ES2307933T3 - Proteina de 35 kda. - Google Patents
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Abstract
Un método de examen de una sustancia reguladora de la producción de azúcar que incluye las siguientes etapas: (1) una etapa de poner en contacto una sustancia candidato con un péptido o proteína que se une específicamente a WF00144 (Figura 1), en la que el péptido o proteína está codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes (a) a (e): (a) un polinucleótido que contiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3, (b) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4, (c) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4, en el que 1-5 aminoácidos están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos, (d) un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3 en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas comprenden el lavado con 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC, (e) un polinucleótido que tiene al menos (1) un 88% de homología, (2) un 92% de homología o (3) un 96% de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3; (2) una etapa de determinación de la condición de unión del péptido o proteína a la sustancia candidato; (3) una etapa de selección de la sustancia candidato que se une al péptido o proteína.
Description
\global\parskip0.940000\baselineskip
Proteína de 35 kDa.
La presente invención se refiere a un método de
examen de un compuesto que participa en la regulación de la
producción de azúcar mediante el uso de un péptido o proteína que se
une específicamente a WF00144 (Figura 1), y al uso de dicho péptido
o proteína como herramienta de examen de una sustancia reguladora de
la producción de azúcar.
El efecto farmacéutico de un fármaco que tiene
una actividad farmacéutica específica, y por lo tanto expresa un
efecto de curación de una enfermedad de un tipo, es el resultado de
la unión específica del fármaco a la proteína que participa en el
fenómeno farmacéutico portando la enfermedad y del efecto del
fármaco causado por la misma de modificar específicamente la
función de la proteína.
Por lo tanto, cuando un fármaco para curar una
enfermedad se une específicamente a una proteína para modificar su
función en tejidos o células que exhiben la enfermedad, entonces la
proteína participa en la enfermedad, y es una diana útil para el
desarrollo de nuevos medicamentos para la enfermedad.
Por ejemplo, se usa un inmunosupresor FK506 como
medicamento para transplante e inflamaciones crónicas. El profesor
Schreiber et al. han aclarado que la proteína de unión
específica en las enfermedades a las que se dirige el medicamento
es la proteína FKBP12 (Harding M.W., Galat A., Uehling D.E.,
Schreiber S.L., Nature 341, pág. 758-760
(1989)). Se ha aclarado adicionalmente que, después de que FK506 se
haya unido a FKBP12, ésta se une adicionalmente a calcineurina
expresando su efecto inmunosupresor (Liu J., Farmer J.D. Jr., Lane
W.S., Friedman J., Weissman I., Schreiber S.L., Cell
66(4), pág. 807-815 (1991)). Específicamente,
la FKBP12 descubierta por el uso de FK506 y su ruta
\hbox{de
inmunoregulación son dianas importantes para un desarrollo adicional
de inmunosupresores adicionales.}
Una proteína de 35 kDa se une a la sustancia
WF00144 (Fig. 1). La sustancia WF00144 es una sustancia
farmacéuticamente activa producida por hongos Phoma sp. nº
00144. Esta sustancia inhibe la producción de azúcar in vitro
en células hepáticas de cultivo primario. Además, la sustancia
tiene efecto hipoglucémico en modelos de diabetes animal.
Específicamente, la sustancia es un medicamento para la diabetes que
inhibe la producción de azúcar en hígados y expresa un efecto
hipoglucémico (documento WO 99/61645).
Por las dos razones anteriormente mencionadas,
se cree que la proteína a la que se une específicamente la
sustancia WF00144 puede ser útil para aclarar algunos mecanismos
nuevos para el desarrollo de la diabetes y para el desarrollo de
medicamentos novedosos para la diabetes.
En la base de datos EMBL de 1 de Diciembre de
2001, XP002401616 Q91W74_MOUSE da a conocer un polipéptido (UNIPROT:
Q91W74_MOUSE) que tiene un 87,77% de identidad con la SEQ ID NO: 2
de la presente solicitud en una superposición de 327 aminoácidos y
un 95,95% de identidad a lo largo de 321 aminoácidos con la SEQ ID
NO: 4 de la presente solicitud. El documento da a conocer
adicionalmente una molécula de ácido nucleico (EM_MUS: BC016430) que
tiene un 86% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 a lo
largo de 980 nucleótidos y un 94,63% de identidad con la SEQ ID NO:
3 en una superposición de 1006 nucleótidos.
En la base de datos EMBL de 1 de Junio de 2001,
XP002401618 da a conocer un ADNc de riñón masculino adulto, clon
Riken completo: 0610010D20, que codifica una hipotética
aminoacil-ARNt sintetasa de clase
II/dihidrodipicoli-
nato sintetasa. La SEQ ID NO: 2 de la solicitud tiene un 87,77% de identidad a lo largo de 327 aminoácidos con la proteína de este documento. La SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud tiene un 95,95% de identidad a lo largo de 321 aminoácidos con la proteína de este documento. La SEQ ID NO: 3 tiene un 94,73% de identidad a lo largo de 1006 nucleótidos con EM_HTG:AK002457, que codifica la proteína descrita en este documento.
nato sintetasa. La SEQ ID NO: 2 de la solicitud tiene un 87,77% de identidad a lo largo de 327 aminoácidos con la proteína de este documento. La SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud tiene un 95,95% de identidad a lo largo de 321 aminoácidos con la proteína de este documento. La SEQ ID NO: 3 tiene un 94,73% de identidad a lo largo de 1006 nucleótidos con EM_HTG:AK002457, que codifica la proteína descrita en este documento.
La secuencia de la base de datos EMBL EST de
Homo sapiens de 27 de septiembre de 2001 XP002401621 da a
conocer una secuencia de ácido nucleico parcial de SEQ ID NO: 1 con
un 97,27% de identidad a lo largo de 825 nucleótidos.
La proteína de la base de datos de la OEP
(ondina) de 15 de enero de 2004 XP002401620 da a conocer la
secuencia 7483 dada a conocer en el documento EP 1104808, que tiene
un 100,00% de identidad con la SEQ ID NO: 2 actualmente
reivindicada a lo largo de 113 aminoácidos.
La secuencia de la base de datos EMBL EST de
Homo sapiens de 27 de Septiembre de 2001 XP002401622 da a
conocer la EM_PST: BI763832, que tiene un 99,60% de identidad
(100,00% sin huecos) a lo largo de 743 nucleótidos con la SEQ ID
NO: 1 de la presente solicitud.
El documento WO 99/61645 da a conocer un
compuesto WF00144 y su actividad para inhibir la gluconeogénesis y
el uso de dicho compuesto en preparaciones farmacéuticas para tratar
o prevenir la diabetes. Dicho compuesto WF00144 se une a las
proteínas de SEQ ID NO: 2 y 4. Adicionalmente, este documento da a
conocer un método para examinar sustancias que regulan la
producción de azúcar.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El objeto de la invención incluye lo
siguiente:
Proporcionar un método de examen de un compuesto
que participa en la regulación de la producción de azúcar.
Proporcionar un uso de una proteína o péptido
específico como herramienta de examen de una sustancia reguladora
de la producción de azúcar.
La invención proporciona el uso de una proteína
que participa en la regulación de la producción de azúcar y un
polinucleótido que la codifica.
A partir de células de hígado de rata, se ha
intentado la identificación de una proteína que se una
específicamente a la sustancia WF00144 que tiene la capacidad de
inhibir la gluconeogénesis en células hepáticas de cultivo
primario, y el aislamiento de un gen que codifique la proteína. Como
resultado, se ha identificado una proteína que tiene un peso
molecular de aproximadamente 35 kDa. A partir de la información de
la secuencia parcial de la proteína, se ha aislado un gen completo.
El gen tiene un 96% de homología con un clon de ratón Riken
060010D20 al nivel aminoacídico, y puede ser un gen homólogo del
clon. Sin embargo, su función es bastante desconocida.
Además, se ha aislado un gen homólogo humano. Se
ha expresado el gen proteico en E. coli y se ha obtenido una
proteína que tiene un peso molecular adecuado que se prevé a partir
de la secuencia aminoacídica de la misma. La proteína se vuelve a
unir específicamente a la sustancia WF00144.
En la búsqueda de homología BLAST de la proteína
de 35 kDa de la invención, diversos homólogos biológicos de la
familia de la dihidrodipicolonato sintasa (DHDPS) dan cuenta de la
mayor parte de las proteínas. En consecuencia, se supone que la
proteína de 35 kDa de rata y humana es una proteína de la familia de
DHDPS.
