Guatelli,J.C.,et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874−1878)、転写増幅系(Kwoh,D.Y.,et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173−1177)、およびQ−ベータレプリカーゼ(Lizardi,P.M.,et al.,1988,Bio/Technology,6:1197)。
【0084】
増幅生成物は、下記を含めた多様な方法でアッセイできる:サイズ分析、制限消化に続くサイズ分析、反応生成物中の特異的タグ付きオリゴヌクレオチドプライマーの検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的5’エキソヌクレアーゼ検出、配列決定、ハイブリダイゼーションなど。
【0085】
PCRベースの検出法には、複数のマーカーを同時に多重増幅させる方法が含まれる。たとえば、サイズのオーバーラップしないPCR生成物を生成するPCRプライマーを選択し、同時に分析しうることは、当技術分野で周知である。あるいは、異なる標識を付与し、したがってそれぞれ異なる方法で検出できるプライマーを用いて異なるマーカーを増幅することができる。もちろん、ハイブリダイゼーションベースの検出法によれば、1試料中の複数のPCR生成物を分別検出することができる。複数のマーカーを多重分析しうる他の方法も当技術分野で知られている。
【0086】
例示態様にすぎないが、本方法には(i)患者から細胞試料を採集し、(ii)核酸(たとえばゲノム、mRNA、または両者)を単離し、(iii)IL−1前炎症性ハプロタイプの少なくとも1つの対立遺伝子の5’側および3’側に、ハイブリダイゼーションおよび対立遺伝子の増幅が起きる条件下で特異的にハイブリダイズする1以上のプライマーと、核酸試料を接触させ、そして(iv)増幅生成物を検出する。これらの検出方式は、核酸分子の存在数がきわめて少ない場合にその検出に特に有用である。
【0087】
本発明のアッセイ法の好ましい態様においては、IL−1前炎症性ハプロタイプの対立遺伝子を制限酵素開裂パターンの変化により同定する。たとえば試料および対照DNAを単離し、増幅させ(所望により)、1以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントの長さをゲル電気泳動により測定する。
【0088】
さらに他の態様においては、当技術分野で既知の多様な配列決定反応のいずれかを用いて、対立遺伝子の配列を直接決定することができる。配列決定反応の例には、Maxim and Gilbert((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560)またはSanger(Sanger,et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463)が開発した方法に基づくものが含まれる。本発明のアッセイ法を実施する際、多様な自動配列決定法のいずれも利用できるものとする(たとえばBiotechniques(1995)19:448参照)。これには質量分析による配列決定が含まれる(たとえばWO94/16101;Cohen,et al.,(1996)Adv.Chromatogr.,36:127−162;およびGriffin,et al.(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.,38:147−159参照)。特定の態様については、配列決定反応において1、2または3個の核酸塩基の出現を測定すればよいことは当業者に自明であろう。たとえば1個の核酸のみを検出する場合、A−トラックなどを実施することができる。
【0089】
さらに他の態様においては、開裂剤(たとえばヌクレアーゼ;ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムとピペリジン)からの保護を利用して、RNA/RNAまたはRNA/DNAまたはDNA/DNAヘテロデュプレックス中の不適正対合塩基を検出できる(Myers,et al.(1985)Science,230:1242)。一般にこの技術”不適正塩基対合開裂”法は、野生型対立遺伝子を含む(標識)RNAまたはDNAを試料とハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロデュプレックスを得ることから始まる。対照鎖と試料鎖の間の塩基対合不適正のため存在するデュプレックスの一本鎖領域を開裂する物質でこの二本鎖デュプレックスを処理する。たとえばRNA/DNAデュプレックスをRNaseで処理し、DNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理して、不適正塩基対合領域を酵素消化することができる。1態様においては、不適正塩基対合領域を消化するために、DNA/DNAまたはRNA/DNAデュプレックスをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる。不適正塩基対合領域を消化した後、得られた材料を変性性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異部位を判定する。たとえばCotton,et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397;およびSaleeba,et al.,(1992)Methods Enzymol.,217:286−295参照。好ましい態様においては、検出のために対照DNAまたはRNAを標識することができる。
【0090】
さらに他の態様においては、二本鎖DNA中の不適正塩基対を認識する1以上のタンパク質(いわゆる”DNA不適正塩基対合修復”酵素)を不適正塩基対合開裂反応に用いる。たとえば大腸菌(E.coli)のmutY酵素はG/A不適正塩基対合のAを開裂し、HeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはG/T不適正塩基対合のTを開裂する(Hsu,et al.(1994)Carcinogenesis,15:1657−1662)。1態様例によれば、IL−1遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子に基づくプローブを、被験細胞由来のcDNAまたは他のDNA生成物にハイブリダイズさせる。このデュプレックスをDNA不適正塩基対合修復酵素で処理し、開裂生成物があれば電気泳動プロトコルなどから検出できる。たとえばUSP5,459,039参照。
【0091】
他の態様においては、IL−1遺伝子座対立遺伝子の同定に電気泳動移動度の変化を利用する。たとえば一本鎖コンホメーション多型(SSCP)を用いて変異核酸と野生型核酸の電気泳動移動度の相異を検出できる(Orita,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2766;Cotton(1993)Mutant Res.,285:125−144;およびHayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.,9:73−79も参照)。試料および対照のIL−1遺伝子座対立遺伝子の一本鎖DNAフラグメントを変性させ、そして再生させる。一本鎖核酸のこの二次構造は配列によって異なり、それにより生じる電気泳動移動度の変化から1塩基の変化ですら検出することができる。DNAフラグメントを標識するか、あるいは標識プローブで検出することもできる。RNA(DNAではなく)の使用によりアッセイ法の感度を高めることができる。この場合、二次構造は配列の変化に対しさらに感受性である。好ましい態様においては、本発明方法では電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロデュプレックス分子を分離するためにヘテロデュプレックス分析法を用いる(Keen,et al.(1991)Trends Genet.,7:5)。
【0092】
さらに他の態様においては、変性剤勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での対立遺伝子の移動を変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)(Myers,et al.(1985)Nature,313:485)によりアッセイする。DGGEを分析法として用いる場合、DNAが完全には変性しないことを保証するために、たとえば約40bpの高融点GC富化DNAのGCクランプをPCRで付加することによりDNAを修飾する。さらに他の態様においては、変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照DNAと試料DNAの移動度の相異を同定する(Rosenbaum and Reissner(1987)Biophys.Chem.,265:12753)。
【0093】
対立遺伝子を検出するための他の方法の例には選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー延長が含まれるが、これらに限定されない。たとえば既知の変異またはヌクレオチド相異(たとえば対立遺伝子変異体における)を中心に配置したオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全な適正塩基対合がみられる場合にのみハイブリダイゼーションしうる条件下でターゲットDNAにハイブリダイズさせる(Saiki,et al.(1986)Nature,324:163;Saiki,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6230)。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法を用いて、オリゴヌクレオチドがPCRターゲットDNAにハイブリダイズする場合は反応当たり1つの変異または多型領域を検査することができ、あるいはオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション用メンブランに付着させて標識ターゲットDNAとハイブリダイズさせる場合は多数の異なる変異または多型領域を検査することができる。
【0094】
