ES2297131T3 - Produccion de ugppasa. - Google Patents
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Abstract
Proteína enzimática purificada que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEC ID N.º: 2.
Description
Producción de UGPPasa.
La presente invención se refiere a
UDP-glucosa pirofosfatasa (UGPPasa), una nueva
proteína enzimática que se ha descubierto que se encuentra en
animales, y a la preparación de la proteína en una forma purificada,
así como a los usos de la proteína en el campo del análisis
bioquímico incluido ELISA, y para la determinación de la
UDP-glucosa contenida en una muestra.
El glucógeno es un polisacárido que constituye
el principal carbohidrato en células animales y en una variedad de
bacterias, entre las que se incluye Escherichia coli, del
mismo modo que el almidón lo es en plantas. El almidón en plantas y
el glucógeno en bacterias son producidos a partir de un sustrato
común, la ADP-glucosa (ADPG). En animales, por otro
lado, el glucógeno es sintetizado a partir de
UDP-glucosa (UDPG) (1). Se cree que la síntesis
neta de estos polisacáridos de reserva en organismos es controlada
por una variedad de factores reguladores que responden al entorno
externo, así como a condiciones fisiológicas internas. Tales
factores reguladores se espera que actúen, por ejemplo, en el
control alostérico de la reacción de ADPG (o UDPG) pirofosforilasa
(AGPasa o UGPasa, respectivamente) en la vía de la glucogénesis, o
controlando la expresión de genes que codifican enzimas
gluconeogénicas (1-4).
Investigaciones recientes han demostrado que el
glucógeno puede ser sintetizado y degradado simultáneamente durante
el crecimiento bacteriano, originando un ciclo fútil en el que la
AGPasa tiene una doble función en la catalización de la síntesis
de novo de ADPG y al reciclar las unidades de glucosa
procedentes de la degradación del glucógeno
(5-7).
Se ha observado que la síntesis y la degradación
simultáneas de glucógeno y almidón también tienen lugar en animales
y plantas, respectivamente (8-10), lo que de este
modo indica que la operatividad del ciclo fútil puede suponer
ventajas tales como la regulación sensible y la canalización del
exceso de intermediarios gluconeogénicos hacia diversas vías
metabólicas en respuesta a necesidades fisiológicas y
bioquímicas.
Se ha predicho la presencia de una enzima
unidireccional que cataliza la hidrólisis de ADPG (o UDPG) en
relación con esta vía parecida al ciclo fútil, que permitiría una
regulación más sensible de los niveles de ADPG (UDPG) y por lo
tanto del índice neto de síntesis/degradación de los polisacáridos
de reserva. La primera de tales enzimas fue descubierta por
Pozueta-Romero J. y sus colaboradores, que aislaron
y purificaron ADP-glucosa pirofosfatasa (AGPPasa) a
partir de cebada y de bacterias (11-13). La AGPPasa
que aislaron era una enzima unidireccional que cataliza la
hidrólisis de ADPG a
glucosa-1-fosfato (G1P) y adenosina
5'-monofosfato (AMP). Se ha observado presencia de
las enzimas que catalizan la degradación hidrolítica de UDPG en
células de mamíferos (14-16). Estas enzimas, que
intervienen en el control de la biosíntesis de glucoproteínas,
glucolípidos y glucosaminoglucanos (17-22),
muestran una amplia especificidad de sustrato y se ha visto que
están asociadas con fracciones de la membrana nuclear,
mitocondrial, plasmática y del retículo endoplásmico.
La biosíntesis del glucógeno tiene lugar en el
citosol. La posible participación de la degradación enzimática de
la UDPG en el control del flujo de carbono hacia glucógeno en
células de mamífero nos ha impulsado a identificar una proteína
citosólica, designada como UDP-glucosa pirofosfatasa
(UGPPasa), que hidroliza la UDPG con la especificidad
sustancialmente más alta.
Ahora, aplicando una técnica de purificación de
proteínas enzimáticas, PAGE sin SDS (a la que en adelante se hace
referencia como "PAGE nativa"), los inventores de la presente
han purificado satisfactoriamente UDP-glucosa
pirofosfatasa (UGPPasa) de animales (humanos y cerdos), una enzima
que tiene propiedades comparables a las de la AGPPasa de plantas y
bacterias, y han establecido un procedimiento para producir la
enzima mediante tecnología recombinante. Esta enzima, ahora
designada definitivamente como UGPPasa, es la enzima que los
inventores denominaron provisionalmente UGPPasa o USPPasa tal como
describieron en sus solicitudes internacionales PCT/JP02/02726,
presentadas el 20 de marzo del 2002, o el 17 de septiembre del 2002,
respectivamente.
La UGPPasa es una enzima hidrolítica
unidireccional que cataliza la conversión de UDPG, la molécula
precursora del glucógeno, a G1P y UMP.
De este modo, la presente invención proporciona
una proteína enzimática purificada que consiste en la secuencia de
aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º: 2 en el
listado de secuencias. La proteína tiene actividad UGPPasa, es
decir, la actividad de hidrolizar la UDP-glucosa en
glucosa-1-fosfato (G1P) y uridina
5'-
monofosfato.
monofosfato.
\newpage
La presente invención también proporciona una
proteína enzimática producida mediante tecnología recombinante
(proteína recombinante) que consiste en la secuencia de aminoácidos
establecida anteriormente como SEC ID N.º: 2 en el listado de
secuencias, en una forma purificada. Se ha confirmado que la
proteína recombinante tiene actividad UGPPasa.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para producir una proteína enzimática recombinante
que comprende las siguientes etapas: incorporar el ADN que consiste
en la secuencia de nucleótidos establecida anteriormente como SEC
ID N.º: 1 en el listado de secuencias a un vector de expresión,
introducir el vector de expresión construido de este modo en
células competentes, cultivar las células transformadas con el
vector de expresión construido y purificar la proteína expresada,
en la que la proteína tiene capacidad para hidrolizar
UDP-glucosa a
glucosa-1-fosfato y uridina
5'-monofosfato.
La presente invención proporciona además el uso
de la proteína enzimática recombinante como estándar de referencia
en el análisis de la actividad UGPPasa en muestras, en el que la
proteína consiste en la secuencia de aminoácidos establecida
anteriormente como SEC ID N.º: 2, en el que la proteína tiene
capacidad para hidrolizar la UDP-glucosa a
glucosa-1-fosfato y uridina
5'-monofosfato. Dicho uso permite obtener datos
estandarizados de los niveles de actividad de la enzima, que
permiten una comparación cuantitativa exacta entre los datos
obtenidos de distintas muestras cuantificadas en distintos momentos
y lugares.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento para preparar UGPPasa de mamíferos purificada tal
como se define en la reivindicación 1 que comprende las siguientes
etapas:
(a) homogenizar tejido de un animal mamífero en
un medio acuoso,
(b) centrifugar el homogeneizado obtenido de
este modo,
(c) recoger el sobrenadante del homogeneizado
centrifugado,
(d) dializar el sobrenadante recogido frente a
un medio acuoso,
(e) aplicar el sobrenadante dializado obtenido
anteriormente en (d) a uno o más procesos de cromatografía
utilizando uno o más materiales en fase estacionaria,
respectivamente, y recoger fracciones que muestren actividad
UGPPasa concentrada, en las que entre el material o materiales en
fase estacionaria se incluya uno seleccionado del grupo que
consiste en intercambiador de aniones, intercambiador de aniones
débiles, gel para exclusión de tamaño e hidroxiapatita,
(f) aplicar a las fracciones que muestren
UGPPasa activa concentrada obtenidas anteriormente en (e) la técnica
de PAGE nativa, y
(g) eliminar del gel una parte que contenga una
UGPPasa concentrada de actividad específica y extraer la proteína
UGPPasa de la parte del gel con un medio de extracción acuoso.
El procedimiento anterior se realiza más
preferiblemente en presencia de uno o más agentes protectores del
grupo sulfhidrilo disueltos en el medio utilizados en una o más de
las etapas (d)-(i) y, más preferiblemente, en todas.
Además, la presente invención proporciona un
anticuerpo purificado contra la UGPPasa, el cual anticuerpo puede
ser policlonal o monoclonal.
