JP2005520518A - ＵＧＰＰａｓｅの製造 - Google Patents

Abstract

動物細胞中に天然に存在する、精製された新規の酵素タンパク質ＵＧＰＰａｓｅ、組換え技術によるその生産、当該タンパク質に対する抗体、分析対象中のＵＧＰＰａｓｅ量の測定のためのＥＬＩＳＡを行うための方法、及びサンプル中のＵＤＰＧの定量のための方法が、開示されている。当該一方向タンパク質は、グリコーゲンの前駆体であるＵＤＰグルコースの、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）及びウリジン５’−一リン酸（ＵＭＰ）への加水分解を触媒する。

Description

本発明は、動物に存在することの見出された新規の酵素タンパク質であるＵＤＰ−グルコースピロホスファターゼ（ＵＧＰＰａｓｅ）に関し、そして精製された形での該タンパク質の製造に、並びに、ＥＬＩＳＡを含む、そしてサンプル中に含有されるＵＤＰグルコースの定量のための、生化学的分析の分野における、使用に関する。

グリコーゲンは、植物におけるデンプンと丁度同じように、動物細胞及び大腸菌を含む種々の細菌における主要な炭水化物たる多糖類である。植物中のデンプン及び細菌中のグリコーゲンは、共通の基質であるＡＤＰグルコース（ＡＤＰＧ）から産生される。他方、動物においては、グリコーゲンは、ＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰＧ）から産生される(1)。生物体におけるこれらの貯蔵多糖類の合成の正味の速度は、外的環境と内的な生理学的条件とに応答する種々の制御因子によって調節されていると考えられている。そのような制御因子は、例えば、糖新生経路におけるＡＤＰＧ（又はＵＤＰＧ）ピロホスフォリラーゼ（それぞれ、ＡＧＰａｓｅ又はＵＧＰａｓｅ）の反応のアロステリック調節において、又は糖新生酵素をコードする遺伝子の発現を調節することによって、働くと予測されている（１〜４）。

最近の研究は、グリコーゲンが細菌の増殖に際して同時に合成及び分解され得、ＡＤＰＧの新たな合成を触媒することにおいて、及びグリコーゲン分解によって生じるグルコース単位のリサイクリングにおいて、ＡＧＰａｓｅが二重の役割を有するものである無益回路を構成していることを明らかにしている（５〜７）。

グリコーゲン及びデンプンの同時的な合成及び分解は、動物及び植物においてもそれぞれ起こることが報告されており（８〜10）、そのことは、無益回路の動作は、生理学的及び生化学的な必要に応じて、鋭敏な制御や、過剰な糖新生中間体を種々の代謝経路へ輸送する等のような利点を伴っているのかも知れないということを示している。

この無益回路様の経路との関係において、ＡＤＰＧ（ＵＤＰＧ）レベルの、従って貯蔵多糖類の合成／分解の正味の速度の一層鋭敏な制御を可能にする、ＡＤＰＧ（又はＵＤＰＧ）の加水分解を触媒する一方向酵素の存在が予言されてきた。そのような酵素の最初のものが、ＡＤＰグルコースピロホスファターゼ（ＡＧＰＰａｓｅ）を大麦及び細菌から単離して精製したPozueta-Romero, J 及びその共同研究者によって発見された（11〜13）。彼らが単離したＡＧＰＰａｓｅは、ＡＧＰＧの、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）及びアデノシン５'−一リン酸（ＡＭＰ）への加水分解を触媒する一方向酵素であった。ＵＤＰＧの加水分解を触媒する酵素が、哺乳類細胞に存在することが報告されている（14〜16）。糖タンパク質、糖脂質及びグリコースアミノグリカンの生合成の調節において役割を演じており（17〜22）、これらの酵素は、広い基質特異性を示し、そして、核、ミトコンドリア、小胞体及び形質膜画分に結合していることが見出されている。

グリコーゲンの生合成は、細胞質ゾルにおいて行われる。哺乳類細胞での、グリコーゲンへと向かう炭素の流れの制御におけるＵＤＰＧの酵素分解の関与の可能性が、ＵＤＰＧを実質的に最高の特異性をもって加水分解するＵＤＰグルコースピロホスファターゼ（ＵＧＰＰａｓｅ）と命名した細胞質ゾルのタンパク質の同定へと、我々を促した。

今や、酵素タンパク質の精製のための技術であるＳＤＳ不含ＰＡＧＥ（以下、「無変性ＰＡＧＥ」という。）を適用して、本発明者等は、動物（ヒト及びブタ）から、植物及び細菌におけるＡＧＰＰａｓｅの性質に匹敵する性質を有する酵素であるＵＤＰグルコースピロホスファターゼ（ＵＧＰＰａｓｅ）の精製に成功し、そして、当該酵素を組換え技術によって製造する方法を確立した。この酵素は、今や最終的にＵＧＰＰａｓｅと命名されたが、本発明者等の２００２年３月２０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２７２６又は２００２年９月１７日に出願されたＰＣＴ／ＪＰ０２／０９５４２にそれぞれ開示されているように、本発明者等がＵＧＰＰａｓｅ又はＵＳＰＰａｓｅと暫定的に命名していた酵素である。

ＵＧＰＰａｓｅは、グリコーゲンの前駆分子であるＵＤＰＧのＧ１Ｐ及びＵＭＰへの変換を触媒する一方向加水分解酵素である。

従って、本発明は、配列表において配列番号２として示されたアミノ酸配列を含んでなる精製された酵素タンパク質を提供する。該タンパク質はＵＧＰＰａｓｅ活性、すなわち、ＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）とウリジン５’−一リン酸（ＵＭＰ）とに加水分解する活性を有する。

本発明はまた、配列表において配列番号２として示されたアミノ酸配列を含んでなる、組換え技術によって産生した酵素タンパク質（組換えタンパク質）をも、精製された形で提供する。当該組換えタンパク質が、ＵＧＰＰａｓｅ活性を有することは、確認されている。

本発明は更に、組換え酵素タンパク質を製造するための方法であって、配列表において配列番号１として示されたヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡを発現ベクターに組込むステップと、こうして構築された発現ベクターをコンピテント細胞に導入するステップと、該構築された発現ベクターによって形質転換された細胞を培養するステップと、そして発現されたタンパク質を精製するステップと含んでなり、該タンパク質がＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸とウリジン５’−一リン酸とに加水分解する活性を有するものである、方法をも提供する

本発明は更に、サンプル中のＵＧＰＰａｓｅ活性のアッセイにおける組換え酵素の使用を提供し、ここに当該タンパク質は、配列番号２として示されたアミノ酸配列を含んでなり、当該タンパク質は、ＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸とウリジン５’−一リン酸とに加水分解する活性を有する。かかる使用は、当該酵素の活性レベルの標準化されたデータを得ることを可能にし、それは異なった時及び場所で測定された異なったサンプルからとられたデータ間での正確に定量的な比較を可能にする。
加えて、本発明は、精製された哺乳類のＵＧＰＰａｓｅを製造するための方法であって、
(a) 哺乳類動物からの組織を水性媒質中でホモジナイズするステップと、
(b) こうして得られたホモジネートを遠心するステップと、
(c) 遠心されたホモジネートの上清を回収するステップと、
(d) 回収された上清を水性媒質に対して透析するステップと、
(e) 上記(d) で得られた透析済み上清を１又は２以上の固定相材料をそれぞれ用いた１又は２以上のクロマトグラフィー工程に付しそして濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ活性を示す画分を回収するステップであって、該固定相材料が、陰イオン交換体、弱い陰イオン交換体、サイズ排除用ゲル、及びヒドロキシアパタイトから選ばれるものを含むものであるステップと、
(f) 上記(e) において得られた濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ活性を示す画分を未変性ＰＡＧＥに付すステップと、そして
(g) 濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ特異的活性を含んだ部分をゲルから切り出してＵＧＰＰａｓｅタンパク質を該ゲル部分から水性抽出媒質で抽出するステップと
を含んでなる方法を提供する。