あるいは、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅法を本発明と組み合わせて使用できる。特異的増幅にプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、目標とする変異または多型領域を分子の中心に保有する(したがって増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する)(Gibbs,et al.(1989)Nucl.Acids Res.,17:2437−2448);あるいは一方のプライマーの3’末端に保有し、この場合は適切な条件下で不適正塩基対合を阻止し、またはポリメラーゼ延長を減らすことができる(Prossner(1993)Tibtech,11:238)。さらに、新たな制限部位を変異領域に導入して開裂ベースの検出を行うことが望ましい(Gasparini,et al.(1992)Mol.Cell Probes,6:1)。ある態様においてはTaqリガーゼを増幅に用いて増幅を行うこともできると考えられる(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:189)。そのような例では、5’側配列の3’末端が完全に適正に塩基対合している場合にのみライゲーションが起き、増幅の有無を調べることにより、特定部位における既知変異の存在を検出できる。
【0095】
他の態様においては、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)を用いて対立遺伝子変異体の同定を実施できる;たとえばUSP4,998,617およびLandegren,U.,et al.((1988)Science,241:1077−1080)に記載。OLAプロトコルでは、ターゲットの一本鎖の隣接配列にハイブリダイズしうるように設計されたの2種類のオリゴヌクレオチドを用いる。一方のオリゴヌクレオチドは分離マーカー、たとえばビオチニル化されたものに結合し、他方は検出可能に標識される。ターゲット分子中に厳密な相補配列があれば、これらのオリゴヌクレオチドは末端を隣接させてハイブリダイズし、ライゲーション基質を形成する。次いでライゲーションさせると、標識オリゴヌクレオチドをアビジンまたは他のビオチンリガンドにより回収することができる。Nickerson,D.A.らは、PCRとOLAの利点を組み合わせた核酸検出アッセイ法を記載している(Nickerson,D.A.,et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:8923−27)。この方法では、ターゲットDNAの対数増幅を達成するためにPCRを用い、次いでこれをOLAで検出する。
【0096】
このOLA法に基づく幾つかの方法が開発されており、IL−1遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子を検出するのに使用できる。USP5,593,826には、3’−アミノ基をもつオリゴヌクレオチドおよび5’リン酸化オリゴヌクレオチドを用いてホスホルアミデート結合をもつ結合体を形成するOLAが開示されている。Tobeら((1996)Nucleic Acids Res.,24:3728)に記載された他のOLA変法では、PCRと組み合わせたOLAにより2つの対立遺伝子を単一のマイクロタイターウェル内で識別することができる。対立遺伝子特異的プライマーをそれぞれユニークハプテン、すなわちジゴキシゲニンおよびフルオレセインでマーキングすることにより、異なる酵素レポーター、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したハプテン特異的抗体を用いて各OLA反応を検出できる。この系により、2種類の異なる色を呈するハイスループット方式で2つの対立遺伝子を検出できる。
【0097】
本発明の他の態様は、再狭窄を発症する素因を検出するためのキットに関する。このキットは1以上のオリゴヌクレオチドを含むことができ、これにはIL−1遺伝子座ハプロタイプの少なくとも1つの対立遺伝子の5’側および3’側にハイブリダイズする5’および3’オリゴヌクレオチドが含まれる。PCR増幅用オリゴヌクレオチドは、その後の分析に好都合なサイズのPCR生成物を生成するために、25〜2500塩基対、好ましくは約100〜約500塩基対の間隔をおいてハイブリダイズすべきである。
【0098】
本発明の診断法に用いるのに特に好ましいプライマーには、SEQ ID No.1〜6が含まれる。
本発明方法によるIL−1多型対立遺伝子の増幅および検出に用いるための他のオリゴヌクレオチドの設計は、ヒト染色体2q13(ヒトIL−1遺伝子座が含まれる)からの最新の配列情報と、この遺伝子座について利用できる最新のヒト多型情報が共に得られることにより、容易になった。たとえばIL−1A、IL−1BおよびIL−1RNのDNA配列をそれぞれ図1(GenBank寄託番号X03833)、2(GenBank寄託番号X04500)および3(GenBank寄託番号X64532)に示す。この配列情報およびプライマー配列の設計と最適化のための当技術分野で既知の標準法を用いて、これらの遺伝子におけるヒト多型を検出するのに適したプライマーを容易に設計できる。そのようなプライマー配列の最適設計は、たとえば市販のプライマー選択プログラム、たとえばPrimer2.1、Primer3またはGeneFisherを用いて達成できる(下記も参照:Nicklin,M.H.J.,Weith,A.,Duff,G.W.,”ヒトインターロイキン−1α、インターロイキン−1βおよびインターロイキン−1受容体アンタゴニスト遺伝子を含む領域の物理的地図”,Genomics,19:382(1995);Nothwang,F.G.,et al.,”インターロイキン−1遺伝子クラスターの分子クローニング:染色体2q13領域に組み込まれたYAC/PACコンティグの構築および部分転写地図”,Genomics,41:370(1997);Clark,et al.(1986)Nucl.Acids Res.,14:7897−7914[正誤表はNucl.Acids Res.,15:868(1987)にある]およびGenome Database(GDB)プロジェクト:URL http://www.gdb.org)。
【0099】
キットに用いるためには、オリゴヌクレオチドは多様な天然および/または合成組成物、たとえば合成オリゴヌクレオチド、制限フラグメント、cDNA、合成ペプチド核酸(PNA)などであってよい。アッセイにおける同定を容易にするために、アッセイキットおよびアッセイ方法に標識オリゴヌクレオチドを用いることもできる。使用できる標識の例には、放射性標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性部分、金属結合性部分、抗原または抗体部分などが含まれる。
【0100】
キットは所望によりDNAサンプリング手段を含むこともできる。DNAサンプリング手段は当業者に周知であり、たとえば下記のものが含まれるが、これらに限定されない:支持体、たとえば濾紙、AmpliCard(商標)(シェフィールド大学、英国シェフィールドS10 2JF;Tarlow,J.W.,et al.,J.of Invest.Dermatol.,103:387−389(1994))など;DNA精製試薬、たとえばNucleon(商標)キット、細胞溶解用緩衝液、プロテイナーゼ溶液など;PCR試薬、たとえば10×反応緩衝液、熱安定性ポリメラーゼ、dNTPなど;および対立遺伝子検出手段、たとえばHinfI制限酵素、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、乾燥血液由来の入れ子型PCR用変性オリゴヌクレオチドプライマー。
【0101】
4.2.3.薬理ゲノム学
骨粗鬆症の発症に対する素因と関連付けた個々の対立遺伝子の知識そのもの、または同じ状態に関与する他の遺伝子欠損と組み合わせたものは、本発明の実用化、すなわち”薬理ゲノム学”の目標である個体の遺伝子プロフィールに従った処置を可能にする。たとえば個体のIL−1プロフィールを骨粗鬆症の集団プロフィールと比較することにより、特定の患者または患者集団(すなわち同じ遺伝子変異をもつ患者群)に対して安全かつ効果的であることが期待される薬物その他の治療方式を選択または設計できる。
【0102】
さらに、最高の臨床効果を示すと期待される集団を遺伝子プロフィールに基づいてターゲティングできるので、下記のことが可能となる:1)既に市販されている薬物の再評価;2)患者サブグループに特異的な安全上または効力上の制約があったため臨床開発が中断されていた薬物候補の救出;および3)候補となる療法薬の開発の促進および経費削減、ならびにより最適な薬物表示(たとえば原因変異に対する種々の用量の薬剤の効力を測定することは有効量の最適化に有用であるから)。
【0103】
ある療法を受けている個体の処置をタンパク質(たとえばIL−1α、IL−1βまたはIL−1Ra)、mRNAおよび/または転写レベルの測定によりモニターすることができる。検出されたレベルに応じて、その後その療法方式を継続するか、または調節する(用量の増加または減少)ことができる。好ましい態様においては、対象をある薬剤で処置することの有効性の判定には下記の工程が含まれる:(i)その薬剤の投与前に対象から投与前試料を採取する;(ii)投与前試料のタンパク質、mRNAまたはゲノムDNAのレベルまたは量を検出する;(iii)対象から1以上の投与後試料を採取する;(iv)投与後試料のタンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現レベルまたは活性を検出する;(v)投与前試料のタンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現レベルまたは活性を、投与後試料の対応するタンパク質、mRNAまたはゲノムDNAとそれぞれ比較する;そして(vi)これに従って対象への薬剤投与を変更する。
【0104】
療法薬投与の前と後に対象の細胞を採取してIL−1遺伝子以外の遺伝子の発現レベルを検出し、その療法による遺伝子発現の増減(有害となる可能性があるもの)がないことも確認できる。これはたとえば、転写プロフィール作成法により行うことができる。たとえばある療法をインビボで受けた細胞に由来するmRNA、およびその療法を受けていない同じタイプの細胞に由来するmRNAを逆転写し、多数の遺伝子に由来するDNAを含むチップにハイブリダイズさせ、これによりその療法で処置した細胞と処置しなかった細胞において遺伝子発現を比較することができる。
【0105】
4.3.骨粗鬆症療法