La búsqueda de motivo en la secuencia
aminoacídica de la proteína de 35 kDa en la base de datos PROSITE ha
revelado que la secuencia aminoacídica contiene dos motivos
almacenados en la familia de DHDPS. De estos, la secuencia que
contiene una lisina en centro activo, DHDPS_2 (PROSITE
AC.PS00666)Y-[DNS]-[LIVMFA]-P-x(2)-[ST]-x(3)-[LIVMF]-x(13,14)-[LIVM]-x-[SGA]-[LIVMF]-K-[DEQAF]-[STAC]
está almacenada completamente en ratones, ratas y seres humanos, y
en la secuencia DHDPS_1 (PROSITE AC.PS00665)
[GSA]-[LIVM]-[LIVMFY]-x(2)-G-[ST]-[TG]-G-E-[GASNF]-x(6)-[EQ],
se almacenan 8 de 10 residuos aminoacídicos no convertibles.
A partir de lo anterior, la proteína de 35 kDa
tiene una estructura primaria similar a la conocida de la proteína
de la familia de DHDPS, y se supone que la proteína puede ser una
proteína de la familia de DHDPS y puede tener una función de
actividad aldolasa de clase I.
La enzima que participa en los metabolismos de
azúcar existe universalmente desde microorganismos hasta mamíferos,
pero respecto a la proteína de 35 kDa, su gen homólogo se encontró
sólo en mamíferos tales como seres humanos y roedores.
Además, su expresión génica está limitada a
hígados, riñones y testículos. En consecuencia, se considera que la
proteína de 35 kDa participa en la ruta metabólica añadida
especialmente a hígados y riñones de mamífero con ciertos
propósitos, además del sistema metabólico de azúcar existente
universalmente en los animales.
En los animales superiores, se cree que el
sistema glicolítico y el sistema gluconeogénico pueden estar en una
relación de reacción recíproca que está catalizada por una enzima
común, excepto algunas enzimas limitantes de velocidad.
Especialmente en mamíferos, la producción de glucosa
(gluconeogénesis) ha evolucionado en los hígados y riñones como una
función indispensable para asegurar la supervivencia de los
individuos ante la hambruna.
Sin embargo, para el hombre de hoy, la promoción
de la producción de azúcar hepático es una característica
sintomática de la diabetes. Se ha considerado hasta la fecha que la
promoción de la producción de azúcar era un cambio en el equilibrio
del sistema glucolítico y el sistema gluconeogénico.
Específicamente, se ha creído que la promoción de la producción de
azúcar existía porque el nivel del sistema gluconeogénico podía ser
mayor que el del sistema glucolítico.
Se ha considerado que, puesto que la sustancia
WF00144 que se une específicamente a la proteína de 35 kDa puede
inhibir la producción de azúcar hepático y tiene un efecto
hipoglucémico en modelos de enfermedad animal, la proteína de 35
kDa puede exhibir su función en una ruta de producción de azúcar que
difiere del sistema de descomposición de azúcar/producción de
azúcar conocido hasta la fecha en la técnica. Específicamente, se
supone que, en hígados y riñones, la proteína de 35 kDa puede
existir en una ruta que ha evolucionado para producir eficazmente
glucosa separadamente del sistema glicolítico en los mismos.
En consecuencia, la proteína de 35 kDa y el
sistema metabólico del azúcar que la contiene son dianas útiles
para el desarrollo de medicamentos novedosos para la diabetes.
Concretamente, se describe la invención a
continuación.
(1) Un método de examen de una sustancia
reguladora de la producción de azúcar como se define en la
reivindicación 1.
(2) Uso de un péptido o una proteína que se une
específicamente a WF00144 (Fig. 1) como herramienta de examen como
se define en la reivindicación 2.
La proteína que participa en la producción de
azúcar de la invención y el polinucleótido que codifica la proteína
tienen toda o una parte de la secuencia de cualquiera de la SEQ ID
NO: 2 ó 4.
Un polinucleótido codifica la proteína usada en
la invención, e incluye ADN genómicos y ADN sintetizados
químicamente, además de ADNc. En la medida en que codifique la
proteína usada en la invención, el polinucleótido incluye
cualquiera que tenga cualquier secuencia de bases basada en la
policondensación de código genético.
Como anteriormente, el polinucleótido que
codifica la proteína usada en la invención puede aislarse con
cualquier método ordinario, por ejemplo, de hibridación con una
sonda de secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 3 o parte de
ella, o PCR con un cebador diseñado basándose en la información de
dicha secuencia polinucleotídica.
La proteína usada en la invención que participa
en la producción de azúcar puede obtenerse, por ejemplo,
expresándola en un transformante que se prepara mediante
transformación con un vector de expresión que contiene una secuencia
de marco abierto de lectura de SEQ ID NO: 1 ó 3.
La proteína expresada puede purificarse y
aislarse a partir de las fracciones celulares con cualquier método
ordinario. Concretamente, el método de purificación y aislamiento es
el siguiente: en primer lugar, se recogen las células con cualquier
modo ordinario de filtración, centrifugación o similar, y se
procesan las paredes celulares y/o las membranas celulares de las
células de modo ordinario para obtener una fracción
citoplasmática.
A continuación, se disuelve la fracción
citoplasmática en una disolución acuosa adecuada. Se aísla entonces
la proteína de la invención y se purifica a partir de la fracción
citoplasmática según un método ordinario empleado generalmente para
la purificación y el aislamiento de proteínas naturales o
sintéticas. Son ejemplos de métodos de aislamiento y purificación
diálisis, exclusión molecular, cromatografía en columna de afinidad
con un anticuerpo monoclonal de la proteína de la invención o del
péptido parcial de la misma, cromatografía en columna en un
adsorbente adecuado, cromatografía líquida de alta resolución,
etc.
Puede existir un polinucleótido que codifica una
proteína funcionalmente equivalente a la proteína anteriormente
mencionada. La expresión "funcionalmente equivalente" como se
usa en la presente memoria significa que las proteínas pretendidas
son materialmente la misma desde el punto de vista de su función en
seres vivos. Específicamente, cualquier experto en la técnica puede
preparar una proteína que es funcionalmente equivalente a la
proteína de 35 kDa del ejemplo descrito a continuación, por
ejemplo, utilizando un método de introducción de mutación en la
secuencia aminoacídica de la proteína (por ejemplo, una mutagénesis
específica de sitio ("Current Protocols in Molecular Biology",
ed. Ausubel et al., (1987) publicado por John Wiley and Sons,
secciones 8.1-8.5)).
Puede formarse una proteína de ese tipo mediante
la mutación de aminoácidos naturales. En la medida en que tengan
una función equivalente a la de la proteína identificada en el
ejemplo descrito a continuación, está dentro del alcance de la
presente invención cualquier otra proteína que tenga la secuencia
aminoacídica de la proteína identificada (secuencia aminoacídica de
la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 ó 4) en la que, sin
embargo, uno a cinco aminoácidos estén sustituidos, eliminados,
insertados y/o añadidos.
Los 1 a 5 aminoácidos designados en la presente
memoria no se definen específicamente desde el punto de vista del
número de mutaciones de los aminoácidos y de los sitios de mutación
de los mismos en la proteína, en la medida en que la proteína
mantenga su función. El número de mutaciones está típicamente dentro
del 10% de todos los aminoácidos, preferiblemente dentro del 5% de
todos los aminoácidos, más preferiblemente dentro del 1% de todos
los aminoácidos. Según sea el caso, la invención puede comprender
una proteína con mutación de 1 a 5 aminoácidos como aminoácidos
plurales.
Preferiblemente, el aminoácido que va a
sustituir a uno original tiene propiedades similares a las del
aminoácido original. Por ejemplo, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe
y Trp están todos dentro del grupo de aminoácidos no polares, y
pueden tener propiedades similares. Los aminoácidos no cargados
incluyen Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn y Gln. Los aminoácidos ácidos
incluyen Asp y Glu. Los aminoácidos básicos incluyen Lys, Arg e
His.
La proteína que es funcionalmente equivalente a
la proteína de 35 kDa del ejemplo descrito a continuación puede
aislarse utilizando tecnología de hibridación o tecnología de
amplificación génica bien conocida por los expertos en la técnica.
Específicamente, cualquier experto en la técnica puede aislar en
general un polinucleótido que tiene una alta homología con el
polinucleótido que codifica la proteína identificada en el ejemplo
descrito a continuación basándose en la secuencia de bases (SEQ ID
NO: 1 ó 3) del polinucleótido que codifica la proteína
identificada, o basándose en una parte de la secuencia de bases y
mediante el uso de una técnica de hibridación ("Current Protocols
in Molecular Biology", ed. Ausubel et al., (1987),
publicado por John Wiley and Sons, secciones
6.3-6.4), y puede obtenerse una proteína
funcionalmente equivalente a la proteína identificada a partir del
polinucleótido
aislado.
aislado.