上記方法は、より好ましくはステップ(d)〜(i)の１又は２以上において、そして最も好ましくはステップ(d)〜(i)の全てにおいて、用いられる媒質中に溶解された１又は２以上のスルフヒドリル基保護剤の存在下に行われる。

更には、本発明は、ＵＧＰＰａｓｅに対する精製された抗体を提供し、該抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。

更には、本発明はまた分析対象中のＵＧＰＰａｓｅの量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法により定量するための方法であって、
(a) 抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体を結合させた固相を用意するステップと、
(b) 所定量の分析対象を含有する第１の溶液を、該固相に結合した該抗ＵＧＰＰａｓｅに該分析対象中に含有されるＵＧＰＰａｓｅが結合することを許容するに十分な時間にわたって、該固相に接触させるステップと、
(c) 該第１を除去した後、所定量の酵素接合抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体を含有する第２の溶液を、該固相に結合した抗ＵＧＰＰａｓｅに結合したＵＧＰＰａｓｅに該酵素接合抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体が結合するに十分な時間にわたって、該固相に接触させるステップと、
(d) 該第２の溶液を除去した後、該接合した酵素に対する所定量の基質を含有する第３の溶液を該固相に接触させ、該接合した酵素を該基質と所定時間にわたって反応させて該酵素反応の特異的生成物を産生させるステップと、
(e) こうして産生された特異的生成物の量を測定するステップと、そして
(f) 該分析対象中のＵＧＰＰａｓｅの量を、上記(e) における特異的生成物の量と、(b) 〜(d) と同一の条件下に所定量のＵＧＰＰａｓｅから産生された特異的生成物の量との比較に基づいて、定量するステップと
を含んでなる方法を提供する。

尚も更には、本発明はまた、与えられたサンプル、好ましくは液体サンプル、より好ましくは血液等のような生物学的サンプル中に含有されるＵＤＰＧの量を定量するための方法をも提供する。ＵＤＰＧ欠乏は糖尿病動物（患者）において起こることから（25〜27）、サンプル中のＵＤＰＧの定量は、糖尿病患者の同定のために利用することができる。該方法は、ＵＤＰＧのＧ１Ｐへの１対１変換に基づいており、
(a) サンプルの所定量を、所定量のＵＧＰＰａｓｅを含有する緩衝溶液と混合して反応混合物を調製するステップと、
(b)ＵＤＰＧをＧ１Ｐに変換するのに十分な時間にわたって該反応混合物をインキュベートするステップと、
(c) 反応混合物を加熱することにより反応を終了させるステップと、そして
(d) 該反応液の少なくとも既知の部分に含有されるＧ１Ｐをホスホグルコムターゼ、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤと反応させ、産生されたＮＡＤＨの量を、例えば３４０ｎｍにて分光光度法により測定することによって、(d)において産生されたＧ１Ｐの量を測定するステップと
を含んでなる。

この方法は、非糖尿病のヒトにおいては０．１ｍＭと１ｍＭとの間の範囲にＵＤＰＧレベルがあるものである（28、29）、ヒト組織中のＵＤＰＧの量を測定することを可能にする。

本発明は、ブタＵＧＰＰａｓｅの単離及び精製、ヒト組換えＵＧＰＰａｓｅの製造、それらの酵素的特徴付け、抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体の製造、ＥＬＩＳＡによるＵＧＰＰａｓｅの測定、及びサンプル中に含まれるＵＤＰグルコースの定量のプロセス及び結果を参照して、以下に更に詳細に記述されよう。

抗ＵＧＰＰａｓｅモノクローナル抗体も、動物（例えば、マウス）へのＵＧＰＰａｓｅの接種、十分な抗体価を示す動物の脾臓の採取、Ｂ細胞の選択、Ｂ細胞とＢ細胞起源のミエローマ細胞との融合による抗体分泌性のハイブリドーマ細胞の形成、及び培養培地からの抗体の精製等のようなステップを含む、モノクローナル抗体の製造のための慣用の方法によって製造することができる。ポリクローナル抗体は、家兎、ウマ、マイス及びモルモット等のような如何なる哺乳類動物を用いて製造してもよい。

材料及び方法：
（１）ＵＧＰＰａｓｅ活性の測定方法
ＵＧＰＰａｓｅ活性は、本酵素によって産生されるＧ１Ｐの量に基づいて定義される。測定は、Rodriguez-Lopez等によって報告された方法（11）に従って２段階反応で行われる。最初の反応においては、ＵＧＰＰａｓｅ含有サンプル、０〜20ｍＭ濃度の糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−、ＡＤＰ−又はＧＤＰグルコース）（SIGMA）、20ｍＭの塩化マグネシウム、及び50ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ9.0）よりなる反応混合物50μｌを、37℃にて30分間インキュベートする。ブランクとして、ＵＧＰＰａｓｅを不活化するために２分間煮沸した同じサンプルを用いる。インキュベーション時間の後、２分間の煮沸により反応を停止させ、混合物を20,000×ｇで４℃にて10分間遠心する。

第２の反応は、50ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ7.5）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭの塩化マグネシウム、15ｍＭのＫＣｌ、１単位のホスホグルコムターゼ（Roche）、0.6ｍＭのＮＡＤ（Sigma）、１単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Sigma）、及び第１の反応の上清30μｌよりなる反応混合物300μｌの中で行われる。反応混合物を、96穴のFluoroNunc^TMプレート（NUNC）に入れ、37℃にて10分間インキュベートする。この第２の反応は、第１の反応で産生されたＧ１Ｐの量と等モル量のＮＡＤＨを産生する。ＮＡＤＨの量は、マイクロプレートリーダー（MOLECULAR DEVICE）を用い、340ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量される。

サンプル中のＵＧＰＰａｓｅ量（活性）は、単位（Ｕ）で表され、１単位は、１分間に１μmolのＵＤＰＧを加水分解する酵素活性の強さとして定義される。活性は、次のようにして計算された。
１Ｕ＝(a)/30/0.03
ここに(a)は、反応において産生されたＮＡＤＨのμmol量である。
第１の反応の上記諸条件は、各試験の目的に応じて、下に示したように修正された。

（２）ブタＵＧＰＰａｓｅの抽出：
新鮮なブタ腎臓（重量3.5ｋｇ）を、２ｍＭのＤＴＴ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有する50ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.0）１２リットル中でホモジナイズし（緩衝液１ｍｌあたり組織0.3ｇ）、Miracloth^TM （CALBIOCHEM）でろ過した。30,000×ｇで４℃にて30分間遠心した後、上清のうち２リットル部分を20リットルの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に対して、透析膜（分子量１４ｋＤａカット）を用いて４℃にて12時間透析し、同じ液量の新鮮な透析液に対し更に１２時間透析した。上清の全液量を処理するために、このプロセスを反復（全部で５回）した。この後に用いた全ての緩衝液は、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有した。100,000×ｇで４℃にて30分間遠心の後、最終濃度50ｍＭとなるように上清にトリス塩酸を添加した（ｐＨ8.0）。この同じサンプルの３リットルをとり、２リットルのＱ セファロース ファストフロー（Q Sepharose Fast Flow）樹脂（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）とよく混合し、ガラスフィルターを通して濾液を除去した。樹脂に結合したタンパク質を、50ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）及び塩化ナトリウムを、それぞれ０、0.1、0.2、0.3、0.4又は0.5Ｍ、この順に含有する緩衝液の各２リットルで順次溶出した。サンプル全量を処理するために、これらの操作を４回行った。ＵＧＰＰａｓｅ活性のある溶出画分を収集して合わせた。