Además, la presente invención también
proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de UGPPasa
que es una proteína tal como se define en la reivindicación 1 en un
analito basado en un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) que
comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una fase sólida a la que se une
un anticuerpo anti-UGPPasa,
(b) poner una primera solución que contenga una
cantidad predeterminada del analito en contacto con la fase sólida
durante un período de tiempo suficiente para permitir que la UGPPasa
contenida en el analito se una a la unión
anti-UGPPasa de la fase sólida,
(c) después de eliminar la primera, poner una
segunda solución que contenga una cantidad predeterminada de un
anticuerpo anti-UGPPasa conjugado a una enzima en
contacto con la fase sólida durante un período de tiempo suficiente
para permitir que el anticuerpo anti-UGPPasa
conjugado a la enzima se una a la unión UGPPasa en la unión
anti-UGPPasa de la fase sólida,
(d) después de eliminar la segunda solución,
poner una tercera solución que contenga una cantidad predeterminada
de un sustrato para la enzima conjugada en contacto con la fase
sólida, y dejar que la enzima conjugada reaccione con el sustrato
durante un período predeterminado de tiempo para producir un
producto específico de la reacción enzimática, (e) cuantificar la
cantidad del producto específico obtenido de este modo, y
(f) determinar la cantidad de UGPPasa en el
analito basándose en la comparación entre la cantidad del producto
específico obtenido en (e) y la cantidad del producto específico
producido a partir de una cantidad predeterminada de UGPPasa en las
mismas condiciones que en (b)-(d).
Aún más, la presente invención también
proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de UDPG
contenida en una muestra dada, preferiblemente una muestra líquida y
más preferiblemente una muestra biológica tal como sangre. Puesto
que la carencia de UDPG tiene lugar en tejidos de animales
diabéticos (pacientes) (25-27), la determinación de
UDPG en muestras se utilizará en la identificación de pacientes
diabéticos. El procedimiento, que se basa en una conversión
biunívoca de UDPG a G1P, comprende las siguientes etapas:
(a) mezclar una cantidad predeterminada de una
muestra con una solución tampón que contenga una cantidad
predeterminada de UGPPasa tal como se define en la reivindicación 1
para preparar una mezcla de reacción,
(b) incubar la mezcla de reacción durante un
período de tiempo suficiente para convertir la UDPG a G1P,
(c) finalizar la reacción calentando la mezcla
de reacción, y
(d) cuantificar la cantidad de G1P producida en
(d) haciendo reaccionar la G1P contenida en por lo menos una parte
conocida de la mezcla de reacción con fosfoglucomutasa, G6P
deshidrogenasa y NAD, y cuantificar la cantidad de NADH producido,
por ejemplo, mediante espectrofotometría a 340 nm.
Este procedimiento permite cuantificar la
cantidad de UDPG en tejidos humanos, en los que la concentración de
UDPG oscila entre 0,1 mM y 1 mM en humanos no diabéticos (28,
29).
La figura 1 ilustra un esquema del flujo de
reacciones bioquímicas relacionadas con el metabolismo del glucógeno
que tienen lugar en células animales, en las que se cree que
participa la UGPPasa. En la figura: Glc; glucosa, HK; hexoquinasa,
PGM; fosfoglucomutasa.
La figura 2 muestra el resultado de
SDS-PAGE del producto purificado (3 \mug) en cada
etapa del proceso de purificación de UGPPasa del homogeneizado
renal. En la figura: columna M, marcador peso molecular; columna 1,
extracto homogeneizado renal (0,00161 mU); columna 2, sobrenadante a
30.000 g (0,00429 mU); columna 3, muestra dializada (0,00481 mU);
columna 4, sobrenadante a 100.000 g (0,00579 mU); columna 5, eluido
columna de Q-Sefarosa (0,00655 mU); columna 6,
segundo eluido columna de Q-Sefarosa (0,0248 mU);
columna 7, eluido columna de Q-Sefarosa con un
gradiente lineal de NaCl (0,0523 mU); columna 8, eluido columna de
Superdex 200 (0,184 mU); columna 9, eluido columna monoQ (0,535
mU); columna 10, eluido columna MonoP (2,59 mU); columna 11, PAGE
nativa (98,5 mU).
La figura 3 es una gráfica que muestra la
concentración de proteína y la actividad UGPPasa de fracciones
31-45 de una columna monoP.
La figura 4 muestra el resultado de
SDS-PAGE de fracciones 29-39 de la
columna MonoP.
La figura 5 muestra el resultado de
SDS-PAGE de dos lotes de muestras después de
purificar mediante PAGE nativa. En la figura: columna M, marcador
peso molecular. La cantidad de UGPPasa en el gel: 0.184 mU (lote 1,
fracción 5); 4,33 mU (lote 1, fracción 6); 2,88 mU (lote 1,
fracción 7); 3,74 mU (lote 2, fracción 5); 4,43 mU (lote 2,
fracción 6); 0,558 mU (lote 2, fracción 7).
La figura 6 muestra la primera mitad de los
resultados de ESI-TOF MS/MS. La primera mitad de las
secuencias deducidas de aminoácidos de AAD15563.1 (humano) y
BAB23110.1 (ratón) están alineadas con las secuencias de
aminoácidos de fragmentos de UGPPasa porcina. Los aminoácidos
comunes en las tres especies aparecen marcados con "...",
mientras que los que sólo son comunes entre el cerdo y la especie
humana o el ratón aparecen marcados
con ".".
con ".".
La figura 7 muestra la segunda mitad de los
resultados de ESI-TOF MS/MS. La segunda mitad de las
secuencias deducidas de aminoácidos de AAD 15563.1 (humano) y
BAB23110.1 (ratón) están alineadas con las secuencias de
aminoácidos de fragmentos de UGPPasa porcina. Los aminoácidos
comunes en las tres especies aparecen marcados con "...",
mientras que los que sólo son comunes entre el cerdo y la especie
humana o el ratón aparecen marcados
con ".".
con ".".
La figura 8 muestra el resultado de la
electroforesis (0,8% gel de agarosa) del producto de amplificación
de la
RCP.
RCP.
La figura 9 ilustra un vector T pT7Blue con AAD
15563.1 incorporado.
La figura 10 ilustra un pET11a con AAD
AAD15563.1 incorporado.
La figura 11 muestra el resultado de la
electroforesis (0,8% agarosa) del pET11a.AAD15563.1 digerido con
NdeI/BamHI.
La figura 12 muestra los resultados de
SDS-PAGE de la suspensión de las células
AD494(DE3) transformadas con pET11a AAD15563.1 o pET11a:
columna 1, cultivo de 0 horas de células transformadas con pET11a;
columna 2, cultivo de 0 horas de células transformadas con pET11a
AAD 15563.1; columna 3, cultivo de 3 horas de células transformadas
con pET11a; columna 4, cultivo de 3 horas de células transformadas
con pET11a AAD15563.1. La cantidad aplicada al gel: 0,072; 0,034,
0,034 y 0,292 (mU) para las columnas 1 a 4, respectivamente.
La figura 13 muestra los resultados de
SDS-PAGE (10-20% gel de
poliacrilamida) obtenidos con cada uno de los productos purificados
(2,0 \mug) en las etapas de purificación de la UGPPasa humana
recombinante (r-hUGPPasa). En la figura: columna 1,
suspensión AD494 (DE) (1,8 mU); columna 2, sobrenadante a 10.000 g
(3,0 mU); columna 3, eluido Q-Sefarosa (6,2 mU);
columna 4, eluido MonoP (13,5 mU). La actividad específica de las
muestras fue: columna 1, 0,910 U/mg; columna 2, 1,51 U/mg; columna
3, 3,09 U/mg, columna 4, 6,74 U/mg.
La figura 14 es una gráfica que muestra el
intervalo óptimo de pH para la UGPPasa porcina. La cuantificación
se realizó en Tris-HCl 50 mM con (\blacklozenge) o
sin ( ) MgCl_{2}.
La figura 15 es una gráfica que muestra el
intervalo óptimo de pH para la UGPPasa recombinante humana. La
cuantificación se realizó en Tris-HCl 50 mM con
(\blacklozenge) o sin ( ) MgCl_{2} 20 mM, o en
glicina-KOH 50 mM (O) con MgCl_{2} 20 mM.
La figura 16 es una gráfica que muestra la
actividad de la UGPPasa porcina en función de la concentración de
UDPG (mM). A partir de la gráfica, se determina que la Kd de la
enzima es de 4,26 mM.
La figura 17 es una gráfica que muestra la
actividad de la UGPPasa recombinante humana en función de la
concentración de UDPG (mM). A partir de la gráfica, se determina
que la Kd de la enzima es de 4,35 mM.
La figura 18 muestra el resultado de un análisis
mediante método Northern del ARN total de tejidos porcinos.