骨粗鬆症療法とは、対象の骨粗鬆症の発症を阻止もしくは遅延し、または症状を軽減する、いかなる薬剤または療法方式をも表す。療法薬はポリペプチド、ペプチド模倣体、核酸、または他の無機もしくは有機分子、好ましくは”小分子”であり、ビタミン、無機質または他の栄養素も含まれる。好ましくは療法はIL−1ポリペプチドの少なくとも1つの活性、たとえば受容体との相互作用を、天然ポリペプチドの模倣または増強(作動)もしくは阻害(拮抗)することにより調節できる。アゴニストは、野生型タンパク質、または野生型の生物活性の少なくとも1つ(たとえば受容体結合活性)をもつその誘導体であってよい。アゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレートするか、あるいはタンパク質の生物活性の少なくとも1つを高める化合物であってもよい。アゴニストは、ポリペプチドと他の分子、たとえば受容体との相互作用を高める化合物であってもよい。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子(たとえば受容体)との相互作用を阻害もしくは低下させる化合物、または信号伝達もしくは翻訳後プロセシングを遮断する薬剤(たとえばIL−1変換酵素(ICE)阻害薬)であってもよい。したがって好ましいアンタゴニストは、受容体への結合を阻害もしくは低下させ、これによりその後の受容体活性化を遮断する化合物である。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、あるいはタンパク質の存在量を減少させる化合物であってもよい。アンタゴニストは、優性ネガティブ形のポリペプチド、たとえばターゲットペプチド(たとえば受容体)と相互作用しうるがその受容体の活性化を促進しない形のポリペプチドであってよい。アンタゴニストは、優性ネガティブ形のポリペプチドをコードする核酸、アンチセンス核酸、またはRNAと特異的に相互作用しうるリボザイムであってもよい。さらに他のアンタゴニストは、ポリペプチドに結合してその作用を阻害する分子である。そのような分子には、ペプチド、たとえば生物活性をもたず、受容体への結合を阻害する形のターゲットペプチドが含まれる。したがってそのようなペプチドはタンパク質の活性部位に結合してそれがターゲットペプチドと相互作用するのを阻止する。さらに他のアンタゴニストには、結合してポリペプチドの生物学的機能を妨害するように分子のエピトープと特異的に相互作用する抗体が含まれる。さらに他の好ましい態様においては、アンタゴニストは小分子、たとえばポリペプチドとターゲット受容体の相互作用を阻害しうる分子である。あるいは、小分子は受容体結合部位以外の部位と相互作用することによりアンタゴニストとして機能することができる。
【0106】
IL−1(たとえばIL−1α、IL−1β、またはIL−1受容体アンタゴニスト)またはIL−1遺伝子と連関非平衡状態にある遺伝子によりコードされるタンパク質の調節薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子または核酸を含めたいかなるタイプの化合物であってもよい。好ましいアゴニストには、核酸(たとえばIL−1タンパク質をコードするもの、またはIL−1タンパク質によりアップ−もしくはダウン−レギュレートされる遺伝子)、タンパク質(たとえばIL−1タンパク質、またはそれによりアップ−もしくはダウン−レギュレートされるタンパク質)、または小分子(たとえばIL−1タンパク質の発現または結合を調節するもの)が含まれる。たとえば本明細書に記載するアッセイ法により同定できる好ましいアンタゴニストには、IL−1の転写および/またはタンパク質活性を抑制または阻害する作用をもつ核酸(たとえば一本鎖(アンチセンス)または二本鎖(トリプレックス)DNAまたはPNA、およびリボザイム)、タンパク質(たとえば抗体)、および小分子が含まれる。
【0107】
4.3.1.有効量
そのような化合物の毒性および療法効果は、細胞培養または実験動物における医薬標準法、たとえばLD50(集団の50%に対して致死的な量)およびED50(集団の50%において療法効果を示す量)により判定できる。有毒量と療法有効量の比率は治療指数であり、比率LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物の方が好ましい。有毒な副作用を示す化合物も使用可能であるが、非罹患細胞に対する損傷の可能性を最小限にすることにより副作用を少なくするために、そのような化合物には罹患組織をターゲティングする送達系を設計するように配慮すべきである。
【0108】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトに使用する用量範囲の判定に利用できる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないED5 0を含む循環濃度内にある。用量はこの範囲内で、用いる剤形および用いる投与経路に応じて変更できる。本発明方法に使用するいずれの化合物についても、療法有効量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養で測定したIC50(すなわち症状の最大阻害の半分を達成する被験化合物濃度)を含む循環血漿濃度を達成する用量を判定する。そのような情報を用いて、ヒトに有用な用量をより的確に決定することができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【0109】
4.3.2.処方および使用
本発明により使用する化合物を、常法により1以上の生理学的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と処方することができる。たとえば本発明化合物およびそれらの生理学的に許容できる塩類および溶媒和物を、たとえば注射、吸入もしくは吹入れ(口または鼻から)、または経口、口腔、非経口または直腸投与による投与のために処方することができる。
【0110】
そのような療法のために、全身および局所または局在投与を含めた多様な投与用に本発明化合物を処方することができる。方法および処方は一般にRemington’s Pharmaceutical Sciences(Meade Publishing社、ペンシルベニア州イーストン)にみられる。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含めた注射が好ましい。注射用としては、本発明化合物を溶液として、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、たとえばハンクス液またはリンゲル液中に処方することができる。さらに、本発明化合物を固体剤形で処方し、使用直前に再溶解または懸濁させることができる。凍結乾燥剤形も含まれる。
【0111】
経口投与のためには、組成物はたとえば常法により医薬的に許容できる下記の賦形剤を用いて製造した錠剤またはカプセル剤の形をとることができる:たとえば結合剤(たとえばプレゲル化したコーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(たとえば乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(たとえばバレイショデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム);または湿潤剤(たとえばラウリル硫酸ナトリウム)。錠剤を当技術分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、たとえば液剤、シロップ剤または懸濁液剤の形をとってもよく、あるいは使用前に水その他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製剤であってもよい。このような液体製剤は常法により医薬的に許容できる下記の添加剤を用いて調製できる:たとえば沈殿防止剤(たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪);乳化剤(たとえばレシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(たとえばationed油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油);および保存剤(たとえばp−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸)。これらの製剤は緩衝塩類、着香剤、着色剤および甘味剤を適宜含有してもよい。
【0112】
経口投与のための製剤は、有効化合物を制御放出するように処方することが適切である。口腔投与のためには、組成物は常法により処方した錠剤またはトローチの形をとることができる。吸入による投与のためには、本発明により使用する化合物をエアゾルスプレー剤の形で、適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素その他の適切なガスを用いて加圧パックまたはネブライザーから送達するのが好都合である。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は計量された量を送達するための弁を設けることにより決定できる。吸入器または吹入器に用いるために、本発明化合物および適切な粉末基剤(たとえば乳糖またはデンプン)の粉末ミックスを収容した、たとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを調製することができる。
【0113】
本発明化合物を注射による非経口投与、たとえばボーラス注射または連続注入用に処方することができる。注射用処方は単位用量剤形で、たとえばアンプルまたは多数回容器に入れ、保存剤を添加して供給することができる。組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤または乳剤の形をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および/または分散助剤などの配合剤(formulating agent)を含有してもよい。あるいは有効成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば発熱物質を含有しない無菌水により構成するための粉末状であってもよい。
【0114】
組成物は、たとえば慣用されるカカオ脂または他のグリセリドなどの坐剤基剤を含有する坐剤または貯留浣腸剤などの直腸用組成物として処方することもできる。
【0115】