En la medida en que tengan una función
equivalente a la de la proteína identificada en el ejemplo descrito
a continuación, están dentro del alcance de la invención otras
proteínas codificadas por un polinucleótido capaz de hibridar con
el polinucleótido que codifica esa proteína. Las condiciones
rigurosas de hibridación para aislar el polinucleótido que codifica
la proteína funcionalmente equivalente de la proteína identificada
son generalmente "1 x SSC, 0,1% de SDS, 37ºC" o similar para
lavado; son unas condiciones más rigurosas para ello "0,5 x SSC,
0,1% de SDS, 42ºC" o similar; son unas condiciones aún más
rigurosas para ello "0,1 x SSC, 0,1% de SDS, 65ºC" o similar.
En dichas condiciones de hibridación más rigurosas, puede esperarse
el aislamiento de un polinucleótido que tenga una alta homología
con la secuencia de sonda.
Sin embargo, las combinaciones de SSC, SDS y
temperatura anteriormente mencionadas son sólo indicativas de
algunos ejemplos, y cualquier experto en la técnica podría
establecer fácilmente cualquier otra condición rigurosa como las
anteriores combinando adecuadamente los factores anteriormente
mencionados y otros para determinar el rigor de hibridación (por
ejemplo, concentración de sonda, longitud de sonda, tiempo de la
reacción de hibridación).
La proteína así aislada mediante el uso de la
técnica de hibridación anterior tiene generalmente una alta
homología desde el punto de vista de la secuencia aminoacídica de la
misma o de la secuencia de bases que codifica la proteína, en
comparación con la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 ó 4. Se
pretende que alta homología indique una homología de secuencia de
al menos un 88%, aún más preferiblemente al menos un 92%, lo más
preferiblemente al menos un 96%.
La homología puede determinarse mediante el uso
del algoritmo de recuperación BLAST2 (Altschul, S.F. et al.,
1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs", Nucleic Acid.
Res 25, pág. 3389-3402).
Es posible otro método, que es como sigue: según
una técnica de amplificación génica (PCR) ("Current Protocols in
Molecular Biology", ed. Ausubel et al., (1987), publicado
por John Wiley and Sons, secciones 6.1-6.4), se
diseña un cebador basándose en una parte de la secuencia
polinucleotídica (SEQ ID NO: 1 ó 3) identificada en el ejemplo
descrito a continuación y se aíslan fragmentos polinucleotídicos que
tienen una alta homología con la secuencia polinucleotídica o con
parte de la misma, y basándose en esto, se obtiene una proteína
funcionalmente equivalente a la proteína identificada en el ejemplo
de la invención.
Se describen a continuación un péptido parcial
de la proteína de la invención y un polipéptido que codifica el
péptido parcial. El péptido parcial comprende una secuencia
aminoacídica de al menos 7 aminoácidos, preferiblemente al menos 9
aminoácidos, más preferiblemente al menos 12 aminoácidos, aún más
preferiblemente al menos 15 aminoácidos. El péptido parcial puede
introducirse, por ejemplo, según un método de ingeniería genética o
un método de síntesis peptídica conocido, o escindiendo la proteína
de la invención con una peptidasa adecuada.
Se describe también un péptido de expresión que
contiene cualquiera de los polinucleótidos anteriormente
mencionados. Adicionalmente, se mencionan un transformante que
porta el polinucleótido anteriormente mencionado o cualquier vector
anteriormente mencionado y un método para la producción de una
proteína que participa en la producción de azúcar, o un péptido
parcial de la misma, mediante el cultivo del transformante y el
aislamiento de la proteína de la invención a partir del cultivo.
Adicionalmente, se describen la proteína producida según el método
anterior o un péptido parcial de la misma.
Cuando se produce un polipéptido según un método
de recombinación génica, es bien conocido por los expertos en la
técnica que se obtienen diversos polipéptidos que difieren desde el
punto de vista del tipo y el grado de glucosilación de los mismos,
dependiendo del tipo de células hospedadoras usadas, y que la
secuencia aminoacídica terminal (N-terminal y/o
C-terminal) del polipéptido precursor expresado en
las células hospedadoras se procesa con una peptidasa señal o
similar, y por lo tanto se obtienen diversos polipéptidos que tienen
una secuencia aminoacídica terminal diferente. En consecuencia,
cualquier experto en la técnica podría entender fácilmente que
dichos polipéptidos están naturalmente dentro del alcance de la
proteína usada en la invención.
El siguiente Ejemplo ilustra la construcción de
un vector de expresión que funciona en procariotas, especialmente
en E. coli. Sin embargo, como resultado de la divulgación del
polinucleótido que codifica la proteína de la invención, es fácil
para cualquier experto en la técnica construir, basándose en ella,
un vector de expresión que, cuando se introduce en células
hospedadoras de hongos tales como levadura o de mamíferos, puede
hacer expresar y producir a los hospedadores la proteína usada en la
invención. En consecuencia, se describe también un vector de
expresión que se construye según métodos bien conocidos en la
técnica basándose en la secuencia polinucleotídica de la proteína
usada en la invención.
Las células de microorganismos susceptibles de
usarse para la expresión del polinucleótido que codifica la
proteína usada en la invención incluyen, por ejemplo, bacterias
procarióticas (Escherichia coli, Bacillus subtilis) y
levadura eucariótica (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae).
Las células de mamífero incluyen células humanas cultivadas y
células animales cultivadas. Además, son también utilizables en la
presente memoria células de planta cultivadas.
Para facilitar la purificación de la misma,
puede añadirse un aminoácido básico que tiene afinidad por quelatos
de ión metálico a cualquier extremo de la proteína usada en la
invención.
Dicho aminoácido básico puede añadirse como
sigue: usando un cebador con una serie de secuencias de bases que
codifican aminoácidos deseados añadidas al extremo 5' de la misma,
se lleva a cabo una PCR, con lo que puede añadirse un oligopéptido
deseado a cualquier extremo deseado del gen pretendido. El
aminoácido básico incluye histidina, lisina o arginina.
El polinucleótido que codifica la secuencia
aminoacídica de la proteína usada en la invención puede obtenerse
mediante síntesis parcial o síntesis completa, por ejemplo, mediante
el uso de un sintetizador de ADN. Aparte de esto, puede obtenerse
también mediante el uso de una sonda o cebador diseñado basándose en
la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 2 a partir de una colección
de ADNc humano.
Adicionalmente, puede prepararse un ADN genómico
que codifica la proteína usada en la invención procesando un ADN
genómico de modo ordinario (por ejemplo, mediante digestión con
enzima de restricción, desfosforilación con fosfatasa alcalina
bacteriana, fosforilación con polinucleótido cinasa T4, ligamiento
con ADN ligasa T4). Además, utilizando el ADN genómico así
obtenido, puede aclararse el punto de iniciación de la transcripción
del gen en el genoma, y puede identificarse específicamente la
región de control de la expresión existente cadena arriba del
punto.
La región de control, tal como promotora y
potenciadora del control de la expresión del gen que codifica la
proteína usada en la invención, es útil como región diana para
detectar cualquier error de expresión en la producción de la
proteína de la invención. Adicionalmente, puede realizarse el
control de la expresión en medicamentos de ácido nucleico señuelo
que se orientan a la región.
Las células hospedadoras para uso en el método
de la invención incluyen células que se usan para análisis de la
función de la proteína usada en la invención y aquellas para
examinar inhibidores de la función y promotores de la función
utilizando la proteína. La introducción del vector en células
hospedadoras puede conseguirse, por ejemplo, según un método de
precipitación con fosfato de calcio, un método de perforación por
pulso eléctrico ("Current Protocols in Molecular Biology", ed.
Ausubel et al., (1987), publicado por John Wiley and Sons,
secciones 9.1-9.9), un método de lipofectamina o un
método de microinyección. Puede conseguirse la preparación de la
proteína de la invención a
\hbox{partir de transformante
mediante aislamiento y purificación de proteína bien conocidos por
los expertos en la técnica.}
Se describe un polinucleótido que comprende una
secuencia de bases complementaria del polinucleótido de secuencia
de bases SEQ ID NO: 1 ó 3 o de la cadena complementaria del mismo, y
que contiene al menos 15 nucleótidos.