La figura 19 muestra el resultado de un análisis
mediante método Northern del ARN total de tejidos humanos.
La figura 20 ilustra un pET19b con AAD15563.1
incorporado.
La figura 21 muestra el resultado de la
electroforesis (0,8% agarosa) del pET19b.AAD15563.1 digerido con
NdeI/BamHI.
La figura 22 muestra los resultados de la
tinción CBB (1) y un análisis de inmunotransferencia de la proteína
de fusión hUGPPasa con cola de histidina
(His-tag), expresada en células de E.
coli y purificada a partir de células de E. coli
transformadas, con antisuero anti-hUGPPasa (2) y con
un anticuerpo anti-his (3).
La figura 23 es una gráfica que muestra los
resultados de un ELISA de hUGPPasa de una proteína de fusión
hUGPPasa con cola de histidina purificada como estándar. Se
representan las DO a 450 nm de soluciones estándar que contienen la
proteína a 1-1.000 ng/ml. La línea oblicua indica
linealización de la relación entre la concentración de proteína (x)
y la DO a 450 (y), en ambos casos a una escala logarítmica.
La figura 24 es una gráfica que muestra los
resultados de un ELISA de hUGPPasa de lisados de dos tipos de
células de E. coli, uno que incluye pET-19b
AAD15563.1 y otro que incluye pET-19b a distintos
niveles de dilución.
La figura 25 es una gráfica que muestra la
correlación entre la cantidad de UDPG contenida inicialmente en las
muestras y la cantidad de G1P cuantificada utilizando UGPPasa.
La presente invención se describirá con mayor
detalle más adelante haciendo referencia a los procedimientos para
aislar y purificar la UGPPasa porcina, así como a los resultados, a
la producción de UGPPasa recombinante humana, a su caracterización
enzimática, a la producción de un anticuerpo
anti-UGPPasa, a la cuantificación de UGPPasa basada
en ELISA y a la determinación de la UDP-glucosa
contenida en una muestra.
También puede producirse un anticuerpo
monoclonal anti-UGPPasa mediante un procedimiento
convencional para preparar un anticuerpo monoclonal, que comprende
etapas tales como: inocular UGPPasa a animales (por ejemplo,
ratones), extirpar el bazo de un animal que muestra suficientes
títulos de anticuerpos, seleccionar células B, fusionar las células
B con células de mieloma originadas a partir de células B para
formar células de hibridoma que secreten el anticuerpo, y purificar
el anticuerpo del medio de cultivo. Puede producirse un anticuerpo
monoclonal utilizando cualquier animal mamífero tal como conejos,
caballos, ratones y cobayas.
La actividad UGPPasa se define a partir de la
cantidad de G1P producida por la enzima. La cuantificación se lleva
a cabo en reacciones de dos etapas según el procedimiento notificado
por Rodriguez-Lopez y otros (11). En la primera
reacción, 50 \mul de la mezcla de reacción que consiste en una
muestra que contiene UGPPasa, una concentración
0-20 mM de un nucleótido azucarado (UDP-, ADP- o
GDP-glucosa)(SIGMA), MgCl_{2} 20 mM, y
Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), y se incuba la mezcla a
37ºC durante 30 minutos. Como blanco, se utiliza la misma muestra
que se ha hervido durante dos minutos para inactivar la UGPPasa.
Tras el período de incubación, se finaliza la reacción con un
hervido de dos minutos y se centrifuga la mezcla a 20.000 g durante
10 minutos a 4ºC.
La segunda reacción se lleva a cabo en una
mezcla de reacción de 300 \mul que consiste en HEPES 50 mM (pH
7,5), EDTA 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, KCl 15 mM, 1 unidad de
fosfoglucomutasa (ROCHE), NAD 0,6 mM (SIGMA), 1 unidad de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(SIGMA) y 30 ml del sobrenadante de la primera reacción. La mezcla
de reacción se coloca en una placa FluoroNunc^{TM} de 96 pocillos
(NUNC) y se incuba a 37ºC durante 10 minutos. Esta segunda reacción
produce una cantidad de NADH equimolar a la de G1P producida en la
primera reacción. La cantidad de NADH se determina cuantificando la
DO a 340 nm utilizando un lector de microplacas (DISPOSITIVO
MOLECULAR).
La cantidad (actividad) de UGPPasa contenida en
una muestra se expresa en unidades (U), definiéndose cada unidad
como la fuerza de actividad de la enzima que hidroliza un \mumol
de UDPG por minuto. La actividad se calculó tal como sigue:
1 U =
[a]/30/0,03
donde [a] es la concentración en
\mumol del NADH producido en la
reacción.
Las condiciones anteriores de la primera
reacción se modificaron según el propósito de cada prueba, tal como
se indica de manera específica posteriormente.
Se homogeneizó un riñón fresco de cerdo, de 3,6
kg de peso, en 12 litros de un tampón HEPES 50 mM (pH 7,0) que
contenía DTT 2 mM y EDTA 2 mM (0,3 g tejido por 1 ml de tampón) y se
filtró a través de Miracloth^{TM} (CALBIOCHEM). Después de
centrifugar a 30.000 g cada 30 minutos a 4ºC, se dializó una parte
de dos litros del sobrenadante durante 12 horas frente a 20 litros
de solución de dializado (DTT 1 mM, 2-mercaptoetanol
1 mM) a 4ºC utilizando una membrana dializadora (corte de peso
molecular de 14 kDa), y durante otras 12 horas frente al mismo
volumen de solución de dializado fresca. Este procedimiento se
repitió (5 veces en total) para tratar todo el volumen del
sobrenadante. Todo el tampón utilizado de aquí en adelante contenía
DTT 1 mM y 2-mercaptoetanol 1 mM. Después de
centrifugar a 100.000 g durante 30 minutos a 4ºC, se añadió
Tris-HCl al sobrenadante hasta una concentración
final de 50 mM (pH 8,0). Se cogieron tres litros de esta muestra y
se mezclaron bien con 2 litros de una resina de una columna Q
Sepharose Fast Flow (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), y a continuación
se eliminó el filtrado a través de un filtro de cristal. Las
proteínas unidas a la resina se eluyeron sucesivamente con dos
litros cada una del tampón que contiene Tris-HCl 50
mM (pH 8,0) y NaCl 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 o 0,5 M, respectivamente y
sucesivamente. Estos procedimientos se llevaron a cabo cuatro veces
para tratar todo el volumen de la muestra. Se recogieron fracciones
de eluido de UGPPasa activa y se combinaron.
Se dializó la mitad (seis litros) del eluido
activo obtenido anteriormente durante 12 horas frente a 20 litros
de la solución de dializado (DTT 1 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM, Tris-HCl 50
mM, pH 8,0) a 4ºC, y durante otras 12 horas frente al mismo volumen
de la solución de dializado fresca. Doce litros de esta solución
intercambiada con tampón se mezclaron bien con un litro de resina Q
Sepharose Fast Flow (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), y a continuación
se eliminó el filtrado a través de un filtro de cristal. Las
proteínas unidas a la resina se eluyeron sucesivamente con un litro
de cada uno de los tampones que contenían Tris-HCl
50 mM (pH 8,0) y NaCl 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 o 0,5 M,
respectivamente y sucesivamente. Estos procedimientos se llevaron a
cabo dos veces para tratar todo el volumen de la muestra.
Las fracciones de UGPPasa activa combinadas, que
constituían hasta 1,6 litros de volumen, se dializaron frente a 20
litros de la solución de dializado (DTT 1 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM) a 4ºC durante 12 horas.
Después de añadir un tampón de hidrógeno fosfato sódico (pH 7,0) a
la concentración final de 1 mM, se mezcló bien la solución de
dializado con 100 g de resina de hidroxiapatita (SEIKAGAKU
CORPORATION) que había sido equilibrada con el mismo tampón.
Después de eliminar el filtrado a través de un filtro de cristal y
lavar con 200 ml de tampón fosfato de hidrógeno sódico 1 mM (pH
7,0), se eluyeron las proteínas adsorbidas a la resina de
hidroxiapatita con 200 ml de tampón fosfato de hidrógeno sódico 400
mM (pH 7,0). Se combinaron las fracciones de UGPPasa activa de la
resina de hidroxiapatita y se intercambiaron con tampón
Tris-HCl 40 mM (pH 8,0). Se cargaron 600 ml de esta
solución cada vez en una columna de Q Sepharose HP HiLoad 26/10
(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) y se eluyeron con 500 ml de
Tris-HCl 40 mM (pH 8,0) con un gradiente lineal de
NaCl 0-0,5 M a una velocidad de flujo de 5 ml/min.