上記で得られた活性のある溶出液の半分（６リットル）を、20リットルの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、50ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ8.0）に対して４℃にて12時間透析し、そして等量の新鮮な透析液に対して更に12時間透析した。緩衝液交換したこの溶液12リットルを、１リットルのQ Sepharose Fast Flow 樹脂（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）とよく混合し、ガラスフィルターを通して濾液を除去した。樹脂に結合したタンパク質を、50ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）及び塩化ナトリウムを、それぞれ０、0.1、0.2、0.3、0.4又は0.5Ｍ、この順に含有する緩衝液の各１リットルで順次溶出した。サンプルの全量を処理するために、これらの操作を２回行った。

1.6リットルの液量をなす集められたＵＧＰＰａｓｅ活性画分を、20リットルの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に対して４℃にて12時間透析した。最終濃度１ｍＭとなるようにリン酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）を添加した後、透析液を、同じ緩衝液で平衡化させておいた100ｇのヒドロキシアパタイト樹脂（SEIKAGAKU CORPORATION）とよく混合した。ガラスフィルターで濾液を除去し、１ｍＭのリン酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）の200ｍｌで洗浄した後、ヒドロキシアパタイト樹脂に吸着したタンパク質を、200ｍｌの400ｍＭリン酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）で溶出させた。ヒドロキシアパタイト樹脂からのＵＧＰＰａｓｅ活性画分を合わせ、40ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）と緩衝液交換した。この溶液を、一度に600ｍｌずつ、Q Sepharose HP HiLoad 26/10 カラム（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）に負荷し、０〜0.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有する40ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）の500ｍｌで、流速５ｍｌ／分で溶出した。溶液の全量を処理するために、この操作を３回行った。合わせられたＵＧＰＰａｓｅ活性画分を、一度に15ｍｌずつ、0.2Ｍの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.5）500ｍｌで平衡化させておいたSuperdex 200 カラム（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）に負荷した。分子量分画のために、同じ緩衝液でカラムを流速３ｍｌ／分で溶出した。合わせたＵＧＰＰａｓｅ活性画分の全液量を処理するために、これらの操作を全部で８回行った。

活性画分を合わせ、10リットルの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、50ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ8.0）に対して４℃にて12時間透析した。この溶液を、一度に85ｍｌずつ、50ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）で平衡化させておいたMonoQ HR5/5 カラム（陰イオン交換樹脂、AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）に負荷し、カラムを、０〜0.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有する40ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ8.0）の30ｍｌで、流速１ｍｌ／分で溶出した。溶液の全量を処理するために、この処理を３回行った。

収集して合わせた活性画分を、５リットルの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、75ｍＭトリス塩酸、ｐＨ9.0）に対して４℃にて12時間透析した。この透析後の溶液を、一度に11ｍｌずつ、75ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ9.0）で平衡化させておいたMonoP HR5/20（弱陰イオン交換樹脂、 AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）カラムに負荷し、０〜0.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有する50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ9.0）の40ｍｌで、流速１ｍｌ／分にて溶出させた。透析後の溶液の全量を処理するために、この操作を２回行った。

活性画分を、１Ｌの透析液（１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール）に対して４℃にて12時間透析し、液量を３ｍｌから２ｍｌに減少させるために凍結乾燥した。これに、×５未変性ＰＡＧＥサンプル処理液（312.5ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.8、75％グリセロール、0.005％ＢＰＢ）の500μｌを加えた。次いで、このサンプルの各500μｌを、12.5％ポリアクリルアミドゲルの各シート（全部で５枚）に適用した。0.025Ｍトリス及び0.192Ｍグリシン（ｐＨ8.4）を含有する緩衝液を用いて、40ｍＡにて２時間ゲルを電気泳動に付した（23）。電気泳動の完了後、ゲルをゲルの長手方向に３ｍｍ間隔で切って切片とした。切り出された各切片を、別々に500μｌの抽出緩衝液（10ｍＭトリス、ｐＨ7.4、10ｍＭの２−メルカプトエタノール、500ｍＭの塩化ナトリウム）中に吊るして、タンパク質を抽出するため４℃にて12時間放置した。ＵＧＰＰａｓｅ活性を示し且つＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドを与えることの確認された切片からのンパク質画分を、最終的な、精製ＵＧＰＰａｓｅ産物として集めた。

（３）分子量アッセイ：
精製したブタＵＧＰＰａｓｅを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10〜20％アクリルアミド勾配ゲル）に付した。クマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色されるバンドをゲルから切り出し、凍結乾燥した。タンパク質をゲルから抽出し、37℃にてトリプシンで16時間消化してペプチド断片とし、これを精製し、脱塩しそしてZipTip（MILLIPORE）を用いて濃縮して、Micromass Q-TOF MS（MICROMASS）により質量スペクトル分析に付した。質量分析器中においてペプチド断片は、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法によりイオン化され、形成されたペプチドイオンは、質量対電荷比率（ｍ／ｚ）に従って分離された。400〜1800のｍ／ｚを有するペプチドイオンを選択し、希ガス分子との衝突エネルギーによって更に断片化して50〜2000のｍ／ｚを有するイオンラダーを発生させた。Ｎ末端からの断片からなる一つのシリーズとＣ末端からの別のシリーズとの、２つのタイプのラダーが得られた。断片間の質量の差はＴＯＦ（飛行時間）質量スペクトロメトリーシステムにより、またアミノ酸配列の情報はタンパク質のＮ又はＣ末端から得られた。

（４）AAD15563.1 ｃＤＮＡのＰＣＲクローニング：
AAD15563.1ｃＤＮＡを増幅するために、ヒト甲状腺からのｃＤＮＡライブラリー1.6μｇ、５'末端に1個のNdeI切断部位を含んだ順方向プライマー5'-CATATGGAGCGCATCGAGGGGGCGTCCGT-3'（配列番号９)の４pmol、BamHI切断部位を含んだ逆方向プライマー5'-GGATCCTCACTGGAGATCCAGGTTGGGGGCCA-3'（配列番号10）の４pmol、１単位のAmpliTaq Gold（PERKIN ELMER）ＤＮＡポリメラーゼ、及び、AmpliTaq Gold Buffer（PERKIN ELMER）中の0.2ｍＭのｄＮＴＰを、最終液量20μｌ中において用いてGene Amp PCR System 9700（PERKIN ELMER）中で、次の条件の下でＰＣＲを行った：94℃にて５分間；（94℃にて１分間、55℃にて1.5分間、及び72℃にて２分間）の35サイクル；72℃にて５分間；そして次いで４℃。反応産物の電気泳動（0.8％アガロースゲル）は、AAD15563.1の単一バンドを示した（図８）。こうして増幅された50ｎｇの678ｂｐのｃＤＮＡ断片を、GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification キット（タンパク質を変性させアガロースを溶解させるためのカオトロピック剤含有緩衝液、ＤＮＡを特異的に吸着するためのガラス繊維マトリックスを充填したマイクロカラム、トリスＥＤＴＡ洗浄緩衝液、及びオートクレーブ処理した溶出用の２回蒸留水を含むキット：AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）で精製し、25μｇのpT7Blue T−ベクター（NOVAGEN）ＤＮＡと混合し、蒸留水で液量を５μｌに調節した。次いでこれを、Ligation Kit Ver.2（TAKARA）の５μｌの溶液Ｉ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ含有緩衝液）と混合し、16℃にて終夜放置してｃＤＮＡ断片をベクター中にクローニングした（図９）。このｃＤＮＡを含んだベクターを大腸菌（JM109）に導入し、ＬＢ1.5％寒天培地（GIBCO BRL）中で細胞を37℃にて終夜放置した。寒天培地上に形成された単独コロニーの幾つかを、50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地（LB+Amp）（DIFCO）中で37℃にて撹拌しつつ終夜培養した。培養物を18,000×ｇで４℃にて５分間遠心し、上清を廃棄した。沈殿した細胞から、RPM^TM キット（BIO 101, INC.）を用いてプラスミドを抽出した。幾つかのクローンから選択された500ｎｇのプラスミドを、それぞれ、Ｋ緩衝液（20ｍＭトリス塩酸、ｐＨ8.5、10ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、100ｍＭの塩化ナトリウム）中において、最終液量15μｌとし37℃にて１時間、制限酵素NdeI（TAKARA）及びBamHI（TAKARA）の各１単位と反応させた。反応後、反応混合物を、0.8％アガロースゲル中で電気泳動に付した。プラスミドクローンを試験し、当該ｃＤＮＡを含んだものを選択した。