前記処方のほかに、組成物をデポ製剤として処方してもよい。そのような持効性処方は埋込み(たとえば皮下または筋肉内に)または筋肉注射により投与できる。たとえば組成物を適切なポリマー材料または疎水性材料と(たとえば許容できる油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂と処方するか、あるいは貧溶解性誘導体、たとえば貧溶解性塩として処方することができる。他の適切な送達系には、薬物を長期間にわたって非侵襲的に局所送達しうるマイクロスフェアが含まれる。この方法には毛細血管サイズより小さいマイクロスフェアを用い、これを冠動脈カテーテルにより、たとえば心臓その他の臓器の選択した部分に、炎症または虚血を引き起すことなく注入することができる。投与した療法薬はこれらのマイクロスフェアから徐々に放出され、周囲の組織細胞(たとえば内皮細胞)に取り込まれる。
【0116】
全身投与は経粘膜または経皮手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与のためには、透過すべき関門に適した浸透剤を用いる。そのような浸透剤は一般に当技術分野で既知であり、たとえば経粘膜投与には胆汁酸およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、透過促進のために界面活性剤も使用できる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤使用によるものであってもよい。局所投与のためには、本発明のオリゴマーを当技術分野で一般に知られている軟膏剤(ointment、salve)、ゲル剤またはクリーム剤中に処方する。傷害または炎症の治療には、治癒促進のために洗浄液を局所使用できる。
【0117】
所望により、有効成分を含有する1以上の単位剤形を入れたパックまたは使捨て用具として組成物を供給してもよい。パックには、たとえば金属またはプラスチック箔、たとえばPTPパックが含まれる。パックまたは使捨て用具には投与指示書を添付することができる。
【0118】
4.4.療法薬同定のためのアッセイ法
骨粗鬆症発症の原因または誘因となる変異の同定に基づいて、本発明はさらに療法薬同定のための細胞ベースアッセイ法または無細胞アッセイ法を提供する。1態様においては、IL−1受容体またはIL−1遺伝子と連関非平衡状態にある遺伝子がコードするタンパク質に対する受容体を細胞膜外面に発現する細胞を、被験化合物単独の存在下、または被験化合物と他のタンパク質の存在下でインキュベートし、被験化合物と受容体、またはタンパク質(好ましくはタグ付きタンパク質)と受容体の相互作用を、たとえばマイクロフィジオメーター(microphysiometer、McConnell et al.(1992)Science,257:1906)により検出する。受容体と被験化合物またはタンパク質との相互作用は、マイクロフィジオメーターにより媒質の酸性化の変化として検出される。したがってこのアッセイ系は、たとえばタンパク質−受容体相互作用を妨害することにより機能する分子アンタゴニスト、およびたとえば受容体を活性化することにより機能する分子アゴニストを同定する手段を提供する。
【0119】
細胞または無細胞アッセイ法を用いて、IL−1遺伝子またはそれと連関非平衡状態にある遺伝子の発現を調節する化合物、mRNAの転写を調節する化合物、またはmRNAもしくはタンパク質の安定性を調節する化合物を同定できる。したがって1態様においては、IL−1または他のタンパク質を産生しうる細胞を被験化合物と共にインキュベートし、細胞培地中に産生されたタンパク質の量を測定し、被験化合物と接触しなかった細胞から産生されたものと比較する。タンパク質に対する本発明化合物の特異性を種々の対照分析、たとえば1以上の対照遺伝子の発現を測定することにより確認できる。特にこのアッセイ法は、アンチセンス、リボザイムおよびトリプレックス化合物の有効性を測定するために採用できる。
【0120】
無細胞アッセイは、タンパク質と相互作用することによりそのタンパク質の活性を調節しうる化合物の同定にも採用できる。そのような化合物は、たとえばタンパク質の構造を修飾することによりそのタンパク質が受容体に結合する能力に影響を与えるものである。好ましい態様においては、そのような化合物を同定するための無細胞アッセイ法には、本質的にはタンパク質および被験化合物または被験化合物ライブセリーを結合パートナーの存在下もしくは不存在下で含有する反応混合物が含まれる。被験化合物は、たとえば結合パートナーの誘導体、たとえば生物学的に不活性なターゲットペプチド、または小分子であってもよい。
【0121】
したがって本発明のスクリーニングアッセイ法の一例には、タンパク質またはその機能性フラグメントを被験化合物または被験化合物ライブセリーと接触させ、そして複合体の形成を検出する工程が含まれる。検出のために、分子を特異的マーカーで標識し、標識化合物または被験化合物ライブセリーを異なるマーカーで標識することができる。次いで、インキュベーション工程および洗浄工程の後、2標識のレベルを測定することにより、被験化合物とタンパク質またはそのフラグメントとの相互作用を検出できる。洗浄後に2標識が存在することは相互作用の指標である。
【0122】
分子間の相互作用は、光学現象である表面プラズモン共鳴(SPR)を検出する実時間BIA(Biomolecular Interaction Analysis,Pharmacia Biosensor AB)により同定することもできる。検出は生物特異的界面における高分子の物質濃度の変化に依存し、相互作用物質を標識する必要がない。1態様においては、被験化合物ライブセリーをセンサー表面、たとえばマイクロフローセルの壁の1つを形成する表面に固定化する。次いでタンパク質またはその機能性フラグメントをこのセンサー表面に連続的に流す。信号記録上に示される共鳴角度の変化は、相互作用が起きたことを示す。この方法については、たとえばPharmaciaによるBIAtechnology Handbookに詳述されている。
【0123】
本発明のスクリーニングアッセイ法の他の例には、(a)(i)IL−1または他のタンパク質、(ii)適切な受容体および(iii)被験化合物を含有する反応混合物を調製し;そして(b)タンパク質と受容体の相互作用を検出する工程が含まれる。被験化合物の存在下でのタンパク質と受容体の相互作用が被験化合物の不存在下での相互作用と対比して統計的に有意に変化(増強または阻害)すると、有効なアンタゴニスト(阻害薬)の指標となる。このアッセイの化合物は同時に接触させることができる。あるいはタンパク質をまず被験化合物と適切な時間接触させ、次いで受容体を反応混合物に添加してもよい。種々の濃度の被験化合物を用いて得たデータから用量応答曲線を作成することにより、化合物の有効性を評価できる。さらに対照アッセイを実施して、比較のためのベースラインを求めることもできる。
【0124】
タンパク質と受容体の複合体形成は多様な方法で検出できる。たとえば検出可能に標識したタンパク質、たとえば放射性標識、蛍光標識または酵素標識したタンパク質または受容体を用い、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出により複合体形成の変化を定量できる。
【0125】
一般に、複合体形成していない形の一方または両方のタンパク質からの複合体の分離を容易にするために、あるいはアッセイの自動化を可能にするために、タンパク質または受容体を固定化することが望ましいであろう。タンパク質と受容体の結合は、反応体の収容に適した任意の容器内で行うことができる。一例には、マイクロタイタープレート、試験管およびミクロ遠心管が含まれる。1態様においては、タンパク質がマトリックスに結合しうるドメインを付加した融合タンパク質を調製することができる。たとえばグルタチオン−S−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、ミズーリ州セントルイス)またはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを受容体(たとえば35S−標識受容体)および被験化合物と混和し、混合物を複合体形成可能な条件下、たとえば塩およびpHに関して生理的な条件下(ただし、わずかに緊縮条件が望ましい)でインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズを洗浄して結合していない標識を除去し、マトリックスを固定化し、放射性標識を直接に測定し(たとえばビーズをシンチレーション剤に装入する)、あるいは次いで複合体を解離させた後の上清中において測定することができる。あるいは複合体をマトリックスから解離させ、たとえば実施例に記載する標準電気泳動法を用いてSDS−PAGEにより分離し、ビーズ画分中にみられるタンパク質または受容体のレベルをゲルから定量することができる。タンパク質をマトリックスに固定化するための他の方法も本発明のアッセイに利用できる。たとえばビオチンとストレプトアビジンの結合を利用してタンパク質または受容体を固定化することができる。アゴニストおよびアンタゴニストの同定、または候補療法薬の安全性および有効性の確認のために、トランスジェニック動物を作製することもできる。本発明のトランスジェニック動物には、適切な内因性プロモーターの制御下またはヘテロロガスプロモーターの制御下にある再狭窄の原因となる変異をもつ非ヒト動物が含まれる。
【0126】
トランスジェニック動物は、適切なプロモーターまたはそのフラグメントの制御下にあるトランスジーン、たとえばレポーター遺伝子をもつ動物であってもよい。これらの動物は、たとえばIL−1タンパク質の産生を遺伝子発現の調節などにより調節する薬物の同定に有用である。トランスジェニック非ヒト動物を得る方法は当技術分野で周知である。好ましい態様においては、たとえば発現を目標パターンに制御するシス作用配列の使用により、原因変異の発現を特定の細胞サブセット、組織または発生段階に限定する。本発明においては、タンパク質のそのようなモザイク発現が多くの形の系統分析に必須である可能性があり、さらにたとえば他は正常な胚において組織のごく一部の発生を著しく変化させる可能性のある発現レベルの効果を評価する手段となりうる。この目的で、組織特異的調節配列および条件調節配列を用いて、変異の発現を特定の空間パターンに制御することができる。さらに、たとえば条件組換え系または原核細胞転写調節配列を用いて、一時的発現パターンを得ることができる。変異を発現させる遺伝学的方法は、部位特異的遺伝子操作によりインビボ調節でき、当業者に既知である。
【0127】