Este procedimiento se llevó a cabo tres veces para tratar todo el
volumen de la solución. Se cargaron 15 ml de las fracciones de
UGPPasa activa combinadas cada vez en una columna Superdex 200
(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) que había sido equilibrada con 500 ml
de tampón HEPES 50 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 0,2 M. La columna
se eluyó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 3 ml/min
para fraccionamiento de peso molecular. Estos procedimientos se
llevaron a cabo ocho veces en total para tratar todo el volumen de
las fracciones de UGPPasa activa combinadas.
Las fracciones activas se combinaron y
dializaron frente a 10 litros de la solución de dializado (DTT 1
mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, Tris-HCl
50 mM, pH 8,0) a 4ºC durante 12 horas. Esta solución, 85 ml cada
vez, se cargó en una columna MonoQ HR5/5 (intercambiador aniónico,
AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) que había sido equilibrada con
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), y la columna se eluyó con
30 ml de Tris-HCl 40 mM (pH 8,0) con un gradiente
lineal de NaCl 0-0,5 M a una velocidad de flujo de
1 ml/min. Este procedimiento se llevó a cabo tres veces para tratar
todo el volumen de la solución.
Las fracciones activas obtenidas y combinadas se
dializaron frente a cinco litros de la solución de dializado (DTT 1
mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, Tris-HCl
75 mM, pH 9,0) a 4ºC durante 12 horas. Se cargaron 11 ml de esta
solución de dializado cada vez en una columna MonoP HR5/20
(intercambiador aniónico débil, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) que
había sido equilibrada con Tris-HCl 75 mM (pH 9,0),
y se eluyó la columna con 40 ml de Tris-HCl 50 mM
(pH 9,0) con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M a
una velocidad de flujo de 1 ml/min. Este procedimiento se llevó a
cabo dos veces para tratar todo el volumen de la solución de
dializado.
Se dializaron las fracciones activas frente a un
litro de solución de dializado (DTT 1 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM) a 4ºC durante 12 horas, y se
liofilizaron para reducir el volumen de la solución de tres ml a dos
ml. Llegados a este punto se añadieron 500 ml de solución
terapéutica de muestra PAGE nativa x5 (Tris-HCl
312,5 mM; pH 7,8; glicerol al 75%; BPB al 0,005%). A continuación,
se aplicaron 500 ml de esta muestra en un lámina de gel de
poliacrilamida al 12,5% (cinco láminas en total). Se sometió el gel
a electroforesis utilizando un tampón que contenía Tris 0,025 M y
glicina 0,192 M (pH 8,4) a 40 mA durante dos horas (23). Al
finalizar la electroforesis, se cortó el gel en pedazos de 3 mm
siguiendo la dirección lineal del gel. Cada una de las piezas
extraídas del gel se suspendió por separado en un tampón de
extracción de 500 ml (Tris 10 mM; pH 7,4;
2-mercaptoetanol 10 mM, NaCl 500 mM) y se dejó en
reposo durante 12 horas a 4ºC para extraer proteínas. Se recogieron
las fracciones de proteína de estos pedazos que se había confirmado
que mostraban actividad UGPPasa y que proporcionaban una sola banda
en SDS-PAGE como último producto de UGPPasa
purificado.
Se sometió la UGPPasa porcina purificada a
SDS-PAGE (10-20% gel de gradiente
acrilamida). Se eliminaron del gel las bandas teñidas con azul de
Coomassie brillante (Coomassie Brilliantes Blue, CBB) y se
desecaron por congelación. Se extrajo la proteína del gel y se
digerió con tripsina a 37ºC durante 16 horas para obtener
fragmentos peptídicos, los cuales se purificaron, desalaron y
concentraron utilizando ZipTip (MILLIPORE) y se sometieron a
espectrofotometría de masas en un Micromass Q-TOF MS
(MICROMASS). En el espectrómetro de masas, los fragmentos
peptídicos se ionizaron mediante un procedimiento de ionización
electrospray (ESI) y se separaron los iones peptídicos producidos
de este modo según la proporción masa/carga (m/z). Se seleccionaron
los iones peptídicos con una proporción m/z de
400-1.800 y además se fragmentaron mediante energía
de colisión con moléculas gaseosas poco frecuentes para generar
escalas iónicas que tuvieran una proporción m/z de
50-2.000. Se obtuvieron dos tipos de escalas, una
serie consistía en fragmentos del extremo N y la otra del extremo C.
Las diferencias relativas a la masa entre los fragmentos se
determinaron utilizando un sistema de espectrometría de masas de
tiempo de vuelo (time of flight, TOF) y se obtuvo información
sobre la secuencia de aminoácidos de los extremos N o C de la
proteína.
Se realizó la RCP para amplificar el ADNc AAD
15563.1, utilizando 1,6 \mug de una genoteca de ADNc de glándula
tiroidea humana, 4 pmol de un cebador directo
5'-CATATGGAGCGCATCGAGGGGGCGTCCGT-3'
(SEC ID N.º:9), que incluía en su extremo 5' un sitio de escisión
NdeI, 4 pmol de un cebador inverso
5'-GGATCCTCACTGGAGATC
CAGGTTGGGGGCCA-3' (SEC ID N.º:10), que incluía un sitio de escisión BamHI, 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER) y dNTP 0,2 mM (PERKIN ELMER) en un tampón AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), en un volumen final de 20 \mul, mediante un sistema RCP de amplificación génica 9700 (PERKIN ELMER), bajo las siguientes condiciones:
CAGGTTGGGGGCCA-3' (SEC ID N.º:10), que incluía un sitio de escisión BamHI, 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER) y dNTP 0,2 mM (PERKIN ELMER) en un tampón AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), en un volumen final de 20 \mul, mediante un sistema RCP de amplificación génica 9700 (PERKIN ELMER), bajo las siguientes condiciones:
94ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de (94ºC
durante 1 minuto, 55ºC durante 1,5 minutos y 72ºC durante 2
minutos); 72ºC durante 5 minutos y a continuación 4ºC. La
electroforesis (gel de agarosa al 0,8%) del producto de reacción
mostró un sola banda de AAD 15563.1 (fig. 8). Se purificaron quince
ng de este fragmento de ADNc de 678 pb amplificado de este modo con
ADN RCP GFX^{TM} y con un kit de purificación de bandas de
geles (un kit que incluye un tampón que consiste en un
agente caotrópico para desnaturalizar la proteína y disolver la
agarosa, una microcolumna preempaquetada con una matriz de fibra de
vidrio para adsorber específicamente ADN, un tampón de lavado
Tris-EDTA y agua doblemente destilada y esterilizada
en autoclave para la elución: AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), mezclado
con 25 \mug de ADN de un vector T pT7Blue (NOVAGEN) y el volumen
de la solución se ajustó a 5 ml con agua destilada. A continuación
se mezcló con 5 ml de la solución I (un tampón que contenía una
ligasa de ADN del T4) de un kit de ligación Ver.2 (TAKARA) de
ligación y se dejó en reposo a 16ºC durante toda la noche para
clonar el fragmento de ADNc en el vector (fig. 9). El vector
portador del ADNc se introdujo en E. coli (JM109) y se
dejaron las células en reposo a 37ºC durante toda la noche en medio
agar LB al 1,5% (GIBCO BRL). Algunas de las colonias únicas formadas
en el medio agar se cultivaron en 2 ml de un medio líquido LB que
contenía ampicilina (50 \mug/ml) (LB+Amp) (DIFCO) a 37ºC durante
toda la noche en agitación. El cultivo se centrifugó a 18.000 g
durante cinco minutos a 4ºC y se descartó el sobrenadante. Se
extrajeron los plásmidos de las células precipitadas utilizando un
kit RPM^{TM} (BIO 101, INC.). Se hicieron reaccionar 500
ng de plásmido, elegido de alguno de los clones, respectivamente con
1 unidad de cada una de las enzimas de restricción NdeI (TAKARA) y
BamHI (TAKARA) en un tampón K (Tris-HCl 20 mM; pH
8,5; MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM)(TAKARA), en
el volumen final de 15 \mul y a 37ºC durante una hora. Después de
la reacción, se sometió la mezcla de reacción a electroforesis en
gel de agarosa al 0,8%. Se analizaron los clones de plásmidos y se
seleccionaron los que eran portadores del ADNc.