La "cadena complementaria" como se designa
en la presente memoria indica la otra cadena opuesta a la cadena de
un polinucleótido bicatenario que comprende un par de bases A:T
(A:U), G:C. El término "complementario" no está limitado al
caso en que la región de al menos 15 nucleótidos continuos tenga una
secuencia completamente complementaria, sino que incluye cualquier
otra que tenga al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%,
más preferiblemente al menos un 90%, aún más preferiblemente al
menos un 95% de homología desde el punto de vista de la secuencia
de bases de la región. Se describe en la presente memoria el
algoritmo para determinar la homología.
Pueden utilizarse polinucleótidos de ese tipo
como sonda para detectar y aislar ADN o ARN que codifica la
proteína usada en la invención, o como cebador para amplificar el
polinucleótido usado en la invención.
Cuando se usa como cebador, en general, tiene
una longitud de cadena de 15 pb a 100 pb, preferiblemente de 15 pb
a 35 pb. Cuando se usa como sonda, el polinucleótido tiene al menos
una parte o toda la secuencia del polinucleótido usado en la
invención, y tiene una longitud de cadena de al menos 15 pb. Cuando
se usa como cebador, la región del extremo 3' del polinucleótido
debe ser complementaria, pero el extremo 5' del mismo puede tener
un sitio de reconocimiento de enzima de restricción o un marcador
añadido al mismo.
El polinucleótido usado en la invención puede
utilizarse para examen y diagnóstico médico de anormalidad de la
proteína de la invención. Por ejemplo, en hibridación Northern o
PCR-TI en que se usa el polinucleótido de la
invención como sonda o cebador, puede detectarse la falta de
expresión de proteína.
El término "expresión" como se usa en la
presente memoria incluye transcripción y/o traducción. El análisis
de la expresión mediante el uso del polinucleótido usado en la
invención hace posible examinar y diagnosticar la expresión génica
al nivel de transcripción génica.
Cuando se usa el anticuerpo de la proteína usada
en la invención, que se describe a continuación en la presente
memoria, puede examinarse y diagnosticarse entonces la expresión
génica al nivel de traducción génica. Además, el polinucleótido que
codifica la proteína usada en la invención o su región de control de
la expresión pueden amplificarse mediante PCR de ADN genómico o
PCR-TI, en los que se usa en polinucleótido usado en
la invención como cebador en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), y puede examinarse y diagnosticarse la alteración de
secuencia mediante análisis RFLP, SSCP, secuenciación o un método
similar.
El "polinucleótido complementario del
polinucleótido de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 2 o la
cadena complementaria del mismo y que contiene al menos 15
nucleótidos" incluye el polinucleótido antisentido que inhibe la
expresión de la proteína usada en la invención. El polinucleótido
antisentido causa un efecto antisentido y, por lo tanto, tiene una
longitud de cadena de al menos 15 pb, preferiblemente al menos 100
pb, más preferiblemente al menos 500 pb, pero generalmente como
máximo 3000 pb, preferiblemente como máximo 2000 pb.
El polinucleótido antisentido de ese tipo puede
aplicarse a terapia génica para enfermedades causadas por una
anormalidad (anormalidad funcional o anormalidad de expresión) de la
proteína usada en la invención. Concretamente para diabetes, puede
prepararse el polinucleótido antisentido, por ejemplo, según un
método de fosforotioato (Stein, 1988, "Physicochemical Properties
of Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides", Nucleic Acids.
Res. 16, pág. 3209-3221 (1988)), basándose en
la información de secuencia del polinucleótido de SEQ ID NO: 1 ó
3.
Cuando se usa en terapia génica el
polinucleótido o el polinucleótido antisentido usado en la
invención, se administra entonces a pacientes según un método ex
vivo o un método in vivo, por ejemplo, un vector vírico
tal como un vector retrovírico, vector adenovírico, vector vírico
adenoasociado o vector no vírico tal como liposoma.
Se describe también un anticuerpo que se une a
la proteína usada en la invención. El anticuerpo no está
específicamente definido desde el punto de vista de su morfología,
e incluye un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y una
parte de ellos que tenga la capacidad de unirse a antígeno. Incluye
adicionalmente anticuerpos de todas las clases. Además, el
anticuerpo incluye anticuerpos especiales tales como anticuerpos
humanizados.
Cuando el anticuerpo es un anticuerpo
policlonal, puede obtenerse inmunizando conejos con la proteína o
péptido parcial usado en la invención producido en la presente
memoria ("Current Protocols in Molecular Biology" ed. Ausubel
et al., (1987), publicado por John Wiley and Sons, secciones
11.12-11-13). Por otro lado, cuando
es un anticuerpo monoclonal, puede obtenerse inmunizando ratones con
la proteína o péptido parcial usado en la invención, hibridando
entonces las células de bazo de los ratones inmunizados con células
de mieloma en un modo de fusión celular, y aislando el anticuerpo
monoclonal a partir de las células de hibridoma resultantes
("Current Protocols in Molecular Biology" ed. Ausubel et
al., (1987), publicado por John Wiley and Sons, secciones
11.4-11.
11).
11).
El anticuerpo que se une a la proteína usada en
la invención puede utilizarse para purificación de la proteína
usada en la invención y, por ejemplo, adicionalmente para examen y
diagnóstico médico de una anormalidad de expresión o anormalidad
estructural de la proteína. Concretamente, por ejemplo, se extrae
proteína de tejido, sangre o células y se somete ésta a
transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA o similares para
detectar en los mismos la proteína usada en la invención, tras de
lo cual puede examinarse y diagnosticarse la presencia o ausencia
de una anormalidad de expresión o estructural de la proteína.
El anticuerpo que se une a la proteína usada en
la invención puede utilizarse con fines de tratamiento de
enfermedades asociadas a la proteína usada en la invención. Cuando
se usa el anticuerpo con fines de tratamiento de pacientes,
entonces es preferiblemente un anticuerpo humano o anticuerpo
humanizado, ya que su inmunogenicidad es baja. El anticuerpo humano
puede prepararse inmunizando ratones en los que se ha cambiado el
sistema inmunitario por un sistema inmunitario humano (por ejemplo,
"Functional Transplant of Megabase Human Immunoglobulin Loci
Recapitulates Human Antibody Response in Mice", Méndez, M.J.
et al., (1997) Nat. Genet. 15, pág.
146-156). Por otro lado, el anticuerpo humanizado
puede prepararse mediante recombinación genética con una región
ultravariable de un anticuerpo monoclonal (Methods in
Enzymology 203, pág. 99-121 (1991)).
La proteína usada en la invención que se
codifica por el polinucleótido de SEQ ID NO: 2 ó 4 participa en la
regulación de la producción de azúcar, como se menciona
anteriormente en la presente memoria con relación a la regulación
de la producción de azúcar. En consecuencia, cuando se potencia la
expresión de la proteína de ese tipo, se retarda entonces la
producción de azúcar y por lo tanto es eficaz para el tratamiento y
la prevención de diabetes. Adicionalmente, la proteína de ese tipo
y la proteína que es funcionalmente equivalente a ella pueden
usarse por sí mismas como medicamentos para el tratamiento y la
prevención de diabetes.
La invención proporciona también un método de
examen de un compuesto que tiene la capacidad de regular la
actividad de la proteína usada en la invención. Puesto que la
proteína usada en la invención participa en la producción de
azúcar, el compuesto que tiene la capacidad de regular la expresión
del producto del gen de la proteína puede regular la producción de
azúcar, y por lo tanto es útil como medicamento para el tratamiento
y la prevención de diabetes. Se describe a continuación el método de
examen.
Puede aumentarse la expresión de la proteína
usada en la invención que está codificada por el polinucleótido de
SEQ ID NO: 1 ó 3 para retardar la producción de azúcar, y es eficaz
para el tratamiento y la prevención de
diabetes.
diabetes.
Para el método de examen de la invención, se
clona la región de control del gen a partir de un ADN cromosómico y
se une un gen indicador (por ejemplo, luciferasa,
\beta-galactosidasa, GFP (proteína fluorescente
verde)) cadena abajo de la región de control del gen, para así
construir un plásmido de expresión. La región de control de la
expresión del gen que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO:
1 ó 3 puede clonarse a partir de ADN cromosómico de cualquier modo
conocido.
Por ejemplo, es conocido un método de
cartografiado S1 como método de identificación de un punto de
iniciación de la transcripción ("Isolation of Transcription
Control Region" y "Identification and Purification of
Transcription Control Factor", Cell Engineering, ed.
extra. 8, "New Cell Engineering Experience Protocols", ed.