本発明のターゲット動物はすべてそれらの複数の細胞に本発明の原因変異トランスジーンを含み、これらのトランスジーンが”宿主細胞”の表現型を変化させる。別態様においては、バクテリオファージP1のcre/loxP組換え系(Lakso,et al.(1992)PNAS,89:6232−6236;Orban,et al.(1992)PNAS,89:6861−6865)またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のFLP組換え酵素系(O’Gorman,et al.(1991)Science,251:1351−1355;WO92/15694)を用いて、インビボ部位特異的組換え系を作製することができる。Cre組換え酵素はloxP配列間に位置する介在ターゲット配列の部位特異的組換えを触媒する。loxP配列は34塩基対のヌクレオチド反復配列であり、これにCre組換え酵素が結合する。この配列はCre組換え酵素仲介による遺伝子組換えに必要である。loxP配列の配向は、Cre組換え酵素が存在した場合に介在ターゲット配列が切除されるか、または逆転するかを決定し(Abremski,et al.(1984)J.Biol.Chem.,259:1509−1514);loxP配列が直列反復配列として配向している場合はターゲット配列の切除を触媒し、loxP配列が逆方向反復配列として配向している場合はターゲット配列の逆転を触媒する。
【0128】
したがって、ターゲット配列の遺伝子組換えはCre組換え酵素の発現に依存する。組換え酵素の発現はプロモーターエレメントにより調節でき、これらのエレメントは外部から添加する物質により、たとえば組織特異的、発生段階特異的、誘発的または抑制的な調節制御を受ける。この調節制御の結果、組換え酵素の発現がプロモーターエレメントにより仲介される細胞においてのみターゲット配列の遺伝子組換えが起きる。このように原因変異トランスジーンの発現活性化を組換え酵素発現の制御により調節できる。
【0129】
cre/loxP組換え酵素系を原因変異トランスジーンの発現調節に利用するには、Cre組換え酵素と対象タンパク質の両方をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物を構築する必要がある。Cre組換え酵素と再狭窄の原因変異をもつトランスジーンを両方とも含む動物は、”二重”トランスジェニック動物の構築により得られる。そのような動物を得るための好都合な方法は、それぞれ1つのトランスジーンを含むトランスジェニック動物を交配することである。
【0130】
原核細胞プロモーター配列を用いて同様な条件トランスジーンを得ることができる。これは、トランスジーンの発現を促進するために原核細胞タンパク質が同時発現されることを必要とする。プロモーターおよび対応するトランス活性化原核細胞タンパク質の例はUSP4,833,080に示されている。
【0131】
さらに、条件トランスジーンの発現を遺伝子療法に類似の方法で誘導できる。この方法では、トランス活性化されるタンパク質、たとえば組換え酵素または原核細胞タンパク質をコードする遺伝子を組織へ送達し、たとえば細胞特異的に発現させる。この方法によれば、トランスジーンは成人してトランス活性化剤の導入により”開始”されるまでサイレントな状態を維持することができる。
【0132】
1態様例において、本発明の”トランスジェニック非ヒト動物”は、非ヒト動物の生殖細胞系列にトランスジーンを導入することにより作製される。種々の発生段階の胚ターゲット細胞をトランスジーンの導入に使用できる。胚ターゲット細胞の発生段階に応じて異なる方法を用いる。本発明の実施には、任意の動物の特定の系列を、健康状態が全般的に良好であり、胚収率が良好であり、胚に前核が良好に見え、かつ増殖適性が良好であるように選択する。さらに、ハプロタイプは重要な要因である。たとえばトランスジェニックマウスを作製する場合、C57BL/6またはFVB系列などの系統がしばしば用いられる(Jackson Laboratory、メーン州バー・ハーバー)。好ましい系統はH−2b、H−2dまたはH−2qハプロタイプ、たとえばC57BL/6またはDBA/1をもつものである。本発明の実施に用いる系列自体がトランスジェニックおよび/またはノックアウト(すなわち部分または完全抑制された遺伝子を1以上含む動物に由来する)であってもよい。
【0133】
1態様においては、トランスジーン構築体を単一段階の胚に導入する。接合体がマイクロインジェクションに最適なターゲットである。マウスにおいては雄性前核が直径約20μmのサイズに達し、1〜2plのDNA注入が再現可能となる。接合体を遺伝子伝達のターゲットとして用いると、大部分の場合注入したDNAが1回目の卵割前に宿主遺伝子に組み込まれるという点できわめて有利である(Brinster,et al.(1985)PNAS,82:4438−4442)。その結果、トランスジェニック動物のすべての細胞が組み込まれたトランスジーンを保有する。生殖細胞の50%がトランスジーンを宿すので、これは一般に創始動物の子孫にトランスジーンが効率的に伝達されることにも反映される。
【0134】
普通は、受精した胚を前核が出現するまで適切な培地中でインキュベートする。ほぼこの時期にトランスジーンを含むヌクレオチド配列を下記に従って雌性または雄性前核に導入する。マウスなど、ある種においては、雄性前核の方が好ましい。接合体の雄性DNA相補体に、これが卵核または接合体雌性前核によりプロセシングされる前に外因性遺伝子材料を添加することが最も好ましい。卵核または接合体雌性前核は、雄性DNA相補体に影響を与える分子を放出すると考えられる。おそらく、雄性DNA相補体のプロタミンをヒストンで置換し、これにより雌雄DNA相補体が結合して二倍体接合体を形成するのが促進されるのであろう。したがって、雄性DNA相補体または他のDNA相補体が雌性前核の影響を受ける前に、外因性遺伝子材料を添加することが好ましい。たとえば、雄性前核形成後、できるだけ速やかに、初期雄性前核に外因性遺伝子材料を添加する。これは、雌雄前核が十分に離れており、かつ両者が細胞膜に近接した位置にある時期である。あるいは、精子の核がデコンデンゼーション(decondensation)誘発された後に外因性遺伝子材料を添加してもよい。次いで外因性遺伝子材料含む精子を卵子に添加する。あるいはデコンデンゼーションした精子をその後できるだけ速やかにトランスジーンと共に卵子に添加することもできる。
【0135】
胚へのトランスジーンヌクレオチド配列の導入は、当技術分野で既知の任意の手段、たとえばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはリポフェクションにより達成できる。胚へのトランスジーンヌクレオチド配列の導入後、胚をインビトロで種々の時間インキュベートするか、または代理宿主に再移植し、あるいは両者を実施する。成熟するまでのインビトロインキュベーションも本発明の範囲に含まれる。常法の1つは、種に応じて胚をインビトロで1〜7日間インキュベートし、次いでそれを代理宿主に再移植する。
【0136】
本発明の目的について、接合体は本質的には完全な生物に発生しうる二倍体細胞を形成したものである。一般に接合体は、自然または人為的に配偶子由来の2つの一倍体核を融合させるにより形成された核を含む卵からなる。したがって配偶子核は自然状態で適合性のもの、すなわち分化および発生により機能性生物になることができる生存性接合体を生じるものでなければならない。一般に正倍数接合体が好ましい。異数接合体が得られた場合、染色体数はいずれかの配偶子が由来した正倍数生物と対比して1より多い差があってはならない。
【0137】
同様な生物学的考察のほか物理的考察も、接合体核または接合体核の一部を形成する遺伝子材料に添加できる外因性遺伝子材料の量(たとえば体積)を支配する。遺伝子材料が除去されない場合、添加できる外因性遺伝子材料の量は物理的に破壊せずに吸収される量により制限される。一般に挿入する外因性遺伝子材料の体積は約10pLを超えない。添加の物理的影響は、接合体の生存性を破壊するほど大きくてはならない。DNA配列の数および種類の生物学的制限は、個々の接合体、および外因性遺伝子材料の機能に応じて異なり、当業者に自明であろう。得られる接合体の遺伝子材料(外因性遺伝子材料を含めて)は、その接合体が機能性生物に分化および発生するのを生物学的に開始および維持できなければならないからである。
【0138】
接合体に添加するトランスジーン構築体のコピー数は、添加する外因性遺伝子材料の全量に依存し、遺伝子形質転換が起きるのを可能にする量である。理論的には1コピーが必要であるにすぎないが、1コピーが機能性であるためには一般に多数コピー、たとえば1,000〜20,000コピーのトランスジーン構築体を用いる。本発明に関して、外因性DNA配列の表現型発現を高めるためには、挿入する外因性DNA配列の1より多い機能性コピーをもつことがしばしば有利であろう。
【0139】
その方法が細胞、核膜または他の既存の細胞構造もしくは遺伝子構造にとって破壊的でない限り、外因性遺伝子材料を核遺伝子材料に添加しうる任意の方法を利用できる。マイクロインジェクションによれば、外因性遺伝子材料は優先的に核遺伝子材料に挿入される。細胞および細胞構造体のマイクロインジェクションは当技術分野で既知であり、採用されている。
【0140】
再移植は標準法により達成できる。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵管に挿入する。個々の宿主に移植する胚の数は種毎に異なるが、通常はその種が自然に出産する子孫の数に匹敵する。
【0141】
代理宿主のトランスジェニック子孫をトランスジーンの存在および/または発現に関して任意の適切な方法でスクリーニングできる。スクリーニングはしばしば、トランスジーンの少なくとも一部に相補的なプローブを用いるサザンブロットまたはノーザンブロット分析により行うことができる。トランスジーンがコードするタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析を、トランスジーン生成物の存在をスクリーニングする方法の別法または追加法として採用できる。一般にDNAを尾組織から調製し、トランスジーンをサザン分析またはPCRにより分析する。あるいは最高レベルでトランスジーンを発現すると考えられる組織または細胞を、トランスジーンの存在および発現に関してサザン分析またはPCRにより検査する。ただしこの分析には任意の組織または細胞タイプを使用できる。
【0142】
トランスジーンの存在を評価するための別法または追加法には、適切な生化学的アッセイ法、たとえば酵素および/または免疫学的アッセイ法、特定のマーカーまたは酵素活性についての組織染色、フローサイトメトリー分析などが含まれるが、これらに限定されない。血液の分析も、血液中のトランスジーンの存在を検出し、トランスジーンが種々のタイプの血球その他の血液構成成分に与える影響を評価するのに有用である。
【0143】