Algunos de los plásmidos seleccionados
anteriormente se utilizaron para confirmar la secuencia de
nucleótidos del ADNc AAD15563.1 insertado. Doce ml de la mezcla de
reacción contenían 400 ng de uno de los plásmidos, 2 pmol del
cebador T7 (cebador del promotor T7:
5'-TCTAATACGACTCACTATAGG-3') (SEC ID
N.º: 11), 2 pmol del M4 del cebador M13
(5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') (SEC ID
N.º:12), 4,8 ml de la solución de reacción unida al Dye Terminator
Ready Reaction Kit (ABI). La reacción de secuenciación se llevó a
cabo mediante el sistema RCP de amplificación génica 9700 (PERKIN
ELMER), bajo las siguientes condiciones: (96ºC durante 10 segundos,
50ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 4 minutos) x 25 ciclos y 4ºC.
Se añadieron 1,2 \mul de acetato sódico 3 M y 30 \mul de etanol
al 100% al volumen total de la mezcla de reacción para obtener una
suspensión. A continuación se dejó la suspensión en reposo durante
20 minutos sobre hielo y se centrifugó a 18.000 g durante 20
minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 200 \mul de
etanol al 70% para suspender el precipitado, que a continuación se
centrifugó a 18.000 g durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante
y el precipitado fue desecado, resuspendido en 10 \mul de TSR
(Template Suppression Reagent) (PERKIN ELMER), se dejó en
reposo a 95ºC durante 2 minutos y se enfrío rápidamente sobre hielo
durante 2 minutos. Esta muestra se analizó mediante ABI PRISM310
Genetic Analyzer (PERKIN ELMER) para determinar la secuencia de
nucleótidos del ADNc insertado en el plásmido. Después de
determinar la secuencia de nucleótidos de varios clones, se
seleccionó un clon portador del ADN que tuviera la misma secuencia
tal como se ha descrito para el ADNc ADD 15563.1.
Un \mug del clon plásmido que se había
confirmado que contenía el ADN de interés fue digerido con enzimas
de restricción, NdeI y BamHI (ambas de TAKARA). Por separado, se
digerió el vector pET11a (NOVAGEN) con las mismas enzimas de
restricción. El plásmido digerido y el vector fueron sometidos a
electroforesis, respectivamente, en gel de agarosa al 0,8%. Después
de teñir con 1 \mug/ml de bromuro de etidio, se eliminaron del
gel las bandas correspondientes al fragmento de ADNc y al pET11a,
respectivamente, y se extrajeron y purificaron utilizando ADN RCP
GFX^{TM} y un kit de purificación de bandas de geles (AMERSHAM
PHARMACIA BIOTECH). Utilizando 50 ng del fragmento de ADNc
purificado y 25 ng de pET11a, se unió el fragmento al vector de
expresión para volver a clonarlo de la misma manera que se
describió anteriormente en relación con la ligación del fragmento
de ADNc de 678 pb y el ADN del vector T pT7Blue. El plásmido
obtenido (fig. 10) se introdujo en células de E. coli
(JM109) y a continuación se recuperó de las células tal como se ha
descrito anteriormente. Se confirmó que el plásmido recuperado
contenía ADNc AAD15563.1 mediante digestión NdeI/BamHI seguida de
electroforesis en gel de agarosa (fig. 11). A continuación se
introdujo el plásmido en E. coli AD494(DE3) (NOVAGEN),
un huésped adaptado para la expresión elevada de proteínas
extrañas. El transformante obtenido de este modo fue presentado el
12 de febrero de 2002, en la Depositaría de organismos de patentes
internacionales (International Patent Organism Depository,
IPOD), de AIST Tsukuba
Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken 305-8566 Japón (n.º de adquisición FERM BP-7886).
Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken 305-8566 Japón (n.º de adquisición FERM BP-7886).
Las células de E. coli AD494(DE3.)
transformadas anteriormente con el plásmido
pET11a-AAD15563.1 se cultivaron en 10 ml de un
medio líquido LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina
(LB+Amp)(DIFCO) a 37ºC durante toda la noche con agitación. A
continuación se inocularon todas las células en un litro de medio
LB+Amp reciente contenido en un erlenmeyer de cinco litros y se
cultivaron a 37º. Cuando la DO_{550} del cultivo llegó
aproximadamente a 0,5, se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
1 mM al medio y se continuó el cultivo durante otras 3 horas a
37ºC. El cultivo se centrifugó a 8.000 g durante 15 minutos a 4ºC.
Se eliminó el sobrenadante, se recogieron las células precipitadas y
se suspendieron en 100 ml de Tris-HCl 50 mM (pH
8,5) y se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se
eliminó el sobrenadante, se suspendieron las células precipitadas
en 100 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), que contenía
DTT 1 mM y 2-mercaptoetanol 1 mM, y se lisaron
mediante sonicación sobre hielo. Después de centrifugar a 10.000 g
durante 15 minutos a 4ºC, se recuperó el sobrenadante, se filtró a
través de una membrana cuyo poro tenía un tamaño de 0,45 \mum, y
se cargó en una columna Q Sepharose HP HiLoad 26/10 (AMERSHAM
PHARMACIA) que había sido equilibrada con Tris-HCl
50 mM (pH 8,5) que contenía DTT 1 mM y
2-mercaptoetanol 1 mM. Después de lavar con 100 ml
del tampón de equilibrio, se eluyó la columna con 500 ml del tampón
de equilibrio con un gradiente lineal de NaCl 0-1,5
M a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Se recogió la fracción de
UGPPasa activa (18 ml) y se dializó durante toda la noche frente a
un litro de una solución de dializado que contenía DTT 1 mM y
2-mercaptoetanol 1 mM. Esta fracción activa
dializada fue intercambiada por tampon Tris-HCl 50
mM (pH 8,5). A continuación se cargó esta fracción en una columna
MonoP HR5/20 que había sido equilibrada con 20 ml de
Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) que contenía DTT 1 mM y
2-mercaptoetanol 1 mM. La columna se eluyó con 40 ml
de este tampón de equilibrio con un gradiente lineal de NaCl
0-1,5 M a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. La
fracción con mayor actividad UGPPasa y con mayor pureza fue
seleccionada como producto final purificado.
El análisis mediante método Northern se llevó a
cabo utilizando ARN total de distintos tejidos normales de cerdo y
de ser humano para analizar los niveles de expresión de UGPPasa en
aquellos tejidos. Los tejidos de cerdo analizados procedían de
músculo, de corazón, de hígado, de riñón, de pulmón, de cerebro y de
tejido adiposo. En el caso del análisis humano mediante método
Northern, se utilizó un análisis de Northern prefabricado y
comercialmente disponible (Human Adult Normal Tissue Total RNA
Northern Blot I, Catalog No. 021001: BIOCHAIN INSTITUTE, INC,
Hayward, CA) que contenía ARN total de ocho tejidos normales humanos
distintos (corazón, cerebro, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo
y músculo esquelético) que se había hecho correr sobre gel de
agarosa al 1%, desnaturalizante, que contenía formaldehído y se
había transferido a una membrana de nailon de carga modificada.
El producto final purificado de hUGPPasa
obtenido anteriormente en (7) se utilizó como antígeno para
producir un anticuerpo anti-hUGPPasa. Se colocaron
200 \mug de la proteína del antígeno en un tubo Eppendorf de 1,5
ml y se añadió 1 ml de adyuvante GERBU^{TM} 100 (que incluía 0,025
mg/l de glucopéptido procedente de las paredes celulares de L.
bulgaricus, nanopartículas, cationizadores, cimetidina y
saponina basadas en 50 g/l de parafina: BIOTECHNIK GmbH)
(Alternativamente, puede utilizarse adyuvante completo de Freund).
Se agitó la mezcla con una agitadora vorticial durante 30 minutos a
temperatura ambiente para obtener una emulsión de antígeno. Se
vacunó un conejo blanco de Nueva Zelanda de 10 semanas de vida
inyectando al animal esta emulsión de antígeno en el músculo de la
pata trasera una vez cada dos semanas. Al cabo de cinco semanas del
inicio del procedimiento de inmunización, se sacrificó al animal y
se preparó el antisuero mediante un procedimiento convencional. Se
separó el antisuero (antisuero anti-hUGPPasa) en dos
tubos y se almacenaron a 4ºC y -20ºC, respectivamente.