Tokyo University, Medical Science Laboratory, Carcinostatic
Laboratory Section, publicado por Shújun-sha, 1993,
pág. 362-374).
En general, se clona el ADN de la región de
control de la expresión del gen como un clon génico que contiene la
región de control de la expresión examinando una colección genómica
humana con un segmento de 15 a 100 pb, preferiblemente de 30 a 50
pb, del extremo 5' del gen que sirve como ADN de sonda.
Así obtenido, el clon contiene a menudo una
región 5' no traducida del gen que tiene una longitud de al menos
10 kpb. En consecuencia, se acorta o fragmenta el extremo 5' del
clon mediante tratamiento con exonucleasa o similar. Usando la
secuencia que contiene así acortada la región de control de la
expresión, se determinan la intensidad de la expresión y la
regulación de la expresión del gen indicador, y se da la unidad
mínima indispensable para mantener la actividad de la región de
control de la expresión (estudio de deleción).
Además, es conocido un programa para prever la
región de control de la expresión del gen mediante el uso de una
red neuronal (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html,
Reese, M.G. et al., "Large Scale Sequencing Specific
Neutral Networks for Promoter and Splice Site Recognition",
"Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium",
editado por Lawrence Hunter y Terri E. Klein, World Scientific
Publising Co., Singapur, 2-7 de Enero de 1996).
También es posible prever la unidad mínima de actividad mediante el
uso de un programa para prever la región de control de la expresión
mediante la recuperación de secuencias de unión al factor de
transcripción tales como Promoter Scan
(http://biosci.cbs.umn.edu/software/proscan/promoterscan.htm,
Prestridge, D.S. 1995, "Prediction of Pol II Promoter Sequence
Using Transcription Factor Binding Site", J. Mol. Biol.,
249, pág. 923-932). Adicionalmente, puede llevarse a
cabo también un estudio de deleción alrededor del centro de la
parte de núcleo
prevista.
prevista.
Se une funcionalmente un gen indicador cadena
abajo de la región de control así aislada del gen para construir un
plásmido de expresión, y se introduce este plásmido de expresión en
células adecuadas.
En la invención, unión funcional significa que
los dos se unen entre sí de tal manera que podría iniciarse la
transcripción del gen indicador mediante la activación de la región
de control de la expresión.
Como gen indicador, puede utilizarse cualquiera
en la medida en que codifique una proteína en la que pueda
observarse la activación de la región de control de la expresión
como expresión del gen. Concretamente, por ejemplo, puede usarse
generalmente como gen indicador un gen tal como luciferasa,
\beta-galactosidasa o GFP (proteína fluorescente
verde).
Como células en las que se introduce el vector,
por ejemplo, son utilizables células animales en las que el gen
está eliminado. A continuación, por ejemplo, se transforman con el
plásmido de expresión las células animales en las que el gen está
eliminado. Se detecta la expresión del gen indicador debido a la
actividad de transcripción de la región de control en las células
como formación de color o emisión de luz.
En las condiciones anteriores, se siembran las
células en una placa múltiple de 96 pocillos y se añade el
compuesto a examinar a cada pocillo. En éste, es posible en
consecuencia seleccionar fácilmente el compuesto capaz de inhibir o
promover la expresión del producto de expresión del gen.
Se describe el método de selección del
compuesto. Por ejemplo, cuando se usa GFP como gen indicador, se
compara entonces la cantidad de emisión de luz por GFP en el caso
en que se añade un compuesto químico con la del otro caso en que no
se añade el compuesto químico, y es posible seleccionar el
compuesto. La comparación indica una relación de cantidad de
emisión de luz de al menos 2 veces o como máximo 1/2 veces,
preferiblemente al menos 5 veces o como máximo 1/5 veces, más
preferiblemente al menos 10 veces o como máximo 1/10 veces. En el
método, son utilizables no sólo células animales, sin también
cualquier otro hospedador, independientemente de eucariotas o
procariotas, capaz de inducir la expresión de gen indicador en el
mismo sistema.
La muestra a ensayar en el método de examen
incluye, por ejemplo, extractos celulares, productos de expresión
de genoteca, compuestos sintéticos de bajo peso molecular, péptidos
sintéticos y compuestos naturales. Las muestras de ensayo descritas
en la presente memoria son sólo ejemplos.
Los compuestos aislados mediante el método de
examen son candidatos a compuestos que promueven o inhiben la
actividad de la proteína usada en la invención (agonistas,
antagonistas).
Además, son candidatos a compuestos que inhiben
la interacción entre la proteína usada en la invención y una
molécula capaz de interaccionar con la proteína. Estos compuestos
pueden ser aplicables a medicamentos para la prevención o el
tratamiento de enfermedades asociadas a la proteína usada en la
invención.
Es posible saber si la proteína usada en la
invención puede estar asociada o no a cualquier otra enfermedad
usando un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína usada
en la invención, aparte de las anteriormente mencionadas en la
presente memoria, y determinando la correlación entre la enfermedad
específica y la cantidad de expresión y actividad de la
proteína.
Además, la proteína usada en la invención puede
analizarse con referencia a "Molecular Diagnosis of Genetic
Diseases", (ed. Rob Elles, 1996) en una serie de "Method in
Molecular Biology" (publicado por Humana Press).
El anticuerpo que se une a la proteína usada en
la invención puede utilizarse para examen y diagnóstico médico de
una anormalidad de expresión o anormalidad estructural de la
proteína de la invención, además del uso para la purificación de la
proteína usada en la invención.
Concretamente, por ejemplo, se extrae la
proteína de tejido, sangre o células, y se somete ésta a
transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA o similares para
detectar en ellos la proteína usada en la invención, tras de lo
cual puede examinarse y diagnosticarse la
\hbox{presencia o
ausencia de anormalidad de expresión o estructural de la
proteína.}
Adicionalmente, es posible detectar diabetes
determinando la condición de expresión del polinucleótido usado en
la invención.
En la invención, puede aclararse la condición de
expresión del polinucleótido analizando cualquier etapa del proceso
en la que el gen se transcriba a ARNm y se traduzca a proteína. Más
concretamente, por ejemplo, la condición de transcripción puede
conocerse midiendo el ARNm que comprende la secuencia de bases
anteriormente mencionada como polinucleótido anteriormente
mencionado. El ARNm puede determinarse por cualquier método conocido
de hibridación Northern o PCR-TI.
Además, cuando se analiza la proteína que
comprende la secuencia aminoacídica codificada por el polinucleótido
anteriormente mencionado o su fragmento, puede conocerse entonces
la condición de traducción en la proteína. Puede determinarse la
proteína mediante transferencia Western con un anticuerpo que la
reconoce o mediante diversos inmunoensayos.
El método de examen puede llevarse a cabo con
objetivos de muestras de sangre o muestras de fluido cerebroespinal
de pacientes. Para observar la condición de expresión del
polinucleótido en una muestra de especímenes de tejido, es
empleable la hibridación in situ o el inmunoensayo de tejido.
Cuando se analiza la condición de expresión del polinucleótido en
la muestra, y cuando se retarda la expresión de polinucleótido en la
misma en comparación con la de un caso de control sin anormalidad
en la regulación de la producción de azúcar, puede asociarse
entonces la muestra a diabetes.
Se describe un reactivo para aclarar la
condición de expresión del polinucleótido usado en la invención. Más
concretamente, se describe el uso de un polinucleótido
complementario del polinucleótido usado en la invención o de la
cadena complementaria del mismo, y que tiene una longitud de al
menos 15 bases, para la detección del polinucleótido usado en la
invención.
Adicionalmente, se describe el uso de un
anticuerpo que reconoce la proteína usada en la invención para la
detección de la proteína.
La Fig. 1 es la fórmula estructural de la
sustancia WF00144.
La invención se describe más concretamente con
referencia a los siguientes Ejemplos.
Se unió biotina a la parte de ácido carboxílico
de la sustancia WF00144 (documento WO 99/61645) mediante un enlace
amida a través de un espaciador para formar una sustancia WF00144
modificada con biotina (designada de aquí en adelante como
sustancia WF biotinada). La sustancia WF biotinada tenía una
actividad inhibidora de la producción de azúcar en células
hepáticas primarias.