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物と適切な相手を交配することにより、あるいはトランスジェニック動物から得た卵および/または精子のインビトロ受精により得ることができる。相手との交配を行う場合、相手はトランスジェニックおよび/またはノックアウトであってもよく、そうでなくてもよい;トランスジェニックである場合、それは同一もしくは異なるトランスジーンまたは両者を含むことができる。あるいは相手は親系列であってもよい。インビトロ受精を採用する場合、受精した胚を代理宿主に移植するか、またはインビトロインキュベートし、あるいは両者を行う。いずれの方法を用いた場合でも、子孫を前記方法または他の適切な方法でトランスジーンの存在について評価することができる。
【0144】
本発明に従って作製したトランスジェニック動物は、外因性遺伝子材料を含む。さらに、そのような態様においては、その配列は好ましくは特定のタイプの細胞においてトランスジーンを発現させる転写制御エレメント、たとえばプロモーターに結合している。
【0145】
レトロウイルス感染法もトランスジーンを非ヒト動物に導入するために利用できる。発生中の非ヒト胚を胚盤期までインビトロ培養することができる。この期間に割球をレトロウイルス感染のターゲットにすることができる(Jaenich,R.,(1976)PNAS,73:1260−1264)。割球の効果的感染は、透明帯を除去する酵素処理により得られる(Manipulating the Mouse Embryo,Hogan編(Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、1986))。トランスジーンの導入に用いるウイルスベクター系は、一般にトランスジーンを保有する複製欠損レトロウイルスである(Jahner,et al.(1985)PNAS,82:6927−6931;Van der Putten,et al.(1985)PNAS,82:6148−6152)。感染は、割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することにより、容易かつ効果的に行うことができる(Van der Putten,前掲;Stewart,et al.(1987)EMBO J.,6:383−388)。あるいは、より後期に感染を行うこともできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔に注入してもよい(Jahner,et al.(1982)Nature,298:623−628)。組込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起きるので、大部分の創始動物はトランスジーンに関してモザイクである。さらに、創始動物はゲノムの異なる位置に種々のトランスジーンのレトロウイルス挿入配列を含むことができ、これらは一般に子孫において分離するであろう。さらに、妊娠中期の胚を子宮内レトロウイルス感染させることにより、トランスジーンを生殖系列に導入することもできる(Jahner,前掲)。
【0146】
トランスジーン導入のための第3タイプのターゲット細胞は、胚性幹細胞(ES)である。ES細胞は、インビトロで培養し、胚と融合させた移植前胚から得られる(Evans,et al.(1981)Nature,292:154−156;Bradley,et al.(1984)Nature,309:255−258;Gossler,et al.(1986)PNAS,83:9065−9069;およびRobertson,et al.(1986)Nature,322:445−448)。DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介トランスダクションにより、トランスジーンをES細胞に効果的に導入することができる。次いでこのような形質転換したES細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞と混和する。ES細胞は次いで胚をコロニー化し、得られるキメラ動物の生殖系列に関与する。概説についてはJaenisch,R.,(1988)Science,240:1468−1474参照。
【0147】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらを限定と解すべきではない。すべての引用文献(本明細書全体において引用した参考文献、交付特許、公開特許出願を含む)内容を本明細書に援用する。本発明の実施には別途指示しない限り当業者が容易になしうる常法を用いる。たとえばMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Sambrook,Fritsch and Maniatis編,Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning,Vol.I,II(D.N.Glover編,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編.1984);USP4,683,195;USP4,683,202;およびNucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編,1984)参照。
【0148】
5.実施例
実施例1 骨粗鬆症関連研究
UCSF関連研究
カリフォルニア大学サンフランシスコ協会骨粗鬆症性骨折研究に参加している被験者1,071人のコホートを、当技術分野で既知の方法でIL−1遺伝子クラスター内の遺伝子型マーカーについて遺伝子型決定した。
【0149】
遺伝子型決定の結果を表1Aに示す。表1Bはハワイでの骨粗鬆症研究の結果を示す。これについては以下に詳述する。
【0150】
【表1】
【0151】
被験者626人のランダム試料対照コホートにおいて、185例の非脊椎骨折が起きた。これらの被験者を”非脊椎骨折”分析に用いた。
【0152】
【表2】
【0153】
* 185人の非脊椎骨折被験者を含む
表2に示すように、IL−1A(+4845)の対立遺伝子2は非脊椎骨折のリスク増大に関連する。さらに、IL−1B(+3954)の対立遺伝子2は非脊椎骨折のリスク増大に統計的に有意に関連する。これに対し、IL−1RN(+2018)の対立遺伝子2は非脊椎骨折リスクの有意の低下に関連する。IL−1A(+4845)の対立遺伝子2は手首骨折の増加に関連するが、統計的に有意ではなかった(RR=1.8,95%CI=1.0〜3.5)。全コホートにおいて対立遺伝子2は手首骨折のリスク増大に関連する。ホルモン代償療法(HRT)使用者を除くと、この影響は消失する。
【0154】
骨折リスク増大は、IL−1A(+4845)およびIL−1B(+3954)の対立遺伝子2に関して遺伝子量効果を示す。具体的には、対立遺伝子2のコピー数が多いほど効果は大きい。骨折リスク低下も、IL−1RN(+2018)の対立遺伝子2に対する遺伝子量効果を示す。具体的には、対立遺伝子2のコピー数が多いほど効果は大きい。表3Bに示すように、HRT使用者を含めた全コホートを考慮した場合、さほど強くはないが、これらの関連が維持される。他方、股関節部骨折および脊椎骨折はいずれのIL−1遺伝子マーカーとも関連がないように思われる。
【0155】
【表3】
【0156】
* 年齢、改変BMI(骨無機質指数)、閉経後年数、現在の喫煙および飲酒、ERTの使用、チアジド系利尿薬の使用、自己報告による健康状態、ならびに糖尿病について調整
# タイプ1,1に対しp<0.05
【0157】
【表4】
【0158】
* 年齢、改変BMI、閉経後年数、現在の喫煙および飲酒、ERTの使用、チアジド系利尿薬の使用、自己報告による健康状態、ならびに糖尿病について調整
# タイプ1,1に対しp<0.05
踵骨、遠位橈骨、全寛骨、大腿骨頚部および椎骨の骨無機質密度(BMD)を測定した。分析値を骨無機質指数(BMI)、閉経後状態および生活スタイル因子について調整した。踵骨においては、表4Aおよび4Bに示すように、IL−1B(+3954)の対立遺伝子2はHRT使用者を含めた場合も除外した場合も有意に高いBMDと関連する(傾向についてp<0.05;遺伝子型[2.2]対遺伝子型[1.1]についてp<0.05)。IL−1B(−511)の対立遺伝子2は、HRT使用者を含めた全コホートの踵骨においてBMD低下と有意に関連する(傾向についてp<0.05;遺伝子型[2.2]対遺伝子型[1.1]についてp<0.05)。IL−1B(−511)の対立遺伝子2は、HRT使用者を除外した場合、踵骨においてBMD低下傾向と関連する。他の部位には、IL−1遺伝子型とBMDの間に一貫した関連パターンはみられなかった。
【0159】
【表5】
【0160】
*年齢、改変BMI、閉経後年数、現在の喫煙および飲酒、ERTの使用、チアジド系利尿薬の使用、自己報告による健康状態、ならびに糖尿病について調整
+ p(傾向)<0.05
# タイプ1,1に対しp<0.05
全寛骨、大腿骨頚部および踵骨において骨損失速度を測定した。表5Aおよび5Bに示すように、IL−1B(−511)の対立遺伝子2は、全コホートおよびHRT使用者を除外したコホートについて、全寛骨の骨損失速度増大と関連する(傾向についてp<0.05)。IL−1B(−511)の遺伝子型[2.2]は、踵骨において骨損失速度増大傾向と関連する。IL−1B(−511)の対立遺伝子2は、大腿骨頚部において骨損失速度増大傾向と関連する。IL−1B(−511)の対立遺伝子2について、寛骨の骨損失速度に対する遺伝子量効果がある。有意ではないが、同様な関連が大腿骨頚部の骨損失速度についてみられる。これらの結果は、HRT使用者を分析に含めた場合(表5A)も除外した場合(表5B)も同様である。
【0161】
ハワイでの骨粗鬆症研究
ハワイ骨粗鬆症研究において骨折関係者100人および骨折のない関係者100人を、IL−1遺伝子クラスターの遺伝子型マーカーについて遺伝子型決定した。結果を表1Bに示す。研究の関係者はすべて80歳初期から中期の日系アメリカ人女性である。以下の臨床データを分析した:脊椎骨折および非脊椎骨折:卵巣摘除例を含めた場合と除外した場合;遠位橈骨および近位橈骨骨ならびに踵骨の無機質含量(BMC):卵巣摘除例を含めた場合と除外した場合。分析値を年齢、BMIおよびエストロゲン使用期間について調整した。
【0162】
結果
IL−1A(+4845)の対立遺伝子2は、卵巣摘除例を含めるか除外するかに関係なく、脊椎骨折および非脊椎骨折回数の増加に強く関連する(p<0.018)。
【0163】
IL−1B(−511)の対立遺伝子2は、遠位橈骨のBMC低下と関連する(p<0.024)。IL−1RN(+2018)の対立遺伝子2は、踵骨のBMC低下と関連する(p<0.022)。
【0164】
所見の考察
民族の役割 IL−1遺伝子クラスターにおける遺伝子型分布はコーカソイドを祖先とするアメリカ人と日系アメリカ人(この研究において多くは第1世代の移民である)で著しく異なる。他の民族群と著しく異なる分布パターンがみられた:
中国系アメリカ人(IL−1RN(+2018)およびIL−1B(+3954)の対立遺伝子2の出現率がきわめて低い);