Se digerió un \mug de pET-11a
AAD 15563.1, cuya secuencia de nucleótidos había sido confirmada,
con enzimas de restricción NdeI y BamHI, sucesivamente. Por
separado, se digerió el vector pET-19b (NOVAGEN) con
las mismas enzimas de restricción aproximadamente. Las respectivas
mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en agarosa al
0,8% y, después de teñir con 1 \mug/ml de bromuro de etidio y en
condiciones de iluminación ultravioleta, se eliminaron del gel las
bandas correspondientes al ADNc hUGPPasa y al vector
pET-19b. Se extrajeron las fracciones de ADN del
gel utilizando ADN RCP GFX^{TM} y un kit de purificación de bandas
de geles (AMERSHAM BIOSCIENCES) y se purificaron. A continuación se
mezclaron 50 ng del fragmento de ADNc hUGPPasa con aproximadamente
25 ng del vector pET-19b, se añadieron 5 \mul de
la solución I del kit de ligación Ver.2 (TAKARA) a la mezcla y se
dejó que tuviera lugar la reacción de ligación a 16ºC durante toda
la noche. El plásmido pET-19b AAD15563.1 construido
de este modo se introdujo en células AD494 (DE3) de E.
coli.
Las células AD494(DE3) de E. coli
que incluían plásmido pET-19b AAD 15563.1 fueron
cultivadas con agitación en medio líquido LB+Amp [base de caldo de
cultivo LB de Miller (GIBCO BRL), 50 \mug/ml de sal sódica de
ampicilina] a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se
transfirieron todas las células a 1 litro de medio líquido LB+Amp
en un matraz de Erlenmeyer de 5 litros. Las células se cultivaron
con agitación a 37ºC y cuando la DO del cultivo a 600 nm llegó a
0,5, se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
0,5 mM al medio y se continuó el cultivo con agitación durante
otras 3 horas a 37ºC. A continuación se centrifugó el cultivo a
8.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Las células precipitadas fueron
resuspendidas en 250 ml de Tris-HCl 50 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM, Triton X-100
al 0,1%, pH 9,0. Las células se sometieron a sonicación sobre
hielo, se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos a 4ºC y se
recogió el sobrenadante. El procedimiento se repitió con 6 litros
del medio de cultivo de E. coli para obtener un total de 1,3
litros de sobrenadante. Se filtró el sobrenadante a través de un
filtro de membrana cuyo poro tenía un tamaño de 0,45 \mum y se
cargó todo el volumen en una columna Q Sepharose HP HiLoad 26/10
(AMERSHAM BIOSCIENCES) que había sido equilibrada con
Tris-HCl 50 mM, 2-mercaptoetanol 1
mM, Triton X-100 al 0,1%, pH 9,0. Se lavó la columna
con 100 ml del tampón de equilibrio y a continuación se eluyó la
proteína adsorbida con 500 ml de este tampón de equilibrio con un
gradiente lineal de NaCl 0-1,5 M a una velocidad de
flujo de 5 ml/min. Se recogió la fracción de UGPPasa activa (60 ml)
y se cargó la totalidad del volumen en una resina TALON^{TM} de 5
ml de afinidad a metales (resina de afinidad coinmovilizada:
CLONTECH) que había sido equilibrada con Tris-HCl 50
mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, Triton
X-100 al 0,1%, pH 9,0. La columna se lavó con 20 ml
de este tampón de equilibrio fortalecido con imidazol 10 mM y a
continuación eluido con el tampón de equilibrio fortalecido con
imidazol 150 mM para obtener una fracción de UGPPasa activa (13,5
ml). A continuación se cargó esta fracción en una columna
Superdex^{TM}-200 HR (columna de gel de
filtración que consiste en microesferas porosas de agarosa muy
reticuladas y con dextrano unido covalentemente: AMERSHAM PHARMACIA
BIOTECH) que había sido equilibrada con NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,1
M, pH 8,3 y filtrada mediante gel a una velocidad de flujo de 5
ml/min. Se recogió la fracción de UGPPasa más activa y más
purificada como producto final de proteína de fusión hUGPPasa con
cola de histidina purificada.
Para garantizar que el producto final purificado
obtenido anteriormente es una proteína de fusión hUGPPasa con cola
de histidina, se llevó a cabo una inmunotransferencia utilizando el
antisuero anti-hUGPPasa obtenido anteriormente en
(9) y un anticuerpo monoclonal con cola antihistidina comercialmente
disponible (SIGMA). Se separó un \mug de la proteína de fusión
hUGPPasa unida a una cola de histidina mediante
SDS-PAGE (gel de gradiente de acrilamida al
10-20% (DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD.) y se
transfirió a una membrana de transferencia
Trans-blot (BIO-RAD) a 4ºC a V 100
durante 2 horas. Se bloqueó la membrana con leche desnatada al 3%
(p/v) en TBS [solución salina tamponada con Tris (Tris buffered
saline); pH 8,0 (SIGMA)] y se hizo reaccionar con un anticuerpo
monoclonal murino con cola anti-histidina
(GENZYME/TECHNE) diluido en 500 ng/ml con TTBS [TBS con Tween 20 al
0,05%; pH 8,0 (SIGMA)] y a continuación con el antisuero
anti-hUGPPasa que se había diluido 1.000 veces con
TTBS, respectivamente durante 1 hora a temperatura ambiente. La
membrana se lavó tres veces con TTBS, durante 5 minutos cada vez.
La membrana se incubó a 37ºC durante 1 hora bien con una IgG de
cabra antimurina conjugada con fosfatasa alcalina
(BIO-RAD) diluida 1.000 veces con TTBS para
detección basada en el anticuerpo monoclonal con cola
anti-histidina, o bien con una IgG de cabra
anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina
(BIO-RAD) diluida 1.000 veces con TTBS para
detección basada en el antisuero anti-hUGPPasa.
Después de lavar la membrana tres veces con TTBS, durante 5 minutos
cada vez, se
\hbox{añadió una solución sustrato a la membrana
para permitir la aparición de color.}
Para la purificación de afinidad del anticuerpo
anti-hUGPPasa del antisuero
anti-hUGPPasa de conejo, los inventores intentaron
preparar una columna de antígeno basada en la proteína de fusión
hUGPPasa con cola de histidina. Se prepararon ocho mg de proteína
de fusión hUGPPasa con cola de histidina purificada en 14,3 ml de
NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. Esto se cargó en una columna
HiTrap de 5 ml activada con NHS (Sefarosa® activada con
N-hidroxisuccinimida: PHARMACIA BIOTECH) que había
sido equilibrada con HCl 1 mM para que la proteína se uniera
covalentemente a la columna. A continuación se lavó la columna con
30 ml de Tris-HCl 1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3 y 30 ml
de citrato 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 3,0 sucesivamente.
Después de equilibrar con PBS la columna de
antígeno preparada anteriormente, se aplicaron a la columna 20 ml
del antisuero anti-hUGPPasa. La columna se lavó con
20 ml de PBS y a continuación se eluyó con citrato 0,1 M, NaCl 0,5
M, pH 3,0. Las fracciones se neutralizaron con
Tris-HCl 1 M, pH 9,5. La fracción de anticuerpo
(15,8 ml) se dializó durante toda la noche frente a 5 litros de agua
destilada y a continuación se liofilizó.
El anticuerpo anti-hUGPPasa de
conejo obtenido anteriormente se disolvió en NaHCO_{3} 100 mM, pH
8,3 a la concentración final de 4 mg/ml. A 150 \mul de esta
solución se añadieron 50 \mul de peroxidasa activada (peroxidasa
activada de rábano picante: ROCHE) y se dejó en reposo durante 2
horas a temperatura ambiente para que la peroxidasa de rábano
picante (horseradish peroxidase, HRP) se uniera al
anticuerpo. Tras la adición de 20 \mul de
Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y a continuación de 25 \mul
de NaBH_{4} 200 mM, se mantuvo la mezcla a 4ºC durante 30
minutos. A continuación se añadieron 12,5 \mul de NaBH_{4} 200
mM y se mantuvo la mezcla a 4ºC durante 2 horas para que finalizara
por completo la reacción. Tras la adición de 5 \mul de glicina 1
M, pH 7,0, para estabilizar el anticuerpo, se dializó la solución
frente a 1,5 litros de PBS, glicina 10 mM, pH 7,4 a 4ºC durante
toda la noche. La solución del anticuerpo marcado obtenida de este
modo se almacenó a 4ºC como el anticuerpo
anti-hUGPPasa de conejo conjugado con HRP.