（5）挿入されたAAD15563.1のｃＤＮＡの配列の確認：
上で選択されたプラスミドの幾つかを、挿入されたAAD15563.1のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の確認のために用いた。反応混合物の12μｌは、プラスミドの１つ400ｎｇ、Ｔ７プライマー（Ｔ７プロモータプライマー: 5'-TCTAATACGACTCACTATAGG-3'）（配列番号１１）２pmol、Ｍ13プライマーＭ４（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）（配列番号１２）２pmol、Dye Terminator Ready Reaction キット(ABI)に添付の反応溶液4.8μｌを含んだ。配列決定反応は、次の条件下にGene Amp PCR System 9700（PERKIN ELMER）によって行った：（96℃10秒間、50℃５秒間、及び60℃４分間）×25サイクル及び４℃。反応混合物の全量に1.2μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び30μｌの100％エタノールを加えて懸濁液とした。この懸濁液を氷上に20分間放置し、18,000×ｇで20分間遠心した。上清を廃棄し、200μｌの70％エタノールを加えて沈殿を懸濁させ、次いでこれを18,000×ｇで５分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿を乾燥させ、10μｌのTemplate Suppression 試薬（PERKIN ELMER）中に再懸濁させ、95℃にて２分間放置し、氷上で速やかに２分間冷却した。このサンプルをABI PRISM310 Genetic Analyzer（PERKIN ELMER）で分析して、プラスミドに挿入されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列を幾つかのクローンについて決定した後、AAD15563.1ｃＤＮＡとして報告されているのと同じ配列を有するＤＮＡを担持したクローンを選択した。

（６）発現ベクターへのAAD15563.1ｃＤＮＡの挿入：
問題のＤＮＡを有することの確認されたプラスミドクローンの１μｇを制限酵素NdeI及びBamHI（共にTAKARA）で消化した。別に、pET11a ベクター（NOVAGEN）を同じ制限酵素で消化した。消化されたプラスミド及びベクターを、それぞれ0.8％アガロースゲルにおいて電気泳動に付した。１μｇ／ｍｌの臭化エチジムウムで染色した後、ｃＤＮＡ断片及びpET11aにそれぞれ対応するバンドをゲルから切り出し、GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification キット（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）を用いて抽出し、精製した。精製したｃＤＮＡ断片の50ｎｇ及びpET11aの25ｎｇを用いて、678ｂｐのｃＤＮＡ断片及びpT7Blue T−ベクターＤＮＡについて上記したのと同じ方法で、断片を再クローニングのために発現ベクターにライゲートした。得られたプラスミド（図１０）を、大腸菌（JM109）細胞に導入し、次いで上述のようにして細胞から回収した。回収したプラスミドは、NdeI／BamHI消化及びこれに続くアガロースゲル電気泳動（図１１）によって、AAD15563.1ＤＮＡを有することが確認された。次いでプラスミドを、外来タンパク質の高発現に適合させてある宿主である大腸菌AD494（DE3）（NOVAGEN）に導入した。こうして得られた形質転換体は、2002年２月12日に、日本国305-8566茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央第６ 産業技術総合研究所のIPOD特許生物寄託センターに寄託した（受託番号FERM BP-7886）。

（７）組換えAAD15563.1タンパク質の発現及び精製：
上においてプラスミドpET11a-AAD15563.1で形質転換された大腸菌AD494(DE3)細胞を、50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（LB+Amp）（DIFCO）10ｍｌ中で37℃にて撹拌しつつ終夜培養した。全細胞を、５リットルの三角フラスコにおいて、新鮮なLB+Amp培地の１リットル中に播種し、37℃で培養した。培養物のＯＤ₅₅₀が約0.5に達したときに、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを培地に添加し、更に３時間37℃にて培養を続けた。培養物を8,000×ｇで４℃にて15分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収して、100ｍｌの50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.5）中に懸濁させ、そして10,000×ｇで４℃にて15分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿した細胞を、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する100ｍｌの50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.5）中に懸濁させ、そして氷上での超音波処理により溶解させた。10,000×ｇで４℃にて15分間遠心した後、上清を回収し、ポアサイズ0.45μｍの膜でろ過紙、そして、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.5）で平衡化させておいたQ Sepharose HP HiLoad 26/10 カラム（AMERSHAM PHARMACIA）に負荷した。100ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した後、カラムを、０〜1.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有する500ｍｌの平衡化緩衝液で、流速５ｍｌ／分で溶出させた。ＵＧＰＰａｓｅ活性画分（18ｍｌ）を集め、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する１リットルの透析液に対して終夜透析した。この透析後の画分を、50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.5）で緩衝液交換した。次いでこの画分を、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ8.5）の20ｍｌで平衡化させておいたMonoP HR5/20カラムに負荷した。この０〜1.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有するこの平衡化緩衝液40ｍｌで、流速１ｍｌ／分でカラムを溶出させた。最も高いＵＧＰＰａｓｅ活性及び最も高い純度を示した画分を最終精製産物として選択した。

（８）ブタ及びヒト成人の正常組織のノーザンブロット分析：
組織におけるＵＧＰＰａｓｅの発現レベルを調べるために、ブタ及びヒトの種々の正常組織からの総ＲＮＡのノーザンブロット分析を行った。調べたブタ組織は、筋肉、心臓、肝臓、腎臓、肺、脳及び脂肪組織であった。ヒトのノーザンブロットのためには、市販の既成のノーザンブロット（ヒト成人正常組織総ＲＮＡノーザンブロットＩ、カタログNo. 021001：BIOCHAIN INSTITUTE, INC, Hayward, CA）を用い、これは、変性性ホルムアルデヒド１％アガロースゲル上で流しそして荷電変性したナイロン膜にうつし取った８種類の異なったヒト正常組織（心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓及び骨格筋）からの総ＲＮＡを含むものであった。

（９）抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体の製造
上で（７）にて得られたｈＵＧＰＰａｓｅの最終精製産物を、抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体を製造するための抗原として用いた。200μｇの抗原タンパク質を1.5ｍｌのEppendorfチューブに入れ、１ｍｌのGERBU^TM アジュバント100（L. bulgaricus細胞壁から得られたの0.025ｍｇ／Ｌの糖ペプチド、50ｇ／Ｌのパラフィン系ナノ粒子、カチオン化剤、シメチジン及びサポニンを含有：BIOTECHNIK GmbH）を加えた（代わりに、フロイント完全アジュバントを用いてもよい）。混合物を室温にて30分間ボルテックスミキサーで撹拌して抗原エマルジョンを得た。10週齢ニュージーランド白色家兎１羽を、２週毎に１回この抗原エマルジョンを後肢の筋肉内に注射することによって免疫感作した。免疫感作の操作開始から５週後、動物をと殺し抗血清を慣用の方法によって調製した。抗血清（抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清）を２本のチューブに分けて入れ、４℃及び−20℃でそれぞれ貯蔵した。