アフリカ系アメリカ人(日本人集団と類似のパターン);および
ヒスパニック(欧州コーカソイドと類似の分布パターン。これは欧州系祖先に由来するヒスパニックに特に当てはまる。ただしこのパターンは欧州系祖先をもつメキシコ系ヒスパニックにおいては著しく異なる)。
【0165】
したがって、IL−1RN(+2018)の遺伝子型は生物学的パターンおよび反応を正確には反映しない。IL−1B(−511)はその特異的ハプロタイプおよび遺伝子型パターンについてのより正確な指標となりうる。同様に、IL−1B(+3954)はそのハプロタイプパターンの正確なマーカーではない。IL−1B(+4954)はその特異的ハプロタイプおよび遺伝子型パターンについてのより正確な指標となりうる。
【0166】
骨折リスク IL−1A(+4845)の対立遺伝子2およびIL−1B(+3954)の対立遺伝子2は骨折リスクの増大と関連する。これは、ハプロタイプパターン1との関連を指摘する(図3参照)。踵骨BMDはIL−1B(+3954)の対立遺伝子2(ハプロタイプパターン1)と関連する。ハプロタイプパターン1はIL−1aおよびIL−1bレベルならびに生物活性を増大させるが、IL−1受容体アンタゴニストレベルは正常である。
【0167】
骨損失速度 骨損失速度はIL−1B(−511)の対立遺伝子2(ハプロタイプパターン2)と関連する。ハプロタイプパターン2は正常レベルのIL−1を生じるが、IL−1受容体アンタゴニストレベルを低下させる。正味結果はIL−1の生物活性および反応の増大である。
【0168】
骨無機質密度 BMD(またはBMC)は、踵骨および遠位橈骨においてIL−1B(−511)またはIL−1RN(+2018)の対立遺伝子2(ハプロタイプパターン2)と関連する。踵骨におけるBMD増大はハプロタイプパターン2と関連する。他の部位のBMDは、この研究ではIL−1マーカーと有意に関連しない。これは、被験集団の特異性により統計分析力量が不足したためであろう。カリフォルニア大学サンフランシスコ研究集団において役割をもつ他の事項は、より良い健康、より良い教育(特に研究における)およびより高い社会経済状態である。
【0169】
骨リモデリングプロセスは多数の因子により調節され、これには骨代謝、骨損失速度、ピーク骨質量、生活スタイル因子、遺伝、処方薬の使用、および体重が含まれる。骨粗鬆症性骨折は、骨リモデリング、骨損失および老化の複雑なプロセスの結果である。骨リモデリング、したがって骨粗鬆症発症および骨折の可能性は、生活サイクルの異なる段階で異なる生物学的プロセスにより調節される。閉経開始当初の5〜10年間は、エストロゲンレベル低下ならびにIL−1レベルおよび活性の増大のため、最も急速な骨損失が起きる。この段階で増大する破骨細胞の形成および活発化(IL−1レベル増大による)が骨リモデリングプロセスを誘発する。閉経当初の5〜10年間は、IL−1受容体アンタゴニストレベルよりIL−1レベル増大の方が重要であろう。閉経後約10年で、骨リモデリングの生物学的変化のため骨損失速度は低下する。この段階では骨芽細胞形成の低下が骨リモデリングの原因となる推進力を形成する。IL−1受容体アンタゴニストレベル低下は、閉経後の後期に骨損失量調節における、より重要な因子となる可能性がある。
【0170】
ハプロタイプパターン1はIL−1aおよびIL−1bのレベルおよび生物活性の増大に関連するが、IL−1受容体アンタゴニストレベルは正常である。ハプロタイプパターン1をもつ女性はハプロタイプパターン2をもつ女性より閉経初期年間の骨損失が大きい傾向がある。したがってハプロタイプパターン1をもつ女性は、予防手段または処置を開始しなければ生活のいずれの段階でも骨折する傾向がある。ハプロタイプパターン2をもつ女性は、生活後期に、特に年齢関連骨粗鬆症に伴う骨折を起しやすくなる可能性がある。したがってハプロタイプパターン2をもつ対象はハプロタイプパターン1をもつ対象よりIL−1raの構成性産生が少なく、閉経後の生活後期に骨損失が増大し、骨形成が低下する。
【0171】
上記の仮説に基づけば、Keen,et al.(1998)(”インターロイキン−1受容体アンタゴニスト遺伝子における対立遺伝子の変化は椎骨の閉経初期骨損失に関連する”(Bone,23(4),367−371):IL−1RNのVNTRの対立遺伝子[1]と閉経初期骨損失の関連)が報告したデータからは、VNTRの対立遺伝子[1]をもつ対象は実際にはハプロタイプパターン1をもつことが示唆される。この研究の被験者全員が閉経開始後5年以内であるので、その骨損失は増大したIL−1のレベルおよび活発により調節されており、IL−1raレベルの増減によるものではない。IL−1RNのVNTRのみを測定しているので、IL−1RNのVNTRの対立遺伝子1が骨密度の変化に重要であり、骨損失および骨粗鬆症性骨折発生リスクの主要な推定因子であるという誤った結論に達した。
【図面の簡単な説明】
【図1】
2種類の異なる遺伝子ハプロタイプパターンを示す。
【図2】
骨粗鬆症による非脊椎骨折のリスクを示すグラフである。
【図3】
骨粗鬆症による股関節部骨折のリスクを示すグラフである。
【図4】
骨粗鬆症による手首骨折のリスクを示すグラフである。
【図5】
非脊椎骨折のリスクを示すグラフである。
Claims (34)
- 女性対象が骨粗鬆症を発症する素因を有するかを判定するための方法であって、該女性のIL−1ハプロタイプパターンを同定することを含み、その際、ハプロタイプパターン1の存在は該女性が閉経初期年間に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し、ハプロタイプパターン2の存在は該女性が閉経後に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示すものである方法。
- 同定工程が
a)対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション;
b)サイズ分析;
c)配列決定;
d)ハイブリダイゼーション;
e)5’ヌクレアーゼ消化;
f)一本鎖コンホメーション多型性;
g)対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション;
h)プライマー特異的延長;および
j)オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ
よりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 同定工程の前に、またはそれと組み合わせて、核酸試料に増幅工程を施す、請求項1に記載の方法。
- サイズ分析の前に制限酵素消化を行う、請求項2に記載の方法。
- 女性対象に適した骨粗鬆症療法を選択するための方法であって:(a)該女性のIL−1ハプロタイプパターンを同定し、その際、ハプロタイプパターン1の存在は該女性が閉経初期年間に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し、ハプロタイプパターン2の存在は該女性が閉経後に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し;そして(b)該ハプロタイプパターンから生じる正味生物活性を代償する、あるいはそうでなければ調節する療法薬を選択する工程を含む方法。
- 同定工程が
a)対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション;
b)サイズ分析;
c)配列決定;
d)ハイブリダイゼーション;
e)5’ヌクレアーゼ消化;
f)一本鎖コンホメーション多型性;
g)対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション;
h)プライマー特異的延長;および
j)オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ
よりなる群から選択される技術を用いて実施される、請求項5に記載の方法。 - 同定工程の前に、またはそれと組み合わせて、核酸試料に増幅工程を施す、請求項5に記載の方法。
- サイズ分析の前に制限酵素消化を行う、請求項6に記載の方法。
- 療法薬がIL−1活性の調節薬である、請求項5に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1αである、請求項9に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1βである、請求項9に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1RNである、請求項9に記載の方法。
- IL−1活性の調節薬がタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、核酸またはニユートラシューティカル(nutraceutical)である、請求項9に記載の方法。
- 調節薬がアゴニストである、請求項9に記載の方法。
- 調節薬がアンタゴニストである、請求項9に記載の方法。
- 骨粗鬆症を伴うかまたは発症する素因を有する対象を特定用量の特定の療法薬で処置することの有効性を判定するための方法であって:
a)対象から得た試料中のIL−1タンパク質またはIL−1 mRNAもしくはDNAのレベル、量または活性を検出し;
b)特定用量の特定の療法薬を対象に投与し;対象から得た試料中のIL−1タンパク質またはIL−1 mRNAもしくはDNAのレベル、量または活性を検出し;そして
c)工程a)で得た相対レベル、量または活性を工程b)で得たレベル、量または活性と比較する
工程を含む方法。 - 療法薬がIL−1活性の調節薬である、請求項16に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1αである、請求項17に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1βである、請求項17に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1RNである、請求項17に記載の方法。
- 療法薬がタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子または核酸である、請求項16に記載の方法。
- 調節薬がアゴニストである、請求項17に記載の方法。
- 調節薬がアンタゴニストである、請求項17に記載の方法。