El anticuerpo anti-hUGPPasa de
conejo preparado anteriormente en (14) se diluyó con NaHCO_{3} 50
mM, pH 9,6 para preparar una solución 25 \mug/ml. La solución se
añadió a los pocillos de una placa de 96 pocillos (NUNC), 100
\mul en cada uno, y se incubó a 37ºC durante 1 hora para
recubrimiento. Se eliminó la solución de anticuerpo y se añadieron
300 \mul de un tampón de bloqueo [BSA al 1,0% (p/v), PBS, glicina
10 mM, pH 7,4] en cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante 1 hora
para bloqueo. [0046] Para la preparación de un estándar, se diluyó
de manera gradual la proteína de fusión hUGPPasa con cola de
histidina de 10 \mug/ml-0,1 ng/ml utilizando un
tampón de dilución [Tris 20 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1%(p/v), pH
7,4].
Para utilizar como muestras, se lisaron dos
tipos de células AD494(DE3) de E. coli, uno en el que
se había introducido el plásmido pET-19b AAD 15563.1
y el otro con el plásmido pET-19b, respectivamente,
y se diluyeron hasta 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug/ml con el tampón de
dilución. Se eliminó el tampón de bloqueo de cada uno de los
pocillos de la placa y se lavaron tres veces con 300 \mul de TTBS
cada uno. A cada pocillo se añadieron 100 \mul de la solución
estándar o de la solución de la muestra y se prosiguió a incubar a
37ºC durante 1 hora.
Para detectar la proteína de fusión hUGPPasa con
cola de histidina, se utilizó el anticuerpo
anti-hUGPPasa de conejo conjugado con HRP preparado
anteriormente en (15) tras diluirlo hasta 0,5 \mug/ml con el
tampón de dilución. Después de lavar tres veces los pocillos con
TTBS, se añadieron 100 \mul de la solución de anticuerpo de
detección en cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. A
continuación se lavaron tres veces los pocillos con TTBS, y se
añadieron 100 \mul de un sistema de sustrato líquido para ELISA
que contiene cromógeno 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina
(TMB) y peróxido de hidrógeno en un tampón, pH 6,0: SIGMA) en cada
pocillo. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se
añadieron 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M en cada pocillo para
finalizar la reacción y se determinó la DO a 450 nm.
El análisis se realizó para establecer un
procedimiento de determinación de UGPG en una muestra. En el
procedimiento, la cantidad de UDPG se determinó como la cantidad de
G1P producida mediante la degradación hidrolítica catalizada por la
UGPPasa de la UDPG de la muestra.
Se añadieron 20 ml de una muestra líquida que
contenía UDPG en una de las cantidades indicadas en la figura 25 a
un cóctel de 30 ml que incluía 1,5 unidades de UGPPasa, MgCl_{2}
30 mM y Tris-HCl 70 mM (pH 9,0). Al cabo de 7
minutos de incubación a 37ºC, se finalizó la reacción calentando a
100ºC durante 2 minutos. A continuación se centrifugó la mezcla de
análisis a 20.000 xg durante 5 minutos. Entonces se añadieron 30
\mul de sobrenadante a un cóctel de 270 \mul que contenía Hepes
50 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, KCl 15 mM, NAD^{+} 0,4
mM y tres unidades de G6P deshidrogenasa y de fosfoglucomutasa. A
continuación se cuantificó mediante espectrofotometría la cantidad
de NADH (que indica la cantidad de G1P) producido a 349 nm.
La tabla 1 muestra la actividad UGPPasa y la
pureza detectada con el producto purificado en cada etapa de
purificación. La figura 2 muestra el resultado de
SDS-PAGE de estas muestras. La actividad específica
del producto final eluido del PAGE nativa, que había sido
purificada aproximadamente 60.000 veces, fue de 32 U/mg. Se
consideró que este valor era muy parecido a los valores notificados
de actividad específica de la AGPPasa de cebada o de E.
coli, 23 U/mg o 9,5 U/mg respectivamente, (13, 14). La única
banda detectada en el SDS-PAGE del producto final
de la purificación (fig. 2) tiene que ser UGPPasa, dado su
comportamiento idéntico a la banda de UGPPasa activa en las etapas
de purificación utilizando MonoP (figs. 3 y 4) y PAGE nativa (fig.
5), respectivamente.
Se analizaron siete fragmentos peptídicos
preparados mediante un tratamiento con tripsina del producto final
de purificación mediante ESI TOF MS/MS para secuenciación de
aminoácidos. Las secuencias así conocidas (SEC ID N.º: 5, 6, 7 y 8)
eran muy homólogas a cuatro regiones de proteínas humanas y murinas,
respectivamente, con una función desconocida (figs. 6 y 7). Las
proteínas humanas y murinas, los números ID AAD15563.1 (N.º NCBI de
adquisición AF111170) (SEC ID N.º:3) y 50 BAB23110.1 (N.º NCBI de
adquisición AK003991) (SEC ID N.º:4), respectivamente, se
consideraron enzimas, ya que tenían un motivo hidratasa de tipo
Nudix (nucleósido difosfato unido a alguna otra mitad, X) (24). Se
consideró que la proteína UGPPasa porcina purificada era una
homóloga porcina de estas proteínas humanas y murinas, que tienen
entre sí un grado de homología de aproximadamente el 80%.
El ADN que codifica el AAD15563.1, que ahora se
considera una UGPPasa humana según los resultados anteriores de
ESI-TOF MS/MS, se amplificó mediante RCP y se clonó
en un vector de expresión (fig. 10), y a continuación se confirmó
que la proteína recombinante expresada tiene actividad UGPPasa. Los
cebadores de esta RCP no fueron diseñados según la secuencia de
nucleótidos (SEC ID N.º: 1) descrita por el NCBI (el National Center
for Biotechnology Information). El ADN amplificado se clonó en el
vector de expresión de E. coli pET11a para obtener un
plásmido, pET11a-AAD15563.1. Este plásmido se
introdujo en células AD494 de E. coli. La suspensión de las
células transformadas AD494 (DE3) de E. coli que expresan el
gen introducido mostró una actividad UGPPasa ocho veces mayor en
comparación con la suspensión de la bacteria de control que
simplemente había recibido el plásmido intacto, pET11a (fig. 12).
El SDS-PAGE (poliacrilamida 10-20%)
de la suspensión de la bacteria transformada confirmó la banda de
la proteína expresada (fig. 12). Los resultados del
SDS-PAGE (fig. 13) y de la determinación de la
actividad UGPPasa de la suspensión de las células AD494(DE3)
de E. coli que expresan AAD15563.1, sus fracciones solubles
tras la sonicación y los productos purificados mediante
Q-Sefarosa y MonoP, respectivamente, indicaban que
la actividad específica de la UGPPasa aumentaba en paralelo con el
aumento de intensidad de la banda. La actividad específica del
producto final, que mostraba una sola banda en la
SDS-PAGE, fue de 6,7 U/mg, un valor comparable al de
la UGPPasa porcina purificada final. Estos resultados indican que
la proteína AAD15563.1 es una UGPPasa humana.
Utilizando los productos purificados finales de
UGPPasa humana y porcina, se llevó a cabo un estudio para conocer
las condiciones óptimas para su actividad enzimática. Los resultados
mostraron que ambas enzimas tienen un pH óptimo en el intervalo de
9,5 a 10 y que son dependientes de Mg^{2+} (figs. 14 y 15). Se
determinó que la Kd (constante de disociación) de las enzimas con
el sustrato UDPG era de 4,35 mM y 4,26 mM para la UGPPasa humana y
porcina, respectivamente, lo que indica su afinidad casi igual por
el sustrato (figs. 16 y 17). Entre ADPG, UDPG y GDPG, tanto la
UGPPasa humana como la porcina mostraron la mayor especificidad por
el sustrato UDPG: en presencia de 5 mM de un sustrato
correspondiente, se determinó que su actividad relativa era sólo de
aproximadamente un 20 y un 10% con ADPG y GDPG, respectivamente, en
comparación con la actividad con UDPG (100%) (tablas 2 y 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 18 y 19 muestran el resultado de un
análisis mediante método Northern del ARN total de tejidos de cerdo
y humano adulto, respectivamente. Se observa que el ARNm UGPPasa
aparece en distintos tejidos analizados.
Las figuras 20 y 21 muestran el vector de
expresión pET-19b AAD 15563.1 y el resultado de su
electroforesis en gel de agarosa tras la digestión con NdeI y
BamHI. Se constató que las células AD494(DE3) de E.
coli transformadas con este plásmido expresan una gran cantidad
de proteína de fusión con cola de histidina. El análisis de
inmunotransferencia del producto purificado final obtenido
anteriormente en (11) confirmó que la proteína era una proteína de
fusión hUGPPasa con cola de histidina (fig. 22).