（１０）His-tag 融合タンパク質発現ベクターpET-19bへのAAD15563.1ｃＤＮＡの組み込み
ヌクレオチド配列を確認してあるpET-11a AAD15563.1の１μｇを、制限酵素NdeI及びBamHIで、この順で消化した。別に、pET-19bベクター（NOVAGEN）を、同じ制限酵素により同じ順で消化した。それぞれの反応混合物を、0.8％アガロース電気泳動に付し、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム染色の後紫外線照明下に、ｈＵＧＰＰａｓｅのｃＤＮＡ及びpET-19bベクターに対応するバンドを、ゲルから切り出した。GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification キット（AMERSHAM BIOSCIENCES）を用いてＤＮＡ画分をゲルから抽出して精製した。ｈＵＧＰＰａｓｅのｃＤＮＡ断片50ｎｇを、次いで約25ｎｇのpET-19bベクターと混合し、そしてLigation Kit Ver.2（TAKARA）のSolution Iの５μｌを混合物に加え、16℃にて終夜ライゲーション反応を行った。こうして構築されたプラスミドpET-19b AAD15563.1を大腸菌AD494(DE3)細胞に導入した。

（１１）ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質の発現及び精製
プラスミドpET-19b AAD15563.1を含んだ大腸菌AD494(DE3)細胞を、LB+Aｍｐ液体培地〔Miller's LB ブロスベース（GIBCO BRL）、50μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩〕中で、37℃にて終夜振盪培養した。翌日、全ての細胞を、５Ｌ三角フラスコ中の１ＬのLB+Amp液体培地に移した。細胞を37℃にて振盪培養し、培養物の600ｎｍにおけるＯＤが約0.5に達したとき、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを、最終濃度１ｍＭになるように培地に加え、振盪培養を37℃にて更に３時間続けた。培養物を次いで8,000×ｇで４℃にて15分間遠心した。沈殿した細胞を、50ｍＭトリス塩酸、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、0.1％トリトンＸ−100、ｐＨ9.0の250ｍｌに際懸濁させた。細胞を氷上で超音波処理し、10,000×ｇで４℃にて15分間遠心し、上清を収集した。この操作を６Ｌの大腸菌培養物について、全部で1.3Ｌの上清が得られるまで反復した。ポアサイズ0.45μｍのメンブランフィルターで上清をろ過し、全量を、50ｍＭトリス塩酸、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、0.1％のトリトンＸ−100、ｐＨ9.0で平衡化させておいたQ Sepharose HP HiLoad 26/10 カラム（AMERSHAM BIOSCIENCES）に負荷した。カラムを100ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄し、吸着されたタンパク質を０〜1.5Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を有するこの平衡化緩衝液の500ｍｌで、流速５ｍｌ／分で溶出させた。ＵＧＰＰａｓｅ活性画分（60ｍｌ）を回収し、その全量を、50ｍＭトリス塩酸、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、0.1％のトリトンＸ−100、ｐＨ9.0で平衡化させておいた５ｍｌのTALON^TM金属親和性樹脂（Ｃｏ固定化アフィニティー樹脂：CLONTECH）に負荷した。10ｍＭイミダゾールをスパイクしたこの平衡化緩衝液20ｍｌでカラムを洗浄し、次いで150ｍＭのイミダゾールをスパイクした平衡化緩衝液で溶出させてＵＧＰＰａｓｅ活性画分を回収した（13.5ｍｌ）。次いで、この画分を、0.2ＭのＮａＨＣＯ₃、0.1Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ8.3で平衡化させておいスーたパーデックス（Superdex^TM）-200 HRカラム（共有結合させたデキストランを担持する、高度に架橋した多孔質アガロースビーズよりなるゲルろ過カラム：AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）に負荷し、流速５ｍｌ／分でゲルろ過した。最もＵＧＰＰａｓｅ活性が高く且つ最も精製された画分を、最終の精製されたｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質産物として回収した。

（１２）ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質のウエスタンブロット分析
上で得られた最終の、精製産物がｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質であることを確認するために、上に(9)で得られた抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清及び市販の抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体（SIGMA）を用いたウエスタンブロット分析を行った。ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質の１μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10〜20％アクリルアミド勾配ゲル（DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD））によって分離し、４℃にて100Ｖで２時間にわたってTrans-blot Transfer Membrane（BIO-RAD）に移した。この膜をＴＢＳ（トリス緩衝食塩水、ｐＨ8.0（SIGMA））中の３％（ｗ／ｖ）スキムミルクでブロックし、ＴＴＢＳ（0.05％Tween20を含んだトリス緩衝食塩水、ｐＨ8.0（SIGMA））で500ｎｇ／ｍｌまで希釈した抗His-tagマウスモノクローナル抗体（GENZYME/TECHNE）と、次いで、ＴＴＢＳで1,000倍希釈した抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清と、それぞれ１時間室温にて反応させた。膜をＴＴＢＳで３回、各５分間洗浄した。膜を、37℃にて１時間、抗His-tagモノクローナル抗体に基づく検出のためにＴＴＢＳで1000倍希釈したアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（BIO-RAD）又は、抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清に基づく検出のためにＴＴＢＳで1,000倍希釈したｇアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗家兎ＩｇＧ（BIO-RAD）と共にインキュベートした。膜をＴＴＢＳで３回、各５分間洗浄した後、基質溶液を膜に添加して発色させた。

（１３）抗原カラムの調製
家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清からの抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体のアフィニティー精製のために、本発明者等は、ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質に基づく抗原カラムの調製を試みた。精製したｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質の８ｍｇを、0.2ＭのＮａＨＣＯ₃、0.5Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ8.3の14.3ｍｌ中に準備した。これを、１ｍＭのＨＣｌで平衡化させた５ｍｌのHiTrap NHS-活性化カラム（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化Sepharose^(R)：PHARMACIA BIOTECH）に負荷し、タンパク質をタンパク質をカラムに共有結合によって結合させた。次いでカラムを、１Ｍトリス塩酸、0.5Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ8.3の30ｍｌで、そして0.1Ｍクエン酸塩、0.5Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ3.0の30ｍｌで、この順に洗浄した。

（１４）抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体の精製
上記で調製した抗原カラムをＰＢＳで平衡化させた後、20ｍｌの抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清をカラムに適用した。20ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄し、0.1Ｍクエン酸塩、0.5Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ3.0で溶出させた。画分を１Ｍトリス塩酸、ｐＨ9.5で中和した。抗体分画（15.8ｍｌ）を５Ｌの蒸留水に対して終夜透析し、次いで凍結乾燥した。

（１５）家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体の標識
上記で得られた家兎の抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体を、100ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐＨ8.3中に最終濃度４ｍｇ／ｍｌに溶解させた。この溶液150μｌに、50μｌのPeroxidase, Activated（西洋わさびの活性化されたペルオキシダーゼ：ROCHE）を加え、室温にて２時間放置して西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を抗体に結合させた。20μｌの１Ｍトリス塩酸、ｐＨ8.0及び次いで25μｌの200ｍＭのＮａＢＨ₄を加えた後、混合物を４℃に30分間維持した。次いで、200ｍＭのＮａＢＨ₄の12.5μｌを加え、反応を完了させるため混合物を４℃に２時間維持した。抗体を安定化させるために５μｌの１Ｍグリシン、ｐＨ7.0を加えた後、1.5ＬのＰＢＳ、10ｍＭグリシン、ｐＨ7.4に対して溶液を４℃にて終夜透析した。こうして得られた標識された抗体の溶液を、ＨＲＰ接合家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体として４℃にて貯蔵した。