- 女性対象において骨粗鬆症を治療し、または発症を予防するための方法であって:(a)該女性のIL−1ハプロタイプパターンを同定し、その際、ハプロタイプパターン1の存在は該女性が閉経初期年間に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し、ハプロタイプパターン2の存在は該女性が閉経後に骨損失増大および/または骨折リスク増大を生じやすいことを示し;そして(b)該ハプロタイプパターンから生じる正味生物活性を代償する、あるいはそうでなければ調節する療法薬を対象に投与する工程を含む方法。
- 同定工程が
a)対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション;
b)サイズ分析;
c)配列決定;
d)ハイブリダイゼーション;
e)5’ヌクレアーゼ消化;
f)一本鎖コンホメーション多型性;
g)対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション;
h)プライマー特異的延長;および
j)オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ
よりなる群から選択される、請求項24に記載の方法。 - 同定工程の前に、またはそれと組み合わせて、核酸試料に増幅工程を施す、請求項24に記載の方法。
- サイズ分析の前に制限酵素消化を行う、請求項25に記載の方法。
- 療法薬がIL−1活性の調節薬よりなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1αである、請求項28に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1βである、請求項28に記載の方法。
- IL−1活性がIL−1Raである、請求項28に記載の方法。
- 療法薬がタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子または核酸である、請求項24に記載の方法。
- 調節薬がアゴニストである、請求項28に記載の方法。
- 調節薬がアンタゴニストである、請求項28に記載の方法。
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US20070264645A1 (en) * | 2002-01-25 | 2007-11-15 | Kenneth Kornman | IL-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes |
WO2004018642A2 (en) * | 2002-08-24 | 2004-03-04 | Creighton University | Methods for detecting genes associated with bone properties and/or height |
JP2006516196A (ja) * | 2003-01-16 | 2006-06-29 | デコード ジェネティクス イーエッチエフ. | ハプロタイプ関連に基づく、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法 |
JP2007501627A (ja) * | 2003-08-08 | 2007-02-01 | インタールーキン ジェネティックス インク | 骨粗鬆症のための診断法および治療法 |
US7353662B2 (en) * | 2004-12-22 | 2008-04-08 | York International Corporation | Medium voltage starter for a chiller unit |
US8590329B2 (en) | 2004-12-22 | 2013-11-26 | Johnson Controls Technology Company | Medium voltage power controller |
EP1951903A2 (en) * | 2005-10-25 | 2008-08-06 | Interleukin Genetics, Inc. | The il-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes |
EP2089538B1 (en) * | 2006-11-15 | 2013-08-21 | Interleukin Genetics, Inc. | The il-1 gene cluster and insulin resistance: associated polymorphisms, haplotypes and methods of using same |
CA3011363A1 (en) | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Interleukin Genetics, Inc. | Methods for predicting response to treatment |
US10329620B2 (en) | 2017-01-12 | 2019-06-25 | Cardioforecast Ltd. | Methods and kits for treating cardiovascular disease |
EP3980561A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-04-13 | Sitokine Limited | Compositions and methods for treating lung, colorectal and breast cancer |
WO2021028469A1 (en) | 2019-08-12 | 2021-02-18 | Sitokine Limited | Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity |
WO2021205013A1 (en) | 2020-04-09 | 2021-10-14 | Sitokine Limited | Compositions and methods for treating covid-19 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998044150A1 (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-08 | Gemini Research Ltd. | Polymorphisms of an il-1 receptor antagonist gene |
WO1998054359A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Gordon Duff | Prediction of inflammatory disease associated with il-1 geneloci polymorphisms |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8311018D0 (en) | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
CA1316520C (en) | 1987-05-19 | 1993-04-20 | Larry C. Hamilton | Valve |
FR2650840B1 (fr) | 1989-08-11 | 1991-11-29 | Bertin & Cie | Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications |
WO1993011149A1 (en) | 1991-12-03 | 1993-06-10 | Thomas Jefferson University | Methods of detecting a genetic predisposition for osteoporosis |
DK0652975T3 (da) | 1992-07-31 | 2005-02-14 | Garvan Inst Med Res | Vurdering af allelvariation med hensyn til trans-virkende faktorer |
DE69333641T2 (de) | 1992-12-28 | 2005-11-03 | Baylink, David Jeston, Redlands | Methode zur messung der knochenresorption |
IL108947A0 (en) | 1993-03-12 | 1994-06-24 | Osteopharm Ltd | Bone stimulating factor |
CA2164498C (en) | 1993-07-09 | 2007-09-11 | Paul A. Price | Assay for ykl-40 as a marker for degradation of mammalian connective tissue matrices |
US5698399A (en) * | 1996-04-05 | 1997-12-16 | Duff; Gordon W. | Detecting genetic predisposition for osteoporosis |
-
2000
- 2000-08-30 MX MXPA02002251A patent/MXPA02002251A/es unknown
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-
2006
- 2006-07-19 AU AU2006203097A patent/AU2006203097B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998044150A1 (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-08 | Gemini Research Ltd. | Polymorphisms of an il-1 receptor antagonist gene |
WO1998054359A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Gordon Duff | Prediction of inflammatory disease associated with il-1 geneloci polymorphisms |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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