Se anestesiaron ratas (macho de 200 a 250 g) sin
alimento administrado desde el día anterior y se abrieron por corte
sus abdómenes. Se insertó una aguja permanente en la vena porta de
cada rata y se fijó a la misma, y con un líquido preperfusión
(cloruro de sodio 8 g/l, cloruro de potasio 0,4 g/l,
NaH_{2}PO_{4}\cdot2H_{2}O 0,078 g/l,
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O 0,151 g/l, HEPES 2,38 g/l, rojo
fenol 0,006 g/l, EGTA 0,19 g/l, hidrogenocarbonato de sodio 0,35
g/l, glucosa 0,9 g/l) introducido en la misma, se cortó la aorta
abdominal para desangrar y se perfundió el hígado.
A continuación, se perfundió el hígado con un
líquido de colagenasa (cloruro de sodio 8 g/l, cloruro de potasio
0,4 g/l, NaH_{2}PO_{4}\cdot2H_{2}O 0,078 g/l,
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O 0,151 g/l, CaCl_{2} 0,74 g/l,
HEPES 2,38 g/l, rojo fenol 0,006 g/l, inhibidor de tripsina 0,05
g/l, hidrogenocarbonato de sodio 0,35 g/l, colagenasa 0,4 g/l (tipo
III: Sigma)) para liberar las células hepáticas. Se cortó el hígado,
se separó su membrana de recubrimiento y se dispersaron las células
en medio MEM (medio esencial mínimo con sales de Earle).
Se filtraron las células dispersadas a través de
gasa y se centrifugó el filtrado. Se retiró el sobrenadante y se
añadió medio MEM al mismo, se dispersaron de nuevo las células en el
mismo y se centrifugó éste de la misma manera. Se repitió esta
operación 5 veces para preparar una suspensión de células
hepáticas.
Se transfirió la suspensión celular a un disco
de 10 cm recubierto con colágeno y se incubó en el mismo en
condiciones de 37ºC, 5% de CO_{2}, 30 de O_{2} y
\hbox{100%
de humedad durante 6 horas, y las células hepáticas se adhirieron
al disco.}
Se cambió el medio a un medio MEM de Dulbecco
(-glucosa, 1% de FBS, estreptomicina 83 mg/l, penicilina 83 mg/l,
kanamicina 100 mg/l, ácido pirúvico 20 mM, glucagón 0,01 mM, pH 7,2)
en el que se incubaron las células hepáticas durante un día entero
para hacerlas inducir la producción de azúcar.
Se cuantificó la concentración de glucosa
producida en el cultivo celular con el test de glucosa Wako (kit de
medida de glucosa de Wako Pure Chemical) según su manual.
Se recogieron células hepáticas primarias de
rata en las que se había inducido la producción de azúcar durante
una noche a partir del disco, se lavaron entonces una vez con
disolución salina fisiológica tamponada con fosfato (PBS) y se
midió el peso de los sedimentos de células hepáticas.
Se suspendieron los sedimentos celulares en una
disolución de extracción celular (disolución de sacarosa acuosa
0,25 M) de 9 veces el peso de los mismos, y se disgregaron por
ultrasonidos. Se retiró el desecho celular mediante centrifugación
a baja velocidad y se supercentrifugó el sobrenadante (100.000 g, 30
minutos). Se retiraron los residuos y se obtuvo así un extracto de
células hepáticas primarias inductoras de la producción de
azúcar.
Se llevó a cabo la cromatografía de afinidad de
biotina/avidina de modo ordinario (FEBS Lett., 31, 149
(1973)).
En concreto, se añadió WF biotinada 10 mM al
extracto de células hepáticas obtenido en la etapa anterior y se
hizo reaccionar con ello durante una noche a 4ºC. Al mismo tiempo,
se preparó un grupo de control en el que se añadió WF00144 (100 mM)
al extracto celular junto con la WF biotinada para hacer que las dos
compitieran entre sí.
Se dializó la disolución de reacción durante una
noche con la disolución de extracto celular para retirar la WF
biotinada no unida. Se añadió una resina unida a avidina (de Pierce)
a la disolución de reacción y se hizo reaccionar con ella durante
una noche.
Se precipitó la resina unida a avidina mediante
centrifugación y se retiró el sobrenadante. Se lavó entonces la
resina tres veces con una disolución de lavado (extracto celular con
sal 0,5 M añadida). Se degradó la avidina en la resina con urea 8 M
y se separó por elución la proteína unida.
Se separó la proteína eluída mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (al 12%). Se tiñó el
gel con CBB y se observaron las bandas de proteína. De las bandas
de proteína así observadas, aquellas no observadas en el grupo de
solo resina unida a avidina preparado separadamente (sin WF
biotinada añadida a la misma) y en el grupo con WF00144 añadida son
bandas de proteína de unión específica.
Se cortó del gel la banda de proteína de unión
específica observada aproximadamente a un peso molecular de 35 kDa
y se sometió a digestión con tripsina en gel para formar fragmentos
peptídicos. Se determinó el peso molecular de cada fragmento
peptídico según un método de huella de la masa peptídica
(MALDI-TOFMS) (usando Tofspec 2E de Micromass), y
se recuperaron los datos de la base de datos. Como resultado, se
identificó un fragmento peptídico previsto por la secuencia de
bases del clon EST de rata (gi: 8504516)
Del fragmento, se determinaron las secuencias
aminoacídicas subrayadas a partir de péptidos que se habían
preparado realmente a partir de las bandas de 35 kDa, según un
método de marcaje de secuencia peptídica (EM/EM
ESI-TOF) (usando
Q-Tof-2 de Micromass).
Basándose en estos datos se analizaron clones de
ratón Riken, y se consideró que un clon de ratón Riken 060010D20
sería una proteína homóloga de la proteína de 35 kDa de rata.
Se preparó una colección de ADNc de rata con el
sistema SuperScript Choice de Gibco BRL usando el ARN total
preparado a partir de las células hepáticas primarias de rata
inductoras de la producción de azúcar anteriormente mencionadas. Se
compró un ADNc humano en Clontech.
Basándose en la información de secuencia de
bases del clon EST de la secuencia aminoacídica parcial de la
presente proteína, que se había determinado anteriormente, se diseñó
un cebador oligonucleotídico para obtener el gen correspondiente
aproximadamente a la mitad del extremo C del mismo (SEQ ID NO:
7).
Además, a partir de la información de secuencia
de bases del clon Riken 0610010D20, se diseñó un cebador
oligonucleotídico para obtener el gen correspondiente
aproximadamente a la mitad del extremo N del mismo (SEQ ID NO:
6).
A partir de los cebadores así diseñados y la
colección de ADNc que se había preparado a partir de las células
hepáticas primarias inductoras de la producción de azúcar
anteriormente mencionadas, se obtuvo un gen completo según un
método de PCR.
Basándose en la secuencia de bases de rata, se
diseñaron cebadores (SEQ ID NO: 8 y 9) y se obtuvo un gen homólogo
de 35 kDa humano a partir de la colección de ADNc de hígado humano
según un método de PCR.
Se prepararon fragmentos de ADN de la proteína
de 35 kDa de rata y humana para su secuenciación mediante el uso de
BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction de Applied
Biosystems con ADN polimerasa AmpliTaq. Se llevó a cabo la
secuenciación con el analizador genético 3100 de Applied
Biosystems.
Así secuenciadas, la secuencia nucleotídica de
la proteína de 35 kDa de rata y la secuencia aminoacídica de la
misma son la SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. La secuencia
nucleotídica de la proteína de 35 kDa humana y la secuencia
aminoacídica de la misma son la SEQ ID NO: 1 y 2,
respectivamente.
Como resultado, la homología al nivel de
secuencia aminoacídica entre las proteínas de 35 kDa humana y de
rata era de un 87%.
La homología al nivel de aminoácido entre la
proteína que codifica el clon Riken y la proteína de 35 kDa de rata
y la proteína de 35 kDa humana era de un 96% y un 88%,
respectivamente.
Se usó pTrcHis B de Invitrogen como vector de
expresión. Se escindieron los genes obtenidos en la Realización
1-6 con endonucleasas de restricción. Brevemente, el
gen de rata con BamHI y EcoRI y el gen humano con BgIII y
EcoRI.
Se ligó cada fragmento con un fragmento
preparado escindiendo pTrcHis B con la misma combinación de
endonucleasas de restricción para preparar un plásmido de expresión
de la proteína de 35 kDa al que se unía una secuencia de
codificación de marcador de histidina (rata: pTrcHisB/r35k, humano:
pTrcHisB/h35k).
Se plantó E. coli (DH5\alpha)
transformada con el vector de expresión de proteína de 35 kDa humana
o de rata pTrcHisB/h35k en 5 ml de medio L que contenía ampicilina
50 \mug/ml (L-Amp), y se incubó en el mismo con
agitación durante una noche a 37ºC.