Se estableció un sistema de detección ELISA
utilizando un anticuerpo anti-hUGPPasa de conejo
como fase sólida y proteína de fusión hUGPPasa con cola de
histidina purificada como el estándar. Se determinó que la EC50
(concentración de mayor efecto para una respuesta equivalente a la
mitad de la máxima) de este sistema era 246,8 ng/ml, con un límite
inferior de detección de 10 ng/ml y un intervalo de determinación de
10-1.000 ng/ml (fig. 23).
El ELISA realizado con los lisados de células
AD494(DE3) de E. coli que incluyen plásmido
pET-19b
AAD15563.1 mostró un aumento dependiente de la concentración de proteína en la DO a 450 nm, mientras que no se observaba ningún aumento notable en la DO a 450 con células AD494(DE3) de E. coli que sólo incluyen lisados del plásmido pET-19b (fig. 24). Los resultados indican que el sistema ELISA establecido anteriormente tiene una especificidad elevada por la hUGPPasa sin mostrar ninguna reacción cruzada con proteínas intrínsecas de E. coli.
AAD15563.1 mostró un aumento dependiente de la concentración de proteína en la DO a 450 nm, mientras que no se observaba ningún aumento notable en la DO a 450 con células AD494(DE3) de E. coli que sólo incluyen lisados del plásmido pET-19b (fig. 24). Los resultados indican que el sistema ELISA establecido anteriormente tiene una especificidad elevada por la hUGPPasa sin mostrar ninguna reacción cruzada con proteínas intrínsecas de E. coli.
La cantidad de UDPG contenida en una muestra se
determinó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el
apartado "Materiales y procedimientos". Los resultados se
muestran en la tabla 4 y la figura 25. La cantidad determinada de
G1P (nmol), que se considera equivalente a la cantidad de UDPG,
mostró suficiente correlación con la cantidad de UDPG contenida
inicialmente en la muestra, lo que permite determinar la cantidad
de UDPG en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención permite proporcionar
UGPPasa en una forma purificada y en cualquier escala deseada. La
enzima proporcionada purificada de este modo puede utilizarse para
determinar cantidades de UDPG en muestras tales como sangre.
Además, la enzima purificada se utiliza, por ejemplo, como producto
estándar de referencia en el campo del análisis bioquímico de una
variedad de muestras, entre las que se incluyen especímenes
biológicos naturales, para determinar los niveles de actividad de
la enzima. El uso del estándar de referencia permite obtener datos
estandarizados de los niveles de actividad de la enzima, que
permiten una comparación cuantitativa exacta entre los datos
obtenidos de distintas muestras determinadas en distintos momentos y
lugares. La presente invención también proporciona un anticuerpo
anti-UGPPasa, así como un procedimiento de
enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) basado en el anticuerpo
anti-UGPPasa, que es útil para la determinación y/o
detección de UGPPasa en una variedad de muestras y que también
puede utilizarse para proporcionar un kit ELISA para la
determinación de UGPPasa. Además, la presente invención también se
utiliza para la determinación de UDPG en una muestra, tal como
sangre.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Número ID proteína BAB23110.1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento peptídico de USPPasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento peptídico de USPPasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento peptídico de USPPasa
porcina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento peptídico de USPPasa
porcina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador que tiene en
su extremo 5' un sitio de escisión Ndel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatatggagc gcatcgaggg ggcgtccgt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del cebador que tiene en
su extremo 5' un sitio de escisión BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcac tggagatcca ggttgggggc ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctaatacga ctcactatag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M4 de cebador M13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttcccag tcacgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Proteína enzimática purificada que consiste
en la secuencia de aminoácidos establecida como SEC ID N.º: 2.
2. Proteína enzimática purificada de la
reivindicación 1 en la que la proteína tiene una actividad de
hidrólisis de la UDP-glucosa a
glucosa-1-fosfato y uridina
5'-monofosfato. (reivindicación original)
3. Procedimiento para producir una proteína
enzimática recombinante que comprende las etapas de: incorporar el
ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos establecida
anteriormente como SEC ID N.º: 1 en el listado de secuencias, a un
vector de expresión; introducir el vector de expresión construido de
este modo en células competentes; cultivar las células que
contienen el vector de expresión construido y purificar la proteína
expresada, en la que la proteína tiene actividad de hidrolizar de
UDP-glucosa a
glucosa-1-fosfato y uridina
5'-monofosfato.
4. Uso de la proteína enzimática recombinante
como estándar de referencia en el ensayo de la actividad UGPPasa en
muestras, en el que la proteína consiste en la secuencia de
aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º: 2.
5. Procedimiento para preparar UGPPasa de
mamífero purificada, que es una proteína que consiste en la
secuencia de aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º:
2, en el que el procedimiento comprende las etapas
de:
de:
(a) homogeneizar tejido de un animal mamífero en
un medio acuoso,
(b) centrifugar el homogeneizado obtenido de
este modo,
(c) recoger el sobrenadante del homogeneizado
centrifugado,
(d) dializar el sobrenadante recogido frente a
un medio acuoso,
(e) aplicar el sobrenadante dializado obtenido
anteriormente en (d) a uno o más procesos de cromatografía
utilizando uno o más materiales en fase estacionaria,
respectivamente, y recoger fracciones que muestren actividad
UGPPasa concentrada, en las que entre el material o materiales en
fase estacionaria se incluyen uno seleccionado del grupo que
consiste en intercambiador de aniones, intercambiador de aniones
débiles, gel para exclusión de tamaño e hidroxiapatita,
(f) aplicar las fracciones que muestren
actividad UGPPasa activa concentrada obtenidas anteriormente en (e)
a la PAGE nativa, y
(g) eliminar del gel una parte que contenga
actividad UGPPasa específica concentrada y extraer la proteína
UGPPasa de la parte del gel con un medio de extracción acuoso.
6. Anticuerpo purificado que consiste en la
secuencia de aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º:
2.
7. Procedimiento para determinar la cantidad de
UGPPasa, que es una proteína que consiste en la secuencia de
aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º: 2, en un
analito basado en un enzimoinmunoanálisis de adsorción que
comprende las etapas de:
(a) proporcionar una fase sólida a la que se une
un anticuerpo anti-UGPPasa,
(b) poner una primera solución que contenga una
cantidad predeterminada del analito en contacto con la fase sólida
durante un período de tiempo suficiente para permitir que la UGPPasa
contenida en el analito se una a la anti-UGPPasa
unida a la fase sólida,
(c) tras la eliminación de la primera, poner una
segunda solución que contenga una cantidad predeterminada de un
anticuerpo anti-UGPPasa conjugado a una enzima en
contacto con la fase sólida durante un período de tiempo suficiente
para permitir que el anticuerpo anti-UGPPasa
conjugado a la enzima se una a la UGPPasa unida a la
anti-UGPPasa unida a la fase sólida,
(d) después de eliminar la segunda solución,
poner una tercera solución que contenga una cantidad predeterminada
de un sustrato para la enzima conjugada en contacto con la fase
sólida, y dejar que la enzima conjugada reaccione con el sustrato
durante un período predeterminado de tiempo para producir un
producto específico de la reacción enzimática,
(e) cuantificar la cantidad del producto
específico producido de este modo, y
\newpage
(f) determinar la cantidad de UGPPasa en el
analito basado en la comparación entre la cantidad del producto
específico en (e) y la cantidad del producto específico producido a
partir de una cantidad predeterminada de UGPPasa en las mismas
condiciones que en (b)-(d).
8. Procedimiento para determinar la cantidad de
UDPG contenida en una muestra que comprende las siguientes
etapas:
(a) mezclar una cantidad predeterminada de una
muestra con una solución tampón que contenga una cantidad
predeterminada de UGPPasa, que es una proteína que consiste en la
secuencia de aminoácidos establecida anteriormente como SEC ID N.º:
2, para preparar una mezcla de reacción,
(b) incubar la mezcla de reacción durante un
período de tiempo suficiente para convertir la UDPG en G1P,
(c) finalizar la reacción calentando la mezcla
de reacción, y
(d) cuantificar la cantidad de G1P producida en
(d) haciendo reaccionar la G1P contenida en por lo menos una parte
conocida de la mezcla de reacción con fosfoglucomutasa, G6P
deshidrogenasa y NAD, y cuantificar la cantidad de NADH
producido.
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