（１６）ｈＵＧＰＰａｓｅ ＥＬＩＳＡ
上で調製された家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体（14）を、50ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐＨ9.6で希釈して25μｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶液を、96ウェルのプレート（NUNC）のウェルに、100μｌずつ加え、コーティングするために37℃にて１時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、300μｌのブロッキング緩衝液（1.0％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ、10ｍＭグリシン、ｐＨ7.4）を各ウェルに加えて、ブロッキングのため37℃にて１時間インキュベートした。

標準の調製のため、希釈緩衝液（20ｍＭトリス、150ｍＭ塩化ナトリウム、0.1％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ｐＨ7.4）を用いて、ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質を10μｇ／ｍｌ〜0.1ｎｇ／ｍｌへと段階的に希釈した。

サンプルとして使用するために、それぞれ、一方はプラスミドpET-19b AAD15563.1が導入されており、他方はplasmid pET-19bが導入されているものである、２つのタイプの大腸菌AD494(DE3)細胞を溶解させ、希釈緩衝液により50、５、0.5及び0.05μｇ／ｍｌへと希釈した。プレートの各ウェルからブロッキング緩衝液を除去し、各300μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した。各ウェルに100μｌの標準又はサンプル溶液を加え、次いで37℃にて１時間インキュベートした。

ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質の検出のため、（15）において調製したＨＲＰ接合家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体を、希釈緩衝液で0.5μｇ／ｍｌに希釈した後用いた。ウェルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、100μｌの検出抗体溶液を各ウェルに加え、37℃にて１時間インキュベートした。次いでウェルをＴＴＢＳで３回洗浄し、100μｌのTMB LIQUID SUBSTRATE SYSTEM FOR ELISA（色原体３，３≡５，５≡−テトラメチルベンジジン（TMB）及び過酸化水素を緩衝液、ｐＨ6.0中に含有するＥＬＩＳＡ用液体基質系：SIGMA）を各ウェルに加えた。室温にて５分間のインキュベーションの後、50μｌの２Ｍ硫酸を各ウェルに添加して反応を終了させ、450ｎｍにおける吸光度を測定した。

（１７）サンプル中のＵＤＰＧの定量
サンプル中のＵＧＰＧを定量する方法を確立するために試験を行った。その方法においては、ＵＤＰＧ量は、ＵＧＰＰａｓｅにより触媒されるサンプル中のＵＤＰＧの加水分解によって産生されるＧ１Ｐの量として、定量される。

図２５に示した何れかの量のＵＤＰＧを含有する液体サンプルの20μｌを、1.5単位のＵＧＰＰａｓｅ、30ｍＭの塩化マグネシウム及び70ｍＭトリス塩酸を含有するカクテル（ｐＨ9.0）30μｌに加えた。37℃にて７分間のインキュベーションの後、100℃に２分間加熱することにより反応を終了させた。次いで、このアッセイ混合物を20,000×ｇで５分間遠心した。30μｌの上清を、50ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ7.0、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭの塩化マグネシウム、15ｍＭ塩化カリウム、0.4ｍＭのＮＡＤ⁺及び各３単位のＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ及びホスホグルコムターゼを含有するカクテル270μｌに加えた。産生されたＮＡＤＨの量（Ｇ１Ｐの量を示す）を、340ｎｍにて分光光度法により測定した。

結果：
（１）ブタＵＧＰＰａｓｅの精製：
表１は、各精製ステップにおける精製産物について検出されたＵＧＰＰａｓｅ活性と純度とを示す。図２は、それらのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。未変性ＰＡＧｅから溶出された最終産物の比活性は、約60,000倍に精製されたものであるが、32Ｕ／ｍｇであった。この価は、大麦又は大腸菌から精製されたＡＧＰＰａｓｅの比活性について報告された価、すなわちそれぞれ23Ｕ／ｍｇ又は9.5Ｕ／ｍｇ（13、14）に、ほぼ匹敵するものであった。最終精製産物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で検出された単一のバンド（図２）は、MonoP（図３、４）及び未変性ＰＡＧＥ（図５）をそれぞれ用いた精製ステップにおけるＵＧＰＰａｓｅ活性バンドと同一の挙動を示すことから、ＵＧＰＰａｓｅであると結論される。

（２）ブタＵＧＰＰａｓｅのESI-TOF MS/MS分析：
最終精製産物のトリプシン処理により調製した７個のペプチド断片を、アミノ酸配列決定のためにESI-TOF MS/MSによって分析した。こうして知られた配列（配列番号５、６、７及び８）は、機能未知のヒト及びマウスのタンパク質のそれぞれ４つの領域と、高度に相同性であった（図６及び７）。これらのヒト及びマウスのタンパク質は、それぞれ、ＩＤ番号AAD15563.1（NCBI受託番号AF111170）（配列番号３）及びBAB23110.1（NCBI 受託番号AK003991）（配列番号４）であるが、Nudix（他の部分Ｘに連結したヌクレオシド二リン酸）様のヒドラーゼモチーフ（24）を有することから、酵素と考えられた。精製ブタＵＧＰＰａｓｅは、相互に約80％相同であるこれらヒト及びマウスのタンパク質の、ブタ相同体と考えられた。

（３）組換えAAD15563.1の活性測定及びその精製：
ESI-TOF MS/MSの上記結果に基づいて今やヒトＵＧＰＰａｓｅと考えられたAAD15563.1をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、発現ベクター中にクローニングし（図１０）、次いで発現された組換えタンパク質が、ＵＧＰＰａｓｅ活性を有することが確認された。このＰＣＲのためのプライマーは、ＮＣＢＩ（the National Center for Biotechnology Information）によって報告されているヌクレオチド配列（配列番号１）に従って設計された。増幅されたＤＮＡは、大腸菌発現ベクターpET11a中にクローニングされ、プラスミドpET11a-AAD15563.1が得られた。このプラスミドは、大腸菌AD494細胞に導入された。導入された遺伝子を発現する形質転換された大腸菌AD494(DE3)細胞の懸濁液は、単に無傷のプラスミドpET11aを導入されただけの対照細菌の懸濁液に比し、８倍高いＵＧＰＰａｓｅ活性を示した（図１２）。形質転換細菌の懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド10〜20％）により、発現されたタンパク質のバンドが確認された（図１２）。AAD15563.1を発現する大腸菌AD494(DE3)細胞の懸濁液、超音波処理後のその可溶性画分、並びにQ-Sepharose-及びMonoP精製産物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３）及びＵＧＰＰａｓｅ活性測定の結果は、それぞれ、ＵＧＰＰａｓｅの比活性がバンドの強さとの増加に平行して上昇することを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドを示した最終産物の比活性は、6.7Ｕ／ｍｇであり、最終精製ブタＵＧＰＰａｓｅの比活性に匹敵する値であった。これらの結果は、タンパク質AAD15563.1がヒトＵＧＰＰａｓｅであることを示している。

（４）ヒト及びブタＵＧＰＰａｓｅの特徴づけ：
ヒト及びブタのＵＧＰＰａｓｅ最終精製産物を用いて、それらの酵素活性についての至適条件を知るために検討を行った。結果は、両酵素は共に、至適ｐＨを9.5〜10の範囲に有しＭｇ²⁺依存性であることを示した（図１４及び１５）。基質ＵＤＰＧに対するこれらの酵素のＫｄ（解離定数）は、ヒト及びブタＵＧＰＰａｓｅについて4.35ｍＭ及び4.26ｍＭと測定され、このことは、この基質に対するそれら親和性が殆んど等しいことを示している（図１６及び１７）。ＡＤＰｇ、ＵＤＰＧ及びＧＤＰＧのうちで、ヒト及びブタＵＧＰＰａｓｅは、共にＵＤＰｇに最も高い基質特異性を示した：すなわち、５ｍＭの対応する基質の存在下、それらの相対的な活性は、ＵＤＰＧについての活性（100％）と比較すると、ＡＤＰＧについてはそれぞれ約20及び10％であった（表２及び３）。