Se transfirió el cultivo resultante a 200 ml de
L-Amp y se agitó a 37ºC durante 3 horas, se le
añadió entonces IPTG para tener una concentración final 1 mM y se
agitó esto adicionalmente durante 6 horas. Se recogieron las
células cultivadas mediante centrifugación (6000 rpm, 20 min, 4ºC) y
se congelaron y almacenaron a -20ºC.
Se suspendieron las células obtenidas en la
etapa anterior en 40 ml de Tris-HCl 25 mM (pH 8,0)
que contenían lisozima 0,5 mg/ml y cloruro de sodio 0,3 M, y se
dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15
minutos.
A continuación, se sometieron éstas a
ultrasonidos (10 min) con enfriamiento con hielo y se centrifugaron
(10.000 rpm, 20 min, 4ºC), obteniéndose un sobrenadante. Se recogió
el sobrenadante y se pasó a través de una columna
Ni-NTA (Qiagen, volumen de lecho 5 ml) que se había
equilibrado con Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) que
contenía cloruro de sodio 0,3 M, y se lavó la columna con una
cantidad de 4 veces el mismo tampón y después con la misma cantidad
del mismo tampón que contenía imidazol 20 mM. Se eluyó la proteína
pretendida con 10 ml del mismo tampón que contenía imidazol 200 mM,
se recogió y se concentró el eluído hasta aproximadamente 6 ml
mediante el uso de un concentrador de ultrafiltración (ULTRAFREE,
BIOMAX-10k, Millipore).
Se dializó la fracción purificada por
Ni-NTA (6 ml) con 200 ml de Tris-HCl
25 mM (pH 8,0) y, para cortar y retirarle el marcador His, se
añadieron 5 \mul de Tween 20, 50 \mul de CaCl_{2} 100 mM y 30
unidades de enterocinasa (Invitrogen) y se hicieron reaccionar a
temperatura ambiente durante aproximadamente 8 horas.
Después de la reacción de corte, se añadió DTT 5
mM al líquido de reacción y se dejó a temperatura ambiente durante
aproximadamente 30 minutos. Se sometió entonces éste a cromatografía
de intercambio iónico con Mono Q 5/5 (Amersham, Pharmacia).
Usando Tris-HCl 25 mM (pH 8,0)
como tampón equilibrado, se sometió al columna a una elución en
gradiente lineal con un volumen de 20 columnas de cloruro de sodio
0,5 M (caudal 1 ml/min).
Basándose en la absorción UV a 280 nm, se
recogió la fracción de proteína pretendida y se concentró
aproximadamente a 0,8 ml mediante ultrafiltración (ULTRAFREE,
BIOMAX-10k, Millipore).
A continuación, se sometió ésta a cromatografía
de exclusión molecular con Superdex 200HR 10/30 (caudal 0,5 ml/min,
Amersham Pharmacia) equilibrado con Tris-HCl 25 mM
(pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,15 M, en la que se obtuvo
un solo pico que contenía la proteína pretendida.
Así obtenida, la muestra era de aproximadamente
10 mg en el ensayo de proteína (Bio-Rad), y dio una
sola banda aproximadamente a 35 kDa en el análisis de
PAGE-SDS. A partir de estos resultados, se entiende
que el gen de 35 kDa de rata y humano expresado en E. coli
producía una proteína que tiene el peso molecular adecuado supuesto
a partir de la secuencia aminoacídica de la misma.
Usando la misma WF biotinada que en la
identificación de la proteína de 35 kDa y la proteína de 35 kDa
humana expresada en E. coli y purificada, se llevó a cabo la
cromatografía de biotina/avidina anteriormente mencionada, y se
analizó la proteína liberada a partir de la resina de avidina
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
para investigar así la unión específica de la proteína de 35 kDa
humana a WF00144.
Como resultado, la proteína de 35 kDa humana
purificada se mantuvo unida a la resina de avidina sólo en presencia
de la sustancia marcada con biotina. Además, esta unión se
antagonizaba en presencia de WF00144 (a una relación molar con la
sustancia marcada con biotina de 1/1).
Según la cromatografía de exclusión molecular
con Superdex 200HR 10/30 que se había llevado a cabo en la etapa de
purificación, se determinó el peso molecular de la presente
proteína. Se usaron aldolasa (PM: 158 kDa), albúmina (67 kDa) y
ovoalbúmina (43 kDa), todas de Amersham Pharmacia, como marcadores
del peso molecular. El peso molecular de la proteína de 35 kDa, que
se calcula a partir del volumen de elución indicado por cada
marcador, era de aproximadamente 80 kDa.
A partir del peso molecular de la misma (35 kDa)
en el PAGE-SDS anterior, se considera que la
presente proteína tendría una estructura dimérica.
Según un proceso de PCR que usa el panel I de
ADNc de tejidos múltiples de rata (MTC) de Clonetech (nº de cat.
K1429-1), se investigó la condición de expresión del
gen de la proteína de 35 kDa en corazón, cerebro, bazo, pulmón,
hígado, músculo esquelético y riñón. En PCR, se usaron un cebador de
codificación CTGTACAGTGTCCAGGCAA
CA y un cebador inverso AATCCTGCTTGCTGGTCTTGTG, y la ADN polimerasa fue KOD-Plus de Toyobo. Se llevo a cabo la PCR según el manual adjunto al dispositivo. Se analizó el producto de PCR separando el líquido de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa ordinaria.
CA y un cebador inverso AATCCTGCTTGCTGGTCTTGTG, y la ADN polimerasa fue KOD-Plus de Toyobo. Se llevo a cabo la PCR según el manual adjunto al dispositivo. Se analizó el producto de PCR separando el líquido de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa ordinaria.
Como resultado, resulta obvio que la expresión
del gen de la proteína de 35 kDa está limitada sólo a hígado y
riñón. Este resultado sugiere firmemente que el gen de la proteína
de 35 kDa es una proteína que participa en la producción de
azúcar.
En el análisis de la función fisiológica de una
proteína no conocida desde el punto de vista de su función, es útil
la especificidad del gen de la proteína en la expresión en tejido.
Los órganos productores de azúcar están limitados a hígado y riñón.
En consecuencia, si la proteína de 35 kDa participa en la producción
de azúcar, entonces se prevé fácilmente que la expresión de
proteína estará limitada sólo a hígado y riñón. Hígado y riñón son
órganos que están altamente diferenciados desde el punto de vista de
su función, y excepto la producción de azúcar, no hay ninguna otra
función común a dichos hígado y riñón.
La WF001444 es un inhibidor de la producción de
azúcar hepático que se produce por los hongos Phoma sp. nº
00144 (documento WO 99/61645). Esta sustancia inhibe la producción
de azúcar in vitro por células hepáticas de cultivo
primario, y debido a su efecto, ésta exhibe un efecto hipoglucémico
en modelos de animal enfermos de diabetes.
Específicamente, puede decirse que este agente
podría ser un medicamento para la diabetes, ya que se une a cierta
proteína que participa en la producción del azúcar hepático y la
inhibe, inhibiendo así la producción de azúcar hepático y
expresando un efecto hipoglucémico. La proteína de 35 kDa es una
proteína que se une específicamente al inhibidor de la producción
de azúcar hepático WF00144 en las células hepáticas primarias de
rata inductoras de la producción de azúcar mostradas en la
realización 1-2, es decir, en células hepáticas en
que está activo su mecanismo productor de azúcar. En consecuencia,
puede suponerse fácilmente que la de 35 kDa es una proteína que
participa en la producción de azúcar hepático.
Para analizar finalmente la función de una
proteína novedosa, se emplea generalmente un método de deleción,
mutación o sobreexpresión del gen que codifica la proteína para
observar el fenotipo del gen al nivel de las células o al nivel de
los individuos. Sin embargo, el método genético de este tipo lleva
generalmente un largo periodo de tiempo, en el que, sin embargo,
puede activarse algún mecanismo sustituto, con lo que habría muchas
dificultades para un análisis de función exacto según el método.
Como método de análisis de la función final de
una proteína novedosa capaz de compensar los inconvenientes del
método genético, se ha empleado en la presente memoria un método de
uso de un compuesto de bajo peso molecular que se ha establecido
recientemente en la Genética Química como razonable. El compuesto de
bajo peso molecular puede inhibir transitoria y reversiblemente una
proteína en cualquier etapa, es decir, en una etapa en la que se ha
inducido el fenómeno biológico que se va a observar (en general,
este periodo es corto), y puede hacer posible observar el fenotipo
inducido por éste.