（５）ブタ及びヒト成人からの正常組織のノーザンブロット分析
図１８及び１９は、それぞれ、ブタ及び成人の組織からの総ＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す。ＵＧＰＰａｓｅのｍＲＮＡは、試験した種々の組織に存在することが分かる。

（６）pET-19b AAD15563.1の構築及びｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質の精製
図２０及び２１は、発現ベクターpET-19b AAD15563.1、及びそのNdeIとBamHIで消化後のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。このプラスミドで形質転換した大腸菌AD494(DE3)細胞は、多量のHis-tag融合タンパク質を発現することが見出された。上記(11)で得られた最終精製産物のウエスタンブロット分析により、このタンパク質がｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質であることが確認された（図２）。

（７）ｈＵＧＰＰａｓｅ ＥＬＩＳＡ
固定相として家兎抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗体を、標準として精製ｈＵＧＰＰａｓｅ His-tag融合タンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ検出系を確立した。この系のＥＣ５０（最大応答の半分の応答に対応するエフェクター濃度）は、246.8ｎｇ／ｍｌ、最低検出限界10ｎｇ／ｍｌ及び測定範囲10〜1,000ｎｇ／ｍｇと測定された（図２３）。

プラスミドpET-19b AAD15563.1を含んだ大腸菌AD494(DE3)細胞の溶解液について行ったＥＬＩＳＡは、タンパク質濃度依存性の450ｎｍ吸光度増大を示し、これに対し、単にプラスミドpET-19bを含むのみの大腸菌AD494(DE3)細胞の溶解液では、450ｎｍにおける吸光度に認め得る増大はなかった（図２４）。この結果は、上で確立したＥＬＩＳＡ系が、大腸菌固有のタンパク質に交差反応することなくｈＵＧＰＰａｓｅに高い特異性を有することを示している。

（８）サンプル中のＵＤＰＧの定量
サンプル中に含有されるＵＤＰＧの量を、上に「材料及び方法」の部で記載した手順に従って測定した。結果を表４及び図２５に示す。測定されたＧ１Ｐ量（nmol）（ＵＤＰＧ量と等価であると看做される）は、サンプル中に最初に含有されていたＵＤＰＧ量と十分な相関を示し、このことはサンプル中のＵＧＰＧ量の定量を可能にするものである。

本発明は、ＵＧＰＰａｓｅを精製された形で、且つ如何なる所望の規模でも提供することを可能にする。こうして提供される精製された酵素は、血液等のようなサンプル中のＵＤＰＧレベルの定量のために利用できる。加えて、精製された酵素は、例えば、この酵素の活性レベルの測定のための、天然の、生物学的な試料を含む様々なサンプルの生化学アッセイの分野における参照標準製品として使用される。当該参照標準の使用は、この酵素の活性レベルの標準化されたデータを得ることを可能にし、そのことは種々の時及び所において測定された種々のサンプルから得られたデータ間の、正確な定量的比較を可能にする。本発明はまた、抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体、並びに当該抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体に基づく酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のための方法をも提供し、これは、種々のサンプル中のＵＧＰＰａｓｅの測定及び／又は検出のために有用であり、また、ＵＧＰＰａｓｅ測定用のＥＬＩＳＡキットの製造にも使用できる。更には、本発明はまた、血液等のようなサンプル中のＵＤＰＧの定量のためにも使用される。

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図１は、ＵＧＰＰａｓｅが関与すると考えられるグリコーゲン代謝に関係する動物細胞中の生化学的反応の図式的フロー示す。図において、Ｇｌｃ；グルコース、ＨＫ；ヘキソキナーゼ、ＰＧＭ；ホスホグルコムターゼ 図は、腎ホモジネートからのＵＧＰＰａｓｅの精製プロセスの各ステップにおける、精製産物（３μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中：レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；腎ホモジネート抽出物（0.00161ｍＵ）、レーン２；30,000×ｇ上清（0.00429ｍＵ）、レーン３；透析後サンプル（0.00481ｍＵ）、レーン４；100,000×ｇ上清（0.00579ｍＵ）、レーン５；Q-Sepharoseカラム溶出液（0.00655ｍＵ）、レーン６、２回目のQ-Sepharoseカラム溶出液（0.0248ｍＵ）、レーン７；塩化ナトリウムの直線勾配によるQ-Sepharoseカラム溶出液（0.0523ｍＵ）、レーン８；Superdex200カラム溶出液（0.184ｍＵ）、レーン９；MonoQカラム溶出液（0.535ｍＵ）、レーン１０；MonoPカラム溶出液（2.59ｍＵ）、レーン１１；未変性ＰＡＧＥ（98.5ｍＵ）。 図３は、MonoPカラムからの画分31〜45のタンパク質濃度及びＵＧＰＰａｓｅ活性を示すグラフである。 図４は、MonoPカラムからの画分29〜39のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 図５は、未変性ＰＡＧＥによる精製後の２ロットのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中：レーンＭ；分子量マーカー。ゲル中のＵＧＰＰａｓｅ量：0.184ｍＵ（ロット１、画分５）、4.33ｍＵ（ロット１、画分６）、2.88ｍＵ（ロット１、画分７）、3.74ｍＵ（ロット２、画分５）、4.43ｍＵ（ロット２、画分６）、0.558ｍＵ（ロット２、画分７） 図６は、ESI-TOF MS/MSの最初の半分の結果を示す。AAD15563.1（ヒト）及びBAB23110.1（マウス）の推定アミノ酸配列の最初の半分が、ブタのＵＧＰＰａｓｅ断片のアミノ酸配列と並べられている。これら全部の種に共通のアミノ酸は“・・・”によりマークされており、一方、ブタと、ヒト又はマウスの一方にのみ共通のアミノ酸は、“・”でマークされている。 図７は、ESI-TOF MS/MSの次の半分の結果を示す。AAD15563.1（ヒト）及びBAB23110.1（マウス）の推定アミノ酸配列の次の半分が、ブタのＵＧＰＰａｓｅ断片のアミノ酸配列と並べられている。これら全部の種に共通のアミノ酸は“・・・”によりマークされており、一方、ブタと、ヒト又はマウスの一方にのみ共通のアミノ酸は、“・”でマークされている。 図８は、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動（0.8％アガロースゲル）の結果を示す。 図９は、AAD15563.1が組み込まれたpT7Blue T−ベクターを示す。 図１０は、AAD15563.1が組み込まれたpET11aを示す。 図１１は、NdeI/BamHIで消化されたpET11a.AAD15563.1の電気泳動（0.8％アガロース）の結果を示す。 図１２は、pET11a-AAD15563.1又はpET11aで形質転換されたAD494(DE3)細胞の懸濁液ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す：レーン１；pET11aで形質転換された細胞の０時間培養、レーン２；pET11a-AAD15563.1で形質転換された細胞の０時間培養、レーン３；pET11aで形質転換された細胞の３時間培養、レーン４；pET11a-AAD15563.1で形質転換された細胞の３時間培養。ゲルへの適用量：レーン１ないし４につきそれぞれ、0.072、0.034、0.034及び0.292（ｍＵ）。 図１３は、組換えヒトＵＧＰＰａｓｅ（r-hUGPPase）の精製ステップにおける各精製産物（2.0μｇ）について実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10〜20％ポリアクリルアミドゲル）の結果を示す。図中：レーン１；AD494(DE)懸濁液（1.8ｍＵ）、レーン２；10,000×ｇ上清（3.0ｍＵ）、レーン３；Q-Sepharose溶出液（6.2ｍＵ）、レーン４；MonoP溶出液（13.5ｍＵ）。サンプルの比活性：レーン１；0.910Ｕ／ｍｇ、レーン２；1.51Ｕ／ｍｇ、レーン３；3.09Ｕ／ｍg、レーン４；6.74Ｕ／ｍｇ。 図１４は、ブタＵＧＰＰａｓｅについての至適ｐＨ範囲を示すグラフである。測定は、塩化マグネシウムの存在下（◆）又は不存在下（□）に、50ｍＭトリス塩酸中において行われた。 図１５は、ヒト組換えＵＧＰＰａｓｅについての至適ｐＨ範囲を示すグラフである。測定は、20ｍＭの塩化マグネシウムの存在下（◆）若しくは不存在下（□）に、50ｍＭトリス塩酸中において、又は、20ｍＭの塩化マグネシウムの存在下50ｍＭのグリシン−ＫＯＨ（○）中において行われた。 図１６は、ＵＤＰＧ濃度（ｍＭ）の関数としてのブタＵＧＰＰａｓｅ活性を示すグラフである。グラフより、この酵素のＫｄは、4.26ｍＭと決定される。 図１７は、ＵＤＰＧ濃度（ｍＭ）の関数としてのヒト組換えＵＧＰＰａｓｅ活性を示すグラフである。グラフより、この酵素のＫｄは４．３５ｍＭと決定される。 図１８は、ブタ組織からの総ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。 図１９は、ヒト組織からの総ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。 図２０は、AAD15563.1を組込んだpET19bを示す。 図２１は、NdeI/BamHIで消化したpET19b.AAD15563.1の電気泳動（0.8％アガロース）の結果を示す。 図２２は、形質転換大腸菌細胞中に発現されこれから精製された、ｈＵＧＰＰａｓｅヒスチジンタグ融合タンパク質の、ＣＢＢ染色（１）及び、抗ｈＵＧＰＰａｓｅ抗血清（２）及び抗ヒスチジンタグ抗体（３）を用いた、ウエスタンブロット分析の結果を示す。 図２３は、標準としての精製されたｈＵＧＰＰａｓｅヒスチジンタグ融合タンパク質のｈＵＧＰＰａｓｅＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。１〜1,000ｎｇ／ｍｌの該タンパク質を含有する標準溶液の450ｎｍにおける吸光度をプロットしてある。斜めの線は、共に対数目盛り表示での、タンパク質濃度（ｘ）とＯＤ450（ｙ）との間の関係の直線当てはめを示す。 図２４は、一方はpET-19b AAD15563.1を他方はpET-19bを、種々の希釈レベルで含むものである、２つのタイプの大腸菌細胞の溶解物のｈＵＧＰＰａｓｅＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 図２５は、サンプル中に最初に含まれていたＵＤＰＧ量と、ＵＧＰＰａｓｅを用いて測定されたＧ１Ｐ量との間の相関を示すグラフである。

Claims (10)

1. 配列番号２として示したアミノ酸配列を含んでなる精製された酵素タンパク質。
2. 該タンパク質が、ＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸とウリジン５’−一リン酸に加水分解する活性を有するものである、請求項１の精製された酵素タンパク質。
3. 配列番号２として示したアミノ酸配列を含んでなる組換え酵素タンパク質。
4. 該組換えタンパク質が、ＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸とウリジン５’−一リン酸に加水分解する活性を有するものである、請求項３の組換えタンパク質。
5. 組換え酵素タンパク質を製造するための方法であって、配列表において配列番号１として示されたヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡを発現ベクターに組み込むステップと、こうして構築された発現ベクターをコンピテント細胞に導入するステップと、該構築された発現ベクターを含んだ細胞を培養するステップとそして発現されたタンパク質を精製するステップとを含んでなり、ここに該タンパク質が、ＵＤＰグルコースをグルコース−１−リン酸とウリジン５’−一リン酸に加水分解する活性を有するものである方法。
6. サンプル中のＵＧＰＰａｓｅ活性のアッセイにおける参照標準としての組換え酵素タンパク質の使用であって、該タンパク質が配列番号２として示したアミノ酸配列を含んでなるものである、使用。
7. 精製された哺乳類のＵＧＰＰａｓｅを製造するための方法であって、
   (a) 哺乳類動物からの組織を水性媒質中でホモジナイズするステップと、
   (b) こうして得られたホモジネートを遠心するステップと、
   (c) 遠心されたホモジネートの上清を回収するステップと、
   (d) 回収された上清を水性媒質に対して透析するステップと、
   (e) 上記(d) で得られた透析済み上清を１又は２以上の固定相材料をそれぞれ用いた１又は２以上のクロマトグラフィー工程に付しそして濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ活性を示す画分を回収するステップであって、該固定相材料が、陰イオン交換体、弱い陰イオン交換体、サイズ排除用ゲル、及びヒドロキシアパタイトから選ばれるものを含むものであるステップと、
   (f) 上記(e) において得られた濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ活性を示す画分を未変性ＰＡＧＥに付すステップと、そして
   (g) 濃縮されたＵＧＰＰａｓｅ特異的活性を含んだ部分をゲルから切り出してＵＧＰＰａｓｅタンパク質を該ゲル部分から水性抽出媒質で抽出するステップと
   を含んでなる方法。
8. 配列番号２として示したアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に対する精製された抗体。
9. 分析対象中のＵＧＰＰａｓｅの量をＥＬＩＳＡ法により定量するための方法であって、
   (a) 抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体を結合させた固相を用意するステップと、
   (b) 所定量の分析対象を含有する第１の溶液を、該固相に結合した該抗ＵＧＰＰａｓｅに該分析対象中に含有されるＵＧＰＰａｓｅが結合することを許容するに十分な時間にわたって、該固相に接触させるステップと、
   (c) 該第１を除去した後、所定量の酵素接合抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体を含有する第２の溶液を、該固相に結合した抗ＵＧＰＰａｓｅに結合したＵＧＰＰａｓｅに該酵素接合抗ＵＧＰＰａｓｅ抗体が結合するに十分な時間にわたって、該固相に接触させるステップと、
   (d) 該第２の溶液を除去した後、該接合した酵素に対する所定量の基質を含有する第３の溶液を該固相に接触させ、該接合した酵素を該基質と所定時間にわたって反応させて該酵素反応の特異的生成物を産生させるステップと、
   (e) こうして産生された特異的生成物の量を測定するステップと、そして
   (f) 該分析対象中のＵＧＰＰａｓｅの量を、上記(e) における特異的生成物の量と、(b) 〜(d) と同一の条件下に所定量のＵＧＰＰａｓｅから産生された特異的生成物の量との比較に基づいて、定量するステップと
   を含んでなる方法。
10. サンプル中に含有されるＵＤＰＧの量を定量するための方法であって、
    (a) サンプルの所定量を、所定量のＵＧＰＰａｓｅを含有する緩衝溶液と混合して反応混合物を調製するステップと、
    (b)ＵＤＰＧをＧ１Ｐに変換するのに十分な時間にわたって該反応混合物をインキュベートするステップと、
    (c) 反応混合物を加熱することにより反応を終了させるステップと、そして
    (d) 該反応液の少なくとも既知の部分に含有されるＧ１Ｐをホスホグルコムターゼ、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤと反応させ、産生されたＮＡＤＨの量を測定することによって、(d)において産生されたＧ１Ｐの量を測定するステップと
    を含んでなる方法。