En consecuencia, no habría contradicción en la
consideración de que, según el método anterior, "cuando un
compuesto de bajo peso molecular que se une específicamente a una
proteína capaz de unirse específicamente a un compuesto que inhibe
y retarda cierto fenómeno farmacéutico y que difiere del último
compuesto desde el punto de vista de su esqueleto molecular, puede
inhibir y retardar el mismo fenómeno farmacéutico que el último
compuesto, entonces la proteína participa en el fenómeno
farmacéutico".
Por ejemplo, en el presente caso, cuando algún
otro compuesto de bajo peso molecular distinto de la sustancia
WF00144 que se une específicamente a la proteína de 35 kDa, cuya
función fisiológica no está clara, puede exhibir una actividad
inhibidora de la producción de azúcar hepático en rata como la
sustancia WF00144, entonces puede concluirse que la presente
proteína de 35 kDa participa en la producción de azúcar. En
consecuencia, se buscaron compuestos de bajo peso molecular capaces
de unirse específicamente a la proteína de 35 kDa según el método
mencionado a continuación, y se descubrieron los compuestos A y
B.
Se mezcló una disolución que contenía la
proteína de 35 kDa humana o de rata purificada obtenida según el
mismo método que en la Realización 2 anteriormente mencionada con
una disolución que contenía una sustancia de ensayo para formar un
complejo proteína-compuesto. Se analizaron
separadamente con S-51 de BiaCore la sustancia de
ensayo, la proteína y la mezcla que contenía el complejo
proteína-compuesto formado en la misma para
confirmar la condición de las moléculas y el complejo. Se llevó a
cabo el análisis según el manual de operación de
S-51 de BiaCore.
Los datos obtenidos mediante análisis con
S-51 de BiaCore confirmaron que la sustancia de
ensayo se une específicamente a la proteína. Más concretamente, se
muestran en la Tabla 1 los datos del valor de unión k_{d} de la
proteína de 35 kDa humana a la sustancia de ensayo medidos con
S-51 de BiaCore.
Respecto a la actividad inhibidora de la
producción de azúcar de la proteína en células hepáticas primarias
de rata, se muestran en la Tabla 1 los datos de CI_{50} de la
misma medidos según la Realización 1-2. A partir de
estos resultados, se supone que la función fisiológica de la
proteína de 35 kDa sería la producción de azúcar hepático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según el método descrito en la Realización 2, la
expresión y purificación de proteína de 35 kDa de rata y humana, se
preparó la proteína de 35 kDa humana. Se hizo reaccionar
adecuadamente la proteína de 35 kDa humana con su sustrato para
reacción enzimática
gliceraldehido-3-fosfato (GAP),
dihidroxiacetonafosfato (DHAP) o
fructosa-1,6-difosfato (F1,6P_{2})
en un líquido de reacción que tiene la siguiente composición, a
37ºC, durante 30 minu-
tos.
tos.
Líquido de reacción (100 \mul): tampón
Tris-HCl 0,25 mM (pH 8,0),
gliceraldehido-3-fosfato 0,5 mM (de
Sigma), dihidroxiacetonafosfato 0,5 mM (de Sigma), proteína de 35
kDa humana (40 \mug/ml).
Se sometió la mezcla de reacción a TLC con una
placa de gel de sílice 60F_{254} (de Merck) en la que se
desarrolló ésta con un disolvente mixto de butanol/ácido
acético/agua: 4/1/2. Después del desarrollo, se secó la placa y se
analizó entonces el producto de reacción mediante reacción de Molish
ordinaria con \alpha-naftol y ácido
sulfúrico
concentrado.
concentrado.
El valor de Rf y la formación de color de los
tres azúcares en este sistema de análisis son los siguientes:
gliceraldehído-3-fosfato (GAP),
0,28, marrón; dihidroxiacetonafosfato (DHAP), 0,16, azul;
fructosa-1,6-difosfato
(F1,6P_{2}) 0,05, violeta rojizo.
Como resultado, la proteína de 35 kDa humana
formó fructosa-1,6-difosfato a
partir de gliceraldehido-3-fosfato
y dihidroxiacetonafosfato. Además, la proteína de 35 kDa humana
produjo gliceraldehido-3-fosfato y
dihidroxiacetonafosfato a partir de
fructosa-1,6-difosfato. Estas
reacciones son una reacción de condensación de aldol y una reacción
de escisión de aldol, y son características de aldolasa de clase I.
En consecuencia, se confirmó que la proteína de 35 kDa humana es un
tipo de aldolasa de clase I como se preveía a partir de su
estructura.
Se determinó la actividad aldolasa de la
proteína de 35 kDa humana como sigue, según el método descrito en
la referencia ("Novel Biochemistry Experiment Lecture", vol.
15, "Metabolism Abnormality", pág. 111, ed. Biochemical
Society of Japan, publicado por Tokyo Kagaku
Dojin-sha, 22 de Septiembre de 1992).
Se determinó con NADH conjugado con triosa
fosfato isomerasa (TIM) y
glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa
(G3PDH) la reacción de escisión de aldol de fructosa-1,6-difosfato (F1,6P_{2}) con la proteína de 35 kDa.
(G3PDH) la reacción de escisión de aldol de fructosa-1,6-difosfato (F1,6P_{2}) con la proteína de 35 kDa.
Se preparó un líquido de reacción que tenía la
composición mencionada a continuación, y se hizo reaccionar a 37ºC
durante 30 minutos. Se monitorizó la reacción enzimática mediante la
reducción de la absorbancia a 340 nm debido a la oxidación del NADH
en el líquido de reacción. Se indicó la reacción enzimática por el
número de moles de F1,6P2 por mg de proteína escindidos en 1 minuto
(\mumol/min/mg de proteína).
Líquido de reacción (200 \mul): tampón
Tris-HCl 0,25 mM (pH 8,0), NaCl 0,15 M, F1,6P2 0,5
mM (de Sigma), proteína de 35 kDa humana, TIM hepática humana (500
\mug/ml), G3PDH de músculo esquelético de conejo (8 unidades/ml
de Sigma), NADH 0,3 mM (de Nakarai).
\newpage
Para comparación, se ensayaron de la misma
manera un producto comercial de aldolasa, aldolasa de músculo
esquelético de conejo de Sigma (aldolasa de tipo A), y un sistema
exento de enzima. Se muestran en la Tabla 2 los resultados. Los
datos de actividad confirman que la proteína de 35 kDa humana tiene
actividad aldolasa.
La presente invención proporciona el uso de una
proteína que participa en la regulación de la producción de azúcar,
y describe un polinucleótido que la codifica.
Puesto que la invención proporciona un método de
examen de un compuesto que participa en la regulación de la
producción de azúcar, hace posible evaluar los compuestos
participantes en la regulación de la producción de azúcar.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Fujisawa Pharmaceutical Co.,
Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVA PROTEÍNA DE 35 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> T62757
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 03725692.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
28-04-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2002-126107
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1061
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\hskip0.7cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1017
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misceláneas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (165)..(165)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm
Claims (2)
1. Un método de examen de una sustancia
reguladora de la producción de azúcar que incluye las siguientes
etapas:
- (1)
- una etapa de poner en contacto una sustancia candidato con un péptido o proteína que se une específicamente a WF00144 (Figura 1), en la que el péptido o proteína está codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes (a) a (e):
- (a)
- un polinucleótido que contiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3,
- (b)
- un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4,
- (c)
- un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4, en el que 1-5 aminoácidos están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos,
- (d)
- un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3 en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas comprenden el lavado con 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC,
- (e)
- un polinucleótido que tiene al menos (1) un 88% de homología, (2) un 92% de homología o (3) un 96% de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3;
- (2)
- una etapa de determinación de la condición de unión del péptido o proteína a la sustancia candidato;
- (3)
- una etapa de selección de la sustancia candidato que se une al péptido o proteína.
2. Uso de un péptido o proteína que se une
específicamente a WF00144 (Figura 1) como herramienta de examen de
una sustancia reguladora de la producción de azúcar, en el que el
péptido o proteína se codifica por un polinucleótido de uno
cualquiera de los siguientes (a) a (e):
- (a)
- un polinucleótido que contiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3,
- (b)
- un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4,
- (c)
- un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2 ó 4, en el que 1-5 aminoácidos están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos,
- (d)
- un polinucleótido que hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3 en condiciones rigurosas, en el que las condiciones rigurosas comprenden el lavado con 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC,
- (e)
- un polinucleótido que tiene al menos (1) un 88% de homología, (2) un 92% de homología o (3) un 96% de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3